DD293726A5

DD293726A5 - Verfahren zur herstellung eines immunstimulierenden und -restaurativen arzneimittels

Info

Publication number: DD293726A5
Application number: DD34003590A
Authority: DD
Inventors: Siegfried Leistner; Karl Droessler; Guenther Wagner; Herwart Ambrosius; Dieter Lohmann; Guenther Laban
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden Gmbh,De
Priority date: 1990-04-24
Filing date: 1990-04-24
Publication date: 1991-09-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immunstimulierenden und -restaurativen Arzneimittels. Die Aufgabe wird geloest durch die Herstellung von * bzw. * und deren galenische Zubereitung.{immunstimulierende Wirkung; immunrestaurierende Wirkung; Arzneimittel; Chinazoline; Chinazolindione; Disulfane}

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit immunstimulierender und immunrestaurierender Wirkung, das neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen einen neuartigen Wirkstoff enthält.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In geringer Zahl sind bereits Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln mit immunstimulierender und/oder immunrestaurierender Wirkung bekannt, die einen niedermolekularen Wirkstoff enthalten. Als Arzneimittel werden derzeit vor allem Levamisol und Isoprinosin verwendet. Andere Wirkstoffe wie NPT 15392 (Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthin), Azimexon und Imuthiol weisen ebenfalls eine immunstimulierende und/oder immunrestaurierende Wirkung auf. Arzneimittel, die diese letztgenannten Wirkstoffe enthalten, sind jedoch noch nicht eingeführt.

Eine Standardisierung von bekannten und neuartigen Wirkstoffen, die im Sinne einer Stimulierung und/oder Restaurierung auf das Immunsystem wirken, ist derzeit nur schwer möglich. Das ergibt sich einmal aus der Komploxizität des Immunsystems mit seinen vielfältigen Regulations- und Gegenregulationsmechanismen und hängt zum anderen auch mit fehlenden, international verbindlich vereinbarten Versuchsbedingungen bei Laborieren bzw. ebensolchen Bedingungen für klinische Untersuchungen am Menschen zusammen. Ferner werden die eingangs erwähnten Wirkstoffe hinsichtlich ihres immunstimulierenden und/oder immunrestaurierenden Wirkungsmechanismuses weiterhin vertieft untersucht. Einer umfassenden Vergleichbarkeit immunstimulierend und/oder immunrestaurierend wirkender Verbindungen steht auch die unterschiedliche Beeinflussung der verschiedenen immunkompetenten Zellen durch die betreffenden Wirkstoffe entgegen, woraus sich eine nicht gleichartige Einflußnahme auf spezifische und unspezifische Abwehrmechanismen ergibt.

So wirkt z. B. Levamisol vorwiegend immunrestaurierend bei immunsupprimierten Organismen. Bei nur geringem Einfluß auf die humorale Immunantwort werden vorwiegend T-Zellen stimuliert. Eine Aktivierung unspezifischer Abwehrmechanismen ist durch Stimulierung der Phagozytose sowie der Proliferation und Bakterizidie von Makrophagen gegeben.

Isoprenosin dagegen zeigt vor allem eine immunstimulierende Wirkung u.a. durch Steigerung der humoralen Immunantwort.

Die Proliferation und Differenzierung der T-Lymphozyten werden ebenso gesteigert wie die über Lymphokin-Induktion vermittelte Makrophagenfunktion.

Trotz der erzielten Fortschritte auf dem Gebiet der Entwicklung von immunstimulierend und/oder immunrestaurierend wirkenden Substanzen weisen die wenigen bislang bekannten Verfahren zur Bereitstellung derartiger Arzneistoffe Nachteile auf.

So ruft das nur durch Diastereomerentrennung des racemischen Tetramisol erhältliche optische Isomer Levamisol nach oraler Applikation beim Menschen einen bitter-metallischen Geschmack hervor und kann u.a. zu Erbrechen, Nausea, Leukopenie und Agranylozytose führen. Weiterhin weist Levamisol eine bemerkenswerte Abhängigkeit in der Wirkung von genetischen Faktoren, Alter und Geschlecht der Patienten auf.

Das in relativ hohen Dosen zu verabreichende Isoprenosin (50mg/kg/d) kann zu Erbrechen, Hyperurikämie und Haematokritanstieg führen. Bei Azimexon werden Kopfschmerz, Erbrechen, Hb- und Erythrozyten-Abnahme als Nebenwirkung beobachtet.

Gründe für die genannten Nachteile sind in der Art dar bisher verwendeten Wirkstoffe zu suchen.

Ziel dar Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein neues Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch ⁱn Zubereitung bereitzustellen, die eine positive Regulation auf das normale (Immunstimulation) bzw. geschwächte Immunsystem (Immunrestauration) bewirkt und zu einer erhöhten spezifischen sowie unspezifischen Abwehrlage führt. Die nach dem vorzuschlagenden Verfahren herstellbaren Zubereitungen sollen oral wirksam sein und eine geringe Toxizität aufweisen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein Herstellungsverfahren für Arzneimittel mit immunstimulierender und immunrestaurierender Wirkung anzugeben, dessen Endprodukt eine pharmazeutische Zubereitungsform ist, die einen ausreichend resorbierbaren Wirkstoff enthält, der im Blut den erforderlichen Wirkstoffspiegel aufbaut.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß 4H-3,1-Benzothiazin-2,4(1H)-dithione der allgemeinen Formel V,

wobei Rj gleich oder verschieden sein kann und ein oder zwei Η-Atome und/oder andere Substituenten wie Alkoxy oder Halogen bedeuten, mit 2-Amino-ethan-1-ol bzw. 3-Amino-propan-1-ol in der Siedehitze in protischen oder aprotischen dipolaren organischen Lösungsmitteln auf prinzipiell bekannte Weise (vgl. S. Leistner und G.Wagner, Pharmazie 35 [1980] 124) zu den S-fco-Hydroxy-alkyDchinazolin^^dH.SHl-dithionen der allgemeinen Formel |\'

(CHJ_1nCH

wobei η 2 oder 3 sein kann und R_n die oben genannte Bedeutung besitzt, umgesetzt werden kann. Erfindungsgemäß werden die isolierten Verbindungen der allgemeinen Formel IV danach in wäßrig-alkanolischem (Ci-C₃) Reaktionsmilieu in Gegenwart einer Hilfsbase wie z. B. Alkalihydroxid oder Triethylamin mit den Alkylhalogeniden R²X, wobei R² niedrig Alkyl (C₁-C₃) und X Iod oder Brom bedeutet, bei Raumtemperatur zu den 2-Alkylthiochinazolin-4(3H)-thionen der allgemeinen Formel III,

IM

wobei Rn, R² und m die vorher genannten Bedeutungen haben, umgesetzt. Die ggfs. gereinigten und trockenen Verbindungen der allgemeinen Formel III werden anschließend in methanolischer oder ethanolischer Mineralsäure, vorzugsweise Salzsäure, ggfs. unter gelindem Erwärmen gelöst und 1-3d bei Raumtemperatur und weitere 24 h bei etwa 4°C im verschlossenen Gefäß zu den tricyclischen Chinazoliniumsalzen der allgemeinen Formel Il oder Tautomere davon,

wobei R_n und m die vorher genannten Bedeutungen haben und Y einem Säureanion entspricht, umgesetzt. Die mit aprotischen organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Diethylether gewaschenen und an der Luft getrockneten Verbindungen der allgemeinen Formel Il werden durch Eintragen in alkanolisch (C|-C₃)-wäßrige Natronlauge sowie nachfolgendes Filtrieren und Ansäuern des Filtrates mit verdünnten Mineralsäuren in die 3-(2-Mercapto-ethyl- bzw. 3-Mercapto-prop-1-yl)chinazolin-2,4(1 H,3H)- dione der allgemeinen Formel I und Tautomere davon,

wobei Rj und m die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, übergeführt. Die bei dieser Verfahrensweise gebildeten Umsetzungsprodukte der allgemeinen Formel I und Tautomere davon sind dünnschichtchromatographisch rein. Weitere Anteile an Verbindung der allgemeinen Formel I und Tautomere davon, die mit geringen Anteilen dps entsprechenden Bis/(2,4-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-chinazolin-3-yl)alkyl/disulfans der allgemeinen Formel Vl,

^vl

wobei Rn und m die oben genannten Bedeutungen besitzen, vermengt sind, lassen sich dadurch gewinnen, indem die nach der Abtrennung dertricyclischen Chinazoliniumsalze der allgemeinen Formel Il verbleibende Reaktionsmutterlauge unter schonenden Bedingungen zur Trockne gebracht und der gewonnene Rückstand in analoger Weise, wie die heterocyclischen Salze selbst, in die Verbindungen der allgemeinen Struktur I übergeführt wird.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Verbindungen der allgemeinen Formel I ausgehend von den Verbindungen der allgemeinen Formel III auch dadurch gewonnen werden, indem die vorher genannte Reaktionsfolge, jedoch unter Verzicht auf die Isolierung der Verbindungen der allgemeinen Formel II, beschritten wird.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindungsoll nachsteher, j an drei Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

3-(2-Morcapto-ethyl)chinazolin-2,4(1H,3H)-dion (I; Rj = H, m = 2)

1. 3-(2-Hydroxy-ethyl)-2-methylthio-chinazolin-4(3H)-thlon (III; Rj = H, R² = CH₃, m = 2)

2,4g (10 mMol) 3-(2-Hydroxy-ethyl)chinazolin-2,4(1 H,3H)-dithion (IV) werden in methanolischer Natronlauge (20ml) (0,5 N NaOH und 7ml CH3OH) gelöst, mit 1,6g Methyliodid versetzt und 30min im verschlossenen Gefäß bei Raumtemperatur intensiv mechanisch geschüttelt. Der gebildete Niederschlag wird mit wenig 50% Methanol gewaschen und nach dem Trocknen für die nachfolgende Reaktion verwendet. Gelbe Kristalle. C₁₁H₁₂N₂OS₂ (252,4). Schmp.: 117-118⁰C (CH₃OH). Ausbeute: 92%.

2. S-Oxo-^S-dihydro-eH-thiazololS.a-clchlnazolin^-lum-chlorldhydratdl; Rj = H,m = 2, Y = Cl)

505mg de reines Rohprodukt der nach 1. hergestellten Methylthioverbindung werden in 9ml methanolischer Salzsäure (30g HCI-Gas/200ml abs. CH₃OH) gelöst und im verschlossenen Gefäß zunächst 24 h bei Raumtemperatur und weitere 24 h bei -20°C aufbewahrt. Der gebildete Niederschlag wird mit abs. Diethylether gewaschen und im Vak.-Exsikk. (KOH/H₂SO₄) getrocknet. Es werden 240-380mg des Thiazolochinazoliniumchloridhydrates erhalten. Gelbe Kristalle. C₁₀H₃CIN₂OS H₂O 258,7). IR: CO-Bande bei 1740cm~'. MP: m/e 204 (Molekülionenpeak der zugrunde liegenden Base)

3. 3-(2-Mercapto-ethyl)chinozolin-2,4(1H,3H)-dlon (I; Rj = H, m = 2)

700mg des vorstehend erhaltenen Thiazolochinazoliniumchloridhydrates werden in ethanolischer Natronlauge (5ml 3H NaOH, 35ml H₂O und 20ml C₂H₅OH) unter Rühren gelöst. Nach etwa 15min wird die Reaktionslösung filtriert und zu dem farblosen Filtrat unter Rühren bis zur Beendigung der Niederschlagsbildung verd. Salzsäure zugefügt. Der gebildete Niederschlag wird gründlich mit H₂O gewaschen und im Vak.-Exsikkator (konz. H₂SO₄) getrocknet. Es werden 610 mg de reines (Fließmittel: Toluen/ Aceton/Methanol [7:3:1 v/v/v]) Finalprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C₁₀H₁₀N₂O₂S (222,2). Schmp. 192-193⁰C (CHCI₃/ Petrolether).

Ein weiterer Anteil an Finalprodukt, mit geringen Teilen Bis(2,4-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-chinazolin-3-yl)ethyl disulfan) (Vl; Rj = H, m = 2) verunreinigt, kann dadurch gewonnen werden, indem das nach Abtrennung des krist. Thiazolochinazoliniumchlorids erhaltene Filtrat bis zur Trockne eingeengt und der Rückstand in analoger Weise, wie unter 3. beschrieben, behandelt wird.

Beispiel 2

S-lS-Mercapto-prop-i-yll-e.T-dimethoxy-chlnazolin^llH.SHl-dion (I; Rj = 6-OCH₃,7-OCH₃; m = 3)

1. 6,7-Dimethoxy-2-thioxo-3,1-benzooxazln-4(1H)-on

12,5g (0,15 Mol) Thiophosgen werden als 10% Dioxan-Lösung zur Mischung aus 19,9g (0,1 MoM 2-Amino-4,5-dimethoxybenzoesäure, 200ml Dioxanund32g (0,3 Mol) Triethylamin unter Eiskühlen und Rühren zugetropft. Das Rühren wird 3h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Anschließend wird der Reaktionsansatz mit 1000 ml Wasser versetzt und mit verd. Salzsäure angesäuert. Der gebildete Niederschlag wird aus Dioxan/Wasser umkristallisiert. Gelbe Kristalle. C₁₀H₉NO₄S (239,2). Schmp. 211-213⁰C (Dioxan/Wasser). Ausbeute: 75%.

2. 6,7-Dimethoxy-3,1-benzothiazin-2,4(1H)-dithion (V; Rj = 6-OCH₃,7-OCH₃)

2,0g des nach 1. erhaltenen 3,1 -Benzoxazin-Derivates werden in der gerade ausreichenden Menge Pseudocumen heiß gelöst, mit 2,0g Phosphor(V)-sulfid versetzt und 20min rückfließenr¹ erhitzt. Nach Zugabe von weiteren 1,0g Phosphor(V)-sulfid wird weitere 15min am Rückflußkühler erhitzt. Die nocii heiße Pjaktionslösung wird filtriert. Nach 12stdi. Stehen wird der Niederschlag abgesaugt, mit wenig Methanol gewaschen und in 0,5 N Natronlauge gelöst. Danach Wird ohne Verzug die alkalische Lösung in überschüssige verd. Salzsäure filtriert und der gebildete Niederschlag mit Wasser gewaschen. Rote Kristalle. C₁₀H₉NO₂S₃ (271,4). Schmp. 247-249⁰C (Ethylacetat). Ausbeute: 60%.

3. 3-(3-Hydroxy-prop-1-yl)-6,7-dim8thoxy-chinazolin-2,4(1H,3H)-dithlon (IV; Rj = 6-OCH₃^-OCH₃; m = 3)

2,7g (1OmMoI) des nach 2. erhaltenen 3,1-Benzothiazin-Derivates werden zusammen mit 1,2g Triethylamin, 0,82g (11 mMol) 3-Amino-propan-1-ol und 12 ml Ethanol 2 h bei 60°C am Rückflußkühler erhitzt. Nachdem Erkalten wird mit verd. Salzsäure angesäuert, der Niederschlag nach 12h abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Gelborangefarbene Kristalle. C₁₃Hi₆N₂OsS₂ (312,4). Schmp. 239⁰C (Propan-2-ol). Ausbeute: 61 %.

4. Die weitere Umsetzung des nach 3. erhaltenen Dithions zum Finalprodukt erfolgt in analoger Weise wie bei Beispiel 1 unter bis 3. aufgeführt. S-tS-Hydroxy-prop-i-vD-ej-dimethoxy-a-methylthio-chlnazolin^OHl-thiondll; R,', = S-OCH₃,7-OCH₃; m = 3) Gelbe Kristall. C₁₄H₁₈N₂O₃S₂ (326,4). Schmp. 168-17O⁰C (Ethanol). Ausbeute; 76%.

S.IO-Dimethoxy-e-oxo-a^-dihydro^HJH-i.a-thiazinoia.Z-clchlnazolin-B-iumchloriddl; Rj = 6-OCH₃,7-OCH₃, m = 3; Y = Cl) Gelbliche Kristalle. C₁₃H₁₆CIN₂O₃S (314,8). IR: CO-Bande bei 1720cm"¹. Schmp. 197-198⁰C (nach Waschen mit Diethylether).

Ausbeute: 74%.

a-O-Mercapto-prop-i-yD-e^-dimethoxy-chlnazolin-a^dH.aHl-dion (I; Rj = 6-OCH₃, 7-OCH₃; m = 3) Farblose Kristalle. C₁₃H₁₆N₂O₄S (296,3) Schmp. 236⁰C (Methylglycol). IR: SH-Bande bei 2540cm"'; CO-Banden bei 1 695 und 1645cm"¹. Ausbeute: 81 %.

Beispiel 3

3-(2-Mercapto-Gthyl)-G,7-dimethoxy-chinazolin-2,4(1H,3H)-dion (I; Rj = 6-OCH₃; 7-OCH₃; m = 2) Farblose Kristalle. C₁₂H₁₄N₂O₄S (282,4). IR: SH-Bande bei 2520cm"¹; CO-Banden bei 1697 und 1645cm"¹. Schn.p. 312-314°C (Chloroform/Petrolether). Ausbeute: 84% (bezogen auf den letzten Syntheseschritt).

Die Darstellung dieser Verbindung erfolgte aus 6,7-Dimethoxy-3,1-benzothiazin-2,4(1H)-dithion und 2-Amino-ethan-1-ol analog Beispiel 2 bzw. 1. Dabei wurden folgende Zwischenstoffe isoliert und charakterisiert:

1. 3-(2-Hydroxy-ethyl)-6,7-dimethoxy-chinazolin-2,4(1H,3H)-dithion (IV; Rj = 6-OCH₃; 7-OCH₃; m = 2) Gelborangefarbene Kristalle. C₁₂H₁₄N₂O₃S₂ (298,4).

Schmp. 181-183⁰C (Dioxan/Wasser). Ausbeute: 92%.

2. 3-(2-Hydroxy-ethyl)-6,7-dimethoxy-2-methylthio-chinazolin-4-(3H)-thion(lll; Rj - 6-OCH₃,7-OCH₃; m = 2) Gelbe Kristalle. C₁₃H₁₆N₂O₃S₂ (312,4). Schmp. 187-188⁰C (Propan-2-ol). Ausbeute: 72%.

3. 8,9-Dimethoxy-5-oxo-2,3-dihydro-6H-thiazolo[3,2-c]chlnazolin-4-iumchlorid (II; Rj = 6-OCH₃^-OCH₃; m = 2; Y = Cl) Gelbliche Kristalle. C₁₂H₁₃CIN₂O₃S (300,8). IR: CO-Bande bei 1715cm"¹, Schmp. 201-205°C (nach Waschen mit Diethylester). Ausbeute: 67%.

Die nachfolgenden Beispiele beschrieben die Herstellung von zwei pharmazeutischen Anwendungsformen:

Beispiel I

Tabletten mit 45,0mg 3-(2-Mercapto-ethyl)china*olin-2,4(1H,3H)-dion Zusammensetzung:

1 Tablette enthält 45,0mg Wirkstoff, 35,0mg Lactose, 25,0mg Kartoffelstärke, 3,5mg Polyvinylpyrrolidon und 1,5mg Magnesiomstearat.

Herstellungsverfahren:

Der mit Kartoffelstärke und Lactose vermischte gepulverte Wirkstoff wird mit einer 20% ethanolischen Lösung des Polyvinylpyrrolidone gleichmäßig durchfeuchtet, durch ein Sieb der Maschenweite 1,5mm gedruckt, bei 4O⁰C getrocknet und erneut durch ein Sieb (Maschenweite 1,0mm) gepreßt. Das erhaltene Granulat wird mit Magnesiumstearat gemischt und zu Tabletten verpreßt.

Tablettengewicht: 110mg

Beispiel Il

Dragees mit 30,0mg 3-(2-Mercapto-ethyl)chinazolin-2,4(1H,3H)-dion Zusammensetzung:

1 Drageekern enthält: 30,0mg Wirkstoff, 30,0mg Lactose, 16,5mg Maisstärke, 2,8mg Polyvinylpyrolidon und 0,7mg Magnesiumstearat.

Herstellungsverfahren:

Die mit Lactose und Maisstärke vermischte pulverförmige Wirksubstanz wird mit einer 20% ethanolischen Lösung des Polyvinylpyrrolidone gleichmäßig durchfeuchtet, durch ein Sieb der Maschenweite 1,5mm gedruckt, bei 4O⁰C getrocknet und nochmals durch ein Sieb (Maschenweite 1,0mm) gepreßt.

Das erhaltene Granulat wird mit Magnesiumstearat gemischt und auf übliche Weise zu Drageekernen verpreßt.

Kerngewicht: 80,0mg

Die hergestellten Drageekerne werden nach üblichen Vorfahren mit einer Hütte überzogen und anschließend auf übliche Weise poliert.

Charakterisierung der immunstimulierenden und immunrestaurierenden Wirksamkeit von 3-(2-Mercapto-ethyl)chinazolin-2,4(1H,3H)-dion, von 3-(2-Mercapto-ethyl)-6,7-dlmethoxy-chinazolin-2,4(1H,3H)-dion und 3-(3-Mercapto-prop-1-yl)-6,7-dimethoxychinazolin-2,4(1H,3H)-dion Der Nachweis einer immunstimulierenden bzw. immunrestaurierenden Wirkung wurde an zwei Tierspezies (Maus: CBA-Inzuchtstamm und Meerschweinchen: Albino-Koloniezucht) und mit Hilfs folgender Techniken geführt:

1. Rosettentest

2. Plaquetest (direkte und indirekte Methode)

3. Perkutaner Test zum Nachweis einer Kontaktüberempfindlichkeit

4. Fußballschwellungstest

5. Nachweis histologischer Veränderungen im Lymphknoten

Beschreibung der Methoden

1. Rosettentest

Nach der BURNETschen Theorie tragen die l.ymphozyten auf ihrer Oberfläche Immunglobulin-Rezeptoren, die gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet unc* durch eine Reaktion mit dem spezifischen Antigen nachweisbar sind. Die Bestimmung der Anzahl an rosettonbildenden Zellen (RBZ) kann als Maß für die Stärke einer anlaufenden Immunreaktion dienen und folgend auch Effekte im Sinne einer Suppression oder Stimulierung zellproliferativer Prozesse wiedergeben.

1.1. SE-spezifische Rosetten

Drei Tage nach der intravenösen Immunisierung mit 2 χ 10⁵ Schaf erythrozyten in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung wurden die Versuchstiere durch Überstrecken getötet, die Milz entnommen und unter Zugabe von Parker-Medium (pH 7,4) durch Müller-Gaze gerieben. Die Arbeiten zur Gewinnung der Zellsuspension wurden im Eiswasserbad (ca. 0-4°C) durchgeführt. In einer Zählkammer nach Neubauer erfolgte die Bestimmung der Zelldichte und anschließend wurde die für alle Versuchsansätze konstante Zellzahl von 1 χ 10⁷ kernhaltige Zellen (KHZ)/ml Medium eingestellt. 0,9ml der hiilzzcllsuspension (1 χ 10⁷ KHZ/ml) wurden dann mit 0,1 ml einer 5%igen gewaschenen Schaferythrozytensuspension versetzt und 24h bei 4⁰C inkubiert. Als Rosette wurde gewertet, wenn eine KHZ von mindestens 4 Erythrozyten umgeben war und die kernhaltige Zelle zu identifizieren war.

1.2. THP-spezifische Rosetten

Für die Untersuchung der Zahl TNP-spezifischer Rosetten wurden die Versuchstiere am Tag 0 mit einer 1%igen TNP-Lösung sensibilisiert. Zu diesem Zweck wurden 25μΙ dieser Stammlösung hinter beide Ohren des Versuchstieres getropft. Am Tag 8 erfolgte die Untersuchung auf TNP-spezifische Rosetten.

Die Gewinnung der Milzzellsuspension und das Einstellen der Zellzahl auf 1 χ 10⁷ KHZ/ml wurde wie unter 1.1. beschrieben vorgenommen. Im Gegensatz zur Untersuchung SE-spezifischer Rosetten mußten in diesem Fall die Schaferythrozyten an TNP-Gruppen gekoppelt werden. Dazu wurden 8mg Na-Trinitrobenzensulfonat in 2,8ml Cacodylat-Puffer (pH 6,9) gelöst und zu 0,4ml SE-Sediment gegeben. Nach einer Reaktionszeit von 10min bei Zimmertemperatur erfolgte eine lOminütige Zentrifugation bei 60Ox g und dreimaliges Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung. Das damit erhaltene TNP-SE-Sediment wurde anschließend mit NaCI-Lösung verdünnt und als 5%ige Lösung für den Rosettentest (siehe 1.1.) verwendet.

2. Hämolyse-Plaque-Technik

Mittels dieser Methode ist es möglich, Antikörper-bildende Zellen zu erfassen. Zellen aus lymphoiden Organen eines mit SE immunisierten Versuchstieres geben während der Inkubation mit dem spezifischen Antigen (SE) Antikörper ab, die in die Umgebung diffundieren und sich an die SE der unmittelbaren Nähe heften. Nacr Komplementbindung und -aktivierung werden diese SE lysiert. Dadurch entstehen Hämolysehöfe (Plaques) mit einer zentralen Antikörper-bildenden Zelle.

Dieses direkte Vorgehen dient der Bestimmung der IgM-Antikörper-bildenden Zellen.

Die Fähigkeit zur Komplementaktivierung und Hämolyse ist bei den IgG-Antikörpern geringer, so daß deren Nachweis mit Hilfe der indirekten Methode der Plaque-Technik geführt werden muß. Hierboi wirkt nach der ersten Inkubation ein Antiserum gegen das IgG, und es entstehen durch diese Komplexbildung mit IgG ebenfalls Plaques nach Komplementzugabe. Die Zahl der IgG-bildenden Zellen ergibt sich dann als Differenz der mit der indirekten und der direkten Methode erhaltenen Werte.

Bei der gelfreien CUNNINGHAM-Technik befinden sich immunkompetente Lymphozyten, Erythrozyten und Komplement in einer geschlossenen Kammer. In flüssigem Kulturmedium bildet sich dabei eine Monolayer aus. Die für diese Methode benötigten Kammern wurden aus Objektträgern hergestellt, die mit Wasser gespült und in absolutem Alkohol gereinigt wurden.

Die gereinigten Objektträger wurden aneinandergelegt, durch ein doppelklebendes Band (Scotch Double Coated Tape No.410, Minnesota Mining and Manufactoring Co.) an den Enden und in der Mitte beklebt und durch eine zweite Reihe Objektträger exakt und mit festom Druck bedeckt. Durch Auseinanderbrechen entstehen Doppelkammern, die ein definiertes Volumen von 0,15ml enthalten.

Die Gewinnung der Milzzellensuspension erfolgte wie unter 1.1., allerdings wurde die Zellenzahl auf 2x 10₆KHZ 'ml eingestellt.

Der im Trypanblauausschluß-Verfahren ermittelte Anteil toter Zellen war nie größer als 10%.

Zur Kammerfüllung wurde pro Ansatz eine Mischung hergestellt, die für die

- direkte Technik: 0,3ml20%igesSe-Sediment

0,6ml Parker-Medium (pH7,4)

0,5 ml Komlement (1:10 verdünnt mit PBS)

- indirekte Technik: 0,3 ml 20%iges SE-Sediment

0,4 ml Parker-Medium (pH 7,4)

0,2 ml Kan-anti-Maus-lg-Serum (1:40 verdünnt in NaCI-Lösung)

0,5 ml Komplement (1:10 verdünnt mit PBS)

enthielt, wovon 0,4 ml mit 0,2 ml der Milzzellsuspension gemischt wurden. Anschließend wurden die Kammern gefüllt, mit erwärmtem Paraffinum solidum verschlossen und dann in einer feuchten Kammer für 45min bei 37°C inkubiert. Bei der mikroskopischen Auswertung wurde als Plaque gewertet, wenn ein eindeutiger Hämolysehof mit kernhaltiger Zentralzelle beobachtet werden konnte.

3. Perkutaner Test zum Nachweis einer Kontaktüberempfindlichkeit

Die epikutane Applikation von DNFB führt bei Meerschweinchen und Maus zur entwicklung einer verzögerten Überempfindlichkeit, eines Immunstatus, der an die klonale Vermehrung TNP-spezifischer t-Lymphozyten (T_DTH-Ly) gebunden ist. Erfolgt nach einer Latenzperiode von mindestens 5 Tagen eine erneute DNF-Applikation, kommt es zu einer Reaktion mit den ToTH-Ly dieses Hauptbereiches, einer Freisetzung von Lymphokinen und dadurcn zu einer lokal begrenzten Entzündungsreaktion.

Sieben Tage nach einer Immunisierung mit 1%igom DNFB wurden die Flanken der Versuchstiere enthaart und durch Aufbringen je eines Tropfens 0,5-, 0,1 -, 0,05-, 0,025- und 0,01 %iger DNFB-Lösung getestet. Die noch positive Konzentration ist dem Grad der Sensibilisierung umgekehrt proportional. Die Testergebnisse ergeben sich aus Stärke und Anzahl der positiven Hautreaktionun, der Stimuiationsindex (SI) aus dem Vergleich der Test- und Kontrolltiere.

4. Fiißballenschwellungstest

Dieser auch als „dslayed footpad reaction" (FPR) bezeichnete Test ist geeignet, eine Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ gegen ein partikuläres Antigen bei der Maus zu erfassen. Es handelt sich dabei um eine Forin der zeilvermittelten Immunität, für die ebenfalls sogenannte ToTirLy^mphozyten verantwortlich sind.

Der Test wurde nach einer Methode von TAMURA et. al. (1985) durchgeführt. Die Immunisierung der Mäuse erfolgte durch eine l.-v.-lnjektion von 2 x 10⁵ Schaferythrozyten, der Hauttest 4 Tage später durch eine Injektion von 5x 10⁷ SE in 25μΙ in den rechten hinteren Fußballen. Die sich entwickelnde Verdickung (Folge einer perivaskulären Infiltration mit mononukleären Zellen und einer Schwellung des Hautkollagens) wurde mit Hilfe eines Schnelliasters 24 h nach Antigen-Rekontakt gemessen. Die Intensität der Schwellung gilt als Maß für die Stärke der Immunreaktion.

5. Bestimmung von Lymphknotenveränderungen

Infolge epikutanor Sensibilisierung (Ohr) mit Dinitrofluorbenzen (DNFB) kommt es vor allem im parakortikalen Bereich des drainierenden aurikulären Lymphknotens -um verstärkten Auftreten pyroninophiler Immunoblaten, zum Anstieg lymphoproliferativer Prozesse sowie zur Vergrößerung des betreffenden Knotens. Diese Veränderungen wurden durch Auszählen der pyroninophilen Immunoblasten (pylB) an Schnitt- und Ausstrichpräparaten (lichtmikroskopisch). Bestimmung der Keimzentren im Gebiet der Kortex und Ermittlung des prozentualen Anstieges bzw. Abnahme der Lymphknotenmasse (LM %) erfaßt.

ι Uo, α Masse des Kontroilymphknotens ..„

LM % = 1 — : X 1UU

Masse des Testlymphknotens

Für die histologischen Untersuchungen wurden die Lymphknoten 30Min. in einer Lösung nach Carnoy fixiert, in absolutem Alkohol ausgewaschen, über drei Methylbenzoat- und Paraffinstufen in Paraffin eingebettet und 30 Min. mit Methylgrün-Pyronin gefärbt. Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch. Lufttrockene Ausstrichpräparate der Lymphknoten wurden 10 Min. fixiert (Carnoy), mit Alkohol und Aqua dest. kurz gespült und 40 Min. mittels Methylgrün-Pyronin gefärlit.

Ergebnisse der tierexperimenteüen Untersuchungen von 3-(2-Mercapto-ethyl)chinazolin-2,4(1 H,3H)-dion (= LSL-041)

1. Prüfung auf immunstimulierende Effekte

Substanzen, die beim Normaltier zu einer deutlich erhöhten und signifikant über der von Kontrolltieren liegenden Immunantwort führen, werden als Immunstimulantien bezeichnet. Substanzen, die eine schnellere Restauration eines geschädigten oder geschwächten Immunsystems bewirken, heißen Immunrestaurativa.

1.1. Dosis-Wirkungs-Beziehungen bei der Steigerung Plaquebildender Zellen (PBZ)

Versuchstier: CBA-Inzuchtstamm, Maus

Immunisierung: Intraperitoneale Injektion von 4x 10⁸ Schaferythrozyten (SE) in 0,2 ml phosphatgepufferter

Kochsalzlösung (PBS) Substanzapplikation: Tägliche und über 5 Tage gehende orale Gabe mittels Magensonde

Resultate:

tgl. Dosis LSL-041	Steigerung der PBZ im Vergleich zur Kontrolle (= 100 %)	IgG-PBZ
per kg Körpermasse	IgM-PBZ
0,4 mg	295%·	497%»*
2,0 mg	352%»·	300%·»
10,0 mg	179%	56%
100,0 mg	43%	(Erniedrigung)
	(Erniedrigung)

' Differenz zur Kontrolle mit ρ < 0,01 signifikant (t-Test)

'* Differenz zur Kontrolle mit ρ < 0,001 signifikant (t-Test).

Schlußfolgerung:

Eine über 5 Tage gehende tgl. Behandlung mit 2 mg LSL-041/kg Körpermasse verursacht bei der CBA-Maus eine hochsignifikante Steigerung SE-spezifischer IgM- und IgG-Plaque-bildender Zellen.

1.2. Einfluß der Substanz LSL-041 in der unter 1.1. ermittelten optimalen Dosis auf die Anzahl SE-spezifischer rosettenbildender Zellen (RBZ)

Versuchstier: CBA-Inzuchtmaus

Immunisierung: siehe 1.1.

Substanzapplikation: orale Gabe von je 2 mg LSL-041/kg Körpermasse an den Tagen-2,-1,0,+1 und+"·; Alle Angaben sind Mittelwerte. Sie repräsentieren 14 Einzelwerte (Doppelbestimmungen von minder'.dns 7 Versuchstieren).

Tag der Messung (nach Immunisierung)	RBZ/1000KHZ	Testgruppen
	Kontrollgruppen	5,3 ±1,1 19,7 ±3,8 59,7 ± 8,4 50,5 ± 7,4
-2 -3 -4 -5	4,2 ± 0,4 13,3 ±2,6 38,0 ± 4,7 39,4 ± 4,2

Die Steigerung ist am Tag +4 mit ρ < 0,01, am Tag +5 mit ρ < 0,05 signifikant (t-Test).

1.3. Einfluß einer einmaligen intraperitonealen Gabe von LSL-041/PBS-Suspension auf die SE-spezifischen RBZ

Versuchstier: CBA-Inzuchtmaus

Immunisierung: siehe 1.1.

Substanzapplikation: einmalige I.-p.-Injektion von LSL-041 von 0,5 mg, 5,0mg oder 25 mg pro kg Körpermasse am Tag nach

der Immunisierung, die Messung erfolgte am Tag +3 Alle Angaben sind Mittelwerte aus 2 getrennt durchgeh' hrten Experimenten mit jeweils 5 Tieren pro Gruppe.

LSL-041-Dosis	RBZ/1000KHZamTag	+3
	Kontrollgruppen	Testgruppen
0,5 mg 5,0 mg 25,0 mg	29,5 ±3,4 20,5 ± 3,2 18,8 + 2,0	24,6 ± 4,2 33,8 ± 6,3 37,8 ± 4,0

Die Steigerung ist nach 5mg mit ρ < 0,05 und nach 25,0mg mit ρ < 0,005 signifikant (t-Test).

1.4. Einfluß von LSL-041 auf die zeilvermittelte Immunität

1.4.1. Versuchstier: BALB/c-lnzuchtmaus Wachweismethode: Kontaktdermatitis Substanzbehandlung: siehe 1.2

Resultate:

Positive Hautreaktion nach Rekontakt auf 0,1%iges und bei 3 von 12 Tieren noch auf 0,05%iges DNFB bei der Versuchsgruppe (12 Tiere) mit LSB-041-Behandlung.

Die Kontrolltiere reagierten durchgängig auf 0,5%iges und 6 von ihnen auf 0,25%iges DNFB. Mit 0,1%igem DNFB konnte bei keiner der 12 Kontrollmäuse eine Hautreaktion provoziert werden.

1.4.2. Versuchstier: Albino-Meerschweinchen Nachweismethode: siehe 1.4.1

Substanzbehandlung: siehe 1.2.

Resultate:

Die experimentellen Befunde entsprechen denen unter 1.4.1. Die Behandlung mit LSL-041 führte zu einer meßbaren und gegenüber den Kontrollen signifikant erhöhten Sensibilisierung.

1.5. Einfluß von LSL-041 auf DNFB-induzierte Veränderungen des aurikulären Lymphknotens

Versuchstier: Albino-Meerschweinchen

1.5.1. Massenzunahme des Lymphknotens (LM%)

Infolge einer epikutanen Sensibilisierung mit DNFB (20μΙ einer 10%igen DNFB-Lösung) stieg die Masse des aurikulären Lymphknotens an, erreichte am 4.Tag das Maximum (LM% = 23 + 15), fiel danach wieder ab und war nach 7 Tagen nicht mehr signifikant (Vgl. zur Kontrolle) vergrößert. Eine orale Behandlung mit je 2 mg LSL-041 (als Laktoseverreibung) pro Tag und an den Tagen -2 bis +5 verursachte eine Zunahme von LM-% = 32 ± 9 am 4.Tag und zu einer verzögerten Abnahme. Die Differenzen erwiesen sich aber nicht als signifikant (t-Test nach Student).

Bei einmaliger Injektion von 0,4mg LSL-041, suspendiert in 0,1 ml PBS, in das DNFB-sensibilisierte Ohr (am Tag 0) konnte am Tag 4 für LM-% ein Wert von 46 ± 4 und damit zu einer LSL-041-bedingten signifikanten (p < 0,001) Massenzunahme um 100% erreicht werden.

Zum Vergleich wurde Isoprinosin eingesetzt, aber in einer zweieinhalb höheren Dosis von 1 mg. Der LM-% lag mit 23 auf einer Ebene mit den DNFB-Kontrollen.

1.5.2. Einfluß der unter 1.5.1. beschriebenen Behandlung auf die Zunahme pyroninophiler Immunoblasten (PyIB) Durch Bestimmung der pylB (ausgezählt wurden 1000 Lymphknotenlymphozyten) an den Tagen +1 bis +6 nach Sensibilisierung konnte das Maximum mit 134 ± 14 am Tag 4 ermittelt werden. Die orale G.ibe von LSL-041 verursachte nur eine geringe und nicht signifikante Erhöhung der pylB auf 155 ± 22. Das intradermal applizierto LSB-041 (0,4 mg) führte zu einer signifikanten (p < 0,001) Steigerung der pylB auf 180 ± 9. Mit Isopronosin konnte keine Stimulierung erreicht werden. Anhand von Schnittpräparaten konnte gezeigt werden, daß die Blastentransformationen nach DNFB-Sensibilisierung bevorzugt im parakortikalen, d.h. im Thymusabhängigen Bereich des Lymphknotens ablaufen.

2. Prüfung auf immunrestaurative Effekte

2.1. Schädigung des Immunsystems durch Zyklophosphamid (ZY)

2.1.1. Prüfung des restaurativen Effekts von LSL-041 anhand SE-spezifischer rosettenbildender Zellen

Versuchstier: Nachweismethode: Schädigung: Immunisierung: Substanzbehand!ung: Resultate:	34,8 + 1,1 33,4 ± 3,1 22,0 ±2,1	Kontrolle!! (nur ZY, kein LSL-041)	Test (ZY+ LSL-041)
CBA-Inzuchtmaus Rosettentest Durch Injektion von 150mg ZY/kg Körpergewicht am Tag vor der Immunisierung (-Ί) siehe1.1. ; siehe 1.2.	16,5 ±3,3 14,0 ±0,9 15,7 ±2,9	7,1 ±0,2 39,2 ±1,3 31,7 ±2,2
Tag der Testung Kontrolle I (kein ZY, kein LSL-041
+3 +4 +5

Die Suppression durch ZY ist an allen Tagen mit mindestens ρ < 0,005 signifikant; die Restauration an den Tagen +4 und +5 mit ρ < 0,0005 hochsignifikant.

2.1.2. Prüfung des restaurativen Effekts von LSL-041 anhand SE-spezifischer PBZ

Versuchstier: Nachweismethode: Schädigung: Immunisierung: Substanzbehandlung: Resultate (IgM-PBZ):

CBA-Inzuchtmaus

Plaque-Test zum Nachweis von SE-spezifischen IgM- und IgG-PBZ

siehe 2.1.1.

siehe2.1.1.

TagderTestung	lgM-PBZ/10⁶ Milzzellen	Test (ZY+LSL-041)
	Kontrolle (nur ZY, kein LSL-041)	31,7 + 26,6 59,8 ± 26,6 125,2 ±32,7 47,8 ±31,2
+3 +4 +5 +6	37,5 ± 27,1 49,7 ± 32,9 56,8 ± 27,6 74,7 ± 73,4

Unter dem Einfluß von LSL-041 kommt es zu einer meßbaren Erholung der immunologischen Reaktivität, die am Tag +5 mit ρ < 0,05 signifikant ist.

Resultate (IgQ-PBZ):

TagderTestung	Kontrolle (nurZY, kein LSL	lgG-PBZ/10" Milzzellen	Test (ZY+ LSL-041)
	26,7 ±12,1 46,7 ±16,3 63,3 ± 24,2	-041)	88,3 ± 24,8 128,3 ±28,6 58,3 ±43,6
+6 +7 +8

LSL-041 steigerte die Anzahl von IgG-PBZ bei ZY-supprimierten Versuchstieren an den Tagen +6 und +7 signifikant (p < 0,05 bzw. ρ <0,01).

2.2. Schädigung des Immunsystems durch Bestrahlung

Die Versuchstiere - es handelte sich bei diesen Experimenten immer um Mäuse des CBA-Inzuchtstammes - erhielten eine einmalige Ganzkörperbestrahlung (mittels Kobalt-60-Therapiegerät Gammatron 3) (von Siemens) von 5Grey (5Gy).

2.2.1. Prüfung des restaurativen Effekts von LSL-041 anhand SP-spezifischer IgM- und IgG-PBZ Die Immunisierung der Tiere erfolgte 14 Tage nach der Bestrahlung durch intravenöse Injektion von 0,2 ml einer 10%igen SE-Suspension. Die orale Gabe von tgl. 2 mg LSL-041 als Suspension in PBS erstreckte sich über die Tage -2 bis +2 (SE-Gabe am TagO) beim direkten und über die Tage+1 bis +5 beim indirekten Plaque-Test.

Resultate (IgM-PBZ):

Tag der Testung	lgM-PBZ/10^e	^; Milzzellen	Test (Bestrahlung+ LSL-041)
	Kontrolle (nur Bestrahlung, kein LSL-041)	66,7 + 41,6 68,6 + 34,8 1 185,0 ±190,0 455,7 ±161,1
+3 +4 +5 +6	55,0 ±19,7 105,9 + 73,7 114,5 ±68,7 276,7 ±158,3

Der restaurative Effekt wird am 5.Tag deutlich. Die Differenz zur nur bestrahlten Kontrolle ist mit ρ < 0,001 signifikant. Resultate (IgB-PBZ):

TagderTestung	Kontrolle	lgB-PBZ/10⁶ Milzzellen	Test
	430,0 ±102,0 130,0 ±62,0 320,0 ±34,6 210,0 ±120,0	395,0 ±144,3 472,5+153,5 760,0 + 226,5 150,0 + 120,0
+5 +6 +7 +8

Die Differenz zwischen Test und Kontrolle ist an den Tagen +6 und +7 signifikant, ein restaurativer Effekt damit nachgewiesen.

2.2.2. Prüfung des restaurativen Effekts von LSL-041 auf die zellvermittelte Immunität (SE-spezifische DTH) Die Immunisierung derTiere erfolgte 14 Tage nach der Bestrahlung (5Gy) durch intravenöse Injektion von 5 χ 10⁵ SE in 0,2ml PBS, dieAuslösung der lokalen Reaktion durch Injektion von 5 χ 10⁷SE in 25μΙ PBS in einen der hinteren Fußballen; Bestimmung der Dickenzunahme nach 24 und 48 Stunden.

Resultate:

Bei nur immunisierten Tieren kann 24 Stunden nach Rekontakt eine Verdickung des Fußballens um durchschnittlich 20% beobachtet werden. Sie geht schnell zurück und ist nach 48 Stunden nicht mehr meßbar. Die Bestrahlung unterdrückt die Ausbildung einer solchen DTH um etwa 50% (signifikant).

Durch eine Behandlung mit LSL-041 (2mg tgl. vom Tag -2 bis Tag +2) konnte die Suppression nicht aufgehoben werden. Allerdings wurde der schnelle Rückgang verhindert. Die Verdickung war auch nach 48 Stunden in gleicher Stärke vorhanden und damit zu diesem Zeitpunkt signifikant über der der Kontrolltiere.

3. Untersuchungen zum Wirkmechanismus

Proliferations- und Maturationsprozesse immunkompetenter Effektorlymphozyten sind von regulatorischen T-Lymphozyten (Th) und deren Sekretionsprodukten-den Interleukinen IL-2, IL-4und IL-5-abhängig. Durch Thymektomie, Bestrahlung und anschließender Rekonstruktion dieser Tiere mit Knochenmarkzellen syngener Mäuse kann der Einfluß von T_H-Lymphozyten teilweise, durch neonatale Thymektomie nahezu vollständig ausgeschaltet werden.

5 Wochen nach operativer Entfernung der Thymusdrüse wurden die Tiere mit SE immunisiert und mittels Plaque-Technik, wie vorhergehend beschrieben, getestet.

Resultate:

Tabelle 1

Einfluß einer über E Tage gehenden oralen Behandlung mit LSL-041 (jeweils 2 mg/kg Körpermasse) auf die Bildung von SE-spezifischen IgM-PBZ bei adult thymektomierten CBA-Mäusen

Kontrolle Normaltiere (5) 307+ 88 PBZ/10⁶ KHZ

nicht behandelt

Einflußder thymektomierteTiere(5), 150+ 49 PBZ/10⁶ KHZ

Thymektomie nicht behandelt

Einflußder thymektomierteTiere(5), 229 + 32PBZ/10⁶KHZ

Behandlung LSL-041 behandelt

Die Thymektomie bei adult«, ι Tieren führte zu einer signifikanten (p < 0,05) Suppression der PBZ. Durch die LSL-041 -Beh Jndlung konnte diese weitgehend und signifikant (p < 0,005) restauriert werden.

Tabelle 2

Wie Tabelle 1, aber Bestimmung der IgG-PBZ

Kontrolle Normaltiere (5) 856 + 61PBZ/10⁶KHZ

nicht behandelt

Einflußder thymektomierteTiere(5), 209 ±43 PBZ/10⁶ KHZ

Thymektomie nicht behandelt

Einflußder thymektomierteTiere(5), 301 ± 32PBZZIO^1--KHZ

Behandlung mit LSL-041 behandelt

Die thymektomiebedingte Suppression war mit ρ < 0,001, der restaurative Effekt mit ρ < 0,01 signifikant.

Die nach gleichem Versuchsprotokoll an neonatal thymektomierten CBA-Mäuson durchgeführten E;'porimonto ergaben eine Suppression der IgM-PBZ auf 186 ± 102 PBZ/10⁰KHZ (Kontrollen 1131 + 172) und einen mir geringfügigen, nicht signifikanten Behandlungseffekt. Die Werte lagen bei 237 ± 74PBZ/10⁹KHZ.

Die Anzahl der IgG-sezernierenden Zellen war auf 107 + 72PBZ/10⁶ KHZ (Kontrollen 520 ± 134) vermindert und durch di« Behandlung mit LSL-041 auf 186 + 71 PBZ/10⁶ KHZ angehoben. Auch diese Differenz erwies sich nicht als signifikant.

4. Zusammenfassende Wertung

Anhand der vorgelegten tierexperimentellen Daten dürfte als erwiesen gelten, daß die Verbindung LSL-041 einen fördernden Einfluß auf immunproliferative Vorgänge ausübt. Sowohl die zur Antikörperproduktion befähigten B-Lymphozyten als auch dir für die Ausprägung einer verzögerten Überempfindlichkeit (zellvermittelte Immunität) verantwortlichen ToTirLymphozyten werden stimuliert.

Die an thymektomierten Tieren gewonnenen Versuchsergebnisse sprechen eindeutig für eine starke Beteiligung regulatorisch wirksamer T-Lymphozyten.

Ergebnisse der tierexporlmentellen Untersuchungen von 3-(2-Mercapto-ethyl)-6,7-diniethoxy-chinazolln-2,4( IH,3H)-dion

(=LRS-220)und3-(3-Mercapto-prop-1-yl)-6,7-dimethoxy-chinazolin-2,4(1H,3H)-dion(=LRS-268) Mit diesen Substanzen der allgemeinen Formel I wurden bislang folgerdc Ergebnisse erzielt:

1. Einfluß auf die zellvermittelte Immunität

1.1. DNFB-Kontaktdermatitis (Meerschweinchen)

Beide Substanzen führten zu einer der Verbindung LSL-041 entsprechenden Sensibilisierung und Reaktion. Der Stimulierungseffekt war als Differenz zur Kontrolle mit ρ < 0,05 signifikant (t-Test).

1.2. Fußballenschwellungstest(Maus)

Wie bei der Verbindung LSL-041 kam es zu keiner Steigerung der 24-h-Reaktion, aber zu einer Verlängerung der Zellinduration und einer gegenüber den Kontrollen signifikant stärkenden 48-h-Reaktion.

2. Rosettentest

2.1. DNP-spezifische Rosetten

Die Behandlung mit LRS-220 bzw. LRS-268 verursachte eine signifikante (p < 0,05) Steigerung der DNP-spezifischen RBZ.

2.2. SE-spezifische Rosetten

In diesem Test bewirkte die Substanz LRS-268 einen signifikanten (p < 0,05) Stimulationseffekt. Die Substanz LRS-220 erwies sich diesbezüglich als wirkungslos.

3. Immunrestauration

Am Modell der strahlengerchädigten Maus konnte keine Wirkung hinsichtlich einer beschleunigten Wiederherstellung der humoralen Reaktivität gemessen werden. Weder die IgM- noch die IgG-Antwort unterschieden sich von derjenigen der unbehandelten Kontrollen.

Der Fußballenschwellungstest (zellvermittelte Immunreaktion) erbrachte in bezug auf die Substanz LSL-041 vergleichbare Werte.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Verbindungen LRS-220 und LRS-268 im Unterschied zur Substanz LSL-041 eine bevorzugte Wirkung auf das zellvermittelte Immunsystem haben. Effekte auf die humorale Komponente eines normalen Imrnunsystems wurden nicht geprüft.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines immunstimulierenden und -restaurativen Arzneimittels über die Stufen der Synthese der Wirkstoffe und deren Vermischung mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß
ein3-(iu-Hydroxyalkyl)chinazolin-2,4-(1H,3H)-dithion der allgemeinen Formel IV

H
n"~^^>^r (CH)OH

wobei Rn gleich oder verschieden sein können und ein oder zwei Η-Atome und/oder andere Substituenten wie Alkoxy oder Halogen bedeuten und m = 2 oder 3 betragen kann, mit einem Alkylhalogenid R²X, wobei R² niedrig Alkyl und X Jod oder Brom bedeutet, zu Verbindungen der allgemeinen Formel III umgesetzt werden

-(CH₂)_m-OH "I

und diese ggfs. gereinigten, trockenen Verbindungen in alkanolischen Mineralsäuren in die tricyclischen Chinazoliniumsalze der allgemeinen Formel Il und Tautomere davon

wobei Y einem Säureanion entspricht, übergeführt werden und diese Salze durch Eintragen in alkanolisch-wäßrige Natronlauge sowie nachfolgendes Filtrieren und Ansäuern des Filtrates mit verdünnten Mineralsäuren zu den S-iou-MercaptoalkyDchinazolin^^ClH.SHj-dionen der allgemeinen Formel I und Tautomere davon umgesetzt werden

- (CH₂)_m-SH
0

und die erhaltenen und ggfs. gereinigten Verbindungen in an sich bekannter Weise in eine pharmazeutisch anwendbare Form übergeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I für η = steht:

R¹ = H oder 6-OCH₃ oder 7-OCH₃ oder 6-Br oder 7-Br.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I für η = steht:

R¹ = 6-OCH₃ und 7-OCH₃oder
6-OCH₃ und 7-Br oder
6-Br und 7-OCH₃ oder
6-Br und 7-Br.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß für die Herstellung der Chinazoliniumsalze der allgemeinen Formel Il vorzugsweise methanolische oder ethanolische Salzsäure verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Herstellung der 2-Alkylthiochinazoline der allgemeinen Formel III vorzugsweise Methyljodid in methanolischer Lösung in Gegenwart von einem Äquivalent Natriumhydroxid verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Isolierung der Chinazoliniumsalze der allgemeinen Formel Il verzichtet wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung