DD298277A5 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von prednisolon-17-acetat - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Prednisolon-17-Acetat und bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiellen Transformation von * der Pregnanreihe, die in 17 und 21-Stellung verestert oder nur in 17a-Stellung verestert sind, zu Prednisolon-17-acetat, d. h. zu 17a-Acetoxy-11b, * Diese mikrobielle Transformation stellt eine vorteilhafte Variante zur Gewinnung von Glucocorticoiden, speziell Prednisolon, dar. Prednisolon ist ein hochwirksames Arzneimittel zur Behandlung von Allergien, rheumatischer Arthritis, Asthma, Dermatosen u. a. Erfindungsgemaesz wird dem Mikroorganismus bei ausreichender Belueftung ab dem Zeitpunkt der hoechsten Produktbildungsrate bis zum Ende der Fermentation eine dem Verbrauch aequivalente Menge an Energie in Form von Kohlenhydraten, insbesondere Glucose, kontinuierlich zur Verfuegung gestellt. Der Beginn der Glucosedosierung erfolgt spaetestens, wenn der CO2-Gehalt der Abluft ein Minimum aufweist. Der cyanidempfindliche Atmungsweg der Zellen wird als Indikator einer oxidativen Stoffwechsellage zur Prozeszkontrolle genutzt, indem die Atmungsaktivitaet der Zellen in bekannter Weise polarographisch gemessen wird. Der pO2-Gehalt kann ab Beginn der Glucosedosierung 30% sein. Die Glucosedosierung erfolgt in Mengen von 30 bis 100 mg, bevorzugt 40 bis 50 mg Glucose/g Biomassetrockengewicht x h. Besonders geeignet sind die Staemme Cochliobolus lunatus 148, Absidia orchides 409 oder Absidia coerulu 468.{Prednisolonherstellung; Prednisolon-17-acetat; mikrobielle 11b-Hydroxylierung; veresterte * der Pregnanreihe; Cochliobolus lunatus 148; Absidia orchides 409; Absidia coerula 468; Energiezufuhr, kontinuierlich; Kohlenhydrate}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobellen Transformation von 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxosteroiden der Pregnanreihe,

die in 17 und 21 -Stellen verestert oder nur in 17α-Stellung verestert sind, zu Prednisolon-17-acetat, d. h. zu 17a-Acetoxy-11 ß,

21-dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion.

Die mikrobielle 11 ß-Hydroxylierung von 11 -Desoxy-1,4-dien-3-oxo-8teroiden stellt eine vorteilhafte Variante zur Gewinnung von Glucocorticoiden, speziell Prednisolon dar. Prednisolon ist ein hochwirksames Arzneimittel zur Behandlung von Allergien,

rheumatischer Arthritis, Asthma, Dermatosen u.a.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bekannt Ist, daß synthetische Clucocorticode, wie z. B. 11 ß, 17a, 21 -Trihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (Prednisolon), allgemein durch zwei mikrobielle Stufen, eine 11-Hydroxylierung und einer sich anschließenden 1-Dehydrierung, aus den entsprechenden 4-En-3-oxo-11-desoxysteroiden hergestellt werden (vgl. H.J.Rehm, G. Reed; Biotechnology, Verlag Chemie, Weinheim 1984, VoI 6a, chap. 2, S. 36).

11 ß-Hydroxylierungen der entsprechenden 1,4-Oienverbindungen sind aus der DE-OS 2901561 bekannt. Dieses Verfahren arbeitet mit dem 17a-21 -Orthoester eines 1,4-Dien-3-oxo-steroids, iäßt aber nur Umsätze von 0,5g Steroid/I Kulturlösung zu. Es werden zur 11 ß-Hydroxylierung geeignete Mikroorganismen wie Curvularia, Cunninghamella und Trichothecium verwendet. Es wurden auch mikrobielle Verfahren zur Herstellung der 11 ß, 17o, 21-Trihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion-Derivate (Prednisolon) sowie Prednisolon-17-acetat aus den zugehörigen 11 -Desoxy-Verbindungen vorgeschlagen, in denen die 11 ß-Hydroxylierung unter Einsatz von Pilzen der Gattungen Cöchliobolus bzw. Absidia und Zusatz eines Induktors realisiert wird

Nach einem dieser Verfahren erfolgt die 11 ß-Hydroxylierung in der Weise, daß die Biotransformation hauptsächlich am Ende der logarithmischen Wachstumsphase nach Eintritt der Glucose- und Stickstofflimitation stattfindet. Die Prozeßführung ist auf eine pH-Einstellung zwischen 5 bis 7 ausgerichtet, wobei Glucose oder Schwefelsäure zur pH-Stabilisierung verwendet werden. Bei Einsatz von Glucose wird ein Spiegel von 0,02 bis 0,04g/l angegeben. Für den O₂-abhängigen Hydroxylierungsprozeß wird ein pO₂ von mehr als 30% für erforderlich gehalten. Die Kultivierungszeit bis zum vollständigen Steroidumsatz von 2 bis 5g/l wird mit 52 bis 60 Stunden angegeben.

Diese Verfahren haben den Nachteil, daß in ihnen vollständige Steroidumsätze nur bei geringeren Substrateinsatzkonzentratior.en oder bei relativ langen Kultivierungszeiten erreichbar sind.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Raum-Zeit-Ausbeute der mikrowellen 11 ß-Hvdroxylierung veresterter 11-Desoxy-1,4-diensteroide der Pregnanreihe, die zum Prednisolon· 17-acetat führt, zu erhöhen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den mikrobiellen Prozeß der 11 ß-Hydroxylierung durch Verbesserung der Permeation des Steroids durch die Zellumhüllung zu fördern.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß dem Mikroorganismus bei ausreichender Belüftung zur Sicherung der o;.idativen Phosphorylierung?prozesse ab dem Zeitpunkt der höchsten Fortbildungsrate eine der zu diesem Zeitpunkt dem

Verbrauch äquivalente Menge an Energie in Form von Kohlenhydraten wie Glucose oder Saccharose, bevorzugt Glucose,

kontinuierlich bis zum Fermentationsende zur Verfügung gestellt wird.

Glucose wird in Mengen von 30 bis 100 mg/g Biomassetrockengewicht χ h (entsprechend 0,45 bis 1,5g Glucose/I), bevorzugt 40

bis 50mg/g Biomassetrockengewicht χ h (entsprechend 0,6 bis 0,75g Glucose/I) dosiert.

Der Beginn der Glucosedosierung muß spätestens dann erfolgen, wenn der CO₂-Gehalt der Abluft ein Minimum aufweist. Bei dem so geführten Hydroxylierungsprozeß wird der cyanid-empfindliche Atmungsweg der Zellen als Indikator einer

oxidativen Stoffwechssilage zur Prozeßkontrolle genutzt, indem die Atmungsaktivität der Zellen polarographisch gemessen wird. Die Messung erfolgt nach bekannten Methoden. Es zeigt sich, daß dieser oxidative Stoffwechselzustand auch bei pO_:-

Werten von <30% aufrechterhalten werden kann. Durch die .erfindungsgemäße Verfahrensweise werden eine Erhöhung des Steroidumsatzes und eine Verkürzung der Fermentationszeit erreicht. Es werden bis 5g Steroid/I Kulturlösung nahezu vollständig bei ca. 30stündiger Fermentationszeit

umgesetzt.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind speziell die Stämme Cochliobolus lunatus 148, Absidia

orchides 409 und Absidia coerula 468 geeignet.

Ausfül, rungsbelsplele Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden: Beispiel 1 Das Laborverfahren umfaßt folgende Stufen: Vorkultur 1, Vorkultur 2 und die Hauptkulturstufe, die durch die 11 ß-Hydroxylierung gekennzeichnet ist. Ein 500-ml-Rundkolben befüllt mit 200ml Vorkulturmedium 1 und mit 1,5ml einer Sporensuspension von Cochliobolus

lunatus 148 (ZIMET 43797) beimpft.

Das Vorkulturmedium 1 hat folgende Zusammensetzung: 3%Glucose,1% Maisquellwasser flüssig, 0,2% NaNO₃,0,1% KH₂PO₄,

0,2% K₂HPO₄,0,05% MgSO₄ χ 7H₂0,0,002% FeSO₄ x 7H₂0,0,05% KCI, Aqua dest.; pH-Wert 6,5-6,7; Sterilisation 20min bei 120⁰C. Die beimpfte Vorkultur wird 72 h bei einer Temperatur von 29 ± 1⁰C auf einem Fanal-Rundschüttler bei 240 U/min"' geschüttelt.

Die Vorkulturstufe 2 wird durch Beimpfung des VK 2-Mediums (1 % Glucos, 2% Maisquellwasser flüssig, 0,5% Maiskeimöl, Aqua

dest.; pH 6,5-6,7) mit 5% der Vorkulturstufe 1 erhalten. Sie wird 24 h geschüttelt (siehe VK1) und dient dann der Beimpfung der

Transformationskultur (Hauptkultur). Das Hauptkulturmedium hat folgende Zusammensetzung: 0,7% Glucose, 6% Maisquellwasser flüssig, 0,075% KH₂PO₄,0,15% MgSO₄ x 7H₂O,0,012%MnSO₄,0,005%ZnSO₄ x 7H₂0,0,1%CaCI₂,0,2%Maiskeimöl, Aqua dest.; pH4,5durch Einstellung mit

1 η NaOH; Sterilisation 30min bei 120°C. 2,71 des Hauptkulturmediums werden im 5-l-Laborfermenter (LF2) mit 0,9g Induktor:

(20S)-20-Hydroxymethyl-pregn-4-en-3-on (C₂₂-Akohol), gelöst in 8ml Methanol, versetzt. Zur Austreibung des Methanols wird ca. */2h bei 500 U/min gerührt. Die Belüftung während dieser Zeit liegt bei 1501 Luft/h.

Danach erfolgt de Zugabe von 300ml Inoculum (VK2), entsprechend 10% des Arbeitsvolumens des Fermentors. Während der gesamten Fermentation werden folgende Parameter eingehalten: Temperatur: 29 ±1 "C Belüftung: 0,33 wm Rührerdrehzahl: Startdrehzahl 400U/min Bei pO₂ < 30% stufenwoise Erhöhung der Drehzahl bis max. 800U/min. Danach kann der pO₂ auch

Werte < 30% annehmen

pH-Wert: pH 4,5 (Regelung durch Dosierung von 1N Schwefelsäure)

Zur 6., 9. und 12. Fermentationsstunde werden der Kulturlcsung jeweils 3g 1-Dehydro-RSS-i 7-acetat, gelöst in 10 ml Aceton,

zugegeben.

Während der Fermentation wird der Glucosespiegel mit Glucose-Teststreifen gemessen. Zur 11. Stunde ist Glucose mit dieser Methode nicht mehr nachweisbar und gleichzeitig zeigt der CO₂-Gehalt der Abluft ein Minimum. Es wird mit der kontinuierlichen Dosierung von 25 ml 6,6%iger Glucose/h begonnen. Die Kontrolle der Transformation erfolgt dünnschichtchromatogi aphisch. Nach 30stündiger Fermentation ist die Transformation

beendet -1 -Dehydro-RSS-17-acetat ist nicht mehr nachzuweisen.

Die Fermentation wird abgeschlossen, Fermentorablauf und Spülwasser werden der Aufarbeitung zugeführt. Es werden 95% der Theorie an Prednisolon-17-acetat in der Kulturlösung erhalten. Die Konzentration des Ausgangssteroids ist Beispiel 2 Die Untersuchung des zur Prozeßkontrolle als Indikator genutzten CN~-hemmbaren Atmungsweges wird in diesem Beispiel

erläutert.

Die Kultivierung des Pilzes Cochliobolus lunatus 148 (ZIMET 43797) wird entsprechend Beispiel 1 ausgeführt. Zur Transformation werden 4g/l Steroid eingesetzt, die Zugaben zum Hauptkulturmedium erfolgen zur 0., 6., 9. und 12. Stunde mit

jeweils 3g 1-Dehydrc üSS-17-acetat, gelöst in 10ml Aceton.

Zur Bestimmung des Anteils der CN~-hemmbaren Atmung werden während der Fermentation Proben der Kulturlösung

entnommen und die vom Kulturfiltrat abgetrennten und in Phosphat-Puffer (0,1 Md/I, pH 7) resuspendierten Zellen (10-20mg

Trockengewicht/eml) in einer geschlossenen pO₂-Meßzelle mit einer pO₂-Elektrode nach Clark vermessen. Nach Einstellung

einer konstanten Atmungsrate wird mit KCN gehemmt (Konzentration in der Meßzelle 2 mmol/l).

Die einzelnen Phasen dos Biotransformationsprozesses sind durch unterschiedliche) Atmungsraten gekennzeichnet.

Das erste Drittel der Fermentation wird durch einen Anstieg der respiratorischen Aktivitäten charakterisiert. Zur 12. Stunde erreicht die Atmungsrate einen Maximalwert von 2On mol 0₂/mg TG χ min. Dieser Wert bleibt über den durch hohe Transformationsleistungen gekennzeichneten Kultivierungszeitraum konstant, obwohl der pOj-Gehalt der Kulturlösung auf etwa 5% absinkt!

Beispiel 3 Die Anzucht des Pilzes Cochliobolus lunatus bis zur Vorkulturstufe 2 erfolgt entsprechend Beispiel 1. Der mit 2,71 Hauptkulturmedien (siehe Beispiel 1) befüllte Fermentor LF2 wird 0,5h vor Fermentationsbeginn mit 1,5g Induktor,

gelöst in 10ml Methanol und 3g i-Dehydro-RSS-17-acetat, gelöst in 10ml Aceton, versetzt. Zur Austreibung der Lösungsmittel wird Vih gerührt.

Zur Stunde 0 der Fermentation wird der Fermentor mit 300ml VK2 (siehe Beispiel 1) beimpft. Die Fermentationsbedingungan sind analog Beispiel 1. Die weitere Substratzugabe erfolgt zur 6., 8., 10. und 12. Formentationsstunde. Es werden jeweils 3g i-Dehydro-RSS-17-acetat/

10 ml Aceton dosiert.

Zur 12.h beginnt die kontinuierliche Glucosedosierung analog Beispiel 1. Die Fermentation sr nach 35h beendet, Fermentorablauf und Spülwasser werden der Aufarbeitung zugeführt. Die Ausbeute an Prednisolon^ 7-acetat in der Kulturlösung beträgt 91 % der Theorie.

Claims (6)

1. Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Prednisolon-17-acetat durch 11 ß-Hydroxylierung der veresterten 11-Desoxy-1,4-dien-steroide der Pregnanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß dem
Mikroorganismus bei ausreichender Belüftung a't dem Zeitpunkt der höchsten Produktbildungsrate eine dem Verbrauch äquivalente Menge an Energie in Form von Kohlenhydraten wie Glucose oder Saccharose kontinuierlich bis zum Ende der Fermentation zur Verfügung gestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenhydratquelle Glucose
eingesetzt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Beginn der
Glucosedosierung spätestens dann erfolgt, wenn der CO₂-Gehalt der Abluft ein Minimum aufweist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der cyanidempfindliche
Atmungsweg derZellen als Indikator füreinen oxidativen Stoffwechsel zur Prozeßkontrolle genutzt, indem die Atmungsaktivität der Zellen in bekannter Weise polarographisch gemessen wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucose kontinuierlich in Mengen von 30 bis 100mg Glucose/g Biomassetrockengewicht x h, bevorzugt 40 bis 50mg
Glucose/g Biomassetrocken "wicht χ h, zugegeben wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stämme Cöchliobolus lunatus 148, Absidia orchides 409 oder Absidia coerula 468 eingesetzt werden.