DD266592A1 - Verfahren zur herstellung von 11beta, 15beta-dihydroxy-(20s)-20-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 11beta, 15beta-dihydroxy-(20s)-20-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on Download PDF

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DD266592A1
DD266592A1 DD31058587A DD31058587A DD266592A1 DD 266592 A1 DD266592 A1 DD 266592A1 DD 31058587 A DD31058587 A DD 31058587A DD 31058587 A DD31058587 A DD 31058587A DD 266592 A1 DD266592 A1 DD 266592A1
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hydroxymethyl
pregnadien
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Heinz Stopsack
Joerg Auweiler
Bernd Roeder
Kaete Meyer
Rudolf Zepter
Helmut Groh
Dieter Tresselt
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Jenapharm Veb
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 11b,15b-Dihydroxy-(20S)-20-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on durch enzymatische Umwandlung von (20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien unter Zuleitung von steriler Luft. Als Mikroorganismen werden vorzugsweise solche der Gattung Curvularia, Cochliobulus, Cunninghamella oder Bacillus megatherium eingesetzt. Das Substrat wird in waessriger Loesung oder in einem organischen Loesungsmittel geloest zugegeben. Bei Anwendung einer waessrigen Suspension wird die Substanz in mikronisierter Form und in Gegenwart von nichtionogen Emulgatoren zugegeben. Wird das Substrat in einem organischen Loesungsmittel geloest zugegeben, so wird die Substanz in einem niederen Alkohol Keton, Glykolmonoether, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid geloest.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 11ß, 15ß-Dihydroxy-(20S)-20-hydroxymethyl-1,4-p.v3gn3Jien-3-on aus (20S)-20-Hydroxymethyl-i,4-prögnadien-3-on durch mikrobiologische Hydroxylierung mit Hilfe von Pilzen der Gattung Cochliobulus. Dorartige hydroxyliorte Verbindungen sind als Zwischenprodukte für clio Synthese pharmazeutisch wortvollor Wirkstoffe mit Steroidstruktur verwendbar.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Wie bekannt, ist (20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on durch mikrowellen Seitenkettenabbau von Storolen gut zugänglich geworden. ((Appl. Microbiol. 23,72 (1972); Bull. Chem. Soc. Jap. 58,1081 [1985]). Wie weiterhin bekannt, Ist es möglich, mit Hilfe enzymischer Reaktionen Hydroxylgruppen in das Steroldgerüst einzuführen (vgl. K. Kieslich, „Steroid Conversions" W. Charney, H. Herzog „Microbif.l Transformations of Steroids", Acad. Press, New York-Zürich, 1967). Gemäß einem älteren Recht kann Prednisolon aus 1-Dehydro-11-desoxy-steroiden mit dem Pilz Cochliobulus lunatus 148 hergestellt werden. Weiterhin ist entsprechend einem älteren Recht bekannt, Prednisolon-17-acetat aus 11-Desoxy-1,4-3-oxo-steroiden mit dem Pilz Cochliobulus lunatus 148 herzustellen. Es ist weiterhin bokannt, 11 ß-Hydroxylierungen mit Hilfe der Mikroorganismen Cunninghamella und Bacillus megatherium durchzuführen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein ökonomisch günstiges Verfahren zur Herstellung von 11ß,15ß-Dihydroxy-(20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on durch enzymatische Hydroxylierung darzulegen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die o. g. Zielverbindung in einem technologisch leicht durchführbaren Verfahren aus dem zugänglichen (20S)-20-Hydroxymothyl-1,4-prognadien-3-on herzustellen.
Crfindungsgemäß kann diese Aufgabe durch mikroblelle Hydroxylierung mit Hilfe Mikroorganismen, z. B. der Gattung Curvularia, Cocnliobulus, Cunninghamella, Bacillus megatherium, Insbesondere aber Cochliobulus lunatus, gelöst werden.
Überraschend dabei ist, daß nach dem bekannten Stand der Technik Storoidkörpor mit der 1,4-Dien-3-on Struktur nur schwer hydroxylierbar sind. In diesem Fall aber sogar Doppelhydroxylierung in Ausbeuten bis zu 80% erreicht wird Die Fermentation wird in der Weise durchgeführt, daß der für die Reaktion eingesetzte Pilz unter üblichen Kulturbedingui.gon in einem Nährmedium angezüchtet und vermehrt wird. Das Substrat, (20S)-20-Hydroxymothyl-1,4-pregnadien-3-on, wird dann in Form einer Suspension oder aber vorzugsweise, in Form einer Lösung in einem Lösungsmittel zugegeben und unter Eintrag von steriler Luft solange fermentiert, bis maximale Substratumwandlung erreicht worden ist.
Als Lösungsmittel bei der Herstellung der Substratlösung sind niedere Alkohole und Ketone, Glykolmonoether, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd geeignet. Bei Einsatz als wäßrige Suspension empfiehlt es sich die Substanz in sehr
fein verteilter Form (mikronisiort) aniubioten und in Gegenwert nichtionogonon Emulgatoren zu arbeiten. Abhängig von dom gewählten Gesamtsystem kann die Substratkonzentration während der Fermentation bis zu 5% betragen. Die erforderliche Fermentationszeit Ist u.a. abhängig von der Substratkonzentration und muß von Fall zu Fall ermittelt werden. Sie beträgt erfahrungsgemäß 30 bis 50 Stunden, bei einer Fermentationstemperatur von 28 bis 30°C.
Die Umsetzung kann leicht mit Hilfe von DC verfolgt werden. Mit Vorteil worden dabei Methylenchloridextrakte eingesetzt, mit Kioselgelplatton gearbeitet und als Laufmittel Chloroform/Methanol (7:3) vorwendet. Die Detektion kann durch Betrachten unter UV-Licht oder Besprühen mit methanollschor Schwefelsäure und anschließendem Erwärmen geschehen, Das Ausgatigsmatorial hat unter diesen Bedingungen einen R(-Wert um 0,8, die Zielsubstanz einen RrWert um 0,0.
Zur Isolierung und Reindarstollung wird die Kulturlösung nach beendeter Fermentation mit einem mit Wasser nicht oder nur begrenzt mischbarem Lösungsmittel erschöpfend extrahiert, wobei zur Erleichterung der Phasentrennung ggf. in Gogenwart. geringer Mengen eines Detorgons zugegeben werden muß. Zur Extraktion geeignet sind halogeniert Kohlenwasserstoffe, niedere Ester und Alkohole mit mehr als 4-C-Atomon, niedore Ketone und aromatische Kohlenwasserstoffe. Mit Vorteil wird jedoch Methylenchlorid verwendet, da sich mit diesem Extraktionsmittel drs Zielprodukt sehr selektiv abtrennen und sohr leicht in eine methanolische Lösung überführen läßt, aus der es dann bereits mit hoher Reinheit auskrlstallisiort. Durch nochmalige Umkristallisation aus Methanol kann 11ß,15ß-Dihydroxy-(20S)-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on in analysenroiner Form erhalten werden. Die Substanz ist durch folgende Eigenschaften charakterisiert: Aussehen: kleine weiße Nadnln F: 241 bis 2510C
Löslichkeit: leicht löslich; DMSO, DMF; löslich:MoOH, EtOH; wonig löslich in Chloroform, />ceton Analyse: C22H32O4 (360,22) ber. C = 73,30; H = 8,95% gef. C = 73,24; H = 8,75% MG (M+;m/e): 360,2276
IR-Maxima (cm"1): 3475 (OH). 3335 (OH), 1660 (C = 0), 1618 (C = C), 1605 (C = C) 'H-NMRIDMSO-ύβ: 1,11 ppm (d, J = 6Hz, 3H) 21-CH3 gegen HMDSaIs ext. Standard) 1,30ppm (s, 3H) 18-CH3
1,60ppm(8,3H)19-CH3
6,09 ppm (d, J = 2Hz,1 H) 4-OH
6,32 ppm (dd, J = 10Hz u. 2Hz, 1 H) 2-CH
7,52ppm(d,J = 1OHz,1H)1-CH
|a]20 D: +16° (MeOH, c= 1) 180g
Ausführiinysbelsplel 21g
2,25g
4,5 g
Eine sterile Nährlösung folgender Zusammensetzung 0,45 g
Maisquollwasser 0,45 g
Glukose 0,15g
Kaliumhydrogenphosphat 3,0 g
Magnesiumsulfat χ 7H2O 3000 ml
Eisen Il sulfat χ 7H2O
Manganchlorid χ 4H2O
Zinksulfat x 7H2O
Kaliumchlorid
Aquadest.ad
wird mit einer 3 Tage alten Kultur (Agrarschrägröhrchen 280C) von Cochliobulus lunatus 118 baimpft. Nach Beimpfen werden 3g (20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on, gelöst in 40ml Methanol, zugegeben und unter Rühren bei 29°C und einem Sauerstoffeintrag von ä40% Sättigung 48 Stunden fermentiert. Während der Fermentation wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 η Schwefelsäure auf 4,5 gehalten.
Nach beendeter Fermentation wird die Kulturlösung mit 750ml und 4mal mit je COOmI Mothylenchlorld extrahiert. Die Extiakte werden verewigt, mit wonig Wasser gewaschen, 20mg Aktivkohle zugegeben, 10 Minuten gekocht, filtriert und etwa 2400ml Methylenchic rid abdostilliert. Nun werden 750ml Methanol zugefügt und das Gemisch auf etwa 150ml eingeengt wobei sich Kristalle abzuscheiden beginnen. Zur Vervollständigung der Kristallisation wird das Konzentrat noch 2 Tage bei etwa 6°C aufbewahrt, ichließlich die Kristalle abgetrennt und mit wenig kaltem Mothylonchlorld gewaschen und getrocknet. Es werden 2,1 g 11ß,25ß-Oihydroxy-(20S)-20-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on erhalten.
Nach Vereiniget der Mutterlauge und Waschlauge und nochmaligem Einengen können weitere 0,75g der o.g. Verbindung isoliert werder.. Durch Umkristallisation aus Methanol .''arm eine weitere Reinigung erfolgen und ein analysenreines Produkt erhalten werden.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung i1ß,15ß-Dihydroxy-(20S)-20-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-un, dadurch gekennzeichnet, daß (20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on enzymatisch unter Zuleitung von steriler Luft in 11 β- und 15ß-Stellung hydroxyliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen vorzugsweise solche der Gattung Curvularia, Conhliobulus, Cunninghamella oder Bacillus megatherium eingesetzt werden.
3. Verfahrennach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat (20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on in wäßriger Suspension oder in einem organischen Lösungsmittel gelöst zugegeben wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anwendung einer wäßrigen Suspension, die Substanz in mikronisierter Form und in Gegenwart von nichtionogenen Emulgatoren zugegobon wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Zugabe des Substrates in Form einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel dieses in einem niederen Alkohol, vorzugsweise Methanol, in einem Keton, Glykolmonoether, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid gelöst wird.
6. Vorfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Formentationstemperatur vorzugsweise 28 bis 3O0C beträgt.
7. Vorfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratkonzentration während der Fermentation bis zu 5% betragen kann.
DD31058587A 1987-12-17 1987-12-17 Verfahren zur herstellung von 11beta, 15beta-dihydroxy-(20s)-20-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on DD266592A1 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1881066A1 (de) * 2006-07-21 2008-01-23 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Neuer zellulärer Biokatalysator zur 15ß-Hydroxylierung von Steroiden

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EP1881066A1 (de) * 2006-07-21 2008-01-23 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Neuer zellulärer Biokatalysator zur 15ß-Hydroxylierung von Steroiden

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