DD230882A1

DD230882A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer ein monozyten-antigen

Info

Publication number: DD230882A1
Application number: DD25465183A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Hartmut Kupper; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11
Also published as: DD230882B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen monoklonaler Antikoerper fuer ein Monozyten-Antigen. Sie hat die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikoerpers vom Typ BL-M/G anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers fuer ein Zelloberflaechenantigen humaner Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen gestattet. Die Aufgabe wird geloest durch die Herstellung des Hybridoms H-BL-M/G und dessen anschliessende Kultivierung in vivo oder in vitro.

Description

Titel der Erfindung;

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für ein Monozyten-Antigen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit humanen Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen reagieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Monozyten und Makrophagen spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen pathogenen Immunreaktionen. Die Analyse der Punktion dieser Zellen und deren diagnostische Verwertung sind an die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen spezifische Monozyten/Makrophagen-Antigene gekoppelt. Es hat nicht an Versuchen gefehlt, Anti-Makrophagen-Seren durch Jeno- oder Alloimmunisierung und anschließende Gewebeabsorption zu erzeugen (ÜUAJSUE, E.R., Nature 218, (1968), 36; STUaMETT, J.D. et al., J. Immunol, riß, (1976), 273ί BREARD, j. _et al., Clin. Immunol. Immunopathol. rj5, ((198O), 438). Diese Antiseren sind jedoch nur in begrenztem Maße herstellbar, nicht reproduzierbar und somit nicht standardisierbar. Eine Lösung dieser Probleme könnten die von Hybridomen sezernierten monoklonalen Antikörper darstellen.

Es ist bereits bekannt, monoklonal© Antikörper herzustellen. Sie haben KÖHLER und MILSTEIl (Nature, 256, (1975), 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen ^l

η «r.:. 4 CiP, L * 1

mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß: verschiedene Hybridomlinien, die .Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. So sind auch monoklonale Ratten-anti-Mausmakrophagen-Antikörper beschrieben (SPRINGER., T.A. et al., Eur. J. Immunol. 9.» (1979), 301). Diese Antikörper kreuzreagieren auch mit Antigenen, die auf humanen Monozyten und Granulozyten vorhanden sind (AlJIiE., K.A. und r. A. SPRIHGER, j. Immunol. 12£, (1980), 359). Es sind auch monoklonale Antikörper, die mit humanen Monozyten reagieren, beschrieben worden (fOT^E^ G. et al., Scand. J. Immunol. J_6, (1982), 515). Da zur Zeit nur 2 monoklonale Antikörper für Monozyten bekannt und erhältlich sind, scheint es sinnvoll, den Stand der Technik durch einen weiteren, leicht zugänglichen und preisgünstigen monoklonalen Antikörper zu bereichern.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-M/£ anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für ein Zelloberflächenantigen humaner Monozyten, Granulozyten sowie Hullzellen gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einfachen und exakten Nachweistesten für humane Monozyten, Granulozyten sowie Hullzellen eignen, wobei Kreuzreaktionen mit Zelloberflächenantigenen anderer Zellen nicht vorkommen sollen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Herstellungsverfahren für monoklonale Antikörper anzugeben, die spezifisch mit humanen Monozyten, Granulozyten sowie

Hullzellen reagieren, wobei in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt werden soll, das unkompliziert zu handhaben ist und dessen Kultivierung technisch und ökonomisch vorteilhaft möglich ist. Die Kultivierung des Hybridoma soll zu monoklonalen Antikörpern führen, die die oben angegebenen Eigenschaften haben and in der klinischen Diagnostik eingesetzt werden können.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach dem an sich bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation mononukleare Zellen aus dem,peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Inkubation dieser Zellen in Plastepetrischalen werden die adhärierenden Zellen isoliert. Nach Ablösung dieser Zellen, z.B. mit einem Gummischaber, w;erden diese erfindungsgemäß zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse eingesetzt. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P 3 - X - 63 Ag 8. 653 (KEARKEY et al., J. Immunol. 1.2J3, (1979) 1548) w/erden in EPMI-I64O mit 10 % fetalem Kälberserum (MS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält CLITTLEEIELD, Science 145, (1 9 6 4 ), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zeilklon selektioniert, der Anti= körper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-/Ul-Kulturen aufgeteilt werden. Die überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit Zelloberflächenantigenen von Monozyten, Granulozyten und Nullzellen reagieren. Hierzu werden alle Kultur-

überstände, die mit adhärierenden Zellen,'(Monozyten) reagieren, mit Granulozyten, die durch an sich bekannte Verfahren mittels Dichtegradientenzentrifugation aus peripherem Blut gesunder Spender gewonnen werden, getestet. Die Festung der Überstände erfolgt mittels indirekter Immunfluoreszenz, wobei im Phasenkontrastverfahren zu kontrollieren ist, daß es sich um Zellen der jeweiligen Art handelt. Hur solche Kulturen werden weiter verwendet, die mit der Mehrheit der Monozyten und Granulozyten reagieren. Die Kulturüberstände werden dann mit den adhärenten Monozyten und mit den Granulozyten inkubiert und der Anteil der markierten Zellen mittels FIiEC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum bestimmt. Mit der Methode der indirekten Immunfluoreszenz wird ausgeschlossen, daß u. HD. Hybridome ausgewählt werden, deren Antikörper mit B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Erythrozyten reagieren.

Das durch diese Selektion erhaltene Hybridom H-Bl-M/GB ward rekloniert und ein Subklon wird selektioniert, der Antikörper, die zur Bestimmung humaner Monozyten, Granulozyten und Nullzellen geeignet sind, produziert. Diese überraschende und vorteilhafte Eigenschaft eröffnet sehr günstige diagnostische Möglichkeiten.

Die Herstellung des Antikörpers erfolgt erfindungsgemäß dergestalt, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-M/G in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen werden. Nach entsprechender Kultivierung in COp-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50 % gesättigtem (NH.igSOj versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonale Antikörper BL-M/G ist potentiell in der Lage, Komplement zu binden und die Zielzellen zytotozisch zu zerstören. · -

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI ο. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-I64O, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 10 mM HEPES, 5 · 1G~⁵ M M-er c apt ©ethanol, 100 mg/1 Gentamyoin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20 %. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10 % zn arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰G: und 38⁰G:. Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu arbeiten.

Der CTO«-Ge halt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10 %, insbesondere 5 %* Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung des Hybridoma erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Danach ist ein teilweiser Mediumwechsel notwendig. Dabei ist erneut die optimale Zelldichte einzustellen.

Der monoklonale Antikörper weist das in Tabelle 1 dokumentierte Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik (RBT) und indirekter Immunfluoreszenz (ilP). bestimmt.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-M/G" in histokompatible A. χ BAIBZc-P₁-Mäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl., vorbehandelt worden sind. Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z.B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zellu-

läre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-M/S. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-M/G spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-M/G; antigenspezi- ^ fisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg BL-M/G pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 2Q mg/ml. '

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50 % gesättigter (IiH, >₂S0. -Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen HH.HCOo-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist.

Tabelle 1

Bindangsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-M/G mit verschiedenen Blutzellen

Testzellen Markierte Zellen (#); Rl¹'

	< 5
Monozyten	>9Q
Granulozyten	>80
TKLymphozyten	< 2
B-Lymphozyten	< 2
O-Zellen	>70
Erythrozyten	0

RI bedeutet die relative Fluoreszenzintensität der Me mb r ananf är b ung

Periphere mononukleäre Zellen

1. Ausführungsbeispiel z

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridzellen (H-BL-M/G) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1 - 5 x Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2 g/l), Mercaptoethanol (5 χ 10~^M), Gentamycin (100 mg/1) und N-2-Hyäroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (10 mM) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20 %, Als geeignet hat sich 10 % Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen COj-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z. T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt-, und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklcnalen Antikörper BI-M/G. Die Konzentration des Antikörpers BL-M/G ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren für Monozyten, Granulozyten und Nullzellen (wie z.B. indirekte Immunfluoreszenz, enzyaiimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten

Technik (ζ. B. indirekte Immunfluoreszenz) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration. . Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50 % gesättigtem Ainmoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCU oder Glycin/HCl-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel:

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-M/G, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Uach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 1Cr bis 5 * 10 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden P--Hybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum, i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BI-M/G enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-EL-M/G. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompa-

tiblen Mäusen i..p. injiziert werden. Salche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50 %. gesättigtem (NH.)₂ ^SO präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5 %ige NH.HCGU-Lösung dislysiert. Inschließend erfolgt die

4 j

Lyophilisierung. Der Antikörper BL-M/G ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und lustestung mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung frischer humaner Blutmonozy-fcen und einem geeigneten FITC-markierten AntiMaus immungl ob ul ins er um bestimmt. Als Titer wird diejenige gröEte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle Monozyten markiert werden.

Ausführuna;sbeispiel t

Zellen des Hybridoms H-BL-M/G werden wie in Beispiel 1 kultiviert und vermehrt. Nach Erreichen einer hinreichenden Zellanzahl werden die Hybridomzellen geerntet und mehrmals mit serumfreiem Zellzuchtmedium gewaschen.

Anschließend werden die Hybridomzellen in einer Dichte von 2 - 5 · 10 Zellen pro 1 ml in einem serumfreien Zellzuchtmedium wie z.B. RPMI-I64O, das mit NaHCO₃ (2 g/l), Mercaptoethanol (5 •'Ίο"⁵ M), Gentamycin (100 mg/1) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird, kultiviert. Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, w:enn die Zellen bei 37⁰C in einer 5 %±gen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden. Die Inkubation dauert 12-24 Stunden.

Der zellfreie Kulturüberstand enthält den monoklonalen. Antikörper des jeweiligen Hybridoms H-BL-M/G ohne

Serumproteine, die sonst als Mediumzusatz verwendet werden. Der monoklonale Antikörper kann durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie oder Protein-A-Adsorption o. dgl. weiter konzentriert werden, wenn das gewünscht wird.

Mit den erfindungsgemäß hergestellten Antikörpern BL-M/& gelingt es besser und genauer als bisher, Monozyten, Granulozyten und Uullzellen zu bestimmen. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der geschilderten Verfahrensweise ist die Möglichkeit, das Hybridom H-BL-M/G über längere Zeit aufzubewahren und auch fZ% nach Ruhezeiten wieder zur Antikörperproduktion einzusetzen. In diesem Sinne wird durch die zur Verfügung gestellte Lehre der Stand der Technik wesentlich bereichert.

Claims

Erfindungsansprüche

. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für ein Monozyten-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit humanen Monozyten immunisiert werden, aus den Milzen derart behandelter Mäuse Lymphozyten separiert werden, diese mit Maus-E-Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen der Art H-BL-M/G selektioniert, die selektionierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die Aszitesflüssigkeit entnommen und der Antikörper BL-M/G gewonnen wird.

^) 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet,

daß das Hybridom H-BL-M/G rekloniert wird und daß ein Subklon selektioniert wird, der zur Bestimmung von Monozyten, Granulozyten und Hullzellen geeignete Antikörper produziert.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet,

daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.

4« Verfahren nach Eünkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P 3 - X 63 Ag 8.653 eingesetzt werden.

5· Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeich- jy net, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine

Reihe von Injektionen mit humanen Monozyten erfolgt.
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß- die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa

_:i 1 ε 1 beträgt.
8. Verfahren nach Punkt 1 ,bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ BALB/c-F..-Hybridmäusen enthält.
9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit humanen Monozyten, Granulozyten, Nullzellen durch indirekte Immunfluoreszenz mittel FITC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobulinserum erfolgt.

>, 10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf das Nichtreagieren mit B- und E-Lymphozyten mittels indirekter Immunfluoreszenz erfolgt.
11. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-M/G in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CCU-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikö'rperhaltige Kulturmedium mit 50 % gesättigtem (HELi₂SO, versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der

^ nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
12. Verfahren nach Punkt 1 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI oder dgl. eingesetzt wird.

Ί3. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI-I64O verwendet wird.

H. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium TO mM HEPES, 5 · TO~^M Mercaptoethanol, 100 mg/1 Gentamycin zugesetzt werden.

15· Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Punkt 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10 %, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10 %. beträgt.

1-7. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 35 bis 38⁰C beträgt.
18. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 17, dadurch ge- ΐβ ' kennzeichnet, daß bei 37⁰C kultiviert wird.
19. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der COo-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium 2—bis 10 % beträgt.
20. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der COg-Gehalt über dem Kulturmedium 5 % beträgt.
21. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß über dem ,Kulturmedium hohe luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der

, Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.

">, 22. Verfahre'n nach Punkt 1 und 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4 Tage kultiviert wird.
23. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-M/G in histokompatible A χ BALB/c-P₁-Mäuse i. p. injiziert wird, nach der Aszitesbildung die Äszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-M/G. enthält,, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Äszitesflüssigkeit z.B. mit 50 %

gesättigter (KH,ipSCh-Lösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte EH-HCO,-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überfüiirt wird.

24·. Verfahren nach Punkt 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des Hybridoms H-BL-M/G bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können.

25· Verfahren nach Punkt 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl, vorbehandelt werden.
26. Verfahren nach Punkt 1, 23 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechender Tumorstimulator 3 Tage bis 6 Wochen vor der Hybridominjektion gegeben wird.
27. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-M/G bei +4⁰C aufbewahrt wird.