DD241749A1 - Verfahren zur herstellung von 6-(3'-methylbuten-2',3'-yl)-isatin - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 6-(3'-methylbuten-2',3'-yl)-isatin Download PDF

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Udo Graefe
Wolfgang Schade
Werner Fleck
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 6-(3-Methylbuten-2,3-yl)-isatin, eines neuen Isatin-Derivates. Insbesondere betrifft die Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung des genannten Isatin-Derivates (Bruttozusammensetzung C13H13NO2) unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces. Die Aufgabe wird in der bevorzugten Ausfuehrungsform in der Weise geloest, dass durch aerobe und sterile Fermentation des Stammes S. albus ZIMET 43 794 in Medien mit C- und N-Quellen sowie Mineralsalzen das 6-(3-Methylbuten-2,3-yl)-isatin gebildet und mit Hilfe extraktiver Verfahren aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatographische Methoden gereinigt wird. Die Struktur des neuen Isatin-Derivates, eines fuer die Herstellung von indigoiden Farbstoffen sowie von Arzneimitteln nuetzlichen Stoffes, ist aus Abb. 1 ersichtlich.

Description

Der Nachweis einer 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin-Bildung erfolgt durch dünhschichtchromatographischen Vergleich von Proben des mit Hilfe organischer Lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat, aus dem Kuiturfiltrat isolierten Rohproduktes mit authentischem Material. Das hochgereinigte 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin kann ferner sowohl auf Grund seiner gelben Farbe als auch auf Grund seiner inhibitorischen Wirkung gegenüber dem Testkeim Bacillus subtilisATCC6633 (Minimalmedium, minimale inhibitorische Konzentration: 20/j.g/ml) erkannt werden. -. .'
Die Herstellung von reinem 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin (I; Abb. 1) aus dem nach Butylacetat-Extraktion der Kulturflüssigkeit .erhaltenem Rohprodukt erfolgt in an sich für lipophile Substanzen bekannter Weise durch Chromatographie an organophilen _ Dextrangelen unter Verwendung von Methanol als Eluentund durch anschließende Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung organischer Solventien als Elutionsmittel. Auf diese Weise wird hochreines 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin erhalten, das durch folgende physikochemische Charakteristika gekennzeichnet wird:
Schmelzpunkt: 1090C bis 1100C \ ; .
Summeriformel: C13H13NO2 : . ' . , ·
Molekulargewicht: 215 (M+:m/z gefunden 215,0935; berechnet 215,0946) /
Charakteristische Fragmente: 187,0994(C12H13NO); 177,1052
(jEOLjMsp-100). , ; > ; ; ν ; ; ' Λ 'ν·:.-'·; ' · v-);;'·;·: .
Kernresonanzspektrum: Abb.2 zeigt das 100 MHz 1H NMR-Spektrum des 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatins (Varian XFT-100). Die Vorteile der Erfindung werden wie folgt gesehen: V :
— Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird mit dem 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin eine neue Verbindung bereitgestellt, die wie die bisher bekannten Isatin-Derivate als Ausgangssübstanz für die Synthese von indigoiden Farbstoffen einer- und von Arzneimitteln andererseits nützlich ist. : : . '
— Erstmals wird ein mikrobiologisch-biotechnologisches Verfahren bereitgestellt, mit dem unterVerwendung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, insbesondere des Stammes Streptomyces albus ZIMET 43794, sowie unter Rückgriff auf billige Einsatzstoffe ein Isatin-Derivat, nämlich das genannte 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin, gewonnen werden kann. ' ·..;.' ;> "' " ' '. ;: " -- '-'':'" .. ".;. ."" ".' ' :'.. ::'--. / ?' -, ': '·.- . '..'... ; . '-' :.:' : ν : .: \
Ausführungsbeispiel
Aneinem Ausführungsbeispiel soll die Erfindung näher erläutert werden. .
An Erde lyophil getrocknete Myzelfragrnente des Stammes S.albus ZIMET 43794 dienen zur Beimpfung eines für Streptomyceten üblichen Agarmediumsfolgender Zusammensetzung (g/l): Backhefe 15; Maisstärke 10; NaCI 5; Fleischpepton 1; Agar 20; pH 7,0. Inokulumkulturen werden durch Einsaat von Myzelstücken der Agarkultur oder von gefriergetrockneten Myzelien als Stammkultur in ein Medium folgender Zusammensetzung erhalten (g/l): Sojamehl 40; Glucose40; NaCI2,5; NaCO35; KH2PO40,25; pH6,3.DiezweiteVorkulturerfolgtaufdem gleichen Medium. Nach48stündiger Bebrütung der Vorkultur (500 ml Steilbrustflaschen, 80ml Inhalt, 25°C, Rundschwingtisch, 180UpM) wird die stufenweise Mäßstabvergrößerung durch Übertragung von Kulturproben in 51-Steilbrustflaschen (0,51 Medium) und weitere 24 Stünden Bebrütung bei 27°C durchgeführt. ^
Für die Kultivierung in Fermentern wird ein Medium folgenderZusammensetzung verwendet (g/1): Sojamehl40; Glucose 2Ö; Kartoffelstärke 30; NH4NO3 2; CaCO32; pH6,2 (vor der^Sterilisation). Die Belüftung erfolgt mit steriler Luft (1:1), die Fermentationszeit beträgt 72 Stunden bis 144 Stunden, die Rührgeschwindigkeit 280UpM. Die Schaumbildung kann in an sich bekannter Weise durch Zusatz kleiner Mengen ah siliconhaltigen Schaumbekämpfungsmitteln kontrolliert werden. Die Kulturlösung wird bei pH4,0 mit 0,2 Volumenteilen Butylacetat extrahiert.
DerButylextraktaus500l Kulturlösung ergibt nach Einengen im Vakuum ca. 200g Rohprodukt, das in Methanol gelöst und portionsweise der Säulenchromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel unterworfen wird. Proben der Einzelfraktionen (jeweils 20 ml Eluat) werden auf Kieselgelplatten aufgetragen, die im System Benzen/Ether (1:1, v/v) entwickelt werden. Diejenigen Fraktionen, die eine gelbe Zone mit Rf 0,5 enthalten, ' werden vereinigt und eingeengt. Anschließend erfolgt Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von CHCI3/ Methanol (95:5, v/v) als Lauf mittel. Die im Verlauf der Säulenchromatographie erscheinenden, gelb gefärbten Fraktionen werden vereinigt und eingeengt (Rückstand 250 mg). Die weitere Reinigung erfolgt durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgelschichten unter Verwendung von Benzen/Ether 1:1 als Laufmittel, wobei reines 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin (Rf 0,5) durch Extraktion aus der gelb angefärbten Zone erhalten wird (Ausbeute 100mg).

Claims (3)

Erfindungsanspruch:
1. Verfahren zur Herstellung von 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin, gekennzeichnet dadurch, daß ein Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, vorzugsweise der Art Streptomyces albus,' unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 2O0C bis 38°C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen bei einer Azidität, die zu Beginn des Fermentationsprozesses
- zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt, kultiviert wird, und daß das in das Kulturfiltrat ausgeschiedene 6-(3'-Methylbuten-2',3-yl)-isatin als neues Derivat des Isatins mit der in Abb. 1 gezeigten Struktur anschließend mittels Extraktion isoliert wird.
2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Streptomyces albus ZIMET 43794 bei 26 0C während eines Zeitraumes von 4 Tagen kultiviert wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen und durch an sich bekannte chromatograpische Methoden weiter gereihigt wird.
Hierzu 2 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung einer neuen chemischen Verbindung. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der chemischen und in der pharmazeutischen Industrie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Isatin (CsH5N(^) bzw. bestimmte substituierte Derivate dieser bizyklischen aromatischen Verbindung dienen zur Herstellung sowohl von synthetischen Indigofarbstoffen (H. BEYER, Lehrbuch der Organischen Chemie, S. Hirzel-Verlag Leipzig, 1961, Seiten 597 und 637-638; H. FIESER und M. FIESER, Lehrbuch der Organischen Chemie, Verlag Chemie, 1957, Seiten 938 und 1054; O. BAYER und W.ECKERT „Isatine"; in: Hoyben-Weyl-Methoden der organischen.Chemie, Sauerstoffverbindungen II, Teil 4 (Ed.: E.MÜLLER), G. Thieme-Verlag Stuttgart, Seiten 1-32) als auch von Hellmitteln, wie z.B. des Gicht-wirksamen Präparates Atophan (vgl. die Patentschriften DE-OS 2346938, DE-OS 2559509, DE-OS 2804832, DE-OS 2815609, DE-OS 3000338 und DE-OS 3310891 sowie W.CSUMPTER, Chem. Rev. 34(1944),393-434; W.CSUMPTER und F.M.MILLER, in: A.WEISSBERGER, The Chemistry of Heterocyclic Compounds, vol. 8, lnterscience Publishers Inc., New York, 1954, Seiten 111-170 und K.THIESS, in: Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, Bd.8, Verlag Urbau und Schwarzenberg, München-Berlin (West), 1957, Seiten 748-762).
Bisher bekannte Derivate dieser Substanz sind etwa das 5-Nitroisatin, das*5-Carbethoxyisatin und das 5-Cyanoisatin. Isatin und seine bisher bekannten Derivate werden ausschließlich auf chemischen Wege hergestellt. Diese Herstellungsverfahren erweisen sich als vergleichsweise materialaufwendig; außerdem stellen sie nicht unerhebliche Umweltbelastung dar.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Isatin-Derivates, nämlich des 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatins, um die Palette der bekannten Syntheseeinsatzstoffe mit Isatin-Struktur um eine in ihrer chemischen Konstitution neuartige Verbindung zu erweitern, die für die Herstellung von indigoiden Farbstoffen und von Pharmaka von potentiellem Nutzen ist. .
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches mikrobiologisch-biotechnologisches Verfahren zu beschreiben, mit · dessen Hilfe 6-(3'-Methylbuten-2',3'-yl)-isatin unter Verwendung billiger Einsatzstoffe hergestellt und mit Hilfe einfacher chromatographischer Methoden in reiner Form erhalten werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, vorzugsweise der Art Streptomyces albus und insbesondere der Stamm Streptomyces albus JA 3453-10, unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Medium mit an sich bekannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und mit den in der Fermentationsindustrie üblichen Mineralsalzzusätzen zum Medium kultiviert wird (Submersfermentation). Der Mikroorganismus JA 3453-10 ist in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR-6900 Jena, Beutenbergstraße 11, unter der Registriernummer ZIMET 43794 hinterlegt worden.
Die Kultivierung und Erhaltung des eingesetzten Mikroorganismusses der Gattung Streptomyces, vorzugsweise der Art S.albus und hierbei insbesondere des Stammes ZIMET 43794, wird wie folgt vorgenommen: In Glucose/Gelatine (5%ig) lyophilisierte Myzelfragmente werden auf Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien eingeimpft, und das entstandene Myzel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 2O0C und 380C, vorzugsweise 26°C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Azidität kultiviert, die zu Beginn der Fermentation zwischen pH5,5 und pH7,5 liegt. Als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können die in der Fermentationsindustrie üblichen Einsatzstoffe verwendet werden. Die Fermentation des jeweils eingesetzten Streptomyces-Stammes kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentem bzw. in V2A-Tanks durchgeführt werden.
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