DE2850503C2

DE2850503C2 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antibiotika

Info

Publication number: DE2850503C2
Application number: DE2850503A
Authority: DE
Inventors: Inc. Boston Mass. Penicillin Assays
Original assignee: Individual
Current assignee: Charm Sciences Inc
Priority date: 1977-11-21
Filing date: 1978-11-21
Publication date: 1985-09-12
Also published as: DE2850503A1; IL55964A0; NL186930C; GB2008248A; NL7811478A; DK152383C; JPS587279B2; JPS5496098A; NZ188910A; DK152383B; DK516878A; FR2409517B1; FR2409517A1; NL186930B; BR7807695A; CA1108516A; GB2008248B

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte (A) und (B) gleichzeitig durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) Mikroorganismen oder Teile davon verwendet werden, die auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert sind, und die Abtrennung (C) durch Entfernung des Trägers aus der Flüssigkeit und Waschen vorgenommen wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der an der festen Phase gebundenen markierten Substanz bestimmt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als markierte Substanz ^MC-markierte Verbindungen, ^l25J-markierte Verbindungen oder irit einer Peroxidase markierte Verbindungen verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) ein Stamm eines Mikroorganismus mit einer Temperatur des optimalen Wachstums über 50° C verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus stearothermophilus verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als markierte Substanz in Schritt (B) das nachzuweisende oder zu bestimmende Antibiotikum in markierter Form eingesetzt wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen, empfindlichen Nachweis und zur Bestimmung von Antibiotika in Flüssigkeiten wie Milch, Körperflüssigkeiten, Fleischextrakten sowie etwa Fermentationsbrühen. Die Möglichkeit eines Nachweises kleiner Konzentrationen von Antibiotika in Flüssigkeiten ist auf zahlreichen Anwendungsgebieten von großer Bedeutung, beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie, wo die Verwendung von Antibiotika zur Behandlung von Tieren, die Nahrungsmittel produzieren, zu einem Bedarf nach einem schnellen, genauen Testverfahren führte, das beispielsweise auch im Lebensmittelgroßhandel udgl. anwendbar ist

Da zur Behandlung der Mastitis von Milchvieh Penicilline herangezogen werden, sind Nachweisverfahren zur raschen und genauen Feststellung und Aussonderung penicillinhaltiger Milch von besonderer Bedeutung. Das steigende medizinische Interesse am Problem der Aufnahme kleiner Mengen Antibiotika durch Menschen über die Nahrung erfordert demgemäß bei einem Vorliegen von Penicillinen in Milch im Bereich von 0,010 bis 0,050 IU/ml oder darüber einfache Screening-Verfahren zum Nachweis derart kleiner Mengen an Penicillin und anderen Antibiotika.

Es sind bereits zahlreiche Verfahren zum Nachweis von Antibiotika bekannt. Die meisten davon beruhen auf mikrobiologischen Vorgängen, wobei das Vorliegen oder die Abwesenheit von Penicillin oder anderen Antibiotika durch Beobachtung der Inhibierung des Wachstums antibiotikaempfindlicher Mikroorganismen in Gegenwart der Testprobe ermittelt wird. Früher erforderten derartige Verfahrensweisen Inkubationszeiten von 4 h oder darüber; durch Verwendung von gegenüber Antibiotika überempfindlichen Mikroorganismenstämmen konnte die zur Durchführung der Versuche erforderliche Zeit auf 2 bis 2,5 h verringert werden.

Andere Verfahren zum Nachweis von Antibiotika machen als Testbasis von verschiedenen anderen spezifischen Eigenschaften des zu bestimmenden Antibiotikums oder der zu bestimmenden Klasse der Antibiotika Gebrauch. So wurde in der Literatur (J. F. Rusling et al., Immobilized Enzyme-Based Flowing-Stream Analyzer for Measurement of Penicillin in Fermentation Broths, Analytical Chemistry, Vol.48 (1976) 1211) ein Test angegben, der auf der enzymalischen Hydrolyse von Penicillin mit einem immobilisierten//-Lactamase-Derivat beruht.

Von Palmer (I. M. A. Palmeret al., Simple Ultrasensitive Test for Detecting Penicillin in Milk,). Dairy Science.

hS 50(1967) 1390) wurde ferner ein Verfahren zum Nachweis von Penicillin entwickelt, das auf dem Wachstum von Sporen von Hacillus subtilis auf Nährmedium-Sporen-Farbstoff-Papierschcibehen. die in einer kleinen Probe von der Luft ausgesetzter Milch wachsen, beruht. Mit der Verdampfung des Wassergehalts der Milch steigt zugleich die Konzentration von ggf. anwesenden Penicillin und führt dann zu einer Farbänderung des Farbstoffs,

die einen Hinweis auf die Konzentration gibt

In der US-PS 35 86 483 ist ein Verfahren zum Nachweis von Tetracydin-Antibiotika in Flüssigkeiten beschrieben, bei dem die Flüssigkeit auf einem Absorptionsstreifen absorbiert wird, der ein komplexbildendes Metal! enthält, das mit dem Antibiotikum einen floureszierenden Metallkomplex bildet, wobei die Fluoreszenz des Metallkomplexes unter UV-Licht beobachtet wird.

Die obengenannten sowie andere bisher verfügbare Verfahren zum Nachweis von Antibiotika unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und ihrer Geschwindigkeit sehr voneinander. Es ist davon auszugehen, daß keiner der bisher bekannten Tests zum Nachweis kleiner Konzentrationen von 0,01 IU Penicillin/ml (6 ng/ml) in Meßzeiten unter 1 h geeignet ist

In Em. J. Biochem. 72 (1977) 341-352 sind Untersuchungen zur Bestimmung der Bindungsfähigkeit verschiedener nichtmarkierter /-Lactam-Antibiotika an bestimmte Zellmembranproteine auf der Basis des sog. Competitive Assay beschrieben. Bei diesen Untersuchungen waren jedoch die Konzentrationen des markierten und des nicht markierten Antibiotikums bekannt Ferner wurden Membranen von speziellen Bakterien (E. coif KN 126) eingesetzt Eine Umkehrung dieser Methodik und Ausarbeitung eines Testverfahrens unter Verwendung von Zellfragmenten und insbesondere von intakten Zellen, das sich auf sehr verschiedene Klassen von Antibiotika anwenden läßt, lag entsprechend für den Fachmann nicht nahe.
Aus der DE-AS 22 06 103 war ferner das Prinzip des Competitive Assay bekannt

Ein derartiges Testverfahren würde in wirtschaftlicher Weise eine schnelle und zugleich zuverlässige Feststellung beispielsweise dahingehend ermöglichen, ob Milchproben aus relativ kleinen Partien Antibiotika in über den nach den entsprechenden Vorschriften zulässigen Konzentrationen Hegenden Mengen enthalten.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachteil einer großen Zahl verschiedener antibiotischer Substanzen in verschiedenen flüssigen Medien anzugeben, das so ausgebildet werden kann, daß es sehr schnell bei brauchbarer Empfindlichkeit oder auch andererseits etwas langsamer bei außerordentlich hoher Empfindlichkeit arbeitet Das Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antibiotika soll zum Nachweis sehr geringer Mengen von Antibiotika von etwa 1 ng/ml in flüssigen Proben von Materialien wie Milch, Körperflüssigkeiten, Fleischrückständen, Fermentationsbrühen udgl. geeignet sein und

^ eine Durchführung ohne Zentrifuge oder Szintillationszähler ermöglichen; es soll ferner auf bequeme Weise

ψ auch außerhalb von Labors durchgeführt werden können.

|| Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprü-

w ehe.

r_;. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antibiotika in flüssigen Proben ist

% gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(A) Inkubation der Probe mit einem Mikroorganismus mit zur Bindung des Antibiotikums befähigten Rezep-

; · torstellen

^;: unter Bedingungen, unter denen die Moleküle eines in der Probe vorliegenden Antibiotikums eine Bindung

mit den Rezeptorstellen eingehen können, wobei die Verwendung von E. coli zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von>?-Lactam-Antibiotika ausgenommen ist

(B) Inkubation des Gemischs von (A) mit einer zu einer Bindung an den Rezeptorstellen befähigten markierten Substanz, die ein markiertes Antibiotikum, ein markiertes Antibiotikumsderivat oder ein markierter Antibiotikums-Vorläufer ist,

(C) Abtrennung der festen Phase von der Flüssigkeit nach der Inkubation,

; (D) Bestimmung der Menge der an der festen Phase gebundenen markierten Substanz oder der markierten

: Substanz in der Flüssigkeit und

'■■. (E) Vergleich der Bestimmung mit einem Standard.

Bestimmte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung eignen sich in idealer Weise zur Feststellung und Aussonderung von Milch, die Antibiotika vom Penicillintyp enthält.
ί Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf diese, allerdings lediglich beispielhafte Anwendung näher

erläutert. Aus dem folgenden geht hervor, daß das Erfindungskonzept zur Untersuchung von Körperflüssigkei-(cn, Fleischextrakten, Fermentationsbrühen udgl. auf zahlreiche antibiotische Substanzen herangezogen werden kann.

Der wichtigste Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahrensweise liegt darin, daß sie den Nachweis sehr kleiner Anlibiotikakonzentrationen von beispielsweise 0,001 IU Penicillin/ml auf zugleich sehr schnelle Weise ermöglicht, beispielsweise in weniger als etwa 10 min.

Wenn in der Probe Moleküle eines Antibiotikums vorliegen, werden die markierten wie auch die unmarkier-

len Moleküle an einer begrenzten Anzahl von Rezeptorstellen auf den Zellen gebunden, wobei die Menge des

'. hierdurch immobilisierten Antibiotikums der Konzentration des Antibiotikums in der Testprobe umgekehrt

proportional ist. In analoger Weise hängt die Menge des in der flüssigen Phase verbleibenden markierten Antibiotikums von der ursprünglichen Antibiotikumskonzentration ab.

Die überraschend hohe Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wird einerseits der hohen Bindungskonstante der Wechselwirkung zwischen den Antibiotikumsmolekülen und den Rezeptorstellen an den Zellwänden oder anderen subzellulären Strukturen gegen Antibiotika empfindlicher Organismen sowie andererseits der Spezifität von Antibiotikumsmolekülen für derartige wechselwirkungsfähige Rezeptorstellen an solchen Organismen zugeschrieben. Die Bindungskonstante für Penicilline an Rezeptorstellen auf grampositiven Zellen ist beispielsweise um Größenordnungen höher als die Bindungskonstante für die immunchemische Antigen-Antikörper-Reaktion, auf der analoge Nachweisverfahren (sog. Immunoassays) beruhen.

Bei einer besonders wichtigen Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Schnelltest

zur Verwendung bei der Milchüberwachung ein einziger Inkubationsschritt vorgenommen, bei dem der gegen Antibiotika empfindliche Mikroorganismus, die zu untersuchende Probe und das markierte Antibiotikum oder der markierte Antibiotikumsvorläufer eingesetzt werden, worauf der Trennschritt durch Zentrifugieren vorgenommen wird. Geschwindigkeit wie auch Empfindlichkeit dieses Verfahrens werden durch Verwendung von Zellstämmen erhöht, die gegenüber einer nachzuweisenden Klasse von Antibiotika oder einem bestimmten nachzuweisenden Antibiotikum überempfindlich sind.

Nach einer Weiterbildung dieses Konzepts werden als antibiotikumsempfindliche Mikroorganismen vorzugsweise Stämme verwendet, die eine Temperatur des optimalen Wachstums über etwa 50⁰C aufweisen. In diesem Fall kann die Inkubation bei relativ hohen Temperaturen durchgeführt werden, was wiederum aus kinetischen Gründen die Reaktionsgeschwindigkeit der Reaktion zwischen Antibiotikum und Rezeptorstelle beschleunigt.

Bevorzugte Mikroorganismen zur Durchführung von Tests auf/?-Lactam-Antibiotika sind Bacillus stearothermophilus (ATTC 10 149 oder 15 952). Erfindungsgemäß können jedoch auch Zellen verschiedener anderer gegen Antibiotika überempfindlicher Stämme eingesetzt werden; in Fällen, in denen eine geringere Empfindlichkeil ausreicht, können auch lediglich normal empfindliche Stämme eingesetzt werden.

Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Zelistämme sind bestimmte Mutanten von E. coli, Ps. acruginosa, B. subtilis und S. aureus, die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung der genannten Mikroorganismen beschränkt

Wenn bei entsprechenden Tests die erzielte Geschwindigkeit weniger von Bedeutung ist als die erzielte Empfindlichkeit, können nach einer entsprechenden Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens die Probe und die Zellkultur eine Zeitlang inkubiert werden, wonach dann das markierte Antibiotikum später zugesetzt wird. Bei Verwendung empfindlicher Mikroorganismen mit optimal hoher Wachstumsgeschwindigkeit wurde festgestellt, daß die Empfindlichkeit nicht linear mit der Zeit ansteigt und die Inkubaticnsdauer 15 min nicht überschreiten sollte.

Nach einer bevorzugten Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zum Nachweis von ^-Lactam-Antibiotika wie etwa Benzylpenicillin, Cephalosporin, Ampicillin, Oxacillin, Methicillin, Cloxacillin, Cephaloridin und Cephalotin als markiertes Antibiotikum Benzylpenicillin oder der Antibiotikumsvorläufer 6-Aminopenicillansäure verwendet. Andere nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbare Antibiotika sind beispielsweise Erythromycin, Lincomycin, Actinomycin, Vancomycin, Bacitracin und Aminoglycoside wie etwa Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin und Neomycin. Die Erfindung ist jedoch nicht auf den Nachweis bzw. die Bestimmung der genannten Antibiotika beschränkt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich gut zum Nachweis von solchen Penicillinen oder penicillinartigen Antibiotika, welche die Zellvermehrung dadurch inhibieren, daß sie sich an die entsprechenden Stellen auf den Zellmembranen unter Inhibierung der Zellwandsynthese anlagern.

Antibiotika mit anderen Wechselwirkungsstellen wie etwa Rifamycin sowie Tetracycline können jedoch erfindungsgemäß ebenfalls nachgewiesen werden.

Die Markierung des Antibiotikums kann mit einem radioaktiven Atom, einem Enzym, einem Enzyminhibitor oder etwa einem Coenzym vorgenommen werden.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind markierte Substanzen, die ^l4C-Atome in der Struktur des Antibiotikumsmoleküls enthalten, ferner solche, die ein durch Reaktion mit beispielsweise Tyrosin oder geeigneten Derivaten davon verknüpftes ¹²⁵J-AtOm enthalten, sowie Antibiotika, die mit einem Enzym wie etwa einer Peroxidase markiert sind.

Nach einer anderen wichtigen Weiterbildung der Erfindung werden Rezeptorstellen enthaltende Zellteilc eingesetzt, die auf einem unlöslichen Träger wie beispielsweise Baumwollmull udgl. immobilisiert sind. Hierdurch wird der Abtrennungsschritt erleichtert, da der Träger nach der Inkubation in einfacher Weise aus der Flüssigkeit entnommen und gewaschen werden kann.

Die Verwendung einer Vorrichtung zum Nachweis radioaktiver Zerfallsprodukte kann ferner durch Markierung mit einem Enzym vermieden werden. In diesem Fall erfolgt die Bestimmung des Vorliegens der Enzymmarkierung durch Inkubation des Trägers mit einer Lösung des Enzymsubstrats, das unter dem katalytischen Einfluß des Enzyms einer nachweisbaren chemischen Veränderung unterliegt Ein bevorzugtes System umfaßt Peroxidase als Markierungsenzym sowie eine Substratlösung mit H2O2 und 4-Aminoantipyrin, die bei Vorliegen von Peroxidase einen Farbwechsei zeigt

Entsprechende Testsets zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Antibiotika in flüssigen Proben umfassen eine bestimmte Menge konzentrationsstabilisierter, antibiotikumsempfindlicher und vorzugsweise gegen Antibiotika überempfindlicher Zellen, eine bestimmte Menge eines markierten Antibiotikums oder Antibiotikumsvorläufer, der nach einer hohen Bindungskonstante gegenüber den Rezeptorstellen der Zellen ausgewählt ist, sowie einen Standard, mit dem die Ergebnisse der mit den Reagentien durchgeführten Tests verglichen werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfassen solche Testsets gefriergetrockneten Bacillus stearothermophilus, als markiertes Antibiotikum radioaktiv, beispielsweise mit ¹⁴C, markiertes Benzylpenicillin und als ao Standard entweder eine Standardkurve oder zumindest eine Probe, die eine bekannte Konzentration des nachzuweisenden Antibiotikums oder von Antibiotika der nachzuweisenden Antibiotikumsklasse enthält.

Nach eine anderen Ausführungsform weist das Testset einen wasserunlöslichen Träger auf, auf dem gegen-

über Penicillin überempfindliche Zellen immobilisiert sind, ferner enzymmarkierte 6-Aminopenicillansäure sowie eine Lösung des Enzymsubstrats, die unter dem katalytischen Einfluß des Markierungsenzyms eine Farbändercmg liefert Das Markierungsenzym kann dabei eine Peroxidase sein; die Substratlösung enthält H2O2, Phenol und 4-Aminoantipyrin.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Zeichnung erläutert; es zeigt

Fig. 1 ein Blockdiagramm zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis bzw. zur

Bestimmung von Antibiotika und

F i g. 2 eine Eichkurve für Benzylpenicillin.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt vier Hauptschritte: die Inkubation; bei der ilas gegebenenfalls in tier Probe vorliegende Antibiotikum sowie ein markiertes Antibiotikum an antibioiikuniseinplintlliche /.eilen ge bunden werden, den Schritt der Abtrennung, bei dem die Zellen mit daran gebundenen Antibiotikum vom restlichen System abgetrennt werden, einen Bestimmungsschritt, in dem ein Hinweis aiif die Menge des entweder mit den Zellen verbundenen oder in der abgetrennten Flüssigkeit vorliegenden markierten Antibiotikums erhalten wird, sowie einen Vergleichsschritt, in dem das erhaltene Bestimmungsergebnis mit einem Standard verglichen wird.

Mit steigender Konzentration des Antibiotikums in der Testprobe treten entsprechend weniger an den Zellen gebundene markierte Antibiotikumsmoleküle und entsprechend mehr markierte Antibiotikumsmoleküle in der abgetrennten Flüssigkeit auf.

Durch Herstellung einer Reihe von Proben mit bekannter Antibiotikumskonzentration und Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Eichkurve der Antibiotikumskonzentration in Abhängigkeit von der Zählrate (Zählungen pro Minute) im Fall radioaktiver Markierung oder einer entsprechenden anderen Variablen aufgestellt werden. Untersuchungen unbekannter Materialien führen zu einem quantitativen Wert der Anlibiotikumskonzentration durch Vergleich mit einer solchen Eichkurve.

Ein Hinweis auf das Vorliegen von Antibiotika in einer Probe kann ferner auch durch Vergleich des Ergebnisses der Testprobe mit dem markierten Antibiotikum mit den Ergebnissen von parallel dazu durchgeführten Versuchen mit Proben erhalten werden, die bekannte Mengen von Antibiotika enthalten. Wenn lediglich das Vorliegen von Antibiotika in Konzentrationen oberhalb eines bestimmten Maximalwerts geprüft werden soll, kann der erforderliche Vergleichsschritt indirekt durchgeführt werden. Dies geschieht durch Feststellung des Ergebnisses mit der Testprobe und Vergleich mit einem zuvor ermittelten Ergebnis, das mit der kritischen Antibiotikumskonzentration korreliert wurde. Dieser einfache Vergleich wird durch Standardisierung der Reagentien und Verfahrensweise ermöglicht. Bei der Durchführung des Tests wird damit inhärent ein Vergleich durchgeführt, wenn das Testergebnis interpretiert wird.

Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäß erzielte außerordentlich günstige Empfindlichkeit und hohe Schnelligkeit des Tests auf den typischerweise hohen Bindungskonstanten der Umsetzungen zwischen Antibiotika und Zellen sowie auf der Spezifität von Antibiotika gegenüber den mit ihnen wechselwirkungsfähigen Rezeptorstellen beruhen. So werden bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise auch extrem geringe Mengen von Antibiotika in einer Testprobe sehr rasch an den Rezeptorstellen auf den Zellmembranen oder an anderen Orten auf dem Mikroorganismus gebunden, mit dem die Inkubation erfolgt.

In dieser Hinsicht ist bereits gut bekannt, daß zahlreiche Antibiotika dadurch wirken, daß sie an bestimmten Zellorten gebunden werden, wodurch der normale Vermehrungsmetabolismus verhindert wird. So ist beispielsweise von Vancomycin, Bacitracin, Penicillinen sowie Cephalosporinen bekannt, daß sie die Zellvermehrung dadurch inhibieren, daß sie an Rezeptorstellen auf den Zellmembranen gebunden werden, wodurch die Zellwandsynthese blockiert wird (vgl. beispielsweise J. R. Edwards et al., Correlation between Growth Inhibition and the Binding of Various Penicillins and Cephalosporins to Staphylococcus aureus, Journal of Bacteriology, August 1969, S. 459—462, sowie J. L Strominger, The Actions of Penicillin and Other Antibiotics on Bacterial Cell Wall Synthesis, Hopkins Med. J. 133 (1973)63).

Für andere Antibiotika sind entsprechende Wechselwirkungsstellen etwas weniger zugänglich als die Zellmembran; dennoch wirken entsprechende Antibiotika durch Bindung an spezifischen Zellorten wie etwa Ribosomen oder Nucleinsäuren. Mit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise lassen sich entsprechend zusätzlich zu y?-Lactam-Antibiotika und anderen Antibiotika der obengenannten Art auch Erythromycin, Lincomycin, Actinomycin und Tetracycline sowie auch Aminoglycoside wie etwa Streptomycin, Neomycin u. dgl. nachweisen und quantitativ bestimmen. Bei den letztgenannten Substanzen liegen verschiedene Wechselwirkungsstellen bei den Zellen vor, beispielsweise an den Ribosomen u. dgl.

Bei der erfindungsgemäßen Inkubation der markierten Antibiotika zusammen mit der zu untersuchenden Probe konkurrieren markierte und unmarkierte Moleküle um die zugänglichen Rezeptorstellen. Wenn die markierten Moleküle nach der für eine bestimmte Zeit vorgenommenen Inkubation der Probe mit den Zellen zugesetzt werden, werden die markierten Antibiotikumsmoleküle entsprechend an den verbliebenen Rezeptorsteilen gebunden. Da durch Nachweis und Bestimmung des Vorliegens markierter, auf den Zellen gebundener Moleküle in beiden Fällen ein Meßwert für die Menge an gebundenen markierten Antibiotikumsmolekülen erhalten wird, resultiert damit indirekt ein Meßwert für gebundene nicht markierte Moleküle, da die Menge des markierten Antibiotikums auf den Zellen eine Funktion der Menge des Antibiotikums in der Probe ist

Anders ausgedrückt beruht die erfindungsgemäße Verfahrensweise darauf, daß markierte Antibiotikumsmolcküle und in der Testprobe vorhandene nicht markierte Moleküle des Antibiotikums mit einer begrenzten Zahl von Rezeptorstellen auf den Zellen entweder gleichzeitig oder nacheinander reagieren. Ein erfolgreicher Test kann daher entsprechend bereits durchgeführt werden, wenn das nachzuweisende Antibiotikum und das markierte Antibiotikum gleich sind. Zur Inkubation bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise können allerdings in gleicher Weise auch andere in geeigneter Weise markierte Verbindungen aus der Klasse der Antibiotika oder damit verwandter Moleküle wie etwa Antibiptikumsvorläufer oder Derivate eingesetzt werden, die mit derselben Gruppe von Rezeptorstellen wie das zu bestimmende Antibiotikum reagieren. So können beispielsweise bestimmte Penicilline oder Cephalosporine nach geeigneter Markierung zur Bestimmung der gleichen Substanzen, anderer Substanzen oder von Gemischen von Penicillinen oder Cephalosporinen herangezogen werden. Zur Markierung bevorzugte Antibiotika sind allerdings solche Verbindungen einer gegebenen Verbindungsklasse, die eine hohe Bindungskonstante aufweisen, beispielsweise Benzylpenicillin (Penicillin G)₁ Ampicillin oder Cephalosporidin aus der Klasse der ^-Lactam- Antibiotika.

Ein Beispiel für einen Antibiotikumsvorläufer aus dieser Substanzklasse stellt 6-Aminopenicillansäure dar; ein Beispiel für ein entsprechendes Derivat ist das Reaktionsprodukt von 6-Aminopenicillansäure mit Tyrosin.

Wie bereits oben angegeben, werden unter einem markierten Antibiotikum oder unter einer markierten Substanz markierte Antibiotika, Antibiotikumsvorläufer und entsprechende Derivate sowie andere verwandte

s Substanzen verstanden, die eine Affinität gegenüber wechselwirkungsfähigen Stellen ihrer entsprechenden Stamm-Antibiotika aufweisen.

Hinsichtlich der Art der Markierung sind gegenwärtig verschiedene Markierungstypen erhältlich. Das markierte Antibiotikum kann demgemäß ein ¹⁴C-AtOm, ein ¹²⁵J-AtOm oder andere radioaktive Atome enthalten, die z. B. mit einem Zähler nachweisbar sind, ferner Enzyme, Enzyminhibitoren, beispielsweise Methotrexat, oder Coenzyme, beispielsweise NAD, die dadurch nachweisbar sind, daß das markierte Antibiotikum mit einer Substratlösung umgesetzt wird, die eine nachweisbare chemische Reaktion unter dem katalytischen Einfluß der Markierung ergibt, oder bei der eine Reaktion inhibiert wird. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden unter Verwendung radioaktiv markierter Antibiotika wie beispielsweise mit ¹⁴C-markiertem Ben?vlpenicillin (Penicillin G) erzielt, das im Handel erhältlich ist.

Dem Fachmann ist ferner geläufig, daß zur Erzeugung einer Verknüpfungsstelle für ein radioaktives Jodatom in den meisten Fällen ein Derivat des Äntibiotikumsmoieküis synthetisiert werden muß. Enzyme als rviarkicrungssubstanzen wurden erfindungsgemäß ebenfalls mit Erfolg eingesetzt, auch können im Rahmen der Erfindung Coenzyme wie Dehydrogenase-Coenzyme eingesetzt werden. Das Vorliegen des Markierungsenzyms wird in an sich bekannter Weise unter Verwendung einer Substratlösung für das Enzym bestimmt, die bei der Umsetzung mit dem Enzym beispielsweise eine Farbänderung ergibt Die quantitative Bestimmung des Coenzyms erfolgt dadurch, daß die abgetrennten Zellen oder die verbleibende Flüssigkeit mit einer Lösung umgesetzt werden, die ein Substrat enthält, das bei der Einwirkung eines Enzymsystems, dessen entscheidender Bestandteil des Coenzym ist, eine Farbänderung ergibt Die anderen Enzyme des Systems sind in der Lösung enthalten.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind allgemein alle Zellen, die gegenüber drrn nachzuweisenden Antibiotikum empfindlich sind. So kann beispielsweise jeder Mikroorganismus, der durch Penicillin inhibiert wird, zum Nachweis von Antibiotika vom Penicillintyp herangezogen werden. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit ist es allerdings sehr bevorzugt, Mikroorganismen zu verwenden, die gegenüber dem nachzuweisenden Antibiotikum überempfindlich sind. In jüngster Zeit sind zahlreiche Stämme von Mikroorganismen verfügbar geworden, die entweder gegen bestimmte Antibiotika oder gegen Klassen von Antibiotika überempfindlich sind. Beispiele für Mikroorganismen, die gegenüber Antibiotika vom /?-Lactamtyp empfindlich sind, sind etwa B. subtilis, B. megatherium, S. aureus sowie Ps. aeruginosa.

Die günstigsten Ergebnisse hinsichtlich Geschwindigkeit und Empfindlichkeit wurden bei Verwendung von überempfindlichen Mikroorganismenstämmen erzielt, die eine Temperatur optimalen Wachstums aufweisen, die im allgemeinen über etwa 50°C liegt. Ein in dieser Hinsicht bevorzugter Mikroorganismus ist Bacillus stearothermophilus ATCC 10 149. B. stearothermophilus ATCC 15 952 kann ebenfalls Verwendung finden. Da die Inkubationen mit diesem Mikroorganismentyp bei hoher Temperatur durchgeführt werden können, läßt sich hierdurch die Geschwindigkeit der Bindung des Antibiotikums steigern.

Von Penicillin G ist bekannt, daß es an D-Alanincarboxypeptidase gebunden wird und dieses Enzym inhibiert, das normalerweise auf Zellmembranen gebunden ist, z. B. auf den Membranen von B. stearothermophilus.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch unter Verwendung von Zellteilen mit Rezeptorstellen durchgeführt werden, die auf einem geeigneten Träger immobilisiert sind, beispielsweise auf Baumwollmull, einer Collagenmatrix, Polystyrolkügelchen oder flachem sowie andersartig geformtem Polystyrol, Polyacrylamid-Gei oder einer kleinen Menge eines formstabilen Agar-Nährmediums, das an einem Stäbchen zum Eintauchen vorgesehen ist. Hierdurch wird die Abtrennung der Zellen von den flüssigen Bestandteilen des Reaktionsgemischs erheblich vereinfacht und beschleunigt.

Bei Verwendung ganzer Zellen wird die Abtrennung vorzugsweise durch Zentrifugieren vorgenommen. Erfindungsgemäß können jedoch auch andere Verfahren zur Abtrennung der Zellen vom restlichen Reaktionsgemisch, beispielsweise Ultrafiltration, angewandt werden.
Aus dem Obigen ist ersichtlich, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung einer Vielzahl von Antibiotika oder Antibiotikumsgemischen in einer großen Zahl verschiedener flüssiger Medien anwenden lassen. Ferner können eine Vielzahl markierter Antibiotika sowie Zellen bzw. Zelluntereinheiiefi verwtndei werden, auch kann das erfindungsgemäße Verfahren als qualitativer wie auch als quantitativer Test durchgeführt werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von speziellen Ausführungsbeispielen näher erläutert

Das erste Beispiel bezieht sich auf den Nachweis der Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Schnelluntersuchung von Milchproben auf das Vorliegen von kleinen Mengen von 0,001 IU/ml Penicillin.

Beispiel 1
Bacillus stearothermophilus wurde unter folgenden Bedingungen kultiviert:

Medium:	248 kg
Lösung A — Difco-Hefeextrakt	248 kg
Difco-Bactotrypton	144 kg
Dinatriumphosphat	515 g
Monokaliumphosphat	515 g
Ammoniumsulfat	5151
destilliertes Wasser

	28	50 503
Lösung B -	wasserfreies Magnesiumsulfat	103 g
	destilliertes Wasser	1.291
Lösung C —	Calciumchlorid-dihydrat	UV>g
	Manganchlorid	0.52 g
	destilliertes Wasser	1,291
Lösung D -	Glucose	2,58 kg
	destilliertes Wasser	12.91

Bedingungen: 60⁰C, Belüftung, 10% Inoculum.

Kultivierungsdauer: 2,5 h.
/■; Verfahrensweise

Tl Die Lösung A wird im Fermenter sterilisiert. Die Lösung B wird unabhängig davon sterilisiert und der Lösung

^ A in einer Menge von 2,5 ml pro Liter Lösung A zugesetzt. Die Endkonzentration an Magnesiumsulfat im

Medium beträgt 0,2 g/I. Die Lösung C wird getrennt sterilisiert und anschließend der Lösung A in einer Menge ■ von 2,5 ml pro Liter Lösung A zugesetzt.

Die Endkonzentration im Medium betragen:

\ Calciumchlorid-dihydrat 0,025 g/I

; Manganchlorid 0,001 g/l.

':';! Lösung D wird getrennt sterilisiert und der Lösung A in einer Menge von 25 ml pro Liter Lösung A zugesetzt.

Die Endkonzentrationen an Glucose im Medium beträgt 5 g/l.

Die Temperatur der Lösung A im Fermenter sollte zwischen 60 und 65° C liegen. Die Lösungen B, C und D

werden unter kräftigem Rühren in den Fermenter gegeben. Zur Vermeidung der Bildung eines Niederschlags

; muß die Lösung C langsam und unter kräftigem Rühren zugesetzt werden. Das vollständige Medium besitzt

ohne Einstellung einen pH-Wert von 6,9. Dem Medium wird ferner ein Antischaummittel in einer Konzentration von 0,1 % zugesetzt Zur Kultivierung der Mikroorganismen ist eine sehr kräftige Belüftung erforderlich.

Nach Beginn der Fermentation wird ein Behälter mit 61 des vollständigen Mediums mit dem Inhalt von zwei [ I-I-Erlenmeyer-Kolben geimpft, die jeweils 150 ml einer über Nacht gezüchteten Kultur enthalten. Bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,150 (600 nm) wird der gesamte Inhalt des Behälters zur Impfung des 60-l-Fer-' menters verwendet Wenn der Feststoffgehalt 0,03% beträgt wird der Inhalt des 60-i-Fermenters zum impfen

eines 530-l-Fermenters herangezogen.

Die Zellen werden zweimal mit dem fünffachen Volumen an 0,2 M NHUCl, pH 7,0, sowie anschließend zweimal mit dem zehnfachen Volumen einer Pufferlösung von pH 7,8 gewaschen, die 0,01 M Magnesiumacetat 0,01 M Mercaptoethanol und 0,02 M Tris-HCl-Puffer enthält.

Die Zellen werden anschließend abzentrifugiert und nach dem Abdekantieren des Überstands in einer gemischten Lösung von A, B und C wie oben resuspendiert und anschließend auf Flaschen aufgeteilt. Der Inhalt jeder Flasche kann in bekannter Weise gefriergetrocknet und über längere Zeit bei etwa 4° C aufbewahrt werden. Durch Gefriertrocknung des kultivierten Mediums (ohne Glucoselösung) bleibt die maximale Antibiotikums-Bindungswirkung der Zellen erhalten. Derartige gefriergetrocknete Zellen stellen eine ideale konzentra-' tionsstabilisierte Zellquelle zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren dar.

Als markiertes Antibiotikum wurde ¹⁴C-markiertes Benzylpenicillin (50 \iC\/mg) verwendet. Dieses Reagens ί kann ebenfalls aus Stabilitätsgründen gefriergetrocknet werden.

' Zur Erzielung quantitativer Ergebnisse sowie für Kontrollzwecke können zwei oder mehr flüssige Proben

parallel untersucht werden, von denen bekannt antibiotikumsfrei ist und die andere eine bekannte Menge des ^' nachzuweisenden Antibiotikums enthält, beispielsweise 0,01 IU/ml Penicillin. Diese Proben können ebenfalls aus

& Siabilitätsgründen gefriergetrocknet werden. Die obengenannten Reagentien können mit destilliertem Wasser

oder einem leicht sauren Phosphatpuffer wiederhergestellt werden. Bei Penicillinen erfolgt die Bindung am günstigsten zwischen pH 6,0 und 7,0.

Die stabilisierten Zellen, das markierte Antibiotikum sowie das Kontrollmaterial (bzw. die Eichkurve) stellen ein entsprechendes Testset dar, das sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet

Die oben angegebenen Reagentien wurden zur Aufstellung einer Eichkurve sowie zur Untersuchung unbekannter Substanzen auf das Vorliegen von Penicillin herangezogen. Eine Eichkurve wurde dadurch erhalten, daß 12 Milchproben von 1,0 ml, die bekannte Konzentrationen an Benzylpenicillin (Penicillin G) enthielten, mit (1) einer 100-ml-Probe einer Suspension von B. stearothermophilus (aus gefriergetrocknetem Material durch Zusatz von 2£ ml destilliertem Wasser zu einer wie oben erhaltenen Flasche wiederhergestellt) und (2) '^-markiertem Benzylpenicillin (Penicillin G) in zur Erzielung einer Zählrate von etwa 10 000 Zählungen/min ausreichender Menge inkubiert wurden. Die Inkubation wurde 3 min bei 90° C in einem Trockenbad-Inkubator durchgeführt Die Zellen wurden anschließend 2 min bei 3000 g abzentrifugiert Der Oberstand wurde verworfen und Zentrifugenröhrchen ohne Aufrühren der Zellen mit Phosphatpuffer gespült Die Zellen wurden anschließend aus dem Zentrifugenröhrchen in eine Szintillationsflasche übertragen, wobei Szintillationsflüssigkeit als Waschflüssigkeit verwendet wurde.

Bei Verwendung von ¹²⁵J als Markierungssubstanz kann dieser letzte Verfahrensschritt entfallen, da die markierten Moleküle direkt nachgewiesen werden können.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt:

Tabelle I

Eichkurve zur Bestimmung von Benzylpenicillin

1	•\	331	84
2	·)	367	120
3	0	15 457	15 210
4	0	15 582	15 335
5	1,0	13165	12 918
6	1,0	13 368	13121
7	5,0	9 859	9 612
8	5,0	10639	10392
9	10	7 615	7368
10	10	8 277	8 030
11	50	4175	3 920
12	50	4 461	4 214

5 Probe Benzylpenicillin Zählungen/10 min untergrundkorrigierte Mittelwert- C/C,,**)

Nr. (ng/ml) Zählungen/10 min Zählungen/10 min

102

Z. 'J JO/ ΙΛ) J

10 3 0 15 457 15 210 \ 1₅₂725

13 0193

15 8 5,0 10 639 luJitt J ^

α in 7 Αίς 7 ·Μ«ι

7 699

\ 4 071

20

*) Zusatz von 20 000 IU Benzylpenicillin (Peniciiiin G) zur Probe. **) Zählrate der Probe/Zählrate der Leerprobe (ohne Penicillin G in der Probe).

Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, tritt ein außerordentlicher und signifikanter Abfall der Zählrate 25 auf, wenn die Menge an Benzylpenicillin in den Probe von Null (3,4) auf 10 n^/ml (9,10) gesteigert wird.

Die Daten der Tabelle I sind in F i g. 2 graphisch dargestellt, wobei das Verhältnis der Zählrate der Probe zur Zählrate der Leerprobe in Abhängigkeit von der Penicillinkonzentration in ng/ml angetragen ist Unter Verwendung dieser Tabelle bzw. der zugehörigen Kurve als Standard für Vergleichszwecke wurden

Untersuchungen an 20 Milchproben durchgeführt, die aus einem Milchverarbeitungsbetrieb stammen. Es wurde

30 genau wie oben zur Erzeugung der Eichkurve verfahren, wobei zusätzlich die mit den Testproben erhaltene Zählrate mit der Eichkurve verglichen und die Dimension ng/ml der Konzentration des Penicillins in IU/ml

(0,01 IU w 6 ng) umgerechnet wurden.

Die Ergebnisse dieser Versuche gehen aus der nachstehenden Tabelle II hervor:

Tabelle II

Vergleich der Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem mikrobiologischen Verfahren

₄₀ Probe Nr. bekannte Penicillinkonzentration Testergebnisse nach dem erfindungsgemäß

(IU/ml) mikrobiologischen Verfahren erhaltene

(IU/ml) Testergebnissc

(IU/ml)

45 1 0,005 — 0,007

0,009 0,008 0,003 0,002

50 6 0,007 — 0,006

- 0,001 0,1 0,005

- 0,004 0,06 0,07

55 11 U₁U^u 0,04 0,05

0,03 0,04

0,02 0,03

0.05 0,06

- 0,01 0,01 0,02 0,09 0,10 0,08 0,09 0,07 0,08

- < 0,001

65

Zu den obigen Ergebnissen ist festzustellen, daß mit den Tests übereinstimmend das Vorliegen einer kleinen Menge von 0,01 IU/ml Penicillin nach etwa 6 min Testdauer (ohne die Zähldauer) nachgewiesen wurde.

Dabei wurde so verfahren, daß die Probe sowie das markierte Penicillin lediglich 3 min gleichzeitig inkubiert

0,007 1,000	Ψ I
0,853	I
0.655	1
0,504
0,267

1	0,005
2	0,005
3	0,003
4	0,002
5	0,000
6	0,007
7	0,000
8	0,042
9	0,003
10	0,030
11	0,020
12	0,020
13	0,025
14	0,037
15	0,007
16	0,017
17	0,043
18	0,022
19	0,030
20	0,000

wurden, worauf 2 min zentrifugiert wurde. Die Testbedingungen sinrl dabei so ausgewählt, daß eine brauchbare Empfindlichkeit sowie höchstmögliche Schnelligkeit erzielt wird

Zur Erläuterung der unter Verwendung von "B. stearothermophilus und markiertem Benzylpenicillin (Zählrutc 1500 min-') erzielbaren Empfindlichkeit wurde eine weitere Reihe von Tests durchgeführt wobei jeweils 3 min bei 90⁰C in einem Trockenbad-Inkubator inkubiert wurde. Die hierbei erhaltenen Testergebnisse sind in der Tabelle III aufgeführt hieraus geht hervor, daß ein signifikanter Abfall der Zählrate bei den abgetrennten Zellfraktionen auftritt wenn die Antibiotikumskonzentraüon der Probe von 0 über 0,001 und 0,002 auf 0,005 IU/ ml erhöht wird. Dieser Test kann einschließlich der Zählung in weniger als 10 min durchgeführt werden.

Tabelle III

Probe Nr. Menge an Penicillin G in der Probe

; Zählrate der Zellen	}	Mittelwert der Zählra».?
(min-')		(min-')
365	I
311		338
207 227		217
191 176		183,5
97 103	100
89 112	100,5
27
Beispiel 2

10 365 1 „_o

2 0

3 0,001

4 0,001

5 0,002

6 0,002 176 / ""¹^

7 0,005

8 0,005

9 0,010

10 0,010

11 - 27

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 wurde Bacillus stearothermophilus kultiviert Die resultierende Zellsuspension wurde anschließend zur Lyse der Zellen mit Ultraschall beschallt, wobei die Probe in ein Eisbad eingetaucht wurde. Nicht lysierte Zellen wurden durch 5 min Zentrifugieren der beschallten Suspension bei 2500 g abgetrennt. Die Bindungsstellen für Penicillin aufweisenden Zellmembranen wurden durch 10 min Zentrifugieren bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 5000 isoliert.

100 Baumwollmullstücke (Abschnitte zu 6,5 g) wurden anschließend zu 100 ml (CNBr-Lösung einer Konzentration von 30 g/l zugegeben, die mit 5 M NaOH auf pH 11,0 eingestellt war. Nach 10 min wurden die Mullstücke entfernt, mit NaHCCh-Lösung gewaschen und zu den Zellmembranen zugegeben, die wie oben hergestellt und in einer NaHCCh-Lösung von pH 8,1 suspendiert waren. Nach 18 h Rühren bei 4⁰C waren die Zellmembranen durch das Bromcyan kovalent an den Mullstücken gebunden. Die Mullstücke wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, 2 h in Ethanolamin eingeweicht, wieder gewaschen und anschließend getrocknet. ⁴"

Ein Konjugat von 6-Aminopenicillansäure und Peroxidase wurde wie folgt hergestellt:

Eine alkalische Lösung (pH 9,0) mit 28,1 mg 6-Aminopenicillansäure wurde mit einer mit Phosphatpuffer gepufferten Peroxidaselösung mit 8,8 mg Peroxidase und 8,2 mg Carbodiimid in Wasser gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 24 h auf 4° C gehalten. Auf diese Weise wurden die Peroxidase und die 6-Aminopenicillansäure kovalent verknüpft. Die Konjugatlösung wurde anschließend gegen eine mit 0,05 M Phosphatpuffer gepufferte Salzlösung PBS dialysiert; die Penicillinaktivität verschwand aus der Lösung nach dem ersten Wechsel. Nach viermaligem Wechsel der Lösung war das Penicillin-Peroxidase-Konjugat verwendungsfertig. Der Test unter Verwendung der wie oben hergestellten Reagentien wurde so vorgenommen, daß ein Baumwollmullstück zu den entsprechenden Testproben bzw. Kontrollproben zusammen mit 100 μΐ der Konjugallösung zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend 3 min bei 50⁰C in einem trockenen Inkubator inkubiert. Während dieser Reaktionszeit konkurrierten das gegebenenfalls in der Probe vorliegende Penicillin und die mit Peroxidase markierte 6-Aminopenicillansäure um die Verknüpfungsstellen auf den an den Baumwollstücken gebundenen Zellmembranen. Die Probe wurde anschließend aus dem Röhrchen ausgegossen, wonach das Mullstück zur Entfernung nicht gebundenen Konjugats mit Wasser gewaschen Wurde; danach wurde jedem Röhrchen 1 ml Substratlösung zugesetzt. Die Substratlösung bestand aus 1,0 ml 0,3% H 2Ο2,25 mg 4-Äminoantipyrin und 20 ml Phenol, gelöst in 50 ml destilliertem Wasser.

Die Mullstücke wurden zusammen mit dem Substrat anschließend bei 25°C inkubiert. Wenn weniger als 0,05 Einheiten Penicillin in der Probe vorlagen, wurde ausreichend Konjugat auf dem Mullstück immobilisiert, so daß dann unter der Einwirkung der Peroxidase in etwa 15 min eine visuell feststellbare Färbung von rosa bis rot auftrat. Wenn nach 15 min keine Färbung eintrat, enthielt die Probe mehr als 0,05 IU Penicillin/ml.

Zur Erzielung genauerer Ergebnisse kann die optische Dichte des Substrats bei 510 nm spektralphotometrisch vermessen werden. Ergebnisse beispielhafter Tests:

15 20 25 30

40 45 50 55 60

28 50 503	Optische Dichte (510 nm)
Penicillinkonzentration (IU/ml)	0,75 0,78 1,10 1,05
1. 0,05 0,00	0,70 0,77 1,05 1,00
2. 0,05 0,00	0,75 1,05
mittlere optische Dichte bei 0,05 IU Penicillin/ml: mittlere optische Dichte ohne Peniciliin:
Beispiel 3

Zur Erläuterung der beim Nachweis und der Bestimmung von Streptomycin erzielbaren Geschwindigkeit und Empfindlichkeit wurde eine weitere Testserie wie folgt durchgeführt:

5 von 6 5-ml-Milchproben wurden mit Streptomycin gemischt, so daß Proben mit 0, 1, 10, 100, 1000 und 10⁶ ng/ml resultiertea Jede Probe wurde mit einem tritiummarkierten Dihydrostreptomycin (Zählrate 228 000/min-¹; handelsüblich) sowie mit einer wie oben in Beispiel 1 erhaltenen und aus 0,2 ml gefriergetrocknetem Material unter Verdünnung mit 8 ml Wasser wiederhergestellten Suspension von B. stearothermophilux gemischt (Eine geeignete Konzentration des Materials vor dem Gefriertrocknen wurde durch Resuspendieren der durch Zentrifugieren abgetrennten Zellen, wie in Beispiel 1, in einer solchen Konzentration erzielt, daß eine 1:500-Verdünnung bei 600 nm eine optische Dichte von 0,60 ergab).

Die Gemische wurden zur Erleichterung der Bindung des tritiummarkierten Dihydrostreptoniycins an den entsprechenden Bindungsstellen der Zellen erwärmt Bei diesem Beispiel wurden die ursprünglich auf 10 bis 20° C befindlichen Proben entsprechend in einem Heizblock von 90° C 3 min erwärmt, so daß die Temperatur der Proben 60 bis 65° C erreichte. Die Proben wurden anschließend 3 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 3000 zentrifugiert, wonach der Überstand jeweils abdekantiert und das Zentrifugat zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das aus den Zellen bestehende Zentrifugat wurde anschließend mit Szintillationsflüssigkeit in Szintillationsflaschen übertragen, worauf die Zählrate bestimmt wurde. Die erhaltenen Versuchsergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt:

Tabelle IV

Probe Nr. Streptomycinkonzentration Zählrate

(ng/ml) (min-¹)

Verhältnis von Zählrate der Probe zu Zählrate der Leerprobe (%)

1	0
2	1
3	10
4	100
5	1000
6	10«

30 441 25 849 22 644 18 123 14 819 8 707

100
84,9 74,5 59,6 48,7 28,6

Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, tritt bei von 0 (Probe 1) über 1,10 und 100 ng/ml und darüber steigender Menge an Streptomycin in der Probe ein signifikanter Abfall der Zählrate auf.

Das Vorliegen von Streptomycin in Proben mit der geringen Menge von 1 ng/ml kann demgemäß durch Behandlung der Probe gemäß der obigen Verfahrensweise und Vergleich des Zählergebnisses mit den Tabellenwerten bzw. der Eichkurve nachgewiesen werden. Derartige Bestimmungen können in etwa 8 min durchgeführt werden.

Wie aus dem Obigen hervorgeht, ist es erfindungsgemäß ferner möglich, auch kleinere Konzentrationen an Antibiotika beispielsweise dadurch nachzuweisen, daß die Probe mit gegenüber dem Antibiotikum empfindlichen Zellen während einer Zeit inkubiert wird, die dafür ausreichend ist, daß das gesamte in der Probe vorliegende Antibiotikum an entsprechenden Rezeptorstellen gebunden werden kann. Das markierte Antibiotikum wird in diesem Fall danach zugesetzt und reagiert mit noch frei gebliebenen Rezeptorstellen. Abgesehen von dieser Modifizierung ist die Verfahrensweise im wesentlichen mit der oben angegebenen identisch und stellt einen etwas langsameren, aber noch empfindlicheren Test dar.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antibiotika in flüssigen Proben, gekennzeichnetdurch folgende Schritte:

(A) Inkubation der Probe mit einem Mikroorganismus mit zur Bindung des Antibiotikums befähigten Rezeptorstellen

unter Bedingungen, unter denen die Moleküle eines in der Probe vorliegenden Antibiotikums eine Bindung mit den Rezeptorstellen eingehen können, wobei die Verwendung von E. coli zum Nachweis bzw.zur Bestimmung von ^-Lactam-Antibiotika ausgenommen ist,

(C) Abtrennung der festen Phase von der Flüssigkeit nach der Inkubation,

(D) Bestimmung der Menge der an der festen Phase gebundenen markierten Substanz oder der markierten

Substanz in der Flüssigkeit und
(E) Vergleich der Bestimmung mit einem Standard.