JPS587279B2 - 抗生物質の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、乳汁、体液、肉エキスおよび発酵肉汁の如き
液体中に存在しうる抗生物質の迅速且つ高感度な検出方
法に係わる。

液体中に低濃度で存在しうる抗生物質を検出できるとい
うことは種々の情況において重要である。

その一つの例が食品産業であって、その場合食品材料を
生産する動物の治療に抗生物質を用いることにより、大
量食品取扱業者等が現場で使用することのできる迅速且
つ正確な試験方法が必要となってきた。

乳牛の乳腺炎を治療するのにペニシリンが用いられてい
るので、乳汁を迅速且つ正確にスクリーニングするのに
適したペニシリン検出法が特に重要である。

かくして、人による抗生物質の少量摂取について医学的
関心が高まり、乳汁中０．０ １ ０ 〜０．０ ５
０ Ｉ．Ｕ． （国際単位）／ｍｌ範囲又はそれ以上の
ペニシリン量による影響やかかる微少量のペニシリンお
よび他の抗生物質を検出するための簡単なスクリーニン
グ法に注意が向けられてきた。

今日、種々の抗生物質検出法が知られている。

而して、そのほとんどは、試験試料の存在で抗生物質敏
感性微生物の発育抑制を観察することによってペニシリ
ン又は他の抗生物質の有無を決める微生物学的技法を基
礎とずる。

かかる方法は以前、インキュベーションに４時間又はそ
れ以上を要したが、抗生物質に対して「超敏感」な微生
物系統を用いることにより、検定に要する時間が２時間
〜２．５時間に短縮されてきた。

また、他の抗生物質検出法は、試験ベースとして、検出
しようとする抗生物質の別のユニークな各種性質を利用
する。

かくして、Ｊ． Ｆ．Ｒｕｓｌｉｎｇ等のｒ Ｉｍｍｏ
ｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ−ＢａｓｅｄＦ ｌｏｗ
ｉｎｇ − Ｓ ｔｒｅａｍ Ａｎａｌｙｚｅｒ ｆｏ
ｒＭｅａｓｕｒｅｒｎｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｎ ｉｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｒｏｔｈｓ
（発酵肉汁内のペニシリンを測定するための、固定せる
酵素を基剤とした流動流れアナライザー） Ｊ Ｃ Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４
８、ｐ ］− ２ １ １ （１９７６年７月号）〕に
は、固定せるβラクタマーゼ誘導体を用いた、酵素によ
るペニシリンの加水分解を基礎とする試験が開示されて
いる。

また、Ｊ，Ｍ，Ａ．Ｐａｌｍｅｒ等の「Ｓ ｉｍｐｌｅ
ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＴｅｓｔｆｏｒ Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｎｇ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｉｎ Ｍｉｌ
ｋ （乳牛中のペニシリンを検出するための簡単な超高
感度試験） 」（ Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
， Ｖｏｌ， ５ ０、ｐｌ３９０）には、空気に曝露
せる乳汁の小試料中に在る栄養一胞子一染料紙円板上で
のバシルススブチリス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ）胞子の発育を基礎にしたペニシリン検出法
が開示されている。

この場合、乳汁の水分が蒸発するにつれて、もしペニシ
リンが存在すればその濃度は高まり、そして該濃度の指
標となる染料の色変化を誘発する。

更にまた、Ｊ． Ｇ． Ｈｅｉｄｅｒ等の米国特許第３
５８６４８３号には、流体中の抗生物質テトラサイクリ
ンを検出するのに、この抗生物質と一緒になって螢光金
属錯体を形成ずる錯（ヒ性金属を含んだ吸収剤ストリッ
プに上記流体を吸収させ、次いで紫外線下での金属錯体
の螢光を観察することによって上記抗生物質を検出する
方法が開示されている。

しかしながら、これらの方法および他の有効な検出方法
は感度および速度において犬巾に変動する。

而して、今日、１ｍｌ当り０．０ １ Ｉ．Ｕ， （
６ｎ．ｇ／ｍ．ｌ）程度に少いペニシリンを１時間以内
で検出することのできる試験方法はないと信じられる。

仮に、かかる試験が有効であるとすれば、例えば、現場
において比較的小さなバッチよりサンプリングせる乳汁
が食品医薬管理規準より高い抗生物質濃度を有するか否
かを迅速にしかも信頼しうる水準で決定することが経済
的であろう。

概記するに、本発明は、液体中に存在しうる抗生物質を
検出ずるための新規な方法を提供する。

本発明の或る具体化は、ペニシリンタイプの抗生物質に
ついて乳汁をスクリーニングするのに理想的に適合する
ので、この応用面に関し本発明を詳述する。

しかしながら、本発明が、種々の抗生物質薬剤について
体液、肉エキス、発酵肉汁等を検定するのに使用しうろ
ことは、以下の説明にかんがみ明らかであろう。

本発明の顕著な利点は、それが非常に低い抗生物質濃度
例えば０．ＯＯ１Ｉ，Ｕ，／ｍｌのペニシリン濃度を検
出し得、しかも該検出を非常に迅速に例えば約１０分内
で行いうるということである。

最も広い様相において、本発明の方法は、試料を、抗生
物質敏感性微生物の細胞又は細胞次単位とともに、該試
料中に存在しうる抗生物質分子を上記細胞に関連せる受
容部位に結合させる条件下でインキユベートし、同一条
件下でこの細胞一試料混合物を標識抗生物質又はその先
，駆体とともにインキユベートし、該反応混合物の液体
部分から細胞を分離し、この分離された細胞又は残存せ
る液体に関連して存在する標識抗生物質の量を測定し、
そして得られた測定値を標準と比較することを包含する
。

もし、試料中に抗生物質分子が存在するなら、そのとき
は、標識分子、標識されていない分子がいずれも細胞又
は細胞次単位上に在る限られた数の受容部位に結合しよ
うとし、而して固定された標識抗生物質の量は試験試料
中の抗生物質の濃度に反比例する。

同様に、液相中に残存せる標識抗生物質の量は元の抗生
物質濃度の関数である。

本発明方法の驚異的な感度および速度は、抗生物質敏感
性有機体の細胞壁又は他の細胞部分上の受容部位一抗生
物質分子間の牽引力を特徴づける高い結合定数と、抗生
物質分子の、かかる有機体」二の作用箇所（受容部位）
に対する特異性とに起因すると信じられる。

例えば、ペニシリンの場合グラム陽性細胞上の受容部位
との結合定数が、在来の類似検出方法（免疫測定）の基
礎となっている抗原一抗体免疫化学反応の場合の結合定
数よりも高いオーダーの値である。

本発明方法の重要な具体化で、乳汁をスクリーニングす
るとき用いるのに適した迅速試験を供与するために、抗
生物質敏感性微生物、試験試料および標識抗生物質又は
抗生物質先駆体にかかわる単一のインキュベーションを
実施し、また分離工程を遠心処理によって行う。

検出ないし検定の速度および感度はいずれも、検出しよ
うとする或る類の複数種抗生物質又は特定の単一抗生物
質に対して超敏感な細胞系統を用いることにより増進せ
しめられる。

この概念を更に一歩進めると、好ましい抗生物質敏感性
微生物は、約５０゜Ｃより高い最適発育温度を有する菌
株ないし系統のものということになる。

この場合、インキュベーションを比較的高い温度で行う
ことができ、而して抗生物質と受容体との反応が反応速
度論的に高められる。

βラクタム抗生物質の検定を行うのに好ましい微生物は
バシルス・ステアロテルモフイルス（ Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） ／
（ ＡＴＣＣ屋１０４９又は１５９５２）であるが、し
かしながら、他の各種抗生物質超敏感性細胞系統を用い
ることもできる。

事実、低い感度が許容されるときは、単なる敏感性系統
のものを用いることができる。

適当な細胞系統の非制限的例に、Ｅ．コリ（Ｃｏｌｉ）
、Ｐｓ．アエルギノサ（ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ）、
Ｂ．スブチリス（ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）およびＳ．ア
ウレウス（ ａｕｒｅｕｓ ）の或る種の突然変異体が
包含される。

本発明方法の具体化で、感度が速度に優先する場合、試
料と培養細胞とを或る時間インキユベートしたあとで標
識抗生物質を加える。

高い最適発育速度を有する敏感性微生物を用いるときに
注目されたことは、感度が時間との直線関係で高まらな
いということ、またインキュベーションを時間にして１
５分より長くは行うべきでないということである。

本発明の好ましい具体化において、標識抗生物質はベン
ジルペニシリンか或は抗生物質先駆体の６−アミノベニ
シラン酸であり、また検出しようとする抗生物質は、ベ
ンジルペニシリン、セファロスポリン、アンピシリン、
オキサシリン、メチシリン、クロキサシリン、セファロ
リジンおよびセファロチンの如きβラクタム抗生物質で
ある。

検出することのできる他の非制限的抗生物質に、エリス
ロマイシン、リンコマイシン、アクチノマイシン、パン
コマイシン、バシトラシン並びに、ストレプトマイシン
、ジエンタマイシン、カナマイシンおよびネオマイシン
の如きアミノグリコシドが包含される。

本発明の方法は、細胞膜の複数箇所に結合して細胞壁合
成を抑止し而してそれにより細胞の再生を抑制するタイ
プのペニシリン又はペニシリン様抗生物質に対し特によ
く作動する。

しかしながら、他の作用箇所を有するリファマイシンお
よびテトラサイクリンの如き抗生物質も亦検出すること
ができる。

標識抗生物質は、放射性原子、酵素、酵素抑制剤又は補
酵素の標識を付すことができる。

現在好まれる標識として、抗生物質の分子構造に組入れ
られる１４Ｃ、例えばチロシン又はその適当な誘導体と
の反応を介して抗生物質に結合せしめられる１２５■
原子、およびぺルオキシダーゼの如き酵素が挙げられる
。

本発明の別の重要な具体化で、受容部位を有する細胞部
分を不溶性支持体例えば綿棒に固定させる。

この方策は分離工程を容易にする。なぜなら、インキュ
ベーション後該支持体を液体から簡単に除去し得且つ洗
浄しうるからである。

放射性崩壊物を検出することのできる装置の必要性は、
酵素標識を用いることによって排除されうる。

この場合、酵素標識の存在は、支持体を、酵素の触媒的
影響下で検出可能な化学変化を示しうる酵素基質溶液と
ともにインキユベートすることにより決定される。

好ましい系に、ベルオキシダーゼ標識と、該ベルオキシ
ダーゼの存在で色を変える４−アミノアンチピリンおよ
びＨ２Ｓ２を含有する基質溶液とが含まれる。

本発明の別の様相に従えば、液体試料中の抗生物質の有
無を決定するための試験セットが供与される。

このセットは、濃度安定化された抗生物質敏感性（好ま
しくは超敏感性）細胞、該細胞上の受容部位に対する高
い結合定数を有するように選定された標識抗生物質又は
抗生物質先駆体、およびこれら試薬を用いて行った試験
の結果を比較するための標準を含む。

好ましい具体化において、該試験セットは凍結乾燥せる
バシルス・ステアロテルモフイルスを含み、また標識抗
生物質は放射性原子例えば１４Ｃで標識されたベンジル
ペニシリンであり、そしてまた標準は標準曲線か或は、
検出しようとする類の複数種抗生物質又は単一抗生物質
を既知濃度で含有する少くとも１種の試料である。

試験セットの別の具体化は、ペニシリン超敏感性細胞を
有する不溶性支持体又は該支持体上に固定せる細胞膜、
酵素で標識された６−アミノペニシラン酸および、酵素
標識の触媒的影響に応答した色の変化を示しうる酵素基
質溶液よりなる。

而して、酵素標識はベルオキシダーゼとし得、また基質
溶液はＨ２０２、フェノールおよび４−アミノアンチピ
リンよりなる。

従って、本発明の一つの目的は、各種液体媒質中種々の
抗生物質薬剤を検出することのできる抗生物質検出法に
して、非常に高い速度であり且つ受容しうる感度となる
ように適合し得、またわずかに低下した速度でもきわめ
て高い感度となるように適合しつる検出法を提供するこ
とである。

本発明の別の目的は、実験室外で好都合に実施すること
のできる高速な抗生物質検出法を提供することである。

本発明の別の目的は、乳汁、体液、肉エキス、発酵肉汁
等の如き物質よりサンプリンダせる液体中１〜／ｍｌ程
度に少い量で存在する抗生物質を検出するのに適した試
験セットを提供することである。

更に別の目的は、本発明方法を、遠心分離又はシンチレ
ーションカウンターなしで実施せしめつる試験セットを
提供することである。

本発明の上記および他の目的ないし特徴は、いくつかの
重要な具体化を示す以下の記載から明らかとなろう。

本発明をその好ましい具体化に関して以下詳述する。

本発明の方法は、４つの基本工程すなわち、標識抗生物
質と試料中に抗生物質があればこのものとを抗生物質敏
感性細胞又は細胞次単位に結合させるインキュベーショ
ン工程；この抗生物質と結合した細胞を系の残り物質か
ら単離する分離工程；該細胞又は分離された液のいずれ
かに関連せる標識抗生物質の量を示す測定工程；および
該測定結果を標準と比較する比較工程を包含する。

而して、試験試料中の抗生物質濃度が高いほど、細胞に
関連した標識抗生物質分子は少く、分離液に関連した標
識抗生物質分子は多くなる。

一連の既知濃度の抗生物質試料を調製し、これらを本発
明の方法に従って処理することにより、１分当りのカウ
ント数に対してプロットせる抗生物質濃度の標準曲線（
放射性標識の場合）又は類似物を作成することができる
。

未知試料の検定は、かかる曲線と比較するとき抗生物質
濃度の定量的表示をもたらそう。

また、試料中の抗生物質の有無も、標識抗生物質の試験
試料の読取りを、平行して行った既知量の抗生物質含有
試料に関する検定の結果と比較することにより表示され
うる。

もし、抗生物質が或る特定最大値を上回る濃度で存在す
るか否かを決めるだけなら、必要な比較工程を間接的に
実施することができる。

これは、試験試料に関連した読取り値に注目し、この値
を、抗生物質の臨界濃度と相関せる予め求められた読取
り値と比較することにより遂行される。

この簡単な比較は、試薬および手順の標準化によって可
能となる。

かくして、該比較は、試験を実施する技術者が読取り値
を解釈するときに持ちまえの能力で行いうることである
。

本検定方法の有利な感度および速度特性は、抗生物質一
細胞間反応の場合に典型的に高い結合定数と、抗生物質
の、細胞受容部位に対する特異性とにその由来を求める
ことができると信じられる。

かくして、本発明の方法においては、試験試料中の極微
少量の抗生物質でさえ、該抗生物質とともにインキユベ
ートされた微生物の細胞膜上又は他の位置での受容部位
に迅速結合せしめられる。

これについては、多くの抗生物質が、それ自体を特定の
細胞位置に結合し、またそれによって通常の再生代謝を
阻止するということがよく知られている。

例えば、バンコマイシン、バシトラシン、ペニシリンお
よびセファロスポリンは、細胞膜十の受容部位に結合し
て細胞壁合成を妨げ、それによって細胞の再生を抑制す
ることが知られている。

〔例えば、Ｊ ． Ｒ， Ｅｄｗａｒｄｓ等の「Ｃ ｏ
ｒｒｅ ｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｏｗｔｈ
Ｉ ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅＢ ｉｎｄｉ
ｎｇ ｏｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｐｅｎｉ ｃｉ ｌｌｉ
ｎｓ ａｎｄＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ ｔｏ Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（スタフイ
口コックス・アウレウスへの各種ペニシリンおよびセフ
ァロスポリンの結合と発育抑制との相関関係）」、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐ４５
９〜４６２（１９６９年８月）；並びに、Ｊ ， Ｌ，
Ｓ ｔｒｏｍ ｉｎｇｅｒのｒ Ｔｈｅ Ａｃｔｉｏ
ｎｓ ｏｆＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｎＢａｃｔｅｒｉａｌ
ＣｅｌｌＷａｌｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （ペニシリン
および他の抗生物質の、バクテリア細胞壁合成に対する
作用）」、Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｍｅｄ ． Ｊ．、Ｖｏｌ
，１３３、ｐ ６ ３ （ １． ９ ７ ３ ）を参
照のこと〕。

他の抗生物質は、アクセシビリテイが細胞膜よりも若干
低い作用箇所を有するが、それにもかかわらず、それ自
体をソボゾーム又は核酸の如き特定の細胞位置に結合せ
しめることによって作動する。

従って、既述せるβラクタム抗生物質および他の抗生物
質に加えて、本発明の方法は、エリスロマイシン、リン
コマイシン、アクチノマイシンおよびテトラサイクリン
並びに、ストレプトマイシン、ネオマイシン等の如きア
ミノグリコシドを検出することができる。

この後者の物質は、リボゾーム等の如き細胞に関連した
種々の作用箇所を有する。

試料と細胞とのインキュベーションに標識抗生物質を含
ませるときは、その標識分子と標識されていない分子と
が競合して、有効受容部位に結合しようとする。

また、試料を細胞とともに或る期間インキュベートした
あとで標識分子を加えるときは、残存せる受容部位にこ
の標識分子が結合する。

而して、いずれの場合も、細胞上に固定された標識分子
の存在を検出することによって標識抗生物質の結合測度
を得ることができるので、標識されていない分子結合も
間接的に測定される。

なぜなら、細胞上の標識抗生物質の量が、試料中に存在
する抗生物質の量の関数となるからである。

別の表現を取れば、本発明の方法は、標識抗生物質の分
子と試料中に存在しうる抗生物質とを細胞上の限られた
数の受容部位に対して同時反応させようとするか或は順
次反応させようとするかによって異なる。

かくして、検出しようとする抗生物質と標識物質とが同
じ抗生物質であるとき試験を上首尾に行うことができる
。

しかしながら、検出しようとする抗生物質と同じグルー
プの受容部位に結合する或る類の抗生物質又は、抗生物
質先駆体若しくは誘導体の如き関連分子のうち適宜標識
されたものであれば、いずれもインキュベーションに用
いることができる。

例えば、適宜標識された特定の抗生物質ペニシリン又は
セファロスボリンのどれかを用いて同じ抗生物質、他の
任意物或は混成ペニシリン又は混成セファロスポリンを
検出することができる。

しかしながら、標識するのに用いられる好ましい抗生物
質は、βラクタム抗生物質に属するセファロスポリジン
、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、又はアンピシ
リンの如き高い結合定数を有する所定数の抗生物質であ
る。

このβラクタム類の抗生物質先駆体の例は６アミノペニ
シラン酸であり、また誘導体の例は、６アミノペニシラ
ン酸とチロシンとの反応生成物である。

用語「標識抗生物質」又は「標識物質」を以下で用いる
とき、それは、標識された抗生物質、その先駆体および
誘導体並びに、他の関連物質にして、母体である抗生物
質の受容部位に対し親和力を有するものを包含する。

標識の種類についていえば、斯界の現状は、数種の標識
が入手される如き状態にある。

かくして、標識抗生物質は、１４Ｃ、１２５■又は、カ
ウンタ、その他で検出しうる他の放射性原子を含み得、
或は酵素、酵素抑制剤（例 メトトレキセート）又は補
酵素（例 ＮＡＤ）にして、標識抗生物質を、反応が抑
制され又は、標識の触媒的影響下で検出可能な化学反応
を示す基質溶液に付すことによって検出しうるものを含
むことができる。

すぐれた結果は、放射性標識抗生物質例えば、今日市販
されている”ｃ標ｍベンジルペニシリン（ペニシリンＧ
）を用いることによって得られている。

当業者に認識される如く、放射性よう素原子に結合の場
を与えるために、大抵の場合抗生物質分子に対する誘導
体を合成せねばならない。

また、酵素標識も首尾よく用いられており、デヒドロケ
ナーゼの如き補酵素も使用することができる。

酵素標識の存在は、例えば該酵素への暴露で色を変える
酵素基質溶液を用いた既知態様で決定される。

補酵素の定量測定は、分離処理せる細胞（又は残留液）
を、酵素系の影響を受けて色を変える基質含有溶液に付
すことによって遂行される。

而して、酵素系の臨界成分は補酵素である。

この系の他の酵素も基質溶液に含まれる。

一般に、本発明方法に用いることのできる細胞は、検出
しようとする抗生物質に敏感な細胞であればどれでも包
含する。

かくして、例えば、ペニシリンによって抑制される任意
の微生物がペニシリンタイプの抗生物質を検出するのに
用いることができた。

しかしながら、感度を高めるには、検出しようとする抗
生物質に対して「超敏感」な微生物を用いることがはる
かに好ましい。

近年、特定の抗生物質又は特定類の抗生物質に対して超
敏感な多系統の細胞が入手されるようになった。

βラクタム敏感性微生物の例にＢ．スブチリス、Ｂ．メ
ガテリウム、Ｓ．アウレウス、Ｐｓ．アエルギノサおよ
びＥ．コリ の或る突然変異体が包含される。

速度および感度の両面から最も有利な効果は、概ね約５
０℃を越える最適発育温度を有する超敏感性微生物系統
を用いて達成された。

この点で好ましい微生物はバシルス・ステアロテルモフ
イルス（ ＡＴＣＣＮｏ．１ ０ １ ４ ９ ）であ
る。

Ｂ．ステアロテルモフイルスＡＴＣＣＮｏ．１ ５ ９
５ ２も亦使用しつる。

この種の微生物を用いるとき高温でインキュベーション
を行うことができるので、抗生物質の結合速度が高まる
。

注目すべきは、本発明方法では必ずしも、細胞全体を用
いる必要はないということである。

かくして、完全な細胞に代えて、受容部位ないし作用箇
所の位置せる細胞次単位例えば細胞壁ないし細胞膜、リ
ボゾーム、結合酵素等を用いることができる。

例えば、ペニシリンＧは、通常細胞膜上に固定されたＤ
−アラニンカルボキシペプチダーゼに結合してその作用
を抑制することが知られている。

しかしながら、かかる酵素を単離するのに種種の方法が
有効であり、また細胞全体の代りに、これらを用いるこ
とができる（ Ｒ．Ｒｏｇｅｒｓ等の「Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ ｏｆＴ ｈｅｒ ｍｏｐｈｉ １ ｉｃ Ｄ −
Ａ ｌａｎｉｎｅ Ｃ ａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓ
ｅｆｒｏｍＭｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｂ． ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂ．ステアロテルモフ
イルス膜からの好温性Ｄ−アラニンカルボキシペプチダ
ーゼの精製および特性表示）」、Ｊ， Ｂｉｏｌ ，
Ｃｈｅｍ，、Ｖｏｌ．２４９ｐ４８６３〜４８７６参照
〕。

当業者に認識されるように、もしかかる次単位を本明細
書中に教示する如く不溶性固体又は類似物上に固定させ
れば該次単位を反応混合物の他成分より速やかに分離し
うるので、このような物質の使用は細胞全体を用いるこ
とと均等である。

従って、本明細書中用語「細胞部分」を用いるとき、そ
れは、細胞膜又は、受容部位を含有する他の構造部分の
如き細胞次学位のみならず細胞全体をも意味するものと
する。

本発明の方法はまた、綿棒、コラーゲンマトリックス、
ポリスチレンの壁若しくはビーズ、ポリアクリルアミド
ゲル又は、デイツプステイツクに付着せる少量の保形性
倍養寒天の如き適当な支持体上に固定された受容部位含
有細胞部分を用いて実施することもできる。

この場合、反応混合物の液成分から細胞を分離すること
が非常に簡単となり、またスピードアップされる。

細胞全体を用いるとき、好ましい分離方法は遠心処理に
よる方法である。

しかしながら、細胞を反応混合物の残り成分から分離す
る他の方法例えば限外濾過を用いることもできる。

以上の記載にかんがみて認識されるように、本発明の試
，験は、異なる複数種の液体媒質中に存在しうる各種抗
生物質又はその混合物を検出するのに適合しうる。

また、各種の標識抗生物質および細胞又は細胞次単位を
用いることができ、そしてまた、定性試験、定量試験の
いずれも企画することができる。

此処で、本発明を先ず、ペニシリンが０．００１ Ｉ．
Ｕ．／ｍｌ程度に少い量で存在する乳汁を迅速スクリー
ニングするのに適した特定の非制限的具体化に関して説
示する。

例１ バシルス・ステアロテルモフイルスを次の如く発育させ
た。

培養液： 溶液Ａ−テイフコ（ Ｄｉｆｃｏ ）酵母 ２．５
８ｋｇエキス デイフコ・バクトトリプ ２．５８ｋｇトン 二塩基性りん酸ナトリウ １．５４ｋｇム ー塩基性りん酸カリウム ５１５ ｇ 硫酸アンモニウム ５１５ ｇ 蒸留水 ５１５ ｌ 溶液Ｂ一無水硫酸マグネシウム １０３ ｇ蒸留水
１．． ２ ９ｌ溶液Ｃ一塩化
カルシウム・２Ｈ２０ １２．９ ｇ塩化マグネ
シウム ０．５２ｇ蒸留水
１．２９ｌ溶液Ｄ−グルコース
２．５８ｋｇ蒸留水 １２．９ｌ 条件：６０℃、曝気、１０％ 接種物 発育時間：２．５時間 発育方法： 溶液Ａを発酵器内で無菌化する。

別個に、溶液Ｂを無菌化し、これを溶液Ａｌｌ当り２．
５ ｍｌ量で溶液Ａに加える。

この培養液中の最終的な硫酸マグネシウム濃度をｏ．２
ｇ／ｌとする。

また別個に、溶液Ｃを無菌化し、これを溶液Ａｌｌ当り
２． ５ ｍｌ量で溶液Ａに加える。

この培養液中の最終的な化合物濃度を 塩化カルシウム・２Ｈ２０ ００２５ｇ／ｌ塩化
マグネシウム ０．００１ｇ／ｌとする。

また別個に、溶液Ｄを無菌化し、これを溶液Ａｌｌ当り
２５ｍｌ量で溶液Ａに加える。

この培養液中の最終的なグルコース濃度を５ｇ／ｌとす
る。

その際、先ず発酵器に入れた溶液Ａの温度を６０〜６５
℃範囲とすべきである。

而して、激しくかき混ぜながら、この発酵器に溶液Ｂ、
溶液Ｃおよび溶液Ｄを加える。

沈殿物の形成を防止するのに、激しい攪拌と溶液Ｃの緩
徐な添加を必要とした。

完全な培養液は、ｐＨ調節をしなくても６．９のｐＨを
有する。

消泡剤ダウコーニング（ ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ ）
Ｂを０．１％濃度で加える。

有機体を発育させるのに非常に激しい曝気を必要とする
。

発酵開始時、完全な培養液６ｌの入ったカーボイを１１
のエルレンマイヤーフラスコ２個の内容物とともにイン
キユベートする。

各フラスコの内容物は、一夜発育させた培地１５０ｍｌ
とする。

光学濃度の読みがＯ．１．５０（６００ｍμ）に達した
とき、カーボイの全内容物を用いて６０．ｅ発酵器をイ
ンキユベートする。

固形分が０．０３％になったとき、この６０ｌ発酵器を
用いて５３０ｌ発酵器をインキユベートする。

得られた細胞を０． ２ ＭのＮＨ４Ｃｌ （ ｐＨ
７． ０ ）５容で２回洗浄し、次いで０．ＯＩＭの酢
酸マグネシウム、０．０１Ｍのメルカプトエタノールお
よび０．０２ＭのトリスーＨＣＩ 緩衝剤を含有する緩
衝液（ｐＨ７．８）１０容で２回洗浄する。

次いで、細胞を遠心処理し、上澄み液をテカンテーショ
ンしたのち、上記溶液Ａ， ＢおよびＣの混合物中に再
懸濁させ、バイアルに分取する。

各バイアルの内容物は既知方法によって凍結乾燥し得且
つ約４℃で長時間貯蔵しうる。

発育培養液（−グルコース溶液）中で凍結乾燥すること
により、細胞の最大限の抗生物質結合作用が保全される
。

かかる凍結乾燥された細胞は、試験セットに用いられる
理想的な、濃度安定化せる細胞源を構成する。

用いた標識抗生物質は、１４Ｃ原子を含有するベンジル
ペニシリン（５０μキュリー／ｍｇ）で、Ａｍ ｅｒｓ
ｈａｍ Ｓ ｅａｒｌｅ社より購入した。

この試剤も亦安定化のため凍結乾燥することができる。

定量的結果を得るために、また対照として役立てるため
に、２種又はそれ以上の液試料を平行試験することがで
きる。

而して、液試料のうちの一方は抗生物質のないことがわ
かっているものであり、他の試料は検定しようとする抗
生物質を既知量例えばペニシリンを０．０１単位含有す
るものとする。

かかる試料も亦安定化のため凍結乾燥することができる
。

上記試薬はいずれも蒸留水又は、わずかに酸性側のｐＨ
を有するりん酸塩緩衝剤で再組成することができる。

ペニシリンの場合、結合は最適には６．０〜７．０範囲
のｐＨで生起する。

而して、安定化された細胞、標識抗生物質および対照（
又は標準曲線）が、本発明に従って検定を行うのに適し
た試験セットを構成する。

上記試薬の組合せ物を用いて標準曲線を作成し、ペニシ
リンの有無について未知試料を試験した。

先ず、既知濃度のベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）
を含有する乳汁試料１ ２ １． ０ ｍｌを、（１）
Ｂ．ステアロテルモフイルス懸濁物試料（凍結乾燥物か
ら再組成したもので、既述の如く調製せるバイアルに蒸
留水２． ５ ｍｌを添加したもの）１００ｍｌおよび
（２）” Ｃ ｉ識ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ
）（約１００００カウント／ｍｉｎを示すのに十分な量
）とともにインキュベーションに付すことによって標準
曲線を作成した。

インギュベーションは、９０℃に温度設定せる乾燥浴イ
ンキュベーター内で３分間行った。

次いで、２分間３０００Ｇでの遠心処理により細胞を分
離した。

上澄み液を排出したのち、細胞をかき乱さないようにし
て遠心チューブをりん酸塩緩衝剤でゆすいだ。

次いで、チューブからシンチレーションバイアルに細胞
を移した。

このとき、洗液としてシンチレーション流体を用いた。

而して、後者工程は、１２５■ 標識を用いるとき排除
し得、それによって標識分子を直接検出することができ
る。

結果を下記表Ｉに示す。

上表より認識しうるように、試料中のベンジルペニシリ
ン量が０（試料番号３および４）から１． Ｏ ｎｇ
／ｍｌ（試料番号９および１０）へと増加するにつれ、
カウント数の有意且つ急激な低下が生じた。

表Ｉの資料を第２図に示す。この図は、試料カウント／
零カウントに対してペニシリンの濃度（ｎｇ／ｍｌ）
をプロットしたグラフである。

上記表を比較基準として用いながら、市販乳製造業者の
調製せる乳汁試料２０個について試験した。

用いた方法は上記標準曲線を作成した方法と同じである
が、但し追加工程として試，験試料より得られたカウン
ト数／ｍｉｎを標準曲線と比較し、またペニシリンのＨ
ｇ ／ｍｉ値を■，Ｕ．／ｍｌ値（ ０． ０ １ １
．Ｕ．：６ ｎｇ ） に換算した。

これらの結果を下記表■に示す： 注目すべきは、上記試１験で、約６分の試験時間（カウ
ント時間は含まない）内で０．０１Ｉ．Ｕ．程度に少い
ペニシリンの存在が一貫して検出されたということであ
る。

また、上記方法では、試料と標識ペニシリンとをわずか
３分間インキユベートし、それと同時に実施される遠心
拠埋は２分だけということにも注目すべきである。

この試験は、できるたけ速やかに、しかも受容しうる感
度となるように特に企画された。

Ｂ．ステアロテルモフイルス、標識ベンジルペニシリン
（１５００カウント／ｍｉｎ）および、９０℃に温度設
定せる乾燥浴インキュベーターでの３分間インキュベー
ションを用いたできるだけ高い感度を立証ずべく別の試
験を行った。

この試１験結果を下記表■に示す。

表■に記載の資料は、試料の抗生物質濃度をＯから０．
０ ０ １ Ｉ．Ｕ，、０．００２Ｉ，Ｕ，および０．
００５Ｉ．Ｕ．へと高めるとき、分離された細胞部分に
関連せるカウント数／ｍｉｎが有意に低下したことを例
示している。

この試験は、計数工程を含み１０分内で実施されうる。

例１■ 例１に記載の方法に従ってバシルス・ステアロテルモフ
ィルスを発育させた。

得られた細胞懸濁物を音波処理して細胞を溶解した。

好ましくは、その間試刺を水浴中に浸漬せしめた。

この音波処理せる懸濁物を５分間２５００Ｇの遠心処理
に付すことによって、溶解していない細胞を除去した。

また、１０分間５０００Ｇの遠心処理に付すことによっ
て、ペニシリン結合箇所を含有する細胞膜を単離した。

次いで、５ＭのＮ ａ Ｏ Ｈ でｐＨ＝１１．０に
調節せる ３ ０ｇ／ｌのＣＮＢｒ 溶液１ ０ ０
ｍｌに綿棒１ Ｏ Ｏ個（綿部分６．５ｇ）を入れた
。

１０分後、綿棒を取出し、ＮａＨＣＯ３溶液でゆすいだ
のちこれを、ＮａＨＣＯ３溶液（ ｐＨ ＝ ８．１．
）に上記の如く調製した細胞膜を懸濁したものの中に
入れた。

４℃で１８時間かき混ぜたあと、臭化シアンによって細
胞膜を綿棒に共有結合させた。

次いで、綿棒を蒸留水でゆすぎ、エタノールアミンに２
時間浸漬したのち再度ゆすいで乾燥した。

ペニシラン酸とペルオキシグーゼとの抱合物（ ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ ）を次のようにして調製した。

すなわち、６アミノペニシラン酸２ ８． １ ｍｇを
含有するアルカリ溶液（ｐＨ＝９．０）と、ベルオキシ
ダーゼ８．８ｍｇおよびカルボジイミド８．２７ｍｇを
含有する、りん酸塩緩衝剤入りペルオキシダーゼ水溶液
とを混合した。

この反応混合物を攪拌下４℃で２４時間保持した。

その結果、ベルオキシダーゼと６アミノペニシラン酸は
共有結合した。

このようにして得られた抱合物溶液を０．０５Ｍのりん
酸塩緩衝剤入り塩水（ＰＢＳ）に対し透析せしめた。

溶液の初回変化のあと、このＰＢＳからペニシリン活性
が消失した。

溶液の４回変化のあと、ペニシリンーペルオキシダーゼ
抱合物はそのまゝ使用しうる状態にあった。

上記の如く調製せる試剤を用いた検定は、綿棒を抱合物
溶液１． ０ ０ｍｌと一緒に各試験試料（又は対照）
に加えることによって実施される。

ずなわち、この反応混合物を乾燥浴インキュベーター内
で３分間５０℃でインキユベートする。

この間、ペルオキシダーゼ標識ペニシラン酸と試料中に
ペニシリンが在ればそのものとが競合して、綿棒に付着
せる細胞膜上の作用箇所に結合しようとする。

次いで、試料をチューブから注ぎ、綿棒を水洗して結合
していない抱合物を除き、チューブに基質溶液１ ｍｌ
を加える。

基質溶液は０．３％のＨ２０２１，０ｍｌ、４アミノア
チピリン２５ｍｇおよび、蒸留水５０ｍｌに溶解せるフ
ェノール２０ｍｌよりなった。

次いで、この綿棒十基質を２５℃でインキユベートした
。

もし、試料中にペニシリンが０．０５単位未満で存在す
るなら、ペルオキシダーゼの作用によりしかも目視検出
しうるピンク→レツド変色を約１５分できたすに十分な
抱合物が綿棒上に固定される。

１５分後色が現われなげれば、試料は０．０５単位／ｍ
ｌを上回るペニシリン含量を有する。

より精確な結果を得たいときは、分光光度計で５１０ｍ
μにおける基質の光学濃度を読むことができる。

代表的な試験の結果を次に示す：例ＩＩＩ ストレプトマイシンを検出することのできる速度および
感度を例示するために別の試験を行った．６５ｍｌの乳
汁試料にストレプトマイシンを、該含量がＯｎｇ／ｍｌ
、１ ｎｇ／ｍｌ、１ ０ ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／
ｍｌ， １ ０ ０ ０ｎｇ／ｍｌおよび１ ０ ６
ｎｇ ／ｍｌになるように混合した。

各試料に、例Ｉで既述した如く調製せるＢ．ステアロテ
ルモフイルスの凍結乾燥物０．２ｍｌを水８ｍｌで希釈
することにより再組成したものとトリチウム標識ジヒド
ロストレプトマイシン（２２８０００カウント／ｍｉｎ
）（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ． Ｓｅａｒｌｅ社の市販
品）を混合した。

（なお、例■に記載の如き遠心分離せる細胞を、１〜５
００倍の希釈物が６００ｍμの波長で０．６０の光学濃
度を有する如き濃度に再懸濁させることによって、凍結
乾燥に先立ち適当な濃度のＢ．ステアロテルモフイルス
懸濁物が得られる。

）この混合物を加熱することによって、細胞内でのトリ
チウム標識ジヒドロストレプトマイシンの、該結合箇所
における結合が容易になる。

それ故、本例では、試料の温度が６０〜６５℃になるよ
うに、初期１０〜２０゜Ｃの試料を乾式ブロックヒータ
ー内で９０℃に加熱した。

次いで、試料を３０００Ｇで３分間遠心処理し、上澄み
液をテカンテーションし、沈澱物の各々を蒸留水で２回
洗浄した。

次いで、沈殿物（細胞）をシンチレーション流体によっ
てシンチレーションバイアルに移し、１分間のカウント
数を読み取った。

これらの試験結果を下記表■に示す： 上表より認識しうるように、試料のストレプトマイシン
量を０（試料番号１）から１、１０および１ ０ ０
ｎｇ ／ｍｌ並びにそれ以上に高めるにつれ、カウント
数が有意に低下する。

依って、試料を前記方法に従い処理し、そのカウント数
を表の資料と比較することによって、該試料中１ ｎｇ
／ｍｌ程度の少量で存在ずるストレプトマイシンを検
出することができる。

かかる決定は約８分内で遂行しうる。

以上の記載にかんがみて当業者により認識される如く、
例えば、試料中に存在する抗生物質を全て受容体に結合
させるのに十分な時間該試料を抗生物質敏感性細胞とと
もにインキユベートすることによって、更に低い濃度の
抗生物質をも検出することができる。

すなわち、インキュベーションのあと、標識抗生物質を
加えることによって、このものは残存せる受容体に結合
する。

かかる変更を別にすると、検出方法は実質上前記のもの
と同じである。

その場合の速度は若干低下するが、感度は一段と高くな
る。

本発明は、その精神又は基本特性を逸脱することなく他
の特定態様で具体化することができる。

それ故、前記具体化は全ての点において限定的でなく例
示的なものと考えるべきである。

本発明の範囲は、前記説明によるよりは特許請求の範囲
によって示される。

而して、該特許請求の範囲の意味および均等な範囲内に
入る修正ないし変更は全て本発明に包含されるものとす
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗生物質検出方法を例示するフロー
シ一トであり、第２図は、ベンジルペニシリンを検出す
る際本発明を実施するための標準曲線を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体試料中に存在しうる抗生物質の検出方法であっ
   て、 Ａ．前記試料を、前記抗生物質と結合しうる受容部位を
   もつ微生物又は微生物部分とともにインキユベートし、
   而して該インキュベーションは、前記試料中に抗生物質
   が存在するときその分子を前記受容部位に結合させる条
   件下で実施され、Ｂ．前記工程Ａの混合物を、前記受容
   部位と結合しうる標識物質とともにインキユベートし、
   Ｃ．固体相と液体相とを分離し、 Ｄ．該固体相又は該液体相に関連せる標識物質の量を測
   定し、 Ｅ．この測定値を標準と比較して前記試料中の枕生物質
   の有無を知る諸工程を包含する方法。 ２ 固体相に関連せる標識物質の量が測定される特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 工程ＡおよびＢが同時に実施される特許請求の範囲
   第１項又は２項記載の方法。 ４ 標識物質が標識された抗生物質、又はその誘導体若
   しくは先駆体よりなる特許請求の範囲第１項〜３項いず
   れか記載の方法。 ５ 標識物質の標識が放射性原子、酵素又は補酵素であ
   る特許請求の範囲第１項〜４項いずれか記載の方法。 ６ 微生物が、検出しようとする抗生物質に対して敏感
   ないし超敏感である特許請求の範囲第１項〜５項いずれ
   か記載の方法。 ７ 抗生物質に対して敏感な微生物は、約５０℃よりも
   高い最適増殖温度を有する菌株ないしは系統のものであ
   り、そしてインキュベーションの温度が５０゜Ｃより高
   い特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 検出しようとする抗生物質がβラクタム抗生物質で
   あり、また標識物質がβラクタム部分を包含し、そして
   また微生物がβラクタム抗生物質敏感性微生物である特
   許請求の範囲第１項〜７項いずれか記載の方法。 ９ 微生物カバシルス・ステアロテルモフイルス（ Ｂ
   ａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
   ｓ ）である特許請求の範囲第１項〜８項いずれか記載
   の方法。 １０ 検出しようとする抗生物質と標識抗生物質とが
   同じである特許請求の範囲第４項記載の方法。 １１ 検出しようとする抗生物質が、ベンジルペニシ
   リン、セファロスポリン、アンピシリン、オキサシリン
   、メチシリン、クロキサシリン、セファロスポリジンお
   よびセファロチンよりなる群から選ばれ、また標識抗生
   物質が放射性元素で標識された６アミノペニシラン酸お
   よびベンジルペニシリンよりなる群から選ばれる放射性
   標識物質である特許話求の範囲第４項記載の方法。 １２ 検出しようとする抗生物質がストレプトマイシ
   ンであり、また標識物質がトリチウムで標識されたジー
   若しくはテトラヒドロストレプトマイシンである特許請
   求の範囲第４項〜７項いずれか記載の方法。 １３ 分離工程が遠心処理により実施される特許請求
   の範囲第１項〜１２項いずれか記載の方法。 １４ 微生物又は微生物部分が水不溶性支持体上に固
   定され、而して分離工程が、該支持体を液体から取出し
   、これを洗浄することによって実施される特許請求の範
   囲第１項〜１３項いずれか記載の方法。 １５ 液体試料が、乳汁、体液、発酵肉汁および肉よ
   り抽出せる液よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第
   １項〜１４項いずれか記載の方法。 １６ 工程Ｅで用いられる標準が、固体相に関連せる
   標識物質の量の定量的表示に対しプロットされた抗生物
   質濃度の標準曲線である特許請求の範囲第１項〜１５項
   いずれか記載の方法。 １７ 酵素標識が用いられ、また存在する酵素の量表
   示が、該酵素標識の触媒的影響に応答した色変化を示す
   ことのできる酵素基質溶液とのインキュベーションで得
   られ、そしてまた工程Ｅで用いられる標準が標準条件下
   で測定された光学濃度値よりなり、而して該値は選定せ
   る抗生物質の濃度に相当する特許請求の範囲第５項又は
   、該第５項に従属するときの特許請求の範囲第６項〜１
   ５項いずれか記載の方法。 １８ 液体試料中に存在しうる抗生物質の検定用試験
   セットにして、 Ａ．検出１−ようとずる抗生物質と反応する受容部位を
   有する濃度安定化された微生物又は微生物部分、 Ｂ．前記微生物又は微生物部分とともにインキユベーシ
   ョンされるとき前記受容部位と結合しうる標識物質、並
   びに Ｃ．前記微生物と前記標識物質とを以て液体試料に対し
   なされた試験の結果を比較して、試料中の前記抗生物質
   の定性ないし定量的測定をもたらしつる標準の組合せ物
   よりなる試験セツト。 １９ 試薬Ｂがトリチウム、１２５■又は１４Ｃ で
   標識されている特許請求の範囲第１８項記載の試験セツ
   ト。 ２０ 試薬Ａが、抗生物質超敏感性微生物の細胞部分
   を表面に固定させた水不溶性支持体よりなり、また試薬
   Ｂが酵素で標識された抗生物質よりなり、加えて酵素標
   識の触媒的影響に答応した色変化を示すことのできる酵
   素基質溶液をも含む特許請求の範囲第１８項記載の試験
   セット。 ２１ 微生物又は微生物部分がバシルス・ステアロテ
   ルモフイルスよりつくられる特許請求の範囲第１８項〜
   ２０項いずれか記載の試験セット。 ２２ 標準が、標準曲線、検出しようとする抗生物質
   を既知濃度で含有する少くとも１種の試料および標準試
   験条件下で測定された、選定抗生物質濃度に対応する標
   準読取り値である特許請求の範囲第１８項〜２１項いず
   れか記載の試験セット。