DD296686A5 - Salze von n[exp5],n[exp10]-methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsaeure - Google Patents

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DD296686A5
DD296686A5 DD34292190A DD34292190A DD296686A5 DD 296686 A5 DD296686 A5 DD 296686A5 DD 34292190 A DD34292190 A DD 34292190A DD 34292190 A DD34292190 A DD 34292190A DD 296686 A5 DD296686 A5 DD 296686A5
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DD
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salt
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tetrahydrofolic acid
methylene
salts
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DD34292190A
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Fabrizio Marazza
Attilio Melera
Rene Viterbo
Nando Toderi
Original Assignee
Markus Zink,Ch
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/14Ortho-condensed systems

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Abstract

Es werden Salze von * der Formeln I a und I b in Form des (6RS)-Diastereoisomerengemisches oder in Form der einzelnen (6R) oder (6S) Diastereoisomeren beschrieben. Die Substituenten sind in Anspruch 1 definiert. Es werden auch drei Verfahren zur Herstellung dieser Salze beschrieben. Die genannten Salze der Formeln I a und I b koennen zur Herstellung eines Arzneimittels fuer die synergistische Beeinflussung einer Krebs bekaempfenden Verbindung und/oder fuer die Verminderung der Toxizitaet einer Krebs bekaempfenden Verbindung und/oder zum Schutz menschlicher und/oder tierischer Zellen verwendet werden. Formeln I a und I b{* * Alkalimetallsalze; Erdalkalimetallsalze; Ammoniumsalze; Alkylammoniumsalze; Herstellungsverfahren; Krebstherapie; Schutz menschlicher Zellen; Schutz tierischer Zellen}

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Salze von N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels für die synergistische Beeinflussung einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder für die Verminderung der Toxizität einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder zum Schutz menschlicher und/oder tierischer Zellen.
Hintergrund der Erfindung
N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel Il (abgekürzt mit CH2-THF) ist die chemische Spezies, welche als Co-Faktor bei der Inhibierung des Enzyms Thymidilatsynthese (abgekürzt mit TS) mit 5-Fluorouracil (abgekürzt mit 5-FU) und/ oder einer der Vorstufen (prodrug), wie etwa Floxuridine, Tegafur, wirkt. 5-FU oder eine der Vorstufen werden metabolisch in
5F-Desoxyuridinemonophosphat (abgekürzt mit 5F-dUMP) transformiert, welches kovalent und irreversibel an TS in der Gegenwart von CH2-THF gebunden ist, wobei ein ternärer Komplex gebildet wird, welcher als 5F-dUMP/TS/CH2-THF beschrieben wird.
5-FU und seine Vorstufen werden in großem Maß verwendet als chemotherapeutisches Mittel bei der Behandlung von Kolon, rektalem und pankreatischem Karzinom, wie auch bei weiteren Formen von Krebs, wie etwa Brustkrebs und Magenkrebs. Um die Cytotoxizität für die Tumorzellen zu erhöhen, muß die höchste Inhibitionsrate von TS erreicht werden. Dies erfordert eine geeignete Versorgung jener Zellen mit 5-FU (oder eine seiner Vorstufen) und mit dem Co-Faktor CH2-THF. Währenddem 5-FU (oder seine Vorstufen) exogene Verbindungen sind, welche einem Patienten in jeder gewünschten Menge verabreicht werden können, hat CH2-THF normalerweise seinen Ursprung in der endogenen Folat-Zusammenlegung via eine Anzahl von metabolischen Umwandlungen. Jedoch kann die auf diesem Weg gebildete Menge an CH2-THF nicht genügend sein für eine effiziente und komplette Inhibierung von TS.
Es hat sich daher zur Gewohnheit entwickelt, klinische Behandlungsprotokolle zu verwenden, in welchen Calcium-folinat (abgekürzt mit CaF), ein metabolischer Vorläufer von CH2-THF, in hohen Dosen zusammen mit 5-FU einem Patienten zur Verfügung gestellt werden. Siehe R. J. DeLap, The YaIe Journal of Biology and Medicine, 61,23 (1988). Diese hohen Dosen an CaF resultieren in Nebeneffekten, wie etwa Diarrhöe und Stomatitis; siehe G. Marini et al. Oncology 44,336 (1987). Die Versorgung eines Patienten mit adäquaten Mengen an CH2-THF, d.h. die den ternären Komplex bildende Species selbst, konnte bis jetzt nicht erreicht werden, weil kein großtechnisches Verfahren zur Herstellung einer genügend reinen, gut wasserlöslichen und stabilen Verbindung zur Verfügung stand.
Stand der Technik
Die Herstellung in kleinem Maßstab von CH2-THF als freie Säure ist von verschiedenen Autoren beschrieben worden; siehe R.LBIakley, Biochem. Journal,72,707 (1959); M.J.Osborn, P.T.Talbert, F.M.Huennekens, J. Am. Chem.Soc. 82,4921 (1960); R.G.Kallen,W.P.Jenks,J.Biol.Chem.241,5851(1966);P.R.Farina,LJ.Farina,S.J.Benkovic,J.Am.Chem.Soc.95,5409(1973);
R. P. Leary, Y. Gaumont, R. L. Kisliuk, Biochem. Biophys. Res. Comm. 56,484 (1974); R. L.Kisliuk, D.Strumpf, Y. Gaumont, R.P.Leary, L.Palnte,J. Med. Chem.20,1531 (1977); M.Poe, L.M.Jackman,S.T.Benkovic, Biochemistry 18,5527(1979) und
R. Kalbermatten, W. Staedeli, J. H. Bieri, M. Viscontini, HeIv. Chim. Acta 64,2627 (1981).
C.Zarow, A. M.Pellino, P.V.Daneberg, Prep. Biochem. 12,281 (1983) beschreiben ein Herstellungsverfahren „in großem Maßstab", welches eine enzymatische Reduktionsstufe umfaßt.
In allen Fällen konnte jedoch das Produkt nicht anders isoliert werden als in lyophilisierter Form oder als ein amorphes Pulver (siehe C. M.Tatum Jr., P.A.Benkovic, S.T.Benkovic, R.Potts, Biochemistry 16,1903 [1977]) und in einer Reinheit von nicht höher als 80%, was diese Produkte unbrauchbar für die therapeutische Verwendung bei Menschen macht.
Zwei Syntheseverfahren sind beschrieben worden, um CH2-THF als freie Säure zu erhalten.
Erstes Verfahren 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure der Formel IV
COOH
(IV)
CooH
wird mit einem Überschuß an Formaldehyd in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7 umgesetzt. Siehe dazu M. Poe, L.J.Jackman, S.T.Benkovic, Biochemistry 18,5527(1979); R.Kalbermatten, W.Staedeli, J.H. Bieri, M.Viscontini, HeIv. Chim. Acta 64,2627 (1981); C.Zarow, A. M. Pellino, P. V. Danenberg, Prep. Biochem. 12,381 (1983). Dieses Verfahren ist nur geeignet für die Herstellung von Milligramm-Mengen an freier Säure der Formel Il
COOH
COOH
und führt, wegen der inhärenten Instabilität von CH2-THF in wäßriger Lösung mit pH 7, zu einem Produkt mit geringer Reinheit (weniger als 80%); siehe R.G.Kallen, W. P. Jenks, J. Biol.Chem. 241,5851 (1966).
Zweites Verfahren
N5,N10-Methenyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure in Form des Chlorides der Formel V
COOH
(V)
COOM
wird in einem wasserfreien Lösungsmittel mit NaBH4 reduziert. CH2-THF als freie Säure der oben genannten Formel Il wird als ein amorpher Festkörper mit einer Reinheit von 75 bis 80% isoliert; siehe dazu P. R. Farina, L. J. Farina, S. J. Benkovic, J. Am. Chem. Soc. 95, 5409 (1973); C. M.Tatum Jr., P.A. Benkovic, S.T.Benkovic, R. Potts, Biochemistry 16,1903 (1977). CH2-THF in Form der freien Säure ist praktisch unlöslich in Wasser, und ist als solche ungeeignet für parenterale pharmazeutische Präparate. Völlig überraschend wurden nun Verfahren gefunden, welche für die großtechnische Produktion geeignet sind, zur Herstellung von neuen, stabilen und therapeutisch annehmbaren, wasserlöslichen Salzen von CH2-THF, welche genügend rein sind, um einem Patienten verabreicht zu werden.
Die vorliegende Erfindung ist durch die Merkmale in den unabhängigen Ansprüchen charakterisiert. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Beschreibung der Erfindung
In der Tabelle 1 sind einige bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen zusammengefaßt.
COO R
3 a R = H(bekannt)
3 b R = Na+, Pyridinium
3 c R = (HO[CH2]2NH3)+
3d R = {(HO[CH2]2)3NH}+
3e R = (HO[CH2]2NH[CH3]2)+
3f R = ([CH3I3CNHa)+
3 g R = ([L]-Lysin)+
3 h R = ([L]-Arginin)+
3i R = V2Ca2+
3 k R = 1/2 Mg2+
31 R = Na+
3 m R = K+
3 η R = Li+
In der Tabelle Il wird die Herstellung von einigen bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen schematisch dargestellt.
Tabelle II
R— N-f-H H
H-
-H
Coo
H +
COOH
H H H
COOH 3cl
I. MoOH
2.
1 R-hJHi
oder 2 Me+ ~0W (MethodtA)
R-M H H
coo"
-H -H -H
coo-
oder
H R—M-4-H
H-H-
H COO"
coo"
(HethodtB)
3c-h,e.-n+
31Λ
R = N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydropteroyl-
Die verschiedenen erfindungsgemäßen Salze können entweder direkt aus der Verbindung der Formel 3a (Methode A) oder mittels der Reaktion eines Erdalkalimetallsalzes, beispielsweise das Kalziumsalz der Formel 3i, mit dem Oxalsäuresalz des entsprechenden Kations oder Amins (Methode B) hergestellt werden. Die HPLC Reinheit des auf diesem Wege erhaltenen CH2-THF Salzes variiert zwischen 83,8 und 92,4%; die Haüpt-„Verunreinigung" dieser Herstellung besteht aus der gut bekannten und therapeutisch wertvollen (6RS)-N6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure, so daß die gesamte Menge an reduzierten Folaten bei der Herstellung im Durchschnitt 95% beträgt.
Methode A
Die Verbindung der Formel 3a wurde hergestellt mittels der Umsetzung der Verbindung der Formel V in einem Lösungsmittel, wie etwa DMSO (Dimethylsulfoxid) in der Gegenwart einer Base, wie etwa Pyridin, mit der jeweiligen Menge an NaBH4, wobei man die Verbindung der Formel 3 b erhält, welche weiter gelöst wird in einer kalten KOH-Lösung; die Verbindung der Formel 3 a wird erhalten mittels Ansäuern.
Die Verbindung der Formel 3a wird nacheinander umgesetzt mit einer pharmazeutisch annehmbaren Base, wie etwa Ethanolamin, Triethanolamin, 2-Dimethylaminoethanol, tert.-Butylamin, oder mit Aminocarbonsäuren, wie etwa Lysin, Arginin, wobei wasserlösliche Salze gebildet werden. Die Verbindung der Formel 3a kann auch mit Kationen umgesetzt werden, wie etwa Ca2+, Mg2+, Li+, Na", K+, wobei die entsprechenden wasserlöslichen Salze gebildet werden, welche isoliert werden mittels Ausfällen aus der wäßrigen Lösung mittels der Hinzugabe eines organischen Lösungsmittels, wie etwa Ethanol, Aceton. Siehe Tabelle II.
Methode B
Die Erdalkalimetallsalze, beispielsweise die Verbindung der Formel 3i, welche mittels der Methode A erhalten wurden, wurden mit dem Oxalsäuresalz des ausgewählten Amins oder der entsprechenden Aminosäure oder des entsprechenden Kations umgesetzt. Bedingt durch die Ausfällung des wasserunlöslichen Erdalkalimetalloxalates bleibt das entsprechend abgewandelte Salz in Lösung und wird erst ausgefällt mittels der Hinzugabe eines organischen wasserlöslichen Lösungsmittels, wie etwa Ethanol, Aceton. Siehe Tabelle Ii.
Methode C
Völlig überraschend wurde nun noch ein weiteres, drittes Verfahren, welches für die großtechnische Produktion geeignet ist, zur Herstellung von Erdalkalimetallsalzen von N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure gefunden.
Mit dem dritten erfindungsgemäßen Verfahren werden die Erdalkalimetallsalze in großer Ausbeute und in großer Reinheit erhalten. Zudem wird in diesem erfindungsgemäßen Verfahren in wäßrigem Medium gearbeitet, was die Isolierung der gewünschten Erdalkalimetallsalze erheblich vereinfacht.
Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren legt man eine wäßrige Lösung eines wasserlöslichen Salzes der 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure vor und bringt diese dann mit Formaldehyd zur Reaktion. Anschließend wird eine wäßrige Lösung eines Erdalkalimetallsalzes hinzugegeben, wobei das entsprechende Erdalkalimetallsalz ausfällt.
Das Calciumsalz und das Magnesiumsalz der N6,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure sind bevorzugt.
Die 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure kann beispielsweise gemäß den Angaben von E. Khalifa, A. N. Ganguly, J. H. Bieri und
M. Viscontini, HeIv. Ch. Acta (1980), 63,2554 hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Salze können verwendet werden zur Herstellung eines Arzneimittels für die synergistische Beeinflussung einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder für die Verminderung der Toxizität einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder zum Schutz menschlicher und/oder tierischer Zellen. Ein solches Arzneimittel enthält gewöhnlich wenigstens ein aktives Salz in einer Menge von 1 mg bis 500mg, insbesondere von 5 mg bis 150 mg, pro Dosiseinheit. Das Arzneimittel liegt vorzugsweise in Form eines parenteralen und/oder oralen pharmazeutischen Präparates vor.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung. Klinische Resultate und therapeutische Anwendungen dieser Verbindungen werden ebenfalls beschrieben.
Beispiele Beispiel 1
Herstellung der (6RS)-N6,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3a.
Zu einer Lösung von 24,6 g der Verbindung der Formel V (hergestellt gemäß C.Temple, R. D. Elliot, J. D. Rose, J. A. Montgomery,
J. Med. Chem. 22,731 [1979]) in einem Gemisch aus 300ml trockenem DMSO und 100ml trockenem Pyridin, gerührt unter Sauerstoffausschluß bei Raumtemperatur, wurde tropfenweise eine Lösung von 2,0g NaBH^n 100ml DMSO während einer Stunde hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde anschließend mit zwei Liter Aceton während einer Zeitspanne von 20 Minuten verdünnt. Nach einem weiteren Rühren des Gemisches während einer Stunde bei einer Temperatur von+4°C wurde das gefällte gemischte Salz der Formel 3b mittels Filtration gesammelt und dreimal mit frischem Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden 16,17g rohe Verbindung der Formel 3 b isoliert.
Die HPLC-Analyse zeigte, daß dieses Produkt 87,1 % rein war.
Das oben genannte Produkt wurde zu 420ml entgastem Wasser hinzugegeben, und unter Sauerstoffausschluß bei einer Temperatur von +40C gerührt. 0,5M kalte KOH wurde anschließend tropfenweise zur gerührten Suspension hinzugegeben, bis eine vollständige Auflösung beobachtet wurde. Der pH-Wert der so erhaltenen Lösung betrug 7,5 und die freie Säure der Formel 3a wurde ausgefällt mittels der tropf en weisen Hinzugabe von kalter 1 NHCI, bis der pH-Wert der überstehenden Lösung einen Wert von 3,95 erreichte. Nach einem weiteren Rühren bei +40C während 10 Minuten wurde die freie Säure der Formel 3 a mittels Filtration gesammelt, einmal mit kaltem Wasser gewaschen sowie einmal mit Aceton und einmal mit peroxidfreiem Diethyläther gewaschen.
Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden 11,36g der amorphen Verbindung der Formel 3a isoliert.
HPLC-Analyse: 86,5% Reinheit/7,6% N5-Methyl-THF.
Dieses Produkt wurde nicht weiter gereinigt, sondern in verschiedene Salze, wie weiter unten beschrieben, übergeführt.
Beispiel 2
Herstellung des Ethanolaminsalzes von (6RS)-N6,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3c (Methode A).
Zu einer Lösung von 11,36g der Verbindung der Formel 3a, gelöst in 170 ml trockenem DMSO und gerührt bei Raumtemperatur unter Sauerstoffausschluß, wurde eine Lösung von 3,0ml Ethanolamin (2Equivalente) in 50ml DMSO tropfenweise hinzugegeben. Das Gemisch wurde anschließend mittels Filtration von einer leichten Trübung befreit und langsam zu 600ml gerührtem Ethylacetat hinzugegeben. Nach einem weiteren Rühren während 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Produkt mittels Filtration gesammelt und zweimal mit Ethylacetat und einmal mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden 14,22g der Verbindung der Formel 3c isoliert.
HPLC-Analyse: 83,8% Reinheit/7,1 % N5-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/l in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3): Amax = 293nm (ε = 43000) Amin = 247nm Amax/Amin = 3,9. [a]D = +10,4°(c = 1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3).
NMR (220 MHz/in DMSO-Pyridin 9:1 ):2 charakteristische Doublets (J = 4Hz) bei 5,05ppM (1 H)/3,85ppM (1 H) für die C-11 Methylenprotonen.
Beispiel 3
Herstellung des Triethanolaminsalzes von (6RS)-NB,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3d (Methode A).
Zu einer Lösung von 4,35g der Verbindung der Formel 3a in 50 ml trockenem DMSO, gerührt bei Raumtemperatur unter Argon, wurde tropfenweise eine Lösung von 2,84g Triethanolamin (2 Equivalente) in 14 ml DMSO hinzugegeben. Nach dem Abfiltrieren einer kleinen Menge an weißem Niederschlag wurde die Lösung tropfenweise zu einem gerührten Gemisch von 220ml Ethanol und 110 ml Diethylether hinzugegeben.
Die Suspension wurde während weiteren 30 Minuten bei einer Temperatur von +4°C gerührt. Der Festkörper wurde mittels Filtration gesammelt, einmal mit Ethanol/Diethylether 2:1, und einmal mit Diethylether gewaschen, und unter reduziertem Druck getrocknet, wobei man 4,88g der Verbindung der Formel 3d erhielt.
HPLC-Analyse: 90,3% Reinheit/5,8% N5-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/l in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3):
\max = 295 nm (ε = 37 800) Xmi„ = 246 nm Amax/Amin = 4,9.
[a]D = +11,7° (c = 1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3).
NMR (220MHz/inD2O/NaOD):2 charakteristische Doublets (J = 4Hz) bei 5,03 ppM(1H)/3,90 ppm (iH)fürdie C-11 Methylenprotonen.
Beispiel 4
Herstellung des 2-Dimethylaminoethanolsalzes von (6RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3e (Methode A).
Zu einer Lösung von 4,0g der Verbindung der Formel 3a in 46ml trockenem DMSO, gerührt bei Raumtemperatur unter Sauerstoffausschluß, wurde tropfenweise eine Lösung von 1,76ml 2-Dimethylaminoethanol (2 Equivalente) in 13 ml DMSO hinzugegeben. Nach dem Abfiltrieren einer kleinen Menge an Niederschlag wurde die Lösung tropfenweise zu einem gerührten Gemisch aus 200ml Ethanol und 100 ml Diethylether bei einer Temperatur von +40C hinzugegeben. Nach dem Rühren während weiteren 30 Minuten bei dergleichen Temperatur wurde der Festkörper mittels Filtration gesammelt, und einmal mit Ethanol-Diethylether 2:1 und einmal mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden 3,93g der Verbindung der Formel 3e isoliert.
HPLC-Analyse: 91 % Reinheit/5,7% Ns-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/l in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3):
\msx = 295nm (ε = 31200) \m!n = 246nm Amax/Amin = 4,5.
[a]D = +12,1° (c = 1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3).
NMR (220 MHz/in D2O/NaOD): 2 charakteristische Doublets (J = 4Hz) bei 5,03 ppM (1 H)/3,90ppm (1 H) für die C-11 Methylenprotonen.
Beispiel 5
Herstellung des tert.-Butylaminsalzes von (6 RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3f (Methode A).
Zu einer Lösung von 4,3g der Verbindung der Formel 3a in 60 ml trockenem DMSO, gerührt bei Raumtemperatur unter Argon, wurde tropfenweise eine Lösung von 1,97ml tert.-Butylamin (2 Equivalente) in 17 ml DMSO hinzugegeben. Nach wenigen Minuten des Rührens wurde ein dicker Niederschlag gebildet. Das Gemisch wurde weiter bei einer Temperatur von +180C während einer Stunde gerührt. Das Produkt wurde isoliert mittels wiederholter Zentrifugation bei 3500 U/Min, (rpm), wobei das Produkt vorgängig in einem Gemisch von 100ml Ethanol und 50ml Diethylether und danach in reinem Diethylether suspendiert wurde.
Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden 4,63g der Verbindung der Formel 3f isoliert.
HPLC-Analyse: 89% Reinheit/7,1 % N5-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/l in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3):
\max = 295nm (ε = 32700) Xmin = 246nm Amax/Ami„ = 4,5.
[a]D =+11,0° (c = 1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3).
NMR (220 MHz/in D2O/NaOD): 2 charakteristische Doublets (J = 4Hz) bei 5,03 ppM (1 H)/3,90ppm (1 H) für die C-11 Methylenprotonen.
Beispiel 6
Herstellung des (L)-Lysinsalzes von (6RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3q (Methode A).
Zu einer Lösung von 4,05g der Verbindung der Formel 3a in 55 ml trockenem DMSO, gerührt bei Raumtemperatur unter Argon, wurdetropfenweise eine Lösung von 2,60g (L)-Lysin (2 Equivalente) in 15ml DMSO hinzugegeben. Nachdem Rühren während einigen Minuten wurde ein dicker Niederschlag gebildet. Das Gemisch wurde weiterhin bei einer Temperatur von +18°C während einer Stunde gerührt. Das Produkt wurde isoliert durch wiederholte Zentrifugation bei 3 500 rpm, wobei das Produkt vorgängig in einem Gemisch von 100ml Ethanol und 50ml Diethylether und anschließend in reinem Diethylether suspendiert wurde.
Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden 5,03g der Verbindung der Formel 3q isoliert.
HPLC-Analyse: 90% Reinheit/6,1 % N5-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/l in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3):
Amax = 295 nm (ε = 29500) \min = 246 nm Amax/Amin = 4,4.
[a]D = +11,5° (c = 1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3).
NMR (220 MHz/in D2O/NaOD): 2 charakteristische Doublets (J = 4Hz) bei 5,03 ppM (1 H)/3,90ppm (1 H) für die C-11 Methylenprotonen.
Beispiel 7
Herstellung des (L)-Argininsalzesvon (6 RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3 h (Methode A). Das (L)-Argininsalz der Formel 3h wurde in analoger Art und Weise, wie in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt.
Beispiel 8
Herstellung des Calciumsalzes von (6RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3i (Methode A).
1,0g der rohen Verbindung der Formel 3b wurde in kleinen Mengen zu einem Gemisch aus 16ml entgastem Wasser und einem Tropfen 1 N NaOH hinzugegeben, und heftig bei einer Temperatur von+4°C gerührt. Während der Hinzugabe wurde der pH-Wert des Gemisches bei etwa 9,0 mittels der gelegentlichen Hinzugabe von 1 N NaOH gehalten. Danach wurden 0,92 ml einer 2M Kalziumchloridlösung zum Gemisch hinzugegeben. Nach dem Rühren während 10 Minuten wurde die Lösung von einem unlöslichen Niederschlag mittels Filtration befreit. Letztendlich wurde das Gemisch tropfenweise mit 20 ml Aceton unter Rühren bei einer Temperatur von +40C verdünnt, wobei man einen gelblichen Niederschlag erhielt, welcher mittels Filtration isoliert wurde, und einmal mit absolutem Ethanol und einmal mit Aceton gewaschen wurde und unter reduziertem Druck getrocknet wurde. Auf diese Art und Weise wurden 673 mg des Kalziumsalzes der Formel 3i isoliert. HPLC-Analyse: 91 % Reinheit/6% N6-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3):
Amax = 296nrn(e = 28900) Km]n = 245nm Am3X/Amin = 3,68.
Ia]0 = +12,6° (c = 1 in 0,01 N NaOH).
H2O Gehalt (nach Karl Fischer): 8,9%.
Elementaranalyse für CH2-THF-Ca X 3,5H2O
Berechneter Wert exp.Wert
%c 43,02 43,27
%H 5,05 4,84
%N 17,56 17,57
%Ca 7,18 6,99.
Beispiel 9
Herstellung des Magnesiumsalzes von (6RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3k (Methode A). 1,0g der rohen Verbindung der Formel 3b wurden in kleinen Portionen zu einem Gemisch aus 16ml entgastem Wasser und einem Tropfen 1 N NaOH hinzugegeben, und heftig bei einer Temperatur von +40C gerührt. Während der Hinzugabe wurde der pH-Wert des Gemisches bei etwa 9,0 mittels der gelegentlichen Hinzugabe von 1 N NaOH gehalten. Anschließend wurden 0,92 ml einer 2 M Magnesiumchloridlösung zum Gemisch hinzugegeben. Nachdem Rühren während 10 Minuten wurde die Lösung von einem kleinen unlöslichen Niederschlag mittels Filtration befreit. Das Gemisch wurde tropfenweise mit 20 ml Aceton verdünnt, wobei das Gemisch bei einer Temperatur von +4°C gerührt wurde. Man erhielt einen gelblichen Niederschlag, welcher mittels Filtration isoliert wurde, und einmal mit H2O, einmal mit Ethanol, und einmal mit Aceton gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet wurde. Auf diese Art und Weise wurden 537 mg des Magnesiumsalzes der Formel 3 k isoliert. HPLC-Analyse: 92,4% Reinheit/3,4% N6-Methyl-THF
UV (c = 20 mg/l in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3): Xmax = 296nm(e = 27600) Amin = 244nm Amax/Amin = 3,68
Ia]0 = +12,1° (C= 1 in 0,1 N NaOH)
H2O Gehalt (nach Karl Fischer): 8,9%.
Elementaranalyse* für CH2-THF1Mg X 5 H2O
Berechneter Wert exp.Wert
%c 42,17 42,26
%H 5,49 5,51
%N 17,21 16,30
%Mg 4,27 5,02.
* Probe getrocknet in der Luft: 15,8% H2O = Pentahydrat.
Beispiel 10
Herstellung des Natriumsalzes von (6RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 31 (Methode B).
1,0g Kalziumsalz der Formel 3i wurden zu 15ml einer 0,133 M Lösung von Natriumoxalatin H2O hinzugegeben und bei einer Temperatur von +40C unter Sauerstoffausschluß gerührt. Nach 30 Minuten Rühren bei der gleichen Temperatur wurde das ausgefällte Kalziumoxalat mittels Zentrifugation vom Gemisch entfernt, und es wurde eine klare überstehende Lösung erhalten, welche langsam mit 75 ml Aceton unter Rühren bei einer Temperatur von +40C verdünnt wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde mittels Filtration isoliert, einmal mit frischem Aceton gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um 737 mg der Verbindung der Formel 31 als ein gelbes Pulver zu ergeben.
HPLC-Analyse: 88,6% Reinheit/4,5% N5-Methyl-THF.
UV (c = 20 mg/1 in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,3):
Xmax= 296nm(s = 29600) Äm!„ = 245nm Amax/Amin = 4,00.
[a]0 = +12,5° (c = 1 in 0,01 NaOH).
Beispiel 11
Herstellung destert.-Butylaminsalzesvon (6RS)-Ns,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3f (Methode B). 1,0g Kalziumsalz der Formel 3i wurde zu 15ml einer 0,133M Lösung des Oxalsäuresalzes vontert.-Butylamin hinzugegeben und bei einer Temperatur von +40C unter Argon gerührt. Nach 30 Minuten Rühren bei gleicher Temperatur wurde der
Kalziumoxalatniederschlag mittels Zentrifugation entfernt, und die erhaltene klare überstehende Lösung wurde langsam mit 75 mi Aceton unter Rühren bei einer Temperatur von +40C verdünnt. Der erhaltene Niederschlag wurde mittels Filtration isoliert, einmal mit frischem Aceton gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. Um 965 mg der Verbindung der Formel 3f als ein gelbes Pulver zu ergeben.
HPLC-Analyse; 87,2% Reinheit / 5,1 % N5-Methyl-THF.
(Weitere analytische Daten: siehe Beispiel 5.)
Beispiel 12
Herstellung des Magnesiumsalzes von (6RS)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3k (Methode C).
65g von 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure wurden in 400 ml Wasser suspendiert und der pH-Wert wurde auf einen Wert von 9,0 mittels der Hinzugabe von konzentriertem Ammoniak gebracht, wobei eine klare Lösung erhalten wurde. Dann wurden 13ml einer 36%igen wäßrigen Formaldehydlösung hinzugetropft, und das Gemisch wurde während 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Nach der Zugabe einer Lösung aus 50g MgCI2 · 6 H2O in 50 ml Wasser rührte man das so erhaltene Gemisch während 30 Minuten bei Raumtemperatur und ließ es dann während 2 Stunden stehen. Dann wurde das gewünschte Produkt abgenutscht, und einmal mit Wasser und einmal mit Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen bei vermindertem Druck bei 50°C wurden 27g des reinen N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure-Magnesiumsalzes isoliert.
HPLC-Analyse: 98,8% Reinheit.
UV (c = 20mg/l in 0,01 N NaOH):
\max = 296nmte = 30200) Amin = 245nm Amax/Amin = 4,82.
[a]D = +9,4° (c = 1 in 0,01 N NaOH).
Beispiel 13
Herstellung des Calciumsalzes von (6RS)-Ns,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel 3i (Methode C).
190 g von 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure wurden in 1250 ml Wasser suspendiert. 90 ml konz. Ammoniak und 50 ml Pyridin wurden dann zugegeben, wobei man einen pH-Wert von 8,5 erreichte.
Nach der Zugabe von 40 ml wäßriger, 36%iger Formaldehydlösung wurde das Gemisch durch eine Schicht aus Aktivkohle und Celite filtriert.
Zur erhaltenen klaren Lösung wurden unter Rühren 200 ml einer 30%igen Calciumchlorid Lösung zugegeben, und der pH-Wert wurde mittels der Zugabe von konz. Ammoniak auf einen Wert von 9,0 eingestellt.
Dann wurde auf eine Temperatur von +5°C abgekühlt, und man ließ das Gemisch während 2 Stunden stehen. Anschließend wurde abfiltriert, und das erhaltene Produkt wurde einmal mit Wasser und einmal mit Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 500C wurden 180 g des reinen N5,N10-MethyIen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure-Calciumsalzes isoliert.
HPLC-Analyse: 96,5% Reinheit / 0,6% N6-Methyl-THF.
UV (c = 20mg/l in 0,01 N NaOH):
\max = 296nm (ε = 26400) Xmin = 245nm Amax/Amin = 4,87.
[a]D =+17,3° (c = 1/0,01 N NaOH).
(6R)- und (6S)-N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäuresalze gemäß den Beispielen 2-11 wurden in derselben Art und Weise erhalten, wenn man jeweils von den (6R)-und (6S)-freien Säuren ausgeht.
Stabilität der Verbindungen der Formeln 3 c, 3 d, 3 e und 3f in 0,1M Phosphat-Puffer
Eine 0,1%ige Lösung in 0,1 M Phosphat-Puffer/pH 9,0 von jeder der Titelverbindungen wurde mittels HPLC bei den Zeiten 0,60, 120,300 Minuten analysiert, wobei jeweils 2,5 μΙ Injektionen getätigt wurden. Die prozentuale Wiedergewinnung bei der Zeit χ (Rx) wurde erhalten mittels derfolgenden Formel:
, Rx = (B/A)-100, wobei
A die integrierte CH2-THF Peak-Fläche zur Zeit 0 darstellt und B die integrierte Peak-Fläche zur Zeit χ darstellt.
Zeit Rx (3 c) Rx (3d) Rx (3 e) Rx (3 f)
0 100 100 100 100
60 96,7 95,7 97,6 97,0
120 93,3 92,1 94,2 94,3
300 85,1 - 88,3 87,5
Pharmazeutische Präparate für Injektionen a) Ampullen mit Flüssigkeiten
Die Verbindungen der Beispiele 2 bis 13, in einer Menge von 5-150mg, wurden in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie etwa 0,1 M Phosphat-Puffer, gelöst, so daß die Lösung einen pH-Wert von 9,0 hatte.
Die Lösung wurde bis zur Sterilität filtriert und in dunkle Glasampullen gefüllt, welche unter sterilen Bedingungen abgedichtet wurden.
Beispiel
Eine Verbindung der Beispiele 2-13: 5-150mg; Pufferlösung, eingestellt auf pH9,0:1-50 ml.
b) Lyophilisierte Präparate
Die Verbindungen der Beispiele 2 bis 13, in einer Menge von 50-250mg, wurden entweder in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie etwa 0,1 M Phosphat-Puffer, oder in einer physiologischen Natriumchloridlösung gelöst. Die Lösung wurde bis zur Sterilität filtriert, in Proberöhrchen abgefüllt und in einer dem Fachmann bekannten Art lyophilisiert. Bei Bedarf kann das lyophilisierte Pulver wieder rekonstitutioniert werden mittels der Hinzugabe von sterilem Wasser vorgängig der Verabfolgung.
Beispiel
Eine Verbindung der Beispiele 2-13: 50-250mg;
entweder Pufferlösung oder physiologische Natriumchloridlösung: 3-2OmI.
Lyophilisieren der sterilen Lösung.
Pharmazeutische Präparate für die orale Anwendung
Als ein Beispiel eines oralen Präparates werden Formulierungen für enterisch beschichtete Tabletten beschrieben, wobei klar ist, daß weitere orale Formen, wie etwa enterisch beschichtete Kapseln, in analoger Art und Weise hergestellt werden können.
Enterisch beschichtete Tabletten
Die enterisch beschichteten Tabletten, welche von 5-30 mg einer der Komponente der Beispiele 2-13 enthalten können, werden in der per se im Stand der Technik bekannten Art hergestellt, wobei die Enterobeschichtung ausgeführt wird gemäß „Remington Pharmaceutical Sciences", Seite 1614,15th edition, 1975 und „Theory and Practice of Industrial Pharmacy", Lackman-, Liberman, Canig, Seiten 116,371,470-2nd edition 1976.
Beispiel Verbindung der Beispiele 1-13: 5 bis 30 mg
Lactose USP: 150 bis 125 mg
Stärke NF: 35 bis 30 mg
Magnesiumstearat NF: 3mg
EudragitNF: 4mg
TaIcNF 4 mg
Polyethylenglycol 6000 NF: 0,4mg
Klinische Resultate und therapeutische Anwendungen von Salzen der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure
Als Beispiele der möglichen therapeutischen Anwendungen der beschriebenen Verbindungen liegen folgende klinische Ergebnisse vor:
Patient A:
Geschlecht: weiblich Alter: 19
Diagnose: osteogenes Sarkom mit Atmungs- und Schluckbeschwerden
Behandlung: 5-Fluorouracil intravenös verabreicht (300-750 mg/Woche) in Kombination mit intravenös verabreichtem N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure-Calciumsalz(100 mg/Woche).
Klinischer Befund nach 5wöchiger Behandlung:·
— Sichtbare Reduktion des Tumorvolumens
- Verschwinden der Atmungs- und Schluckbeschwerden.
Patient B:
Geschlecht: männlich Alter: 52
Diagnose: Rektum Tumor mit Lebermetastasen
Behandlung: 5-Fluorouracil intravenös verabreicht (300 mg/Woche) in Kombination mit intravenös verabreichtem N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure-Calciumsalz (100 mg/Woche).
Klinischer Befund nach 5wöchiger Behandlung:
- Nekrose des Tumors und Ausscheidung des nekrotischen Gewebes
— Gewichtszunahme des Patienten.
Es sei festgestellt, daß eine vorherige Behandlung des Patienten mit äquivalenten Mengen von 5-Fluorouracil und Leucovorin Calcium keine feststellbare Verbesserung des klinischen Zustands ergab.
Patient C:
Geschlecht: Alter: Diagnose: Behandlung
weiblich 53 Brustkarzinom links 5-Fluorouracil intravenös verabreicht (2x 250 mg/Woche) während 3 Wochen und anschließend (2x 250mg/Woche) während 2 Wochen in Kombination mit intravenös verabreichtem N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure-CalciumsalzOOOmg/B-Fluorouracil Verabreichung).
Klinischer Befund nach 8 Wochen:
— Tumor praktisch nicht mehr sichtbar oder faßbar
- Heilende fibrotische Narben.
Die möglichen therapeutischen Anwendungen beschränken sich nicht auf die Behandlung der oben erwähnten Tumore mit Salzen der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure in Kombination mit 5-Fluorouracil, sondern schließen auch Behandlungen von anderen Tumorarten mit Salzen der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure in Kombination mit 5-Fluorouracil oder anderen Chemotherapeutika, wie ζ. B. Floxuridin (FUDR), Methotrexat, Cisplatin, Adriamycin, Vincristin, usw., ein.

Claims (18)

  1. Patentansprüche:
    1. Salze von N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formeln I a und Ib
    COO
    Ib
    in Form des (6RS)-Diastereoisomerengemischesoderin Form der einzelnen (6R) oder (6S) Diastereoisomeren, worin
    R ein mehrwertiges organisches und/oder anorganisches Kation ist, R1 und R2 ein einwertiges organisches und/oder anorganisches Kation sind, wobei R1 und R2
    gleich oder verschieden sein können, und
    A einen Rest der Formel
    ist.
  2. 2. Salze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um pharmazeutisch und/oder therapeutisch annehmbare Salze handelt.
  3. 3. Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die anorganischen Kationen Alkali- oder Erdalkalimetallkationen sind, vorzugsweise Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+.
  4. 4. Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Kationen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Ethanolamin, Triethanolamin, 2-Dimethylaminoethanol, tert.-Butylamin, einer basischen Aminocarbonsäure, wie etwa Lysin, insbesondere (L)-Lysin, oder Arginin, insbesonder (L)-Arginin.
  5. 5. Verfahren zur Herstellung von Salzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man N5, N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel Il
    COOH
    COOH
    in Form des (6RS)-Diastereoisomerengemischesoder in Form der einzelnen (6R) oder (6 S)-Diastereoisomeren vorlegt und dann mit einer organischen und/oder anorganischen Base oder mit einem Salz eines anorganischen Kations zur Reaktion bringt.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in wenigstens einem Lösungsmittel erfolgt, vorzugsweise ausgewählt aus Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon und Wasser.
  7. 7. Verfahren zurHerstellung von Salzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Erdalkalimetallsalz der Formel 111
    (Hl)
    R' ein Erdalkalimetallkation ist, vorzugsweise Ca2+, Mg2+, gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6 herstellt und dann mit einem entsprechenden Oxalsäuresalz zur Reaktion bringt, wobei das Erdalkalimetalloxalat ausfällt und wobei gleichzeitig das entsprechende organische und/oder anorganische Salz der Verbindung der Formel I gebildet wird, dann das ausgefällte Erdalkalimetalloxalat abtrennt, und dann aus der Lösung das gewünschte Salz der Formel I mittels Zugabe von wenigstens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, Methanol oder Ethanol, ausfällt.
  8. 8. Verfahren zur Herstellung von Erdalkalimetallsalzen von N5, N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel Γ
    in Form des (eRSj-Diasteroismerengemisches oder in Form der einzelnen (6R)-oder (6S)-Diastereoisomeren, worin
    R' ein Erdalkalimetallkation ist, vorzugsweise Ca2+ oder Mg2+, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines wasserlöslichen Salzes der 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure der Formel IV
    COOH
    (IV)
    CooH
    vorlegt und dann mit Formaldehyd zur Reaktion bringt, und anschließend eine wäßrige Lösung eines Erdalkalimetallsalzes hinzugibt, wobei das entsprechende Erdalkalimetallsalz der Formel Γ ausfällt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Hinzugabe von Formaldehyd noch eine wasserlösliche, aromatische, Stickstoff enthaltende Base hinzugibt, welche insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyridin und substituierten Pyridinen, beispielsweise Picoline, Lutidine, Ethylpyridine, wobei Pyridin bevorzugt ist.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das wasserlösliche Salz der 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure herstellt durch Umsetzung der freien Säure in Wasser mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalihydroxiden, Alkalicarbonaten, Alkalihydrogencarbonaten, Ammoniak und organischen, Stickstoff enthaltenden Basen, wie beispielsweise Pyridin, Triethylamin, Triethanolamin.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Hinzugabe der Erdalkalimetallsalzlösung den pH-Wert auf einen Wert im Bereich von 8,5 bis 9,5, insbesondere 9,0, einstellt, vorzugsweise mittels der Hinzugabe einer wäßrigen Ammoniaklösung.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 10°C bis 300C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchführt.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Magnesiumsalz der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure herstellt durch Umsetzung bei Raumtemperatur der 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure in Wasser mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalihydroxiden, Alkalicarbonaten, Alkalihydrogencarbonaten, Ammoniak und organischen, Stickstoff enthaltenden Basen, wie beispielsweise Pyridin, Triethylamin, Triethanolamin, dann diese so hergestellte Salzlösung mit Formaldehyd zur Reaktion bringt, und anschließend eine wäßrige Lösung eines Magnesiumsalzes hinzugibt, wobei das Magnesiumsalz der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure ausfällt.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Calciumsalz der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure herstellt durch Umsetzung bei Raumtemperatur der 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure in Wasser mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalihydroxiden, Alkalicarbonaten, Alkalihydrogencarbonaten, Ammoniak und organischen, Stickstoff enthaltenden Basen, wie beispielsweise Pyridin, Triethylamin, Triethanolamin, dann zu dieser so hergestellten Salzlösung eine wasserlösliche, aromatische, Stickstoff enthaltende Base hinzugibt, welche insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyridin und substituierten Pyridinen, beispielsweise Picoline, Lutidine, Ethylpyridine, wobei Pyridin bevorzugt ist, dann diese so hergestellte Salzlösung mit Formaldehyd zur Reaktion bringt, und anschließend eine wäßrige Lösung eines Calciumsalzes hinzugibt, wobei das Calciumsalz der N5,N10-Methylen-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure ausfällt.
  15. 15. Arzneimittel für die synergistische Beeinflussung einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/ oder für die Verminderung der Toxizität einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder zum Schutz menschlicher und/oder tierischer Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß es als wenigstens eine aktive Verbindung wenigstens ein Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält, vorzugsweise in einer Menge von 1 mg bis 500 mg, insbesondere von 5 mg bis 150 mg, pro Dosiseinheit, und daß es vorzugsweise in der Form eines parenteralen und/oder oralen pharmazeutischen Präparates vorliegt.
  16. 16. Verwendung der Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels für die synergistische Beeinflussung einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder für die Verminderung der Toxizität einer Krebs bekämpfenden Verbindung und/oder zum Schutz menschlicher und/oder tierischer Zellen.
  17. 17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz pro Dosiseinheit in einer Menge von 1 mg bis 500mg, insbesondere von 5mg bis 150mg,im Arzneimittel vorhanden ist.
  18. 18. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel in Form eines parenteralen und/oder oralen, pharmazeutischen Präparates vorliegt.
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