DD222331A1

DD222331A1 - Verfahren zur herstellung eines proteinasen-inhibitors

Info

Publication number: DD222331A1
Application number: DD25556783A
Authority: DD
Inventors: Werner F Fleck; Margit Passarge; Rolf Schlegel; Helmut Wand; Anton Gabert; Irma Brauer; Manfred Gomoll; Christoph Dauth; Wilfried Rattke
Original assignee: Dresden Arzneimittel
Priority date: 1983-10-11
Filing date: 1983-10-11
Publication date: 1985-05-15

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines niedermolekularen Inhibitors saurer Proteinasen, der fuer die Chemotherapie von Krankheiten des Menschen, bei denen saure Proteinasen ursaechlich beteiligt sind (z. B. Pepsin, Renin, Cathepsin D), von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pepstatin A unter Verwendung des Mikroorganismen-Stammes ZIMET 43 679, der nach Mutagenese-Selektionsprozessen aus Populationen einer in der Differenzierung geblockten Streptomyceten-Art gewonnen wurde. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines Proteinasen-Inhibitors mit potentiell chemotherapeutischem Wert mit Hilfe verbesserter Biosynthese- und Isolierungsbedingungen, um die Palette bekannter Herstellungsverfahren zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Mikroorganismus ZIMET 43 679 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen Pepstatin A gebildet, mit Methoden der Hydrophob-Chromatografie durch Adsorption an handelsuebliche, poroese Polystyrolharze nach vorherigem Versetzen mit Aceton aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend gereinigt wird.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung eines Proteinasen-Inhibitors

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer enzyminhibitoriach wirksamen Substanz, die bei der Chemotherapie von Krankheiten des Menschen von potentiellem Uutzen ist, bei denen Proteinasen ursächlich beteiligt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Ge- , winnung eines Inhibitors für saure Proteinasen, der als Pepstatin A bezeichnet wird. '

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Pe pstatine sind eine Gruppe von Inhibitoren saurer Proteinasen wie Pepsin, Renin und Cathepsin D, die zur Gruppe der Oligo peptide (Pentapeptide) geh'c-jren. Ss ist bekannt, daß unterschiedliche Acylreste am Pepstatin-Molekül die renin-inhibitorische Aktivität verändern. Darüber hinaus ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen wie Streptomyces caeapitosus (SUGAWARA et HATA 1956), Streptomyces parvisporogenes (LOCCI et al. 1969 bzw. IGHOTUS), Streptomyces naniwaensis (MURAO et SATOI 1970), Streptomyces testaceus (HAIiADA et OKAMI) und Streptomyces argenteolus var. toyonakensis (UIvIEZAWA, DD-PS 34 449) unterschiedliche Pepstatine zu synthetisieren vermögen, wobei es sich um Gemische von schwer voneinander trennbaren

Oligopeptiden handelt. Ein Nachteil bei. der Gewinnung strukturell modifizierter Pepstatine ist, daß zwar chemische Methoden wie Total- bzw. Partialsynthese oder biochemische Methoden zur enzymatischen Konversion verfügbar sind, deren Anwendung jedoch nicht zu einer ökonomischen Produktherstellung führt und die- großtechnische Gewinnung dieser Derivate nicht gestattet. Bei den bisher bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren für Pepstatine werden bevorzugt Gemische ähnlicher Oligppeptide gewonnen, bei denen als Acylreste Isovaleroyl-, n-Caproyl-, Isocäproyl-, n-Heptanoyl-, Isoheptanoyl-, Anteispheptahpyl-;, n-Caprpyl- und Isocapi-o^l .-Gruppen in Präge kommen. Das erschwert die Trennung der chemisch ähn-''lichen Komponenten und bringt S tandardisierungs probleme •mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Permentationsverlauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten. , Bisher können Pepstatine lediglich mit Hilfe von wenigen, z. T,-nicht gültig beschriebenen Streptomyceten-Arten auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden. . .' ' , Schließlich ist es von lachteil, daß bei der Isolierung der Pepstatine die bei der Gewinnung .anderer peptidartiger Proteinasen-Inhibitoren mit Vorteil eingesetzte Hydrophob-Chromatografie mittels nichtionischer poröser Polymerisationsharze /Wegen unzureichender Selektivität nicht angewendet werden kann. .

,Ziel der Erfindung .

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors saurer Proteinasen aus der Gruppe der Pepstatine, bei dem die aufgeführten Kachteile bisher bekannter mikrobiologischer Herstellungsverfahren vermieden werden.

- 3 Darlegung des Wesens der Brf indung . . ' ..

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisches Verfahren anzugeben, das es gestattet, einen Proteinasen-Inhibitor aus der Gruppe der Pepstatine mit Hilfe eines' Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Kährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen ein zur Gattung Streptomyces ,gehöriger Mikroorganismus öder seine Varianten und Mutanten gezüchtet ?/erden.

Der .Mikroorganismus, der in dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung von Pepstatin verwendet wird, wurde durch Mutagenese-Selektionsprozesse aus Populationen einer Streptomyceten-Art gewonnen und in der ΖΙΜΞΤ-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDR, unter der Hummer ZIMST 43 679 hinterlegt. Bei dem Ausgangsstamm, aus dem die Mutante ZHSET 43 679 abgeleitet ist, handelt es sich um Streptomyces spec. PS 14382, der einen genetischen Block in der Differenzierung von Luftmycel und Sporulation trägt und daher von den bisher bekannten Pepstatin-Bildr^rn abweichende Charakteristica aufweist. \ ι

•Im Gegensatz zum Ausgangsstamm Streptomyces spec. PS 14382 synthetisiert die nach Hutagenese und Selektion erhaltene Mutante Streptomyces spec. ZIMET 43 679 kein Gemisch von unterschiedlichen Pepstatinen und anderen Proteinasen- Inhibitoren, sondern bevorzugt ein chemisch einheitliches Pepstatin.

Die Kultivierung des Pepstatin-Bildners Streptomyces spec, ΖΏΙΕΤ 43 679 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt

unter aeroben Bedingungen, An Erde lyoph.il getrocknetea .bzw. in'flüssigem Stickstoff aufbewahrtes MyCel des Stammes wird in geeignete Agarnährboden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Uährmedien geimpft, und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter tYeise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰C, vorzugsweise bei 28 ⁰C, über einen Zeitraum von 2 bia 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationaprozesaes zwischen pH 6,8 und 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und 8,5 liegt« Das Hährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickst of f.quellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen können Glycerin, Glucose, Lactose, . . Sojaöl und Sojamehle verwendet werden* Als Stickstoffquellen eignen sich außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten Fleischextrakte, Maisquellwasser, Aminosäuregemische, Rohglutamin, Peptone und Trockenhefe..

Gute Fermentationsergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf \ der Fermentation je nach dem verwendeten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Magnesiumsulfaten und Kaliumphosphaten als vorteilhaft erwiesen.

Die Fermentation des Pepstatin-Bildners ZIMET 43 679 kann, in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im.Glasfermenter sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt werden. Die Isolierung des Proteinasen-Inhibitors aus dem Stamm ZIMET 43 679 wird erfindungsgemäß in der Weise durchgeführt, daß das inhibitorhaltige-Kulturfiltrat mit Aceton versetzt, nachfolgend mit wasserfeuchtein, handelsüblichem, porösem Polystyrolharz mit möglichst großer innerer Oberfläche- vermischt, mehrere Stunden vei^ührt und .danach durch Dekantieren vom Überstand des abgesetzten Harzes getrennt wird« Daraufhin wird das ;inhibitorhaltige Harz in eine Säule gefüllt und der Inhalt, mit Hilfe von Methanol desorbiert.

Die methanolische Lösung wird anschließend mit üblichen Methoden bis zur wässrigen Phase eingeengt, diese konzentriert und auf: pH 8,5 mit Hilfe von Natronlauge eingestellt und 2 mal mit n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanol-Estrakte werden mit Essigsäure angesäuert. und unter Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wird mit Methanol aufgenommen und nach Abdestillieren des Methanols erneut mit Methanol versetzt«, Die methanolische Lösung wird unter Sieden mit Aktivkohle behandelt, das dabei erhaltene nur noch schwach gefärbte Filtrat wird eingedampft und der Rückstand nach Aufnehmen mit Lösungsmitteln mit Hilfe der Kieselgel-Chromatografie in einheitliche Fraktionen getrennt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingeengt; der so gewonnene Inhibitor wird aus Methanol umkristallisiert und rein erhalten. Dabei zeigte sich, daß das Versetzen des Kulturfiltrates mit Aceton überraschenderweise die Selektivität der Hydrophob-Chromatografie erhöht.

Der aus dem Stamm ZIMET 43 679 isolierte und gereinigte Inhibitor I 43 679 besitzt einen Schmelzpunkt von 227 bis 229 ⁰C. Die Elementaranalyse ergibt 9,65 % H; ' 60,08 fo C und 9,88 % H. Die Identifizierung des Isoyaleroyl-Restes erfolgt gaschromatografisch. Die Aminosäureanalyse bestätigt das Vorliegen von Pepstatin A (TMEZAWA et al. 1970, J. Antibiot., 23, 259; AOYAYGl et al. 1973, J. Antibiot. 2β₉ 539)ο

Sowohl frische Fermentationslösungen des Pepstatin A-Bildners ZIMET 43 679 als auch der aus ihnen isolierte Proteinasen-Inhibitor I 43 679 (= Pepstatin A) besitzen enzyminhibitorische Aktivität gegen Pepsin. Als Aktivitätsparameter des Pepstatin A ist der IDcQ-Wert des Inhibitors bestimmt worden. Der ID^Q-V/ert führt unter standardisierten Bedingungen zu einer 50%igen Reduzierung

- ' · . .: · - 6 - . - ' ' . .

der Pepsin-Aktivität. Ala Enzymsubstrat iat Rinderaerum- albumin verwendet worden. Die Abspaltung von Tyrosin wird bei 280 mn photometrisch bestimmt und als Maß für die unter Pepstatin Α-Einfluß,verbleibende Restaktivität des Pe pain gewert et.Der 33) ^q-Wert des Pepstatin A liegt bei 0,64

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern,; ohnesie hierauf zu beschränken.

Ausftihrungabeiapiele .Beispiel 1

Zwei 500 ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80 ml des folgenden Torzuchtmediuma : ' ·· ,

Glucose, 1,5%

Sojamehl . . 1,5 %

GaGOy 0,1 %

in Iieitungswasaer, . pH 6,8, Sterilisierung: 35 Min. 115 ⁰C, Jede Steilbrustflasche wird mit einer Myeelauspension des Pepatatin A-Bildnera, ZIMET 43 679, beimpft, welche mit steriler, isotonischer· Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-lährboden gezüchteten, 10 bis 14 Tage alten Kultur des Stammes ZHET 43 679 hergestellt wird; ' ·.· . ' . -

Glucose · 1,0 %

Casein-Pepton ;: . 'C/4 /5/. : : Walfleischextra let .0,4 & "' ITaCl . .-' " . 0,25 fo ' '

Trockenhefe . V 0,02 % in Leitungswasser, pH 7-,0; 20 Minuten bei 115 ⁰C. '

Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48 bis 96 Stundenbei 28 ⁰C auf einem Schiittelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min, bebrütet. 8 ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500 ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktions-Mediums enthalten:

Glycerin	2,0 %
Fleischextrakt	0,75 %
Pe pton	0,75 %
HaCl	0,3 %
MgSo₄* 7. H₂O	0,1 %
K₂HPO₄	0,1 %

In Leitungswasser, pH 7,0. Sterilisierung: 20 Min. bei 115 ⁰C Die Bebrütungstemperaturen bei An-, Vorzucht und Produktion liegen bei 28 ⁰C. '·

Beispiel 2

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Glycerin 2,0 fo : '

Maisquellwasser 1,5 %

HaCl . 0,3 %

MgSO₄* 7 H₂O 0,1 %

K₂HPO₄ 0,1 %

In Leitungswasser, pH 7,0; 20 Minuten bei 115 ⁰C sterilisiert, Beispiel 3

Mit einer Kultur des Pepstatin Α-Bildners Stamm ZIMET 43 679 von einem festen Nährboden wie in Beispiel 1 beschrieben, beimpft man 80 ml des in'Beispiel 1 beschriebenen flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer 500 ml-Steil-

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brustflasche enthalten ist. Man bebrütet 48 Stunden bei .28 ⁰G auf einem Schüttelgerät mit.einer Frequenz von 180 U/Min. 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400 ,ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2-1-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet -weitere⁰24 Stunden bei 28 ⁰G bei gleicher Schüttelfrequenz , ehe die so. erhaltenen 400 ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20 1 des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums dienen können. Letzteres ist in einem 32 1-Glasfermenter enthalten. Nach eintägiger Be.brütung und Belüftung (15 l/Sin.) wird der Inhalt des 32 1-Glas-fermenters als-Inoculum für ginen 450 1 72A-Stahltank eingesetzt. !fahrend der Fermentation kann die Schaumbildung ^: durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. Pie Rührgeschwindigkeit beträgt 400 U/Minute und die Luftzufuhr 400 l/Minute.

Beispiel 4 . "

15 1.der auf diese Weise gewonnenen Kulturlösung, die 420 mg Pepstatin A enthalten, werden mit 3 1 Aceton ver- setzt. Anschließend werden 750 g wasserfeuchtes, handelsübliches, poröses Polystyrolharz mit einer Oberfläche

2 '' '

von 400 m /g und einem mittleren Porendurchinesser von, 250 A hinzugefügt. lach 3-stündigem Rühren der Suspension ist der Adsorptionsprozeß abgeschlossen, man läßt das Harz sich absetzen und dekantiert den Überstand, sammelt das Harz auf einer Fritte und wäscht es-mit Wasser. Danach wird das mit dem Inhibitor beladene Harz in eine Säule gefüllt, so daß mit 3 1 Methanol die Desorption des Inhibitors erfolgen kann. Unter Vakuum wird Methanol aus 'der methanolischen Lösung entfernt, die zurückbleibende wässrige Phase .wird auf 400 ml konzentriert, mit Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt und zweimal mit je ml a-Butanol extrahiert. Die Butanol-Ertrakte werden nach

,Vereinigung mit Essigsäure angesäuert, und mittels Rota- tionsverdampfer wird Butanol entfernt und der Rückstand mehrfach in Methanol gelöst. Durch Destillieren wird Methanol entfernt, ehe der Rückstand in 100 ml Methanol . aufgenommen und unter Sieden mit 10 g Aktivkohle versetzt wird. Nach 10-minütigern Schütteln der entstandenen Suspension wird filtriert, das schwach gefärbte Filtrat wird eingedampft, und der Rückstand wird mit Hilfe der Kieselgel-Chromatografie in einem Laufmittel-Gemisch¹ von Chloroform: Methanol : Eisessig = 86 : 12 : 2 in Fraktionen getrennt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der"entstandene Rückstand wird aus Methanol umkristallisiert. Ss werden 150 mg reines Pepstatin A erhalten.

Claims

*

Srfindungsanspruch : .

Verfahren zur Herateilung eines Proteinasen-Inhibitors, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus StreptomyceS spec. ZIMET 43 679 unter aeroben Bedingungen in flüssigen Hährmedien, die eine Kohlenstoff-Stickstoff-· quelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Tempera- . tür zwischen 25 und 37 ⁰C, während eines Zeitraumes von. 2. bis 6 Tagen kultiviert v/ird und der gebildete Proteinäsen-Inhibitor, Pepstatin A, aus dem Kulturfiltrat nach Ein-. stellung des Filtrates auf eine Acidität im Bereich von pH 1 bis, pH 7, "Vorzugsweise pH 5 bis pH 7, Versetzen mit ; 10 bis, 20 % Aceton, Adsorption an handelsübliches, poröses Polystyrolharz, Desorption mit Hilfe von niederen Alkoholen, 'bevorzugt Methanol, Extraktion mit üblichen Lösungsmitteln, Behandlung mit Aktivkohle, Konzentration mit üblichen Methoden ,isoliert'und mittels chromatografischer Methoden gereinigt \vird. .