PL164541B1 - Sposób wyodrebniania z jadu pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farmakologicznych o strukturze peptydu PL PL PL PL - Google Patents
Sposób wyodrebniania z jadu pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farmakologicznych o strukturze peptydu PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL164541B1 PL164541B1 PL90287113A PL28711390A PL164541B1 PL 164541 B1 PL164541 B1 PL 164541B1 PL 90287113 A PL90287113 A PL 90287113A PL 28711390 A PL28711390 A PL 28711390A PL 164541 B1 PL164541 B1 PL 164541B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gly
- cys
- lys
- minutes
- ile
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 239000002435 venom Substances 0.000 claims abstract description 15
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims abstract description 15
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 241000238898 Agelenopsis aperta Species 0.000 claims abstract description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 229920004439 Aclar® Polymers 0.000 description 4
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 239000005023 polychlorotrifluoroethylene (PCTFE) polymer Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002708 spider venom Substances 0.000 description 3
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 2
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 2
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 2
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 101150061972 zur gene Proteins 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- ODDOYXKAHLKKQY-MMWGEVLESA-N Cys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ODDOYXKAHLKKQY-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 description 1
- 206010036600 Premature labour Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 208000026440 premature labor Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
- A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
- Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Neurology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Sposób w yodrebniania z jad u pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farm akologi- cznych o strukturze peptydu o wzorze H 2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg- cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg- gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu- cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leu- ala-C O N H 2 ewentualnie w postaci jego dopuszczalnych farm akologicznie soli, znamienny tym, ze pelny jad Agelenop- sis aperta eluuje sie z kolum ny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkosc porów 30 nm, wielkosc czastek 10 µ m, stosujac szybkosc przeplywu 15 m l/m inute i uklad rozpuszczalnikowy o progra- mie z gradientem liniowym od 5% - 20% acetonitrylu, 95% - 80% 0,1% wodnego kwasu trójfluoroocto- wego [0 —30 m inut], nastepnie 20% - 70% acetonitrylu, 80% - 30% 0,1% wodnego kwasu trójfluoroocto- wego [30 - 55 m inut] i m onochrom atyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera sie frakcje, która eluuje w 41,5 m inuty i nanosi sie ja na kolum ne C-18 Vydac® o wymiarach 10 m m X 250m m , wielkosc porów 30nm , wielkosc czastek 5 µ m, a nastepnie eluuje sie te kolum ne z szybkoscia 3,5 nil/m inute izokratycznym ukladem rozpuszczalnikowym z 70% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctow ego i 30% acetonitrylu z wykrywaniem piku przy 220-230 nm, zbiera sie fiakcje eluujaca w okolo 7,5 minuty i ewentualnie liofilizuje sie ja lub zawiesza sie ponow nie w wodzie 1 liofilizuje i ewentualnie otrzym any polipeptyd przeksztalca sie w dopuszczalna farm akologicznie sól. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o własnościach farmakologicznych o strukturze peptydu. Wyodrębniony peptyd i jego dopuszczalne farmakologicznie sole blokują kanały wapniowe w komórkach, w tej liczbie w komórkach nerwowych i mięśniowych różnych organizmów, w tym bezkręgowców i kręgowców. Dzięki zdolności blokowania kanałów wapniowych w komórkach wyodrębniony peptyd ma zastosowanie w leczeniu u ssaków chorób i stanów, w których pośredniczy kanał wapniowy, jak również w zwalczaniu szkodników należących do bezkręgowców. W tych celach stosuje się wytworzone peptydy w postaci odpowiednich kompozycji.
Relacjonowano, że jad pająka Agelenopsis aperta zawiera co najmniej dwie toksyny działające na strumienie wapniowe [Jackson, H. i wsp., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987)]. Autorzy ci odkryli toksynę, określaną tu jako AG2, która ma masę cząsteczkową niższą od 1.000 daltonów i przejawia zdolność tłumienia strumieni wapniowych w szerokiej gamie tkanek. Ponadto, Jackson, H. i wsp., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986) opisali inną toksynę z Agelenopsis aperta zawierającą składnik o masie cząsteczkowej 6000. Toksynę tę opisano jako wywołującą blokadę presynaptyczną przenoszenia i sugerowano, że blokuje ona kanały wapniowe związane z uwalnianiem przenośnika nerwowego.
Pewne peptydy znajdujące się w jadzie pająka Agelenopsis aperta ujawniono w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 07/346 181 z. 28 kwietnia 1989. Peptydy te opisano jako blokujące kanały wapniowe w komórkach w odniesieniu do frakcji, w których zostały znalezione.
164 541
Frakcja G: Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca: H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gIy-ala-glu-cys-aspgly-as n-gl u-ser-a sp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-ly^^^^^^^i^i^-<^ę^^-j3i^<^^t:rp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyslys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argasn-glu-trp-leu-ser-, masa cząsteczkowa całego polipeptydu według FAB:7267,
Frakcja Hi.
H 2 N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-glncys-ala-a-p-trp-ala-gly-ala-gly-pΓo-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-trp-eys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-ile-cys-arg-asnasn-asn-CONH2, FAB:4190.
Frakcja H 2:
Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca: FhN-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-servaI-cys-asp-gIy-asn-gIu--er-asp-cys-lyscys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cysarg-cys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thrgly-glu-, masa cząsteczkowa całego polipeptydu.
Frakcja I:
^N-asp-cys^al-gly-glu-ser-gln-glncys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-wllasn-asn-asn-CON^, FAB: 4158.
Frakcja J:
Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca: H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lysser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-thr-his-pro-asp-asp-ala, masa cząsteczkowa całego polipeptydu według FAB: 5505.
Frakcja K:
H2N-glu-a-ptasn-cy--iletala-glu-aspt tys-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lyscy--cys-arg-gly-arg-protcystarg-cys-sermet-ile-gl;^-^thr-asn-cys-glu-cy^-^tlhr-proarg-leu-ile-met-glu-gly-leu-ser-phe-ala-CON^, FAB: 5274.
Frakcja Li.
Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca:
H 2 N-iIetvaItgly-gly-lys-thr-aIa-Iy--phegIy-asp-tyr-prottrptmet-vaIt-er-iIegIn-gIn-IyStasn-Iys-IyStg[ytgίy-phe-a-pprzybliżona masa cząsteczkowa całego polipetydu około 20.000.
Frakcja L2:
Polipeptyd mający następujący charakterystykę identyfikacyjną:
a) występuje we frakcji surowego jadu pająka Agelenopsis aperta, którą z kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10μιη. eluuje się przy szybkości przepływu 15 ml/minutę układem rozpuszczalnikowym, stosując program z gradientem liniowym od 5%—20% B, 95%—80% A [0—30 minut], następnie 20%—70% B, 80%—30% A [30—55 minut], gdzie A jest 0,1% wodnym TFA, a B jest acetonitrylem, w około 43 minutach i
b) występuje we frakcji opisanej wyżej w punkcie a) frakcji, którą z. kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 10 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 5μηι, eluuje się przy szyb4
164 541 kości przepływu 3,5 ml/minutę układem rozpuszczalnikowym, stosując program z gradientem liniowym od 25%->40% B, 75%—60% A [θ—3θ minut], gdzie A jest 0,1% wodnym TFA, a B jest acetonitrylem, w około 22,5 minutach.
Frakcja M: Amino końcowa sekwencja aminokwasowa zawierająca:
H 2N-glu-ala-thr-glu-aIa-aila-lys-val-leuser-asn-leu-asp-glu-th r-val-asp-proprzybliżona masa cząsteczkowa całego polipeptydu około 80.000.
Związki będące antagonistami wapnia mają różne zastosowania praktyczne. Antagonisty wapnia mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu takich między innymi chorób jak angina, nadciśnienie, zaburzenia patologiczne mięśnia sercowego, niemiarowość pozakomorowa, brak rozluźnienia skurczu, przedwczesny poród i choroba Raymanda. Patrz W. G. Nayler, Calcium Antagonists Academic Press, Harcourt Brace Javanovick Publishers, New Jork, NY 1988. Ponadto, takie związki są użyteczne w badaniu fizjologii komórek, takich jak komórki nerwowe i mięśniowe i w zwalczaniu szkodników z grupy bezkręgowców.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębniania peptydu występującego w jadzie pająka Agelenopsis aperta. Polipeptyd wyodrębniony sposobem według wynalazku i frakcja, w której jest on obecny, jest frakcją Q.
Sposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o własnościach farmakologicznych o strukturze peptydu o wzorze
HzN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2 ewentualnie w postaci jego dopuszczalnych farmakologicznie soli, polega zgodnie z wynalazkiem na tym, że pełny jad Agelenopsis aperta eluuje się z kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10μ m, stosując szybkość przepływu 15 ml/minutę i układ rozpuszczalnikowy o programie z gradientem liniowym od 5%—20% acetonitrylu, 95%—80% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [0-* 30 minut], następnie 20%->70% acetonitrylu, 80%->30% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [30—55 minut] i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję, która eluuje w 41,5 minuty i nanosi się ją na kolumnę C-18 Vydac® o wymiarach 10mmX-250mm, wielkość porów 30nm, wielkość cząstek 5 pm, a następnie eluuje się tę kolumnę z szybkością 3,5 ml/minutę izokratycznym układem rozpuszczalnikowym z 70% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego i 30% acetonitrylu z wykrywaniem piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję eluującą w około 7,5 minuty i ewentualnie liofilizuje się ją lub zawiesza się ponownie w wodzie i liofilizuje i ewentualnie otrzymany polipeptyd przekształca się w dopuszczalną farmakologicznie sól.
Polipeptyd wytwarzany sposobem według wynalazku blokuje kanały wapniowe w komórkach. A więc jest on per se użyteczny w blokowaniu kanałów wapniowych. Polipeptyd ma również zastosowanie w zwalczaniu szkodników z gatunku bezkręgowców i w leczeniu chorób i stanów występujących u ssaków, w których pośredniczy funkcja kanału wapniowego w komórce.
Jad uzyskuje się z pająka Agelenopsis aperta drogą ściągania przez stymulację elektryczną według standardowych metod, dobrze znanych fachowcom. Korzystnie, zastosowana metoda jest jedną z tych, które chronią pełny jad przed zanieczyszczeniem przez cofnięcie brzuszne lub hemolimfę. Takie metody są dobrze znane fachowcom. Otrzymany w ten sposób pełny jad przechowuje się w stanie zamrożonym, w temperaturze około -78°C do czasu użycia do opisanego dalej oczyszczania.
Oczyszczanie składników pełnego jadu przeprowadza się metodą wysokosprawnej chromatogiafii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC) na różnych kolumnach preparatywnych i półpreparatywnych, takich jak kolumny C-4 i C-18 Vydac® (Rainin Instrument Co. Inc. MackRoad. Wobum Massachusetts 01801). Wykrywanie piku prowadzi się monochromatycznie przy 220-230 nm. Dalsza analiza frakcji może być przeprowadzana, na przykład z danych polychrome UV zebranych z detektora układu diodowego Waters 990 (Millipore Corporatin, Waters Chromatography Divi164 541 sion, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Frakcje z kolumn zbiera się w znany sposób, taki jak zastosowanie kolektora frakcji ISCO/„FOXY“ i detektora piku ISCO 2169 (ISCO, 47-00 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Frakcje zbiera się do naczyń o równej w przybliżeniu pojemności, takich jak jałowe naczynia laboratoryjne z polietylenu. Zatężenia frakcji dokonuje się przez liofilizację z eluenta, a następnie liofilizację z wody. Czystość frakcji składowych otrzymanych w ten sposób określa się następnie pizez analizę chromatograficzną z zastosowaniem kolumny analitycznej z układem gradientowym, który jest bardziej izokratryczny niż układ stosowany do końcowego oczyszczenia frakcji.
Struktury zawarte w odpowiednich frakcjach określa się znanymi metodami analitycznymi, takimi jak spektrometria masowa i protonowy rezonans magnetyczny. Polipeptyd z frakcji Q sekwencjonuje się znanymi metodami. Na przykład S-pirydyloetylowanie reszt cysteinowych badanego polipeptydu można przeprowadzić w roztworze, a następnie dokonać sekwencjonowania aminokwasowego polipeptydu. Jedna z metod S-pirydyloetylowania jest nastąpująca. Około 1 do 10pg, polipeptydu rozpuszcza się lub rozcieńcza w do 50μ\ buforu otrzymanego przez zmieszanie 1 części lMTrisHCl pH 8,5 zawierającego4 mM EDTA i 3 części 8M guanidyny HCl. Następnie dodaje się 2,5μΐ 10% wodnego 2-merkaptoetanolu i mieszaninę tę inkubuje się 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, w atmosferze argonu. Po inkubacji dodaje się 2μ\ 4-winylopirydyny (świeży reagent przechowywano w atmosferze argonu w temperaturze -20°C) i mieszaninę tę inkubuje się przez dalsze 2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności, w atmosferze argonu. Mieszaninę następnie odsolono, korzystnie chromatograficznie na krótkiej kolumnie z odwróconą fazą. Odzyskany, alkilowany polipeptyd sekwencjonuje się następnie znanymi sposobami.
W praktycznym wykonywaniu wynalazku i stosując ogólne postępowanie podane wyżej stwierdzono, że odpowiednią kolumną do wstępnego frakcjonowania jadu jest kolumna C-17 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10μιη. Kolumnę tę eluuje się przy szybkości przepływu 15 ml/minutę, stosując program z gradientem liniowym 95%-80% A, 5%—20% B [0-30 minut], następnie 80%-30% A, 20%-70% B [30-55 minut], gdzie A jest 0,1% wodnym kwasem trójfluorooctowym (TFA), a B jest acetonitrylem. Frakcje zbiera się w opisany wyżej sposób. Otrzymaną w ten sposób frakcję oznaczoną Q' wybiera się do dalszego oczyszczania. Czas eluowania frakcji Q' był około 41,5 minuty.
Frakcję Q' poddaje się dalszemu oczyszczaniu stosując kolumnę C-18 Vydac® o wymiarach 10 mm X 250 mm,_wielkpść porów 30 nm, wielkość cząstek 5,0/zm, przy szybkości przepływu 3,5 ml/minutę, i układ izokratyczny 70% wodnego TFA, 30% acetonitrylu. Frakcje zebrano w opisany wyżej sposób. Frakcję Q eluuje się z kolumny po około 7,5 minutach. Stwierdzono również, że frakcja eluująca w około 8,3 minutach zawierała polipeptyd, który opisano w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 07/346 181 jako frakcję K.
Frakcja Q zawiera peptyd mający następującą sekwencję aminokwasową:
H 2 N-lys-lys^ll^;^5^-il<^-;da-lys^asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ne-cys-se r-de-m et-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2.
Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku nieodwracalne blokują kanały wapniowe obecne w różnych komórkach, takich jak komórki systemu nerwowego i układu mięśniowego kręgowców i bezkręgowców.
Zdolność polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku do blokowania kanałów wapniowych wykazano w następujący sposób. Mózgowe komórki żerne mikrogleju otrzymano z móżdżków 8 dniowych szczurów (Wilkin, G. P. i wsp., Brain Res: 115: 181-199, 1076). Kwadratyo powierzchni 1cm2 Aclar) Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, N. J. 07719) powlekano poli-L-lizyną i umieszczano na płytkach z 12 otworami, które zawierały 1 ml Eagels Basel Medium. Komórki rozszczepiano i do każdego otworu zawierającego kwadraty Aclar dodawano odmierzone ilości zawierające 6,25 X 10e komórek. Po upływie 24 godzin po umieszczeniu dodano cytozyno-beta-D-arabinofuranozyd (stężenie końcowe 10/iM). Komóiki są używane do analizy fura 2 w hodowli 6, 7 i 8 dniowej. Komórki (przywiązane do kwadratów Aclar) przenoszono na płytki z 12 otworami zawierającymi 1 ml 2μΜ fura 2/AM (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, 97402) w buforze HEPES (zawierającym 0,1% albuminy osocza wołowego, 0,01% dekstrozy, pH 7,4, wolnym od magnezu). Komórki unkubowano 40 minut w temperaturze 37°C. Bufor zawierający fura 2/AM usunięto i zastąpiono 1 ml takiego samego buforu bez fura 2/AM. Do kwarcowej kuwety dodano 2,0 ml ogrzanego uprzednio (37°C) buforu. Komórki na Aclar umieszczono w kuwecie, a samą kuwetę wprowadzono do termostatowanego (37°C) uchwytu wyposażonego w mieszadło magnetyczne i umieszczono fluorescenęję spektoforometrem fluerescencyjnym (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania). Pozwolono na ustabilizowanie się w ciągu około 2 minut sygnału fluorescencyjnego.
Następnie do kuwety dodawano 5-20 μΐ roztworu podstawowego badanego związku w solance buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) w odpowiednich stężeniach kalibrowanie sygnałów fluorescencyjnych i korekty upływności fura 2/AM są przeprowadzane z zastosowaniem ustalonych sposobów postępowania Nemetha i wsp. J. Biol. Chem. 262:5188 (1987) do zakończenia każdego badania, przy czym maksymalną wartość fluorescencji (F max) oznaczano przez dodanie jonomycyny (35 pM), a minimalną wartość fluorescencji (F min) oznaczano przez dodanie następnie EGTA (12 mM) w celu schelatowania wapnia. Stosując powyższe postępowanie wykazano, że blokowanie kanału wapniowego badanym związkiem powoduje spadek fluorescencji po dodaniu tego związku.
Peptyd wyodrębniany sposobem według wynalazku i jego sole są użyteczne jako środki blokujące kanał wapniowy w komórkach. Jako takie, związki te są również użyteczne w zwlaczaniu szkodników z gatunku bezkręgowców i w leczeniu chorób i stanów, w których pośredniczy funkcja kanałów wapniowych w komórkach u ssaków, takich jak angina, nadciśnienie, zaburzenia patologiczne mięśnia sercowego, niemiarowość pozakomorowa, brak rozluźnienia skurczu, przedwczesny poród i choroba Raymonda. Ponadto omawiane związki są użyteczne w badaniach fizjologii komórki obejmujących, ale nie ograniczonych do nich, komórki systemu nerowowego i systemu mięśniowego.
Jak wspomniano, sposobem według wynalazku wytwarza się również dopuszczalne farmakologicznie sole peptydu. Sole te są wytwarzane metodami dobrze znanymi fachowcom, na przykład zasadowe sole peptydu wytwarza się znanymi metodami.
Jeżeli peptyd wyodrębniony sposobem według wynalazku ma być podawany ssakom, to można go podawać jako taki albo w kombinacji z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami lub rozcieńczalnikami zgodnie ze standardową praktyką farmaceutyczną. Peptyd może być podawany doustnie lub pozajelitowo, przy czym korzystna jest droga pozajelitowa. Obejmuje ona podawanie dożylne, domięśniowe, dociemieniowe, podskórne lub zewnętrzne.
W przypadku doustnego podawania peptydu można go podawać na przykład w postaci tabletek, kapsułek lub zawiesin lub roztworów wodnych. W przypadku tabletek do podawania drogą doustną użytecznymi, ogólnie stosowanymi nośnikami są laktoza i skrobia kukurydziana, a także zwykle dodawane czynniki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu. Do podawania doustnego w postaci kapsułek użytecznymi rozczynnikami są laktoza i suszona skrobia kukurydziana. Jeżeli ma się stosować doustnie zawiesiny wodne, to składnik czynny łączy się z czynnikami emulgującymi i suspendującymi. W razie potrzeby można dodawać pewne środki słodzące i/lub zapachowe.
Do stosowania domięśniowego, dociemieniowego, podskórnego i dożylnego przygotowuje się zwykle jałowe roztwory składnika czynnego, a pH tych roztworów powinno być odpowiednio regulowane i buforowane. Do podawania dożylnego całkowite stężenie substancji rozpuszczonych powinno być tak regulowane, aby preparat był izotoniczny.
Jeżeli wyodrębniony peptyd lub jego sól są stosowane dla ludzi, to dawka dzienna będzie zwykle określana przez przepisującego lekarza. Ponadto dawka będzie zmieniać się z wiekiem, ciężarem ciała i reakcją poszczególnego pacjenta, jak również nasileniem występujących u niego objawów i mocy tego związku lub soli, którą się podaje.
Jeżeli wyodrębniony peptyd lub jego sól są stosowane do zwalczania szkodników z gatunku bezkręgowców, to związek ten podaje się bezpośrednio bezkręgowcowi albo doprowadza się do
164 541 jego środowiska. Na przykład związek wyodrębniony sposobem według wynalazku może być rozpylany jako roztwór na bezkręgowca. Ilość związku konieczna do zniszczenia bezkręgowca będzie zmieniała się w zależności od bezkręgowca i warunków środowiskowych, a będzie określana przez osobę stosującą związek.
Jeżeli peptyd lub jego sól stosuje się do badania fizjologicznego komórek, to do komórki wprowadza się je metodami znanymi fachowcom. Na przykład peptyd można wprowadzać do komórki w odpowiednim buforze fizjologicznym. Odpowiednim stężeniem wyodrębnionego związku do wykorzystania w takich badaniach jest 100μΜ. Jednak stężenia tego peptydu w tych badaniach mogą być większe niż lub znacznie mniejsze niż 100μΜ. Ilość podawanego związku będzie określana przez fachowca zgodnie ze znanymi metodami.
Następujący przykład ilustruje sposób według wynalazku.
Przykład.
a) Wstępne frakcjonowanie pełnego jadu Agelenopsis aperta.
Pełny jad Agelenopsis aperta, otrzymany z Narural Product Sciences Ins., Salt Lake City, Utah 84108, który przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -78°C, odmrożono i 10 do 60pl tego jadu rozcieńczono do objętości 200μΐ, którą naniesiono na kolumnę C-18 Vydac® (22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10pl) i eluowano przy szybkości przepływu 15 ml/minutę układem rozpuszczalnikowym, stosując program z gradientem liniowym od 5%-20% B, 95%—80% A [0-30 minut], a następnie 20%-70% B, 80%-30% A [30-55 minut], gdzie A jest 0,1% wodnym TFA, a B jest acetonitrylem. Wykrywanie piku prowadzono monochromatycznie przydługości220-230 nm,frakcjezbieranowkolektorzefrakcjiISCO/„FOXY“ i użyto wykrywacz piku ISCO 2159. Zbierano frakcje od 20 minut do 60 minut. Frakcję Q' zbierano w około 41,5 minutach.
b) Rozfrakcjonowanie frakcji Q' i określenie jej struktur.
Frakcję Q', otrzymaną jak opisano w przykładzie I, naniesiono na kolumnę C-18 Vydac® (10 mmX 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 5pm) i eluowano z kolumny przy szybkości przepływu 3,5 ml/minutę, stosując izokratyczny układ rozpuszczalnikowy 70% A, 30% B, gdzie A jest 0,1 wodnym TFA, a B jest acetonitrylem. Wykrywanie piku prowadzono stosując diodowy układ detektorowy Waters 990, a frakcje zbierano w sposób opisany w przykładzie I. Otrzymano dwie następujące frakcje:
Frakcja Czas eluowania
Q około 7,5 minut
K o koto 8/3 minut
Frakcje Q i K, które zawierały polipeptydy preparowano następnie w celu ustalenia kolejności przez liofilizację z eluenta, a następnie przez liofilizację z wody według znanych metod.
Analizy aminokwasów alkilowanego polipeptydu z frakcji Q i K dokonano stosując metodę Waters Pico-Tag według przepisów wytwórcy. Dane o kolejności czerpano z sekwencera proteina peptyd Applied Biosystems, Inc. 470A (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) z zastosowaniem konwersji wodnym TFA. Analizę otrzymanych kwasów fenylotiohydaatoinowych przeprowadzono na linii analizatorem Applied Biosystems model 120A PTH albo poza linią na kolumnie DuPont Zorbax PTH (Biomedical Product Departament, Chromatography Products, E. I. DuPont de Nemours and Co., Inc. 1007 Market Street, Wilmington, Delaware, 19898).
W wyniku analizy aminokwasów sekwencję aminokwasową wyodrębnionego peptydu zawartego we frakcji Q określono jako:
H 2 N-lys-lys-lys-cys-ne-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-iie-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2
W wyniku analizy aminokwasowej ustalono również, że fiakcja K zawierała polipeptyd z frakcji K opisanej wyżej i ujawniony w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 07/346 181.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 10 000 zł
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentoweSposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o własnościach farmakologicznych o strukturze peptydu o wzorzeIDN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2 ewentualnie w postaci jego dopuszczalnych farmakologicznie soli, znamienny tym, że pełny jad Agelenopsis aperta eluuje się z kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10 pm, stosując szybkość przepływu 15 ml/minutę i układ rozpuszczalnikowy o programie z gradientem liniowym od 5%—20% acetonitrylu, 95%—80% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [0—30 minut], następnie 20%—70% acetonitrylu, 80%—30% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [30—55 minut] i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję, która eluuje w 41,5 minuty i nanosi się ją na kolumnę C-18 Vydac® o wymiarach 10 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 5 pm, a następnie eluuje się tę kolumnę z szybkością 3,5 ml/minutę izokratycznym układem rozpuszczalnikowym z 70% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego i 30% acetonitrylu z wykrywaniem piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję eluującą w około 7,5 minuty i ewentualnie liofilizuje się ją lub zawiesza się ponownie w wodzie i liofilizuje i ewentualnie otrzymany polipeptyd przekształca się w dopuszczalną farmakologicznie sól.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/415,139 US5122596A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Polypeptides useful as blockers of calcium channels |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL287113A1 PL287113A1 (en) | 1991-09-09 |
| PL164541B1 true PL164541B1 (pl) | 1994-08-31 |
Family
ID=23644517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90287113A PL164541B1 (pl) | 1989-09-29 | 1990-09-28 | Sposób wyodrebniania z jadu pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farmakologicznych o strukturze peptydu PL PL PL PL |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5122596A (pl) |
| EP (1) | EP0425096B1 (pl) |
| JP (1) | JPH0692440B2 (pl) |
| KR (1) | KR930007435B1 (pl) |
| CN (1) | CN1033976C (pl) |
| AT (1) | ATE103611T1 (pl) |
| AU (1) | AU626203B2 (pl) |
| CA (1) | CA2026418C (pl) |
| CZ (1) | CZ283651B6 (pl) |
| DD (1) | DD297652A5 (pl) |
| DE (1) | DE69007739T2 (pl) |
| DK (1) | DK0425096T3 (pl) |
| EG (1) | EG19316A (pl) |
| ES (1) | ES2053118T3 (pl) |
| FI (1) | FI96865C (pl) |
| HU (1) | HU208705B (pl) |
| IE (1) | IE64218B1 (pl) |
| IL (1) | IL95765A (pl) |
| MY (1) | MY106832A (pl) |
| NO (1) | NO175208C (pl) |
| NZ (1) | NZ235496A (pl) |
| PH (1) | PH27403A (pl) |
| PL (1) | PL164541B1 (pl) |
| PT (1) | PT95424B (pl) |
| RU (1) | RU2026866C1 (pl) |
| YU (1) | YU184490A (pl) |
| ZA (1) | ZA907782B (pl) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
| US5677288A (en) * | 1991-05-15 | 1997-10-14 | Cypros Pharmaceutical Corporation | Use of aminoglycosides to protect against excitotoxic neuron damage |
| US5763568A (en) * | 1992-01-31 | 1998-06-09 | Zeneca Limited | Insecticidal toxins derived from funnel web (atrax or hadronyche) spiders |
| GB9208110D0 (en) * | 1992-04-13 | 1992-05-27 | Isis Innovation | Assay for antibodies that bind calcium channels |
| US5599559A (en) * | 1992-07-27 | 1997-02-04 | Pfizer Inc. | Calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta and therapeutic methods employing it |
| WO1994015960A1 (fr) * | 1993-01-07 | 1994-07-21 | Eisai Co., Ltd. | Peptide ayant des activites d'inhibition de liberation du glutamate et d'inhibition des canaux calciques |
| ES2075796B1 (es) * | 1993-08-17 | 1996-03-01 | Pfizer | Polipeptido de la agelenopsis aperta bloqueante de los canales de ca lcio |
| EP0804476A1 (en) * | 1994-01-19 | 1997-11-05 | Pfizer Inc. | PORE FORMING PEPTIDES FROM $i(GEOLYCOSA RIOGRANDE) |
| US5512592A (en) * | 1994-09-09 | 1996-04-30 | Wake Forest University | Method of producing cardiotonic effect and improving cardiac contractile function by administration of carnosine |
| US5776896A (en) * | 1996-01-03 | 1998-07-07 | Zeneca Limited | Analgesic peptides from venom of grammostola spatulata and use thereof |
| US5756663A (en) * | 1996-01-03 | 1998-05-26 | Zeneca Limited | Antiarrhythmic peptide from venom of spider Grammostola spatulata |
| US6063819A (en) * | 1997-02-21 | 2000-05-16 | Cypros Pharmaceutical Corp. | Neuroprotective poly-guanidino compounds which block presynaptic N and P/Q calcium channels |
| JP2006056805A (ja) * | 2004-08-18 | 2006-03-02 | Senmi Ekisu Co Ltd | カルシウムチャンネル阻害剤 |
| US8299211B2 (en) * | 2005-09-30 | 2012-10-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Peptides and regulation of calcium channels |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
| US4950739A (en) * | 1988-02-10 | 1990-08-21 | New York University | Membrane calcium channels and factors and methods for blocking, isolating and purifying calcium channels |
| IL92819A0 (en) * | 1988-12-23 | 1990-09-17 | Merrell Dow Pharma | Polypeptides isolated from the venom of the spider hololena curta |
| DD298412A5 (de) * | 1989-04-28 | 1992-02-20 | ������@���Kk�� | Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die geeignet sind als antagonisten exzitatorischer aminosaeure-neurotransmitter und/oder blocker der calciumkanaele |
-
1989
- 1989-09-29 US US07/415,139 patent/US5122596A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-12 DD DD90343970A patent/DD297652A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-13 PH PH41197A patent/PH27403A/en unknown
- 1990-09-24 EP EP90310419A patent/EP0425096B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-24 ES ES90310419T patent/ES2053118T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-24 IL IL9576590A patent/IL95765A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-24 AT AT90310419T patent/ATE103611T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-24 DE DE69007739T patent/DE69007739T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-24 DK DK90310419.8T patent/DK0425096T3/da active
- 1990-09-26 MY MYPI90001663A patent/MY106832A/en unknown
- 1990-09-26 PT PT95424A patent/PT95424B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 EG EG57290A patent/EG19316A/xx active
- 1990-09-27 CZ CS904707A patent/CZ283651B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 CA CA002026418A patent/CA2026418C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 KR KR1019900015349A patent/KR930007435B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-28 JP JP2260329A patent/JPH0692440B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-28 YU YU184490A patent/YU184490A/sh unknown
- 1990-09-28 NZ NZ235496A patent/NZ235496A/en unknown
- 1990-09-28 FI FI904789A patent/FI96865C/fi active IP Right Grant
- 1990-09-28 AU AU63660/90A patent/AU626203B2/en not_active Ceased
- 1990-09-28 PL PL90287113A patent/PL164541B1/pl unknown
- 1990-09-28 CN CN90108137A patent/CN1033976C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-28 IE IE349190A patent/IE64218B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 RU SU904831267A patent/RU2026866C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 ZA ZA907782A patent/ZA907782B/xx unknown
- 1990-09-28 HU HU906267A patent/HU208705B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 NO NO904251A patent/NO175208C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2746361B2 (ja) | 興奮性アミノ酸神経伝達物質の拮抗物質として、および／またはカルシウムチャンネルの遮断剤として有用なポリペプチド | |
| PL164541B1 (pl) | Sposób wyodrebniania z jadu pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farmakologicznych o strukturze peptydu PL PL PL PL | |
| RU2104286C1 (ru) | Полипептид или его фармацевтически приемлемые соли | |
| US5804554A (en) | Calcium channel blocking polypeptides from filistata hibernalis | |
| JP2613852B2 (ja) | アシダカグモ由来の，カルシウムチャンネルを遮断するポリペプチド類 | |
| JP2667578B2 (ja) | カルシウムチャンネルを遮断するテラホシダエ・アホノペルマ由来のポリペプチド |