JPH0655759B2 - ハイブリドインタ−フエロン及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、新規なハイブリドインターフェロン、組換
ＤＮＡ技法によるその微生物的製造、並びにウイルス性
疾患及び新生物疾患の治療におけるその使用に関する。

〔従来の技術〕

インターフェロン（ＩＦＮ）は、種々のマイトジエン及
びウイルスに暴露された後に多くの種類の真核細胞によ
り分泌されるポリペプチドの一群である。インターフェ
ロンはそれらの化学的性質及び生物学的性質により３つ
の群、すなわちＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−
γに分類されている。ＩＦＮ−α及び−βの遺伝子は、
ウイルス、ウイルス成分、及び２本鎖ＲＮＡにより処理
された細胞中で優先的に発現される。他方、ＩＦＮ−γ
はマイトジエンに反応して合成される。

ヒトＩＦＮ−αは１５個以上の非−対立遺伝子から成る
一群の遺伝子によりコードされる。ヒトＩＦＮ−β及び
ヒトＩＦＮ−γはそれぞれ１個の遺伝子によりコードさ
れる。ＩＦＮ−αの一次翻訳生成物は189個のアミン酸
から成り（但し、ＩＦＮ−α_２は188個のアミノ酸から
成る）、これらのアミン酸から２３個のアミノ酸から成
るシグナルペプチドが翻訳後変形により除去される。ヒ
トＩＦＮ−β及びヒトＩＦＮ−γはそれぞれ187個及び1
86個のアミノ酸から成り、これらのアミノ酸からシグナ
ルペプチドを構成する２１個又は２０個のアミノ酸が除
去される。ＩＦＮ−αのサブタイプ間のアミノ酸配列の
相同性は80〜85％であり、他方ＩＦＮ−βとＩＦＮ−α
との間の相同性は約30〜40％である。ＩＦＮ−γとＩＦ
Ｎ−αとは１２％の同一残基に対応するわずかなアミノ
酸の相同性を示す。

ＩＦＮは抗ウイルス活性、免疫調節活性及び細胞変性活
性を示す。ＩＦＮ−αのサブタイプ（例えばＩＦＮ−α
_２、ＩＦＮ−α_１）は異る標的細胞特異性を示すことが
証明されている。ＩＦＮ−α_２及びＩＦＮ−α_１の抗ウ
イルス活性はウシ（ＭＤＢＫ）細胞に対してはおよそ同
じであるが、ヒト（ＷＩＳＨ）細胞に対してはＩＦＮ−
α_２がＩＦＮ−α_１に比べて７倍効果的であり、そして
マウス(L929)細胞の保護についてはＩＦＮ−α_２の活性
はＩＦＮ−α_１のそれの３０分の１である〔M.Streuli
等、Pro.Natl.Acad.Sci.USA,78,2848(1981)〕。多遺伝
子ＩＦＮ−α群の構成員はそれらの抗ウイルス活性の程
度及び特異性を異にするという証拠が幾つかのＩＦＮ−
α“ハイブリド”から得られた結果により確認されてい
る（ＥＰ32134、ＵＳ4,414,150を参照のこと）。これら
の“ハイブリド”はインターフェロン−αのサブタイプ
をコードする２つの遺伝子を制限酵素ＰｖｕII（又は、
２つのケースにおいてはＢｇｌII）により開裂せしめ、
そして得られた断片を交差連結して、１つのＩＦＮ遺伝
子のアミノ末端部分をコードするＤＮＡ配列を他方のＩ
ＦＮ遺伝子のカルボキシ末端部分をコードするＤＮＡ配
列に融合せしめることにより造成された。これらのハイ
ブリドインターフェロンは、親インターフェロンに比べ
て標的細胞特異性における変化を示すが、３種類のイン
ターフェロン活性のいずれかのなんらかの減少又はなん
らかの制限が存在することは証明されなかった。このよ
うな減少又は制限は、例えば、投与されたインターフェ
ロンの他の活性によりもたらされる因子を併発する可能
性を伴わないでウイルス感染のごとき特定の問題にイン
ターフェロン療法を集中することが望ましい臨床的適用
において、好ましいであろう。

〔発明の目的〕

従って、この発明の１つの目的は、インターフェロンに
より誘発される生化学的経路の幾つかのみの選択的又は
優先的活性化により生ずる一層特異的な生物学的活性を
示し、そして天然インターフェロンのその使用を制限す
る不所望の副作用、例えばインフルエンザ様症状（例え
ば、発熱、頭痛及び疲労）、胃腸不全、血圧の低下及び
脱毛が排除され又は低減されている新規なハイブリドイ
ンターフェロンを提供することである。

〔発明の概要〕

この発明のハイブリドインターフェロンは、次の配列： を有する、ヒト−リンポブラストイドインターフェロン
ＬｙＩＦＮ−α−２と、次の配列： を有するヒト−リンポブラストイドインターフェロンＬ
ｙＩＦＮ−α−３とに由来する。

これらのインターフェロン及びその製造方法は、ヨーロ
ッパ特許出願NO.76,489に記載されている。ＬｙＩＦＮ
−α−２はヒト白血球インターフェロンＬｅＩＦ−αβ
（米国特許NO.4,414,150を参照のこと）と近縁であり
（しかしそれと同一ではない）、そして一次ウシ腎細胞
及びヒト胎児包皮細胞（ＨＥＦ）（それぞれ水疱性口内
炎ウイルスに感染したもの）に対してそれぞれ1.85×10
⁸ＩＵ／mg及び2.45×10⁸ＩＵ／mgの比活性を有する。Ｌ
ｙＩＦＮ−α−３はヒト白血球インターフェロンＬｅＩ
Ｆ−αＤ（米国特許NO.4,414,150を参照のこと）に近縁
であり（しかしそれと同一ではない）、そしてウシの細
胞及びＨＥＦ細胞（前記と同様）に対してそれぞれ1.32
×10⁸ＩＵ／mg及び3.7×10⁶ＩＵ／mgの比活性を有す
る。さらに、ＬｙＩＦＮ−α−３はＬｙＩＦＮ−α−２
に比べて高い熱安定性及び低い抗増殖活性を有する。

この発明の特定の目的は、ヒトの細胞に対するＬｙＩＦ
Ｎ−α−２の高い抗ウイルス力価及び／又は高い抗増殖
活性と、ＬｙＩＦＮ−α−３の高い熱安定性を併せ持つ
ＬｙＩＦＮ−α−２／α−３ハイブリドポリペプチドを
提供することである。

この発明は特に、ヒト−リンポブラストイドインターフ
ェロンＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−α−３のサ
ブ配列にアミノ酸の同一性及び数において対応する２〜
４個のサブ配列から成るアミノ酸配列を有するハイブリ
ドインターフェロンポリペプチドに関し、このハイブリ
ドインターフェロンポリペプチドは、ＬｙＩＦＮ−α−
２のアミノ酸１〜150とＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸1
51〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜92とＬｙＩＦＮ
−α−３のアミノ酸93〜150とＬｙＩＦＮ−α−２のア
ミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、及びＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜60とＬ
ｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸61〜92とＬｙＩＦＮ−α−
２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸93〜150とＬｙＩ
ＦＮ−α−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸151〜1
66とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチドから成
る群から選択される。

〔具体的な説明〕

さらに、具体的には、この発明は次の式（Ｉ）： で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ
_３Ｄ_４”； 次の式(II)： で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ
_３Ｂ_４”； 次の式(III)： で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ
_３Ｄ_４”； 次の式(IV)： で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ
_３Ｂ_４”； 次の式(V)： で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ
_３Ｄ_４”；及び、 次の式(VI)： で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ
_３Ｄ_４”；に関する。

この発明の最も好ましいハイブリドインターフェロンは
“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”(V)、及び“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”
(II)である。

この発明のハイブリドインターフェロンは、例えば次の
段階： (a)インターフェロンＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦ
Ｎ−α−３のそれぞれアミノ酸６０、アミノ酸９２及び
アミノ酸150に相当する位置におけるインビトロ組換に
よるか、又は化学的ＤＮＡ合成により前記インターフェ
ロンをコードする構造遺伝子を含んで成るＤＮＡを調製
し、そしてこの得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに
導入し； (b)ハイブリドＩＦＮ構造遺伝子を担持する得られたハ
イブリドベクターを受容体宿主に移し； (c)通常、形質転換された宿主のみが生存する条件下で
培養することにより未形質転換宿主から形質転換宿主を
選択し； (d)該形質転換された宿主を前記ハイブリドＩＦＮ構造
遺伝子の発現を許容する条件下で培養し；そして、 (e)発現されたハイブリドＩＦＮを単離する； ことを含んで成る組換ＤＮＡ技法により製造することが
できる。

適用される方法は、以下の詳細な記載及び添付図面によ
り一層明らかになるであろう。

１．ハイブリドＩＦＮ構造遺伝子を含有するハイブリド
ベクターの調製 ヒト−インターフェロン−α−サブタイプα−２及びα
−３のｃＤＮＡはＥ．コリ（Ｅ．coli）中にクローン化
されている。すなわち、プラスミドｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ
ｙＩＦＮ−α−２及びｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α
−３は、β−ラクタマーゼプロモーターの制御のもとに
ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−α−３のコード領
域を含有するＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ（又はＥ_１０ＲＩ
−ＰｓｔＩ）ＤＮＡ挿入部を含有する（ヨーロッパ特許
出願NO.76,489を参照のこと）。この挿入部の制限地図
を第３図に示す。これらの遺伝子は幾つかの共通の制限
部位を共有し（ＩＦＮアミノ酸配列の６０位、９２位及
び150位に位置する）、これらを、好都合な生物学的及
び／又は物理的性質を有するハイブリドインターフェロ
ンをコードする新規な遺伝子を造成するために便利に使
用することができることが容易にわかる。

従って、ＬｙＩＦＮ−α−２遺伝子及びＬｙＩＦＮ−α
−３遺伝子の間の組換体（１又は複数の交換）を、Ｐｖ
ｕII部位（９２位）及び／又はＳａｕ３Ａ部位（６０位
及び150位）におけるインビトロ組換によって生じさせ
ることができる。インターフェロンの一次構造を４個の
セクション（アミノ酸１−60の第１セクション、アミノ
酸61−92の第２セクション、アミノ酸93−150の第４セ
クション、及びアミノ酸151−166の第４セクション、第
３図を参照のこと）に分けることができるから、それぞ
れがこれらのセクションの１つを示す４個の文字により
この発明のハイブリドインターフェロンを命名すること
ができる。従って例えば、インターフェロンＬｙＩＦＮ
−α−２（前記のようにＩＦＮ−αＢに近縁であるので
“Ｂ”とする）のセクション１〜３とＬｙＩＦＮ−α−
３（前記のようにＩＦＮ−αＤに近縁であるので“Ｄ”
とする）のセクション４とから成るハイブリドインター
フェロン（Ｉ）はＩＦＮ“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”と称され
る。

所望のハイブリドインターフェロンの製造を促進するた
め、ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−α−３コード
領域を含有するＤＮＡ挿入部を、再連結のために制限部
位ＨｉｎｄIII（又はＥ_ｃｏＲＩ）、ＰｖｕII及びＰｓ
ｔＩがそれらの挿入部についてユニークであるように変
形しなけばならない。ＬｙＩＦＮ−α−２をコードする
遺伝子の３′シストロン外領域に追加のＰｖｕII部位が
存在することが第３図から明らかである。この部位は、
例えば、ＬｙＩＦＮ−α−２コード領域を含有するハイ
ブリドベクターをＰｖｕIIにより部分開裂せしめ、生ず
る線状化ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩにより認識されるＤ
ＮＡ配列を含有するリンカーに連結し、ＰｓｔＩにより
開裂せしめ、その消化物を低ＤＮＡ濃度において再連結
し、そして所望の変形、すなわちＰｖｕII部位が除去さ
れた短縮された３′シストロン外領域を有するプラスミ
ドを選択する（例えば制限酵素分析により）ことにより
容易に除去することができる。同様にして、ＩＦＮ遺伝
子をクローニングするために使用されるベクターを、こ
れらにとって制限部位ＨｉｎｄIII、ＰｖｕII及びＰｓ
ｔＩがユニークであるように有利に変形することができ
る。

この発明は、式（Ｉ）〜(VI)のハイブリドインターフェ
ロンのいずれかをコードしそして発現制御配列に作用可
能に連結されているＤＮＡ配列を含んで成るハイブリド
ベクター、及びその製造方法に関する。

ベクターは、形質転換に使用される宿主細胞に依存して
選択される。適当な宿主の例は、制限酵素又は修飾酵素
を有しないか又は少ししか有しない微生物、例えば酵
母、例えばサッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyc
es cereviside)、及び細菌の株、特にエシェリシヤ・コ
リ(Escherichia coli)の株、例えばＥ．コリＸ1776、
Ｅ．コリＨＢ101、Ｅ．コリＷ3110、Ｅ．コリＨＢ101／
ＬＭ1035、Ｅ．コリＪＡ221又はＥ．コリＫ12株294、バ
シルス・ズブチリス(Bacillus subtillis)、バシルス・
ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilu
s)、シュードモナス(Pseudomonas)、ヘモフィルス(Haem
ophilus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)等、そ
してさらに高等生物の細胞、特に樹立されたヒト又は動
物のセルラインである。Ｅ．コリの上記の株、例えば
Ｅ．コリＨＢ101及びＥ．コリＪＡ221、そしてさらにサ
ッカロミセス・セレビシエーが宿主微生物として好まし
い。

特に、選択された宿主中で複製し、そしてこの発明のハ
イブリドＩＦＮ遺伝子を発現するすべてのベクターが適
当である。Ｅ．コリ株中でのハイブリドインターフェロ
ン遺伝子の発現に適当なベクターの例は、バクテリオフ
ァージ、例えばλバクテリオファージの誘導体、又はプ
ラスミド、例えば特に、プラスミドＣｏｌＥｌ及びその
誘導体、例えばｐＭＢ９、ｐＳＦ2124、ｐＢＲ317又は
ｐＢＲ322である。この発明の好ましいベクターはプラ
スミドｐＢＲ322に由来する。適当なベクターは完全な
レプリコン及びマーカー遺伝子を含有し、このマーカー
遺伝子は表現型形質に基いて発現プラスミドにより形質
転換された宿主を選択しそして同定することを可能にす
る。適当なマーカー遺伝子は宿主に、例えば重金属、抗
生物質等に対する耐性を付与する。さらに、この発明の
好ましいベクターは、レプリコン及びマーカー遺伝子領
域の外側に制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を
含有し、これによってこれらの部位にハイブリドＩＦＮ
遺伝子及び適当な場合には発現制御配列を挿入すること
ができる。好ましいベクターであるプラスミドｐＢＲ32
2は、無傷のレプリコン、テトラサイクリン及びアンピ
シリンに対する耐性を付与するマーカー遺伝子（ｔｅｔ
^Ｒ及びａｍｐ^Ｒ）、並びに例えばＰｓｔＩ（ａｍｐ^Ｒ遺
伝子中を開裂せしめ、ｔｅｔ^Ｒ遺伝子を無傷のまま残
す）、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII及びＳａｌＩ（いずれ
もｔｅｔ^Ｒ遺伝子を開裂せしめ、ａｍｐ^Ｒ遺伝子を無傷
のまま残す）、ＮｒａＩ、並びにＥｃｏＲＩの多数のユ
ニーク制限部位を含有する。

幾つかの発現制御配列を遺伝子発現の制御のために使用
することができる。特に、形質転換されるべき宿主の高
度に発現される遺伝子の発現制御配列が使用される。ハ
イブリドベクターとしてのｐＢＲ322及び宿主微生物と
してのＥ．コリの場合には、例えば、ラクトースオペロ
ン、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン
等、及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御領域（これ
らは特にプロモーター及びリボゾーム結合部位を含
む）、並びにファージλＮ遺伝子又はファージｆｄ−コ
ート蛋白質遺伝子の対応する配列等が適当である。プラ
スミドｐＢＲ322はβ−ラクタマーゼ遺伝子（β−ｌａ
ｃ遺伝子）のプロモーターをすでに含有しているが、こ
のプラスミドに他の発現制御配列を導入しなければなら
ない。

酵母中での複製及び発現のために適当なベクターは、酵
母複製開始点、及び酵母のための選択遺伝子マーカーを
含有する。酵母複製開始点、例えば染色体自律複製セグ
メント（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクターは、形
質転換の後酵母細胞内で染色体外に維持され、そして自
律的に複製する。さらに、酵母２μプラスミドＤＮＡに
相同な配列を含有するハイブリドベクターを使用するこ
とができる。このようなハイブリドベクターは、細胞内
にすでに存在する２μプラスミド中に組換により組み込
まれるか、あるいは自律的に複製するであろう。２μ配
列は、高形質転換頻度を有するプラスミドのために特に
有用であり、そして高コピー数を可能にする。この発明
の好ましいベクターはプラスミドｐＪＤＢ207である。

酵母のための適当なマーカー遺伝子は特に、宿主に抗生
物質耐性を付与するもの、又は栄養要求性酵母変異株の
場合には宿主の欠損を補完する遺伝子である。対応する
遺伝子は例えば、抗生物質シクロヘキシドに対して耐性
を付与するもの、又は栄養要求性酵母変異株に原栄養性
を提供するものであり、例えばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、Ｈ
ＩＳ３、又は特にＴＲＰＩ遺伝子である。好ましくは酵
母ハイブリドベクターはさらに、。ハイブリドベクター
及びその中間体の造成及びクローニングを細菌宿主中で
行うことができるように、細菌宿主、特にＥ．コリのた
めの複製開始点及びマーカー遺伝子を含有する。

酵母中での発現に適する発現制御配列は例えば高度に発
現される酵母遺伝子の制御配列である。すなわち、ＴＲ
ＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨII遺伝子、酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＨＯ３又はＰＨＯ５）遺伝子、イソチトク
ローム遺伝子のプロモーター、又は解糖経路の酵素に関
与するプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ
Ｈ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘ
キソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホ
フラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベー
トキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロ
モーターを使用することができる。この発明の好ましい
プロモーターは転写制御を伴うプロモーター、例えばＰ
ＨＯ５、ＡＤＨII及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター
を含有し、これらは増殖条件の変化によりターンオン又
はターンオフされ得る。例えば、ＰＨＯ５プロモーター
は単に培地中の無機リン酸塩の濃度を上昇又は低下せし
めることによって抑制又は抑制解除され得る。

哺乳動物細胞中で使用するためのプロモーターは、例え
ばウイルスプロモーター、例えばＨＴＬＶ、ＳＶ４０、
ワクチニアプロモーター等である。

ハイブリドインターフェロンの効果的な発現を保証する
ように、プロモーターがコード領域に連結される。この
発明の１つの態様においては、プロモーターが連結部に
挿入された翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）を介して成熟ハ
イブリドＩＦＮのコード領域に直接連結される。プロモ
ーターをハイブリドＩＦＮコード領域に連結するための
好ましい領域は大ｍＲＮＡ出発部とそのプロモーターに
天然に付加されている遺伝子のＡＴＧとの間である。

この発明の他の態様において、特に宿主微生物として酵
母が使用される場合、造成物中にシグナル配列を含有せ
しめる。適当なシグナル配列は使用されるプロモーター
に天然に連結されているものである。例えば、ＰＨＯ５
シグナル配列、さらに酵母インベルターゼ遺伝子又はα
−ファクターゼ遺伝子のシグナル配列を使用することが
できる。シグナル配列と成熟ハイブリドＩＦＮアミノ酸
配列との間の正確な開裂を可能にする組み合わせが好ま
しい。追加の配列、特異的なプロセシングシグナルを担
持しているか又は担持していないプロ配列又はスペーサ
ー配列をも造成物中に含有せしめて前駆体分子の正確な
プロセシングを促進することが好ましい。他の方法とし
て、インビボ又はインビトロで適切な成熟を可能にする
内部プロセシングシグナルを含有する融合蛋白質を生じ
させることができる。

好ましくは、この発明のハイブリドベクターはさらに、
転写停止及びポリアデニレーションのための適切なシグ
ナルを含有する、遺伝子の３′−フランキング領域をも
含有する。適当な３′−フランキング領域は、例えば使
用されるプロモーターに天然に連結されている遺伝子の
それである。酵母が宿主微生物として使用されそしてＰ
ＨＯ５プロモーターが発現制御配列として使用される場
合、３′−フランキング配列は好ましくはＰＨＯ５遺伝
子のそれである。

好ましい態様において、この発明は、宿主株において複
製及び表現型選択が可能でありそしてプロモーター及び
新規なハイブリドインターフェロンのいずれかをコード
するＤＮＡ配列を含んで成るハイブリドベクターに関
し、このＤＮＡ配列はこのハイブリドベクター中の転写
開始シグナル及び転写停止シグナル並びに翻訳開始シグ
ナル及び翻訳終止シグナルと共に、前記プロモーターの
制御のもとにあり、この結果、形質転換された宿主中で
該ＤＮＡ配列が発現されこの発明のハイブリドインター
フェロンが生産される。

この発明のハイブリドベクターは、ＬｙＩＦＮ−α−２
コード領域及びＬｙＩＦＮ−α−３コード領域の適当な
セグメントをインビトロ連結し、得られるハイブリドＩ
ＦＮ遺伝子を適当なベクターに挿入するか、又は特定の
ＩＦＮ−ＤＮＡセグメントを、残りの部分をすでに含有
する線状化されたベクターＤＮＡに挿入して所望のハイ
ブリドインターフェロンをコードする遺伝子を形成する
ことにより製造することができる。アミノ末端配列を提
供するＤＮＡセグメントが発現制御配列にすでに融合し
ていることが好ましい。

ＬｙＩＦＮ−α−２コード領域及びＬｙＩＦＮ−α−３
コード領域の適切なセグメントは特にこの発明の好まし
い出発ベクター、すなわちｐＢＲ322由来のプラスミド
ｐＡＭ２及びｐＡＭ21から得られる。プラスミドｐＡＭ
は、β−ラクタマーゼプロモーターの制御のもとにＬｙ
ＩＦＮ−α−３コード領域を含有するＨｉｎｄIII−Ｐ
ｓｔＩ挿入部を含有する。プラスミドｐＡＭ２のベクタ
ー部分はＰｖｕIIに対して耐性である。プラスミドｐＡ
Ｍ21は、９２位にユニークＰｖｕII部位を有しそしてβ
−ラクタマーゼプロモーターの制御のもとにあるＬｙＩ
ＦＮ−α−２コード領域を含有するＨｉｎｄIII−Ｐｓ
ｔＩを含有する。プラスミドｐＡＭ21のベクター部分は
同様にＰｖｕIIに対して耐性である。

特に、ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ
_３Ｄ_４”をコードする遺伝子はプラスミドｐＡＭ21の大
ＰｓｔＩ−ＰｖｕII断片、プラスミドｐＡＭ21の小Ｓａ
ｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラスミドｐＡＭ２の小Ｓａ
ｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片を連結することによって調製され
る。この造成は、β−ラクタマーゼプロモーターの制御
のもとにハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ
_４”コード領域を含有するプラスミドｐＪＣ344をもた
らす。同様にして、ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１
Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”をコードする遺伝子は、プラスミドｐＡ
Ｍ21の大ＰｖｕII−ＰｓｔＩ断片、プラスミドｐＡＭ２
の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラスミドｐＡＭ21
の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片を連結することによって
調製される。この造成は、β−ラクタマーゼプロモータ
ーの制御のもとにハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ
_２Ｄ_３Ｂ_４”コード領域を含有するプラスミドｐＪＣ34
2をもたらす。ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２
Ｄ_３Ｄ_４”をコードする遺伝子は、プラスミドｐＡＭ21
の小ＨｉｎｄIII−Ｓａｕ３Ａ断片、プラスミドｐＡＭ
２の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラスミドｐＡＭ
２の大ＰｖｕII−ＨｉｎｄIII断片を連結することによ
り調製することができる。この造成は、β−ラクタマー
ゼプロモーターの制御のもとにハイブリドインターフェ
ロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”コード領域を含有するプラス
ミドｐＡＭ94をもたらす。同様にして、ハイブリドイン
ターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”をコードする遺伝子
は、プラスミドｐＡＭ21の小ＨｉｎｄIII−Ｓａｕ３Ａ
断片、プラスミドｐＡＭ２の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断
片及びプラスミドｐＡＭ21の大ＰｖｕII−ＨｉｎｄIII
断片を連結することにより調製される。この造成は、β
−ラクタマーゼプロモーターの制御のもとにハイブリド
インターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”コード領域を含
有するプラスミドｐＡＭ90をもたらす。ハイブリドイン
ターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”コード領域を含有す
るプラスミド（例えばプラスミドｐＤＭ１）又はハイブ
リドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”コード領域
を含有するプラスミド（例えばプラスミドｐＤＭ２）を
同様にして調製することができる。これらのプラスミド
は、Ｅ．コリ中で複製し、そしてハイブリドＩＦＮ遺伝
子を発現するために適当である。所望により、前記ハイ
ブリドインターフェロンのいずれかをコードするＤＮＡ
挿入部を対応するプラスミドから切り出しそして異るベ
クターＤＮＡに導入することができる。こうして、β−
ラクタマーゼプロモーター以外のプロモーターの制御の
もとにハイブリドインターフェロンコード領域を含有
し、そして／又はＥ．コリ以外の宿主中で遺伝子が発現
されることを可能にするプラスミドを得ることができ
る。

前記ハイブリドインターフェロンのいずれかをコードす
る構造遺伝子を含んで成るＤＮＡの調製はまた、化学合
成によっても行うことができる。ＤＮＡの合成のための
適当な方法はS.A.Narang〔Tetrahedron39,3(1983)〕に
より要約されている。既知の合成技法が、長さ２０塩基
までのポリヌクレオチドを良好な収率で、高純度で、そ
して比較的短時間に調製することを可能にする。適切に
保護されたヌクレオチドがホスホジエステル法〔K.L.Ag
arwal等、Angew.Chem.84,489(1972)〕により、又は一層
効率的なホスホトリエステル法〔R.L.Letsinger等、J.A
m.Chem.Soc.98,3655(1976)〕により相互に連結される。
ヌクレオチド鎖が適当なポリマーにより結合される固相
法によりオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの合
成を簡純化することができる。Itakura等〔J.Am.Chem.S
oc.103,706(1981)〕は、個々のヌクレオチドではなく固
相合成においてホスホトリエステル法により連結される
トリヌクレオチドを使用し、これらを短時間で且つ良好
な収量で縮合せしめて、例えば３１塩基のポリペプチド
を得ている。実際の２本鎖ＤＮＡを化学合成された短セ
グメントから酵素的に組み立てることができる。このた
めに、Khorana等〔J.Biol.Chem.251,565(1976)〕は両Ｄ
ＮＡ鎖からのオーバーラップするポリヌクレオチド配列
を使用しており、これらが塩基対合により正しい配置で
一緒にされ、そして次に酵素ＤＮＡリガーゼにより化学
的に連結される。他の可能な方法においては、２つのＤ
ＮＡ鎖のそれぞれのポリヌクレオチド配列を、オーバー
ラップする短セグメントを伴って、４種類の必要なデオ
キシヌクレオチドホリホスフェートの存在下で、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラ
ーゼＩのKlenow断片、もしくはＴ_４ＤＮＡポリメラー
ゼ、又はＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素
と共にインキュベートする。こうすることによって２つ
のポリヌクレオチドが塩基対合により正しい配置で一緒
にされ、そして必要なヌクレオチドが酵素により補完さ
れて完全な２本鎖ＤＮＡが与えられる〔S.A.Nargang
等、Anal.Biochem.121,356(1982)〕。Itakura等〔J.Bio
l.Chem.257,9226(1982)〕は、この原理に基いて、いか
にしてヒト白血球インターフェロンα_２−遺伝子の135
塩基対のセグメントがＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow断
片）の存在下で４個の39〜42塩基対の化学合成断片から
組立てられ、そしてリガーゼのみを用いる方法と比べて
化学合成における４０％の節約が達成されるかについて
記載している。この発明のＤＮＡを調製するために適切
な方法が例えばヨーロッパ特許出願NO.146,785に記載さ
れている。

この発明のハイブリドインターフェロンのいずれかをコ
ードする構造遺伝子を含んで成る化学的に合成されたＤ
ＮＡは、発現制御配列がこの遺伝子の発現を制御するよ
うな態様で、発現制御配列を含有するベクターＤＮＡに
挿入することができる。

２．宿主細胞の形質転換 この発明はまた、形質転換された宿主の製造方法に関
し、この方法はこの発明のハイブリドインターフェロン
のいずれかをコードしそして発現制御配列によって制御
されるＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターにより宿主
を形質転換することを含んで成る。

適当な宿主の例は上記の微生物、例えばサッカロミセス
・セレビシエー、バシルス・ズブチリス、及びエシェリ
シャ・コリの株である。この発明の発現プラスミドによ
る形質転換は、例えば文献に記載されているようにし
て、すなわちＳ．セレビシエーについてはA.Hinnen等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,1929(1978)、Ｂ．ズブチリ
スについてはAn agnostopoulos等、J.Bacteriol.81,741
(1961)、そしてＥ．コリについてはM.Mandel等、J.Mol.
Biol.53,159(1970)に記載されているようにして行われ
る。

従って。Ｅ．コリ細胞の形質転換法は、ＤＮＡの取り込
みを可能にするための細胞のＣａ⁺⁺による前処理、及び
ハイブリドベクターとのインキュベーションを含む。細
胞は親細胞からの形質転換細胞の分離を可能にする選択
増殖培地に移される。ベクターを含有しない細胞はこの
ような培地に生存しないであろう。酵母の形質転換は、
例えば(1)グルコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素的除
去、(2)ポリエチレングリコール及びＣａ⁺⁺イオンの存
在下でのベクターにより得られたスフェロプラストの処
理、及び(3)該スフェロプラストを寒天に包埋すること
による細胞壁の再生の段階を含んで成る。好ましくは、
再生寒天は細胞壁の再生と形質転換された再細胞の選択
とを同時に可能にするように調製される。

この発明はまた、上記の経路で得られる形質転換された
宿主に関する。

３．形質転換された宿主細胞の培養及び発現されたハイ
ブリドインターフェロンの単離 この発明はさらに、式（Ｉ）〜(VI)のハイブリドインタ
ーフェロンの製造方法に関し、この方法は該ハイブリド
インターフェロンのいずれかをコードするＤＮＡ配列を
含有するハイブリドベクターにより形質転換された宿主
細胞を培養し、そしてハイブリドインターフェロンを単
離することを特徴とする。

形質転換された細胞を、資化性の炭素源、窒素源及び無
機塩を含有する液体培地中で当業界において既知の方法
により培養する。

この発明の形質転換された宿主の培養のために種々の炭
素源を使用することができる。好ましい炭素源の例とし
て資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マ
ンニトールもしくはラクトース、又は酢酸塩が挙げら
れ、これらは単独で、又は適当な混合物として使用する
ことができる。適当な窒素源の例として、アミノ酸、例
えばカザミノ酸、ペプチド並びに蛋白質及びその分解生
成物、例えばトリプトン、ペプトン、又は肉エキス、そ
してさらに酵母エキス、マルトエキス、そしてさらにア
ンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらは単独で
又は適当な混合物として使用することができる。さらに
使用することができる無機塩は、例えば、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、及びカルシウムの硫酸塩、塩
化物、リン酸塩及び炭酸塩である。

培地はさらに、例えば増殖促進物質、例えば微量元素、
例えば鉄、亜鉛、マンガン 等、及び好ましくは選択圧
を与えそして発現プラスミドを失った細胞の増殖を阻害
する物質を含有する。すなわち、例えば、発現プラスミ
ドがａｍｐ^Ｒ遺伝子を含有する場合にはアンピシリンを
培地に加える。抗生物質のこのような添加はさらに、抗
生物質感受性の汚染微生物を破壊する効果を有する。例
えば必須アミノ酸について栄養要求性である酵母菌株が
宿主微生物として使用される場合、プラスミドは好まし
くは宿主の欠損を補完する酵素をコードする遺伝子を含
有する。酵母菌株の培養は前記アミノ酸に欠ける最少培
地中で行われる。

培養は当業界において既知の方法により行われる。培養
条件、例えば温度、培地のpH値及び発酵時間は、ハイブ
リドインターフェロンの最高力価が得られるように選択
される。すなわち、Ｅ．コリ又は酵母菌株は、振とう又
は攪拌を伴う深部培養による好気的条件下、約20℃〜40
℃において、好ましくは約30℃において、そして４〜８
のpH値、好ましくは約pH７において、約４〜30時間、好
ましくはハイブリドインターフェロンの最高収量が達成
されるまで培養される。

驚くべきことに、この発明のハイブリドインターフェロ
ンの最高力価、例えば、標準的条件下で培養された形質
転換酵母の粗抽出物中に得られるハイブリドインターフ
ェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_ＤＢ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”、
“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”の最
高力価は、米国特許4,414,150に記載されているハイブ
リドインターフェロン“ＢＤ”及び“ＤＢ”に極めて近
縁なハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”
及び“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”、並びにインターフェロン−
α−２のそれよりも明らかに高いことが見出された。

細胞濃度が十分な値に達した時培養を停止しそしてハイ
ブリドインターフェロンを宿主の細胞から放出せしめ
る。この目的のため、例えば洗剤、例えばＳＤＳ又はト
リトンで処理することにより細胞を破壊し、あるいはリ
ゾチーム又は同様に作用する酵素により細胞を溶解す
る。酵母を宿主微生物として使用する場合、グルコシダ
ーゼを用いる酵素的消化により細胞壁を除去する。この
方法に代えて、又はこの方法に加えて、機械的な力、例
えば剪断力（例えばＸ−プレス、フレンチプレス、ダイ
ノミルによる）、又はガラスビーズもしくは酸化アルミ
ニウムとの振とう、又は例えば液体窒素中での凍結と例
えば30℃〜40℃での解凍との反復、あるいは超音波を用
いて細胞を破壊することができる。蛋白質、核酸及び他
の細胞成分を含有する得られた混合物を、遠心分離した
後それ自体既知の方法により、ハイブリドインターフェ
ロンを包含する蛋白質について濃縮する。すなわち、例
えば非蛋白質性成分のほとんどをポリエチレンアミン処
理により除去し、そしてハイブリドインターフェロンを
含む蛋白質を、例えば硫酸アンモニウム又は他の塩によ
る溶液の飽和により沈澱せしめる。細菌性蛋白質はさら
に、酢酸による酸性化によって（例えば0.1％，pH４〜
５）沈澱せしめることができる。これ以上の精製段階
は、例えば限外濾過、ダイアフィルトレーョン、ゲル電
気泳動、クロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマト
グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬ
Ｃ、逆相ＨＰＬＣ等、適当なセファデックスカラムによ
る分子サイズによる混合物の成分の分離透析、アフィニ
ティークロマトグラフィー、例えば抗体、特にモノクロ
ーナル抗体アフィニティークロマトグラフィー、及び他
の既知の方法、特に等業界において知られている方法を
包含する。

驚くべきことに、この発明のハイブリドインターフェロ
ンはインターフェロンＬｙＩＦＮ−α−２及びハイブリ
ドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”よりも高い熱
安定性を有する。すなわち、抗ウイルス活性の５０％が
失われる温度（１℃／分でのＩＦＮ溶液の温度の上昇）
はＬｙＩＦＮ−α−２の場合62.8℃であり、そしてハイ
ブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”の場合６
３℃であるが例えばハイブリドインターフェロン“Ｂ_１
Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ
_３Ｄ_４”及び“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”の対応する値はそれ
ぞれ65℃、64.7℃、65.3℃及び64.2℃である。

この発明はさらに、この発明の方法に従って調製される
か否かにかかわらず式（Ｉ）〜(VI)のハイブリドインタ
ーフェロンに関する。

この発明はさらに、この発明の方法に従って得られるハ
イブリドインターフェロンに関する。

この発明は特に、例に記載されているハイブリドベクタ
ー、形質転換された宿主細胞、ハイブリドインターフェ
ロンポリペプチド、及びその製造方法に関する。

ハイブリドインターフェロンの生物学的性質及び医療製
剤 この発明のハイブリドインターフェロンは、これを価値
ある医薬として特徴付ける興味ある生物学的性質を示
す。

この発明のハイブリドインターフェロンは、哺乳動物細
胞、例えばウシの細胞及び特にヒトの細胞に対する非常
に強力な抗ウイルス活性により特徴付けられる。すなわ
ち、S.Rubinstein等の方法〔J.Virol.37,755(1981)、ウ
シ（ＭＤＢＫ）及びヒト（ＷＩＳＨ）細胞に対するチャ
レンジウイルスとして水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
を使用する〕に従う細胞変性効果の低下として決定され
る抗ウイルス力価は次の通りである。

従って、この発明のハイブリドインターフェロンの抗ウ
イルス作用はヒト細胞に対して確認されないがしかし常
に異種間的(interspecific)である。すなわち、ハイブ
リドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、“Ｂ_１Ｄ
_２Ｂ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３
Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”の抗ウイルス活性は
親インターフェロン−α−２及び米国特許NO.4,414,150
に開示されているハイブリドインターフェロン“ＢＤ”
に非常に近縁なハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２
Ｄ_３Ｄ_４”のそれに匹敵する程度であり、しかも親イン
ターフェロンα−３に対して（10〜30の係数をもっ
て）、及び参照ハイブリドインターフェロン“Ｄ_１Ｄ_２
Ｂ_３Ｂ_４”に対して（230〜600の係数をもって）明らか
に卓越している。

ヒト細胞に対する一般的抗ウイルス活性とは別に、この
発明のハイブリドインターフェロンは標的細胞の一層特
異的な反応を生じさせる。すなわち、インターフェロン
の作用に基き種々の細胞内酵素が誘導される。これらの
内特に（２′−５′）オリゴイソアデニレートシンセタ
ーゼ（“２−５Ａシンセターゼ”）が挙げられ、この酵
素は（２′５′）連結されたオリゴヌクレオチドを生じ
させ、そしてこれらのオリゴヌクレオチドが今度は潜伏
状態のエンドリボヌクレアーゼを活性化し、これがウイ
ルスｍＲＮＡを開裂せしめる。驚くべきことに、この発
明のハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ
_３Ｄ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ
_３Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”はヒト細胞中で、
２−５Ａシンセターゼ活性の特に活性な誘導物質であ
る。すなわち、１０^３ユニット／ｍにおいて、ハイブ
リドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、“Ｂ_１Ｄ
_２Ｂ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｂ_２
Ｄ_３Ｂ_４”はDaudi細胞中で、それぞれ17.5倍、11.4
倍、8.5倍、及び9.6倍の２−５Ａシンセターゼ活性を与
え、これに対して親インターフェロンα−２及びα−３
並びに参照ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３
Ｄ_４”及び“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”はそれぞれ5.6倍、3.9
倍、4.0倍、及び4.3倍の増加を示す。

さらに、この発明のハイブリドインターフェロンは抗増
殖活性(antiproliferative activities)を示す。抗増殖
活性は次のようにして測定することができる。インター
フェロン含有溶液を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲ
ＰＭＩ培地２ｍ中５×10⁴個／ｍのDaudi細胞と共に
インキュベートする。３日間のインキュベーションの
後、細胞の増加を、トリパン・ブルー排除試験を用いて
ヘマチトメーター中で生存細胞を計数することにより決
定する。Daudi細胞の増加の５０％阻害を導くのに必要
なハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、
“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”、“Ｂ_１
Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｄ
_２Ｄ_３Ｂ_４”の濃度はそれぞれ約４，４，1.3,1.3４及
び４ユニット／ｍであり、従って親インターフェロン
α−２及び参照ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２
Ｄ_３Ｄ_４”とおよそ同等（約1.3ユニット／ｍ）であ
り、そして親インターフェロンα−３（約２０ユニット
／ｍ）及び参照ハイブリドインターフェロン“Ｄ_１Ｄ
_２Ｂ_３Ｂ_４”（約400ユニット／ｍ）に卓越してい
る。

ヒト癌に対する抗増殖活性もインビボで証明することが
できる。すなわち、ヒト由来の種々の癌、例えば乳癌、
結腸癌、肺癌、卵巣癌、及び黒色腫をヌードマウスで増
殖させた。増殖した腫瘍の小断片を単離し、そして套管
針により（Ｂａｌｂ／ｃ×ＤＢＡ／２）Ｆ_１（ＣＤ
Ｆ_１）マウスの静脈のうち下に移植した。ＩＦＮを、５
×10⁵〜５×10⁷IU/kg/injの１日２回投与で、１〜５日
（投与の日：０日）筋肉内投与した。６日目に動物を殺
し、最終腫瘍サイズを測定し、そして最初の腫瘍サイズ
（ＩＦＮ処理前）及び未処理対照マウスにおける腫瘍サ
イズと比較する。この発明のハイブリドインターフェロ
ン、例えば“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３
Ｂ_４”による処理の後、腫瘍増殖のかなりのそして有意
な阻害、及び特に腫瘍の退化が観察される。驚くべきこ
とに、ハイブリドインターフェロンの抗増殖活性は親イ
ンターフェロンα−２及びα−３のそれ、並びにハイブ
リドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”及び“Ｄ_１
Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”のそれに卓越する。

この発明のハイブリドインターフェロンの抗ウイルス性
及び抗増殖性は、これらのポリペプチドを、ヒト及び動
物の、ウイルス感染、例えばインフルエンザ及び他の呼
吸器ウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、狂犬病及び
肝炎感染、並びに新生物疾患、例えば黒色腫、腎癌、ハ
ーリー細胞白血病(hairy cell leukemia)の治療のため
に有用なものとしており、これらのポリペプチドは場合
によっては他の抗ウイルス剤又は抗腫瘍剤と組合わせ
て、好ましくは、医療的に有効な量の活性成分を場合に
よっては無機又は有機の固体又は液体の医薬として許容
され非経腸的投与に適する担体と組合わせ又は混合して
含んで成る医薬製剤の形で使用される。

非経腸製剤は特に注射液であり、これは種々の態様、例
えば静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻内投与、
皮内投与、又は皮下投与において有効である。このよう
な液剤は好ましくは、例えば活性成分を単独で又は医薬
として許容される担体と共に含有する凍結乾燥剤から調
製することができる等張水溶液又は懸濁液である。医薬
製剤は無菌化することができそして／又は添加剤、例え
ば防腐剤、安定剤、潤滑剤及び／又は乳化剤、溶解剤、
浸透圧調製塩及び／又は緩衝剤を含有する。この発明の
医薬製剤は、他の医薬として価値ある物質を含有し、そ
してそれ自体既知の方法により、例えば常用の溶解又は
凍結乾燥法により製造され、そして約0.1％〜100％、特
に約１％〜約５０％の、そして凍結乾燥物の場合には10
0％までの活性成分を含有する。この発明のハイブリド
インターフェロン、例えば“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”は活性
の喪失を伴わないで凍結乾燥し、そして再溶解すること
ができる。これに対して、親インターフェロンα−２及
びα−３の凍結乾燥品は、顕著な活性の低下を伴って濁
った溶液をもたらす。従って後者のインターフェロンは
緩衝化溶液中でのみ貯蔵することができる。

この発明はまた、この発明の薬理学的に活性な化合物を
医薬として活性な担体と混合することを特徴とする医薬
組成物に関する。

特定の投与方法及び投与量は、患者の状態、病気の種類
及び病気の状態を考慮して医者により選択されるであろ
う。例えば、ウイルス感染は、通常１日に１回又は２回
数日〜数週間にわたって治療され、他方新生物の治療は
一般に１日１回〜複数回、数週間〜数ケ月にわたって行
われる。通常のインターフェロン療法において使用され
るのと同じ日用量レベル、すなわち約10⁶〜10⁷ユニット
が投与される。

ハイブリドインターフェロンに対するモノクローナル抗
体 ＩＦＮαハイブリドを包含するＩＦＮαの幾つかのサブ
タイプに対する高い親和性及びＩＦＮαのその他のサブ
タイプに対する低い親和性を有する、ＩＦＮαに対する
新規なモノクローナル抗体、及びこれらを分泌するハイ
ブリドーマ細胞を提供することがこの発明の目的の一つ
である。

この新規なモノクローナル抗体は、ＩＦＮα／Ｂ、Ｄ、
Ｆ及び関連するサブタイプ〔D.V.Goeddel等、Nature29
0,20(1981)を参照のこと〕並びにこれらのサブタイプの
ハイブリド、特にこの発明のハイブリドインターフェロ
ンに対して高い親和性を有するが、しかし例えばＩＦＮ
α／Ａサブタイプに対して低い親和性を有することによ
り特徴付けられる。

このモノクローナル抗体は144ＢＳと命名される。この
モノクローナル抗体は144ＢＳ２２−６−１９と称する
ハイブリドーマセルラインにより分泌される。この発明
はさらに、このモノクローナル抗体の誘導体、例えば抗
体断片、放射性ラベルされたモノクローナル抗体、及び
モノクローナル抗体と酵素との接合体等に関する。

この発明のモノクローナル抗体の断片は、例えばＦａ
ｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）_２断片であり、抗原決定
基に対する特異性を維持しているもの、すなわちヒトＩ
ＦＮα及びＩＦＮαハイブリドサブタイプに対する親モ
ノクローナル抗体の特徴的結合パターンを維持している
ものである。

放射性ラベルされたモノクローナル抗体は、例えば放射
性ヨウ素（^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、炭素（
^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｃ）、又はトリチウム（^３Ｈ）等
を含有する。放射性ヨウ素でラベルされたモノクローナ
ル抗体が好ましい。

この発明の抗体接合体は、例えばモノクローナル抗体又
はその断片と酵素、例えばホースラディッシュパーオキ
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラー
ゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグ
ルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、又はア
ビジンもしくはビオチンとの接合体である。これらの接
合体においては抗体は酵素に直接に又はスペーサーもし
くはリンカー基を介して結合している。モノクローナル
抗体と酵素ホースラディッシュパーオキシダーゼ又はア
ルカリ性ホスファターゼとの接合体が好ましい。

この発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩＦＮαの異る
サブタイプに属するポリペプチドに対するその結合能力
により特徴付けられる。この結合能力は、S.S.Alkan
等、"Protides of the biological fluids"、H.Peeters
編、ペルガモンプレス、Vol30,495〜498頁(1983)に記載
されているいわゆるコンバインド・イムノプレシピテー
ション・バイオアッセイにおいて決定される。このアッ
セイ法においては、ＩＦＮα含有溶液が試験されるべき
モノクローナル抗体と共にインキュベートされ、結合し
たモノクローナル抗体及び未結合モノクローナル抗体が
試験されるすべての抗体を結合するポリクローナル血清
の添加により沈澱し、免疫沈澱物が分離されそして酸溶
液に再溶解され、そしてこうして遊離したＩＦＮαがＩ
ＦＮαの抗ウイルス活性に基く古典的なバイオアッセイ
により決定される。

この発明のモノクローナル抗体はＩＦＮサブタイプＢ、
Ｄ、Ｆ及びそのハイブリド、さらにはＩＦＮαサブタイ
プＣ及びＪに強く結合するがしかしＩＦＮαサブタイプ
Ａに低い親和性を示すことは驚くべきことであり、この
サブタイプＡは３種類以上のＩＦＮαサブタイプを認識
する他のすべてのモノクローナル抗体、すなわち広サブ
タイプ認識抗体、例えばモノクローナル抗体ＮＫ２〔D.
Secher等、Nature285、446(1980)〕、ヨーロッパ特許出
願ＥＰ119,476に開示されているモノクローナル抗体Ｅ
ＢＩ−１、２及び３、又は国際特許出願ＷＯ84/03106に
開示されているモノクローナル抗体ＬＯ−２２により結
合されるものである。

国際特許出願ＷＯ84/03106に開示されている、ＩＦＮα
サブタイプＤに特異的なモノクローナル抗体ＹＯＫに比
べて、この発明のモノクローナル抗体は驚くべきことに
広い特異性を示し、特に抗体ＹＯＫにより結合されない
ＩＦＮαサブタイプＢ及びＦに対して特異性を示す。

144ＢＳと称するこの発明のモノクローナル抗体は、良
く知られている方法、例えばクラス特異的第２抗体を用
いる免疫拡散オークテルロニー法により決定される場合
免疫グロブリンクラスＩｇＧ_１κ（カッパ）に属する。

この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体はそれ自
体既知の方法により得られ、この方法はハイブリドーマ
セルライン144ＢＳ２２−６−１９を、 ａ）インビトロ培養し、そして培養上清からモノクロー
ナル抗体を単離し；又は ｂ）適当な哺乳動物中でインビボ増殖せしめ、そして該
動物の体液からモノクローナル抗体を回収し；そして所
望により、 ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
る； ことを特徴とする。

方法ａ）のインビトロ培養のために適当な培地は標準的
培地、例えば場合によっては哺乳動物血清、例えばウシ
胎児血清が補充されたドルベコ改変イーグル培地又はＲ
ＰＭＩ1640培地である。モノクローナル抗体の単離を行
うには、培養上清に含有される蛋白質を硫酸アンモニウ
ム等により沈澱せしめ、次に標準的クロマトグラフ法、
例えばゲル濾過、イオン交換、ＤＥＡＥセルロース上で
のクロマトグラフィー、又はイムノアフィニティークロ
マトグラフィーにより免疫グロブリンを精製する。

方法ｂ）に従うハイブリドーマ細胞の増殖により多量の
所望のモノクローナル抗体を得ることができる。細胞ク
ローンを同種哺乳動物に注射し、これにより抗体産生腫
瘍の増殖が生ずる。１〜３週間の後、目的とするモノク
ローナル抗体を前記動物の体液から回収する。例えば、
Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマセルライン
を、場合によってはあらかじめプリスタンのごとき炭化
水素により処理しておいたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内
注射し、そして１〜２週間後これらのマウスの腹水を集
める。モノクローナル抗体をそれ自体既知の方法によ
り、例えば硫酸アンモニウム等により蛋白質を沈澱せし
めることにより体液から単離し、次に標準的方法、例え
ばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ
セルロース上でのクロマトグラフィー、又はイムノアフ
ィニティークロマトグラフィーにより免疫グロブリンを
精製する。ＩＦＮαサブタイプの抗原決定基に対してそ
の特異性を維持しているモノクローナル抗体の断片、例
えばＦａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）_２断片は、方法
ａ）又はｂ）により調製されたモノクローナル抗体か
ら、それ自体既知の方法により、例えばペプシンもしく
はパパインのごとき酵素により消化及び／又は化学的還
元によるジスルフィド結合の開裂により得ることができ
る。

放射性ヨウ素によりラベルされたモノクローナル抗体
は、それ自体既知のヨウ素化法により、例えばモノクロ
ーナル抗体を放射性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウ
ム及び化学的酸化剤例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロ
ラミンＴもしくはこれらに類するもの、又は酵素的酸化
剤、例えばラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ及びグルコースでラベルすることにより調製され
る。この発明の放射性ラベルされたモノクローナル抗体
はまた放射性ラベルされた栄養を方法ａ）のインビトロ
培養の培地に添加することによって調製することができ
る。このようなラベルされた栄養は例えば放射性炭素（
^１４Ｃ）、トリチウム（^３Ｈ）、硫黄（^３５Ｓ）等を含
有し、そして例えばＬ−（^１４Ｃ）−ロイシン、Ｌ−（
^３Ｈ）−ロイシン又はＬ−（^３５Ｓ）−メチオニンであ
る。

この発明のモノクローナル抗体の接合体は等業界におい
て知られている方法により、例えば方法ａ）もしくは方
法ｂ）に従って調製されたモノクローナル抗体又は上記
のようにして調製されたその断片を、カップリング剤、
例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−
ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベ
ンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−（２′
−ピリジルジチオ）−プロピオノキシ）−サクシンイミ
ド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジ−メチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドの存在下で酵素と反応せしめるこ
とにより調製される。アビジンとの接合体は同様にして
調整される。ビオチンとの接合体は例えばモノクローナ
ル抗体をビオチンの活性化エステル、例えばビオチンＮ
−ヒドロキシサクシンイミドエステルと反応せしめるこ
とにより調製される。

この発明はさらに、144ＢＳ２２−６−１９と称するハ
イブリドーマセルラインに関し。このセルラインは1985
年３月１４日に、パリ、パスツール研究所"Collection
Nationale de Cultures de Microorganimes"にNO.Ｉ−4
24として寄託された。このハイブリドーマセルラインは
マウス骨髄腫セルラインＳｐ２／Ｏ−Ａｇ14と天然ヒト
ＩＦＮαにより免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾
臓のＢリンパ球とのハイブリドである。これは安定なセ
ルラインであり、144ＢＳと称するモノクローナル抗体
を分泌する。セルラインは培養において又は液体窒素中
での深冷凍結により維持し、解凍により再活性化するこ
とができる。

この発明はさらに、モノクローナル抗体144ＢＳを分泌
する前記ハイブリドーマ細胞の製造方法にも関し、この
方法はＢａｌｂ／ｃマウスを天然ヒトＩＦＮαで免疫感
作し、該マウスの抗体産生細胞を骨髄腫セルラインＳｐ
２／ｏ−Ａｇ14の細胞と融合せしめ、この融合において
得られたハイブリド細胞をクローン化し、そして所望の
抗体を分泌する細胞クローンを選択する。

マウスの免疫は、例えば天然ヒトＩＦＮαを２〜４回非
経腸的に、例えば腹腔内及び／又は皮下に、10〜40の間
隔で、約１０^５ＩＵ〜約１０^６ＩＵの量で注射すること
により行う。この注射は場合によってはリンパ球生産を
刺激するアジュバント、例えば完全フロインドアジュバ
ント又は不完全フロインドアジュバントを含有する。

最終追加免疫注射の２〜５日後に採取した抗体産生脾細
胞を融合促進剤の存在下で骨髄腫セルラインＳｐ２／ｏ
−Ａｇ14の細胞と融合せしめる。考慮される融合促進剤
は例えばＵＶ−不活性化形である場合があるセンダイウ
イルスもしくは他のウイルス、カルシウムイオン、界面
活性脂質例えばリソレシチン、又はプロピレングリコー
ルである。好ましくは、1000〜4000の分子量を有する約
30〜60％のプロピレングリコールを含有する溶液中で骨
髄腫細胞を免疫感作されたマウスからの脾細胞３〜２０
倍過剰量と融合せしめる。

融合の後、細胞を再懸濁し、そして選択ＨＡＴ培地中で
培養する。こうすることによりハイブリドーマ細胞のみ
が生存する。なぜなら、これらは骨髄腫細胞に由来する
インビトロで生育しそして複製する能力と、免疫感作さ
れたマウスの抗体産生脾細胞に由来する、ＨＡＴ培地で
の生存に必須な欠損ＨＧＰＲＴ又はＴＫ遺伝子を合わせ
持つからである。

ハイブリドーマ細胞の拡張のために適当な培地は標準的
な培地、例えば場合によっては血清、例えば10〜15％の
ウシ胎児血清を補充されたダルベコの改変イーグル培
地、最少必須培地、ＲＰＭＩ1640培地培養等である。好
ましくは、。フィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔浸
潤細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ等を細胞増殖の初
期に添加する。正常骨髄腫細胞がハイブリドーマ細胞を
オーバーグロー(overgrow)するのを防止するため、培地
に一定間隔で選択ＨＡＴ培地を補充する。

ハイブリドーマ細胞培養上清を目的とするモノクローナ
ル抗体について、好ましくはコンバインド・イムノプレ
シピテーション−バイオアッセイ、又はラジオイムノア
ッセイによりスクリーニングする。陽性のハイブリドー
マ細胞を、例えば限界稀釈法により２回以上クローン化
する。クローン化されたセルラインは常法により凍結す
ることができる。

この発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体
は、天然の又は組換ＤＮＡ法により調製されたヒトＩＦ
Ｎαサブタイプの、及びヒトハイブリドＩＦＮ、特にこ
の発明のそれの定性的及び定量的測定及び／又は精製の
ために有用である。

例えば、モノクローナル抗体又はその誘導体、例えば酵
素接合体又は放射性誘導体、例えばＩＦＮα活性を有す
るポリペプチドの抗体決定基とモノクローナル抗体との
結合相互作用に基く既知のイムアッセイのいずれかにお
いて使用することができる。このようなアッセイ法の使
としてラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、イ
ムノフルオレッセンス、ラテックス凝集、及び血球凝集
が挙げられる。このようなイムノアッセイは例えば、天
然源又は遺伝子操作された微生物からのＩＦＮαの、及
びハイブリドＩＦＮα蛋白質の生産及び精製をモニター
する場合、並びに例えばＩＦＮ療法を行っているか又は
そのような治療を必要とする患者の体液中のＩＦＮα及
びハイブリドＩＦＮαの定性的及び定量的測定において
有用である。

この発明のモノクローナル抗体は、ラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）においてそれ自体として又は放射性ラベル
された誘導体の形で使用することができる。ＲＩＡの既
知の変法のいずれかを例えば均一相ＲＩＡ、固相ＲＩＡ
又は不均一ＲＩＡ、シングルＲＩＡ又はダブル（サンド
イッチ）ＲＩＡ〔ＩＦＮαの直接又は間接（競争的）決
定のため〕のために使用することができる。サンドイッ
チＲＩＡが好ましく、この方法においては、適当な担
体、例えばポリスチレン、ポリプロピレン又はポリ塩化
ビニル製のミクロタイタープレート又は試験管のプラス
チック表面、ガラス又はプラスチックビーズ、濾紙、又
はデキストラン、酢酸セルロース又はニトロセルロース
のシートをＩＦＮαサブタイプに対して特異的なモノク
ローナル抗体で、単純吸着により、又は担体を例えばグ
ルタルアルデヒド又は臭化シアンで活性化した後にコー
トし、そして^１２５Ｉにより放射性ラベルされたモノク
ローナル抗体の溶液及び試験溶液とインキュベートし、
ここでこの溶解したモノクローナル抗体はＩＦＮαサブ
タイプの担体結合モノクローナル抗体とは異るエピトー
プを認識し、そしてＩＦＮα又はハイブリドＩＦＮαの
量を担体上に結合した放射能を測定することにより決定
する。このような好ましいラジオイムノアッセイにおい
ては、担体結合抗体又は放射性ラベルされた抗体のいず
れかが前記のこの発明のモノクローナル抗体又はその誘
導体であり、他方が場合によっては放射性ラベルされて
いるこの発明の範囲に属さないＩＦＮαに対するモノク
ローナル抗体又はポリクローナル抗体である。

前に記載したようにサンドイッチラジオイムノアッセイ
が特に好ましく、この方法においては、この発明のモノ
クローナル抗体がビーズ、例えばポリスチレンビーズに
結合され、このコートされたビーズがＩＦＮα又はハイ
ブリドＩＦＮαを含有する試験溶液又は標準溶液中でイ
ンキュベートされ、そして最後に異るＩＦＮαエピトー
プを認識する放射性ラベルされたモノクローナル抗体に
より顕現される。

第４図及び第５図は、実験の部で詳細に記載するサンド
イッチＲＩＡにおいて測定できるような、試験溶液中Ｉ
ＦＮα／Ｂサブタイプに属するＩＦＮ−α−２ポリペプ
チドの量の関数として担体ビーズに結合した放射能を示
す。ＲＩＡの感度は、150〜5000ＩＵ／ｍのＩＦＮ−
α−２サブタイプの、又は一層時間のかかる方法を選択
すれば１ＩＵ／ｍという少量のＩＦＮ−α−２の迅速
で、確実でそして定量的な決定を可能にする。他のＩＦ
Ｎαサブタイプ、例えばＩＦＮα／Ｄサブタイプ又はＩ
ＦＮα／Ｆサブタイプに属するポリペプチド、及び特に
この発明のハイブリドインターフェロンの測定について
もサンドイッチＲＩＡにおいて同様の結果が得られる。

この発明のモノクローナル抗体は酵素イムノアッセイに
おいてそれ自体として、又は酵素接合誘導体として使用
することができる。このようなイムノアッセイは、この
発明の酵素ラベルされたモノクローナル抗体誘導体、こ
の発明の抗−ＩＦＮα抗体を認識しこれと結合するそれ
自体既知の酵素ラベル抗体、又は他の抗−ＩＦＮα抗体
が使用される試験方法を含む。

ＥＬＩＳＡ（エンザイム−リンクド・イムノソルベント
・アッセイ）が好ましく、この方法においては、ＲＩＡ
について前記した担体がこの発明のモノクローナル抗体
によりコートされ、ＩＦＮαを含有する試験溶液と共に
インキュベートされ、そして次にＩＦＮαに対するポリ
クローナル血清、例えばヒツジの血清と共にインキュベ
ートされ、そして最後にポリクローナル血清の結合した
抗体がそれらを認識しそして結合する酵素ラベルされた
抗体により顕現され、そして結合したＩＦＮαの量が酵
素基質反応により測定される。このような酵素ラベルさ
れた抗体は例えばホスファターゼブラベルされたセギ−
抗ヒツジ免疫グロブリンである。

次のようなＥＬＩＳＡも好ましい。すなわち、ＩＦＮα
サブタイプに対して特異的なモノクローナル抗体により
コートされた担体がＩＦＮαを含有する試験溶液と共に
及び酵素と接合したモノクローナル抗体の溶液と共にイ
ンキュベートされ、ここで溶解したモノクローナル抗体
は担体に結合したモノクローナル抗体が認識するのとは
異るＩＦＮαサブタイプのエピトープを認識する。色の
変化をもたらしそして目により又は光学測定装置により
観察することができる酵素基質反応により、試験溶液中
のＩＦＮαサブタイプ又はＩＦＮαハイブリドサブタイ
プの量と比例する結合した酵素の量を測定する。

イムノドット分析と呼ばれる酵素イムノアッセイが特に
好ましく、この方法においてはＩＦＮα又はハイブリド
ＩＦＮαを含有する試験溶液又は標準溶液がポリペプチ
ドに対する強い本来的親和性を有する微孔性担体、例え
ばニトロセルロース上にスポットされ、前記ＩＦＮα含
有プローブの１個又は数個のドットを担持する担体がこ
の発明のモノクローナル抗体の溶液中でインキュベート
され、そして次のこの発明のモノクローナル抗体を認識
しそしてそれと結合する酵素ラベルされた第２抗体の溶
液中でインキュベートされ、そして最後に検出可能なシ
グナルをもたらす酵素基質、例えば着色基質の溶液中で
インキュベートされる。このような酵素ラベルされた第
２抗体は、例えば４−クロロ−１−ナフトール等のごと
き適切な酵素基質により発色し得るホースラディッシュ
パーオキシダーゼと接合したラビット抗−マウス免疫グ
ロブリンである。

ＩＦＮαサブタイプ又はハイブリドＩＦＮαの定性的又
は定量的測定のための前記のようなモノクローナル抗体
又はその誘導体のこの発明に従う使用はまた、それ自体
既知の他のイムノアッセイ、例えば、螢光物質との抗体
接合体又は抗原接合体を用いる免疫螢光試験、抗原又は
抗体でコートされたラテックス粒子を用いるラテックス
凝集法、及び抗原又は抗体でコートされた赤血球を用い
る血球凝集法等を包含する。

この発明はさらに、ＩＦＮαサブタイプ及びこの発明の
ハイブリドＩＦＮαの定性的及び定量的測定のための試
験キットに関し、このキットはモノクローナル抗体144
ＢＳ及び／又はこの誘導体、並びに場合によってはヒト
ＩＦＮαに対する他のモノクローナル抗体又はポリクロ
ーナル抗体、及び／又は付加物を含む。

ラジオイムノアッセイのためのこの発明の試験キット
は、例えばＩＦＮαに対するモノクローナル抗体により
コートされているか又はコートされていない適当な担
体、ＩＦＮαに対するモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体又はその放射性ラベル誘導体の凍結乾燥されたも
の又は濃縮された溶液（ここで、抗体上にコートされて
いるか、溶液であるか又は放射性ラベルされた形である
モノクローナル抗体の少なくとも１つはこの発明のモノ
クローナル抗体である）、ヒトＩＦＮαの標準溶液、緩
衝液、及び場合によっては非特異的吸着及び凝集体の生
成を防止するためのポリペプチド及び洗剤、ピペット、
反応容器、換算曲線等を含む。

酵素イムノアッセイのためのこの発明の試験キットは、
例えば適当な担体、ＩＦＮαに対するモノクローナル抗
体及び／又はポリクローナル抗体の、並びにＩＦＮα又
はＩＦＮαを認識する第１抗体に対する酵素ラベルされ
たモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の、場合
によっては凍結乾燥されているか又は濃縮されている溶
液（ここで、ＩＦＮαに対するモノクローナル抗体か又
はＩＦＮαに対する酵素ラベルされた抗体誘導体は、こ
の発明のモノクローナル抗体又はその誘導体である）、
固体又は溶解形の酵素基質、ヒトＩＦＮαの標準溶液、
緩衝液、並びに場合によってはポリペプチド及び洗剤、
ピペット、反応ベッセル、換算曲線、カラースケール表
等を含む。

天然由来のＩＦＮαもしくはＩＦＮαサブタイプ又はＩ
ＦＮα関連ポリペプチド、例えばこの発明のハイブリド
インターフェロンはこの発明のモノクローナル抗体の助
けによりイムノアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製することができる。モノクローナル抗体又はその
断片を有機又は無機の適当な担体、例えば架橋されたア
ガロース、デキストラン又は適切な官能化型のポリアル
リルアミド、場合によっては活性化の後、当業界におい
て既知の一般的方法を適用して連結する。例えば、活性
化されたエステル官能基を有する担体を水性緩衝液中に
懸濁し、モノクローナル抗体又はその断片の溶液と混合
し、濾過し、再懸濁し、そして洗浄して過剰のモノクロ
ーナル抗体を除去し、そして無関連の蛋白質の溶液で処
理して担体の遊離反応性部分をブロックする。この抗体
でコートされた担体を使用して、ヒトＩＦＮαサブタイ
プ、例えば一ＩＦＮα／Ｂ、ＩＦＮα／Ｄ及びＩＦＮα
／Ｆサブタイプ並びに関連ポリペプチド、例えばこの発
明のハイブリドインターフェロン（グリコシル化形又は
非グリコシル化形）を結合せしめる。この目的のため、
担体材料を適当な水性溶剤、例えば塩溶液、例えばＮａ
Ｃ溶液、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝化ＮａＣ溶
液、NaHCO₃溶液又は３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンス
ルホン酸溶液中に懸濁し、そしてＩＦＮαを含有する溶
液と接触せしめ、例えばクロマトグラフィーカラムに注
入しそしてＩＦＮα含有溶液を導入しそしてポンプによ
り所望により加圧下で担体材料中に通す。未結合蛋白質
及び他の不純物を水性溶液、例えばpHが約５〜９の緩衝
液、及び／又は塩溶液、例えばＮａＣ溶液により洗浄
除去する。担体材料上の抗体に結合したＩＦＮαを適当
な水性溶液、例えばpHが約２〜５の緩衝液、例えばグリ
シン緩衝液又はクエン酸、異る組成又は塩溶液、例えば
濃NH₄SCN溶液のpHグラジエントにより溶出する。ＩＦＮ
αを含有する溶出液は場合によっては中和し、そして精
製されたＩＦＮαを既知の方法により単離する。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

実験の部 例中に次の略号を使用する。

ＤＴＴ １，４−ジチオスレイトール ＴＮＥ ５０ｍＭTris・ＨＣ（pH7.5）、100ｍＭＮａ
Ｃ及び２ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液 Tris トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＴＥ １０ｍＭTris及び５０ｍＭＥＤＴＡを含有する溶
液。

Ｎ−培地 １当りバクト−トリプトン（１０ｇ、ディ
フコ）、酵母エキス（１ｇ、ディフコ）、グルコース
（１ｇ）、ＮａＣ（８ｇ）及びＣａＣ_２・２Ｈ_２Ｏ
(249mg)を含有する培地 ＴＢＥ ８９ｍＭTris、８９ｍＭ硼酸及び２ｍＭＥＤＴ
Ａを含有する溶液 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＨＡＴ ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン Ｉｇ 免疫グロブリン ＩＵ インターフェロン活性の国際単位 ＭＡｂ モノクローナル抗体 ＰＢＳ リン酸緩衝化塩溶液 SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動 パートＩ．エシャリシャ・コリ中でのインターフェロン
α−２／α−３ハイブリド遺伝子の造成及びクローニン
グ 下記のすべてのハイブリドインターフェロン蛋白質コー
ド配列はβ−ラクタマーゼプロモーターに作用可能に連
結し、ｐＢＲ322由来発現プラスミド中にクローン化
し、そしてＥ．コリＨＢ101に形質転換した。

例１．リンポブラストイドＩＦＮα−２及びＩＦＮα−
３のＤＮＡ配列を担持するＰｖｕII耐性ベクターの造成 ｐＢＲ322をＰｖｕII（ビオラブス）により切断し、そ
して線状ＤＮＡを、次のようにして、〔^３２Ｐ〕−Ｂｃ
ｌＩリンカー〔固相ホスホトリエステル法、H,Rink等、
Nucleic Acids Research12,6369(1984)により合成され
たd(ATGTGTGATCACACAT)に連結する。

制限酵素処理されたプラスミドＤＮＡ（１μｇ、約0.7p
mole末端）を^３２Ｐ−ラベル化ＢｃｌＩリンカー（約４
０pmole末端）に、２０ｍＭTris−ＨＣ(pH7.8)、１０
ｍＭＭｇＣ_２、１０ｍＭＤＴＴ、0.5ｍＭｒＡＴＰ及
び４０Ｕ／ｍＴ_４ＤＮＡリガーゼ（ビオラブス）を含
有する５０ｍの反応溶液中で連結する。１５℃にて２
〜３時間インキュベートした後、水相を等容量のフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡを、１／９
容量の１０×ＴＮＥ及び2.5容量のエタノールを添加し
そして−２０℃にて一夜保持することにより沈澱せしめ
た。ＤＮＡペレットを５０μのＴＥ(pH8.0)に再懸濁
し、そしてコントロンＴＳＴ６０ローター中で５〜23％
シュークロースグラジエント〔５０ｍＭTris−ＨＣ(p
H8.0)／１ｍＭＥＤＴＡ〕中で１５℃、58000ｒｐｍにて
４時間遠心分離する。このグラジエントを頂部から底部
に画分し、そして各画分の放射能をセレンコフ計数によ
りモニターする。注目の画分をプールし、そしてＤＮＡ
をＴＮＥ及びエタノールにより沈澱せしめる。ＤＮＡペ
レットを制限緩衝液中に再懸濁し、そしてＢＣｌＩで消
化し、そして水相をフェノール／クロロホルムで抽出し
た後再び沈澱せしめる。次に、この線状ＤＮＡを５μｇ
／ｍの濃度においてリンカーの連結について記載した
のと同一の条件下で再環化する。

連結されたＤＮＡを酵素ＨｉｎｄIII、ＰｖｕII（残っ
ている無傷のｐＢＲ322を除去するため）及びＰｓｔＩ
で切断し、複製開始点及びａｍｐ^Ｒ遺伝子を含有するＨ
ｉｎｄIII−ＰｓｔＩ大断片（3600ｂｐ＋リンカー）を
シュークロースグラジエント遠心により単離する。

ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−２からのＨｉ
ｎｄIII−ＰｓｔＩ挿入部（1160ｂｐ）及びＣＧ−ｐＢ
Ｒ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３からのＨｉｎｄIII−
ＰｓｔＩ挿入部（1020ｂｐ）（ヨーロッパ特許出願NO.7
6,489）をシュークロースグラジエント遠心により得、
それぞれを上記のようにして調製したＤＮＡに連結し
て、β−ラクタマーゼプロモーターの制御のもとに、そ
れぞれＬｙＩＦＮ−α−２コード領域及びＬｙＩＦＮ−
α−３コード領域を含有するプラスミドｐＡＭ４及びｐ
ＡＭ２を得る。

連結されたＤＮＡを直接使用して、次のようにしてコン
ピテントＥ．コリを形質転換すいる。ＤＮＡ連結混合物
（又はその画分）を150μの１５ｍＭTris−ＨＣ(pH
7.5)、１０ｍＭＣａＣ_２、１０ｍＭＭｇＣ_２、１０
ｍＭＮａＣ及び0.5ｍＭＥＤＴＡ中に移し、そして５
０μのＣａＣ_２処理した受容体Ｅ．コリＨＢ101を
加える。混合物を０℃にて２０分間保持し、次に４２℃
に移して２分間置き、そして室温に冷却した後１ｍの
Ｎ−培地を添加する。インキュベーションを３７℃にて
１時間続け（シェーカープラットホーム、250ｒｐ
ｍ）、この後600μをテトラサイクリン（１０μｇ／
ｍ）を含有するマッコンキー−寒天（ディフコ）上に
プレートする。ペトリ皿を３７℃にて16〜18時間インキ
ュトし、この時点で細菌コロニーを観察することができ
る。

プラスミドＤＮＡを次の方法により形質転換体から得
る。テトラサイクリン（１０μｇ／ｍ）を含有する１
０ｍのＮ−培地を１個ずつの形質転換体コロニーと共
にインキュベートし、そしてこの培養物を３７℃にて0.
9〜1.1(650nm)の光学濃度に達するまで攪拌（シェーカ
ープラットホーム、150-300ｒｐｍ）する。細胞を集
め、そしてテトラサイクリン（１０μｇ／ｍ）及びク
ロラムフェニコール（８０μｇ／ｍ）を含有する等容
量のＮ−培地中に再懸濁する。インキュベーションを３
７℃にてさらに１８時間続けて細胞当りのプラスミドの
数を増幅する。集菌し、そして細菌のペレットを５０ｍ
ＭTris−ＨＣ（pH８）（湿細胞重量ｇ当り１０ｍ）
中に再懸濁し、そしてリゾチームを加えて最終濃度２mg
／ｍとする。０℃にて１０分間の後、この溶液を５０
ｍＭＥＤＴＡに調整し、０℃にて１０分間の後、トリト
ンＸ100を最終濃度0.8％まで加え、そしてこの調製物を
０℃に１時間保持し、次にソルバルＳＳ−３４ローター
中で18000ｒｐｍにて３０分間遠心分離する。透明な上
清をフェノールで抽出し次にクロロホルムで２回抽出し
た後、ＲＮａｓｅ（シグマ）を最終濃度２５μｇ／ｍ
に加え、そして溶液を３７℃にて１時間インキュベート
する。ＲＮＡを除去するため、ＮａＣ（最終濃度１
Ｍ）及びポリエチレングリコール6000（最終濃度7.5
％）を加え、そしてこの調製物を−１０℃にて２時間保
持し、次にソルバルＳＳ−３４ローター中で10,000ｒｐ
ｍ、０℃にて１０分間遠心分離する。ペレットを２００
μのＴＮＥ中に再懸濁し、そしてフェノール／クロロ
ホルム（１：１）で再度抽出し、次に沈澱を行う（５０
０μのエタノールの添加、−８０℃にて５分間、１０
分間のエッペンドルフ遠心による）。ＤＮＡペレットを
20〜40μのＴＥに再懸濁する。この方法により得られ
る典型的な収量はプラスミドＤＮＡ約２０μｇである。

調製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＡＭ４及びｐＡＭ２）
を制限酵素分析にかける。ｐＡＭ４及びｐＡＭ２の構造
を確認する。

例２．ｐＡＭ４からの３′シストロン外ＰｖｕII部位の
除去 ｐＡＭ２（α−３）とは異り、ｐＡＭ４（α−３）はな
お２個のＰｖｕII部位を含有している（第３図を参照の
こと）。ＩＦＮコード領域内のＰｖｕII部位におけるハ
イブリドＩＦＮ遺伝子の造成を促進するため、シストロ
ン外領域内の第２のＰｖｕII部位を除去する。

プラスミドｐＡＭ４のこの変形は本質上、ＰｓｔＩ部位
と３′シストロン外ＰｖｕII部位との間の３′シストロ
ン外ＩＦＮα−２ｃＤＮＡ配列の除去である（第３図参
照のこと）。ｐＡＭ４をＰｖｕIIにより部分消化し〔５
μｇのｐＡＭ４、５０ｍＭＮａＣ、６ｍＭＭｇＣ
_２、６ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭTris
−ＨＣ(pH7.5)、１ユニット／μｇＰｖｕII（ビオラ
ブス）中、３７℃にて５分間消化、フェノール抽出によ
り反応停止〕、そして〔^３２Ｐ〕−ＰｓｔＩリンカー
（コラボラティブ・リサーチ、第１に記載した方法によ
る）に連結する。ＤＮＡ混合物を上記のようにしてＥ．
コリＨＢ101に形質転換し、そして１６クローンのプラ
スミドをＰｓｔＩ，ＰｖｕII及びＨｉｎｄIIIを用いる
制限酵素分鎖により正しいサイズ（246ｂｐ）の欠失の
存在についてスクリーニングする。スクリーニング１６
個のクローンの内３個が未変形のｐＡＭ４であり、１個
が多量体であり、５個が大きな欠失（620ｂｐ）を有
し、そして７個が目的の小欠失（246ｂｐ）を担持して
いる。短縮されたＩＦＮα−２挿入部（ＨｉｎｄIII−
ＰｓｔＩ小断片、907ｂｐを有する１つのクローンを選
択し、そしてｐＡＭ21と称する。

例３．アミノ酸９２におけるクロスオーバー部位を有す
るＰｖｕハイブリドの造成 プラスミドｐＡＭ２（α−３）及びｐＡＭ２１（α−
２）のそれぞれをＨｉｎｄIII及びＰｖｕIIで切断し、
β−ラクタマーゼプロモーター配列及びＩＦＮ遺伝子の
Ｎ−末端側の半分（アミノ酸１−92をコードする）を含
むＤＮＡ断片（521ｂｐ）を切り出す。大断片（約４Ｋ
ｂ）及び小断片（521ｂｐ）をシュークロースグラジエ
ント遠心により分離し、そして大断片を、５０μの５
０ｍＭTris（pH８）中で１μｇのＤＮＡ断片を１ユニッ
トのウシ腸カルカリ性ホスファターゼ（１０ｐmol５′
末端当り）により３７℃にて３０分間処理することによ
り脱リン酸化する。上記の適切な大ＤＮＡ断片及び小Ｄ
ＮＡ断片を連結することによりハイブリドインターフェ
ロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”及び“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”遺
伝子を造成する〔ｐＡＭ２からのＨｉｎｄIII−ＰｖｕI
I大断片（約４Ｋｂ）をｐＡＭ２１からのＨｉｎｄIII−
ＰｖｕII小断片（521ｂｐ）に連結することによりタイ
プ“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”ＩＦＮ遺伝子が生ずる等〕。連
結は、２０ｍＭTris−ＨＣ(pH7.8)、１０ｍＭＭｇＣ
_２、１０ｍＭＥＤＴＴ、0.5ｍＭｒＡＴＰ、４０ユニ
ット／μＴ_４ＤＮＡリガーゼ（ビオラブス）、並びに
約500ngの大ＤＮＡ断片及び20〜40ngの小断片を含有す
る１０μの容量中で行う。１５℃にて５時間の後、５
μの連結混合物を使用してＥ．コリＨＢ101を前記の
ようにして形質転換し、それぞれ約1000個の形質転換さ
れたコロニーを得る。３個ずつのコロニーを拾い上げ、
これらのプラスミドを単離し、そして酵素ＨｉｎｄII
I、ＰｖｕII、ＥｃｏＲＩ、ＴａｑＩ及びＰｓｔＩによ
り分析する。予想される構造を有するプラスミドＤＮＡ
〔ｐＡＭ２７（“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”）、及びｐＡＭ３
３（“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”）〕を含む２個のコロニーを
選択する。

例４．アミノ酸150でクロスオーバーするハイブリドＩ
ＦＮ遺伝子の造成 プラスミドｐＡＭ２（α−３）及びｐＡＭ２１（α−
２）のそれぞれをＰｖｕII及びＰｓｔＩにより消化す
る。ＤＮＡ断片をシュークロースグラジエント遠心によ
り、ＰｖｕII−ＰｓｔＩ大断片（約４Ｋｂ、ＩＦＮα−
２及びα−３のＮ−末端の９２個アミノ酸をコードす
る）、並びにＰｖｕII−ＰｓｔＩ小断片（長さが386ｂ
ｐ及び495ｂｐであり、それぞれＩＦＮα−２及びα−
３のＣ−末端をコードする）に分離する。第２段階にお
いて、ｐＡＭ２及びｐＡＭ２１からの精製されたＰｖｕ
II−ＰｓｔＩ小断片をそれぞれ次のようにして^３２Ｐ−
ラベルする。

ＤＮＡ断片（約１μｇ）をそれぞれ５０μの５０ｍＭ
Tris−ＨＣ(pH8.0)に溶解し、そしてＩＵ／１０ｐｍ
ｏｌｅ５′末端のアルカリ性ホスファターゼで３７℃に
て３０分間処理することにより脱リン酸化する。６５℃
にて１時間インキュベートすることにより酵素を不活性
化し、そしてＤＮＡをＤＥＡＥ−セルロースへの吸着及
びそれからの溶出により精製し、そしてエタノール中で
沈澱せしめる。このＤＮＡを、５０ｍＭTris−ＨＣ(p
H9.5)、１０ｍＭＭｇＣ_２、〔５ｍＭＤＴＴ、30〜40
μの凍結乾燥したγ−〔^３２Ｐ〕−ＡＴＰ（アメルシ
ャム、6000Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍ）〕及び0.
5Ｕ／μＴ_４キナーゼ（Ｐ．Ｌ．バイオケミカルス）
を含有する２０μの反応溶液中でリン酸化する。３７
℃にて２０分間の後、ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えるこ
とにより、反応を停止する。次に、過剰（約４μｇ）の
対応する未反応ＤＮＡ断片を加え、そして溶液をフェノ
ール及びクロロホルムにより抽出する。ＤＮＡを残留γ
−〔^３２Ｐ〕−ＡＴＰからＴＮＥ中セファデックスＧ５
０によるクロマトグラフィーにより分離する。セレンコ
フ計数によりモニターされた排除ピーク画分をプール
し、そしてエタノールで沈澱せしめる。

この〔^３２Ｐ〕ラベルされたＰｖｕII−ＰｓｔＩ小断片
のそれぞれをＳａｕ３Ａにより完全消化し、そしてこの
制限酵素処理されたＤＮＡを、ランニング緩衝液として
ＴＢＥを用いる６％ポリアクリルアミドゲル中での電気
泳動により分離する。ＰｖｕII−Ｓａｕ３Ａ（ＩＦＮα
−２及びα−３のアミノ酸93-150をコードする172ｂ
ｐ）、及びＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ（それぞれ、ＩＦＮα
−２及びα−３のアミノ酸151-166をコードする214ｂｐ
及び323ｂｐ）に対応する４個のＤＮＡ断片をゲールか
ら単離する。

３種類の適切な断片の再連結（第２表を参照のこと）に
より、アミノ酸150においてクロスオーバーした４つの
ハイブリドＩＦＮタイプが生ずる。対応するプラスミド
を次の一連の段階において再構成する。第１の連結反応
において、等モル量のＰｖｕII−Ｓａｕ３ＡＤＮＡ断片
及びＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片を、２０ｍＭTris
−ＨＣ(pH7.8)、１０ｍＭＭｇＣ_２、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、0.5ｍＭｒＡＴＰ及び４０ユニット／μＴ_４ＤＮ
Ａリガーゼを含有する連結緩衝液中で、１５℃にて３〜
６時間連結する（コンカテマーＤＮＡが生ずる）。Ｐｖ
ｕII−ＰｓｔＩによる消化及びフェノール／クロロホル
ム（１：１）による消化の後、過剰の適切なＰｖｕII−
ＰｓｔＩ大断片〔脱リン酸化されている：典型的には、
１μｇのＤＮＡを５０μの５０ｍＭTris−ＨＣ（pH
８）中で（約0.6ｐｍｏｌｅ５′末端）0.06ユニットの
ウシ腸アルカリ性ホスファターゼにより３７℃にて３０
分間処理する〕を加え、そしてＤＮＡを再度連結する。
Ｅ．コリＨＢ101を形質転換し、そして制限酵素分析
〔ＰｖｕII，Ｓａｕ３Ａ，ＴａｑＩ及びＥｃｏＲＩ）に
より決定された予想された構造を有するＤＮＡを担持す
る４個のクローンを拾い上げる。これらのクローンを
Ｅ．コリＨＢ101／ｐＪＣ334、ｐＪＣ37、ｐＪＣ342及
びｐＪＣ344と称する（第２表を参照のこと）。

例５．アミノ酸６０においてクロスオーバーするハイブ
リドＩＦＮ遺伝子の造成 これらのハイブリドＩＦＮ遺伝子の造成は、例４に記載
したのと実質的に同じ方法により達成される。

プラスミドｐＡＭ２（α−３）及びｐＡＭ２１（α−
２）のそれぞれをＨｉｎｄIII及びＰｖｕIIにより切断
し、そして断片をシュークロースグラジエント遠心によ
り分離する。ＨｉｎｄIII−ＰｖｕII小断片（521ｂｐ、
β−１ａｃプロモーター領域を含有し、そしてＩＦＮα
−２及びα−３のＮ−末端の９２アミノ酸をコードす
る）を^３２Ｐラベル、そしてＳａｕ３Ａにより部分消化
する（ＤＮＡμｇ当り0.5ユニットの酵素、３７℃にて
５分間反応、フェノール抽出により反応停止）。断片の
得られた混合物を６％ポリアクリルアミドゲル中での電
気泳動により分離し、そして４つの断片（２つの424ｂ
ｐＨｉｎｄIII−Ｓａｕ３Ａ断片、及び９７ｂｐのＳａ
ｕ３Ａ−ＰｖｕII断片）をゲルから抽出する。例４に記
載したような段階的方法による３個の適切な断片の連結
（第３表参照のこと）、及びＥ．コリＨＢ101への形質
転換により予想した４造成物の内２個の形質転換体のみ
が得られる。ｐＡＭ65（“Ｄ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”）、及び
ｐＡＭ90（“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”）。

アミノ酸６１においてクロスオーバーする他の２種類の
ハイブリドＩＦＮ遺伝子を造成するため、プラスミドｐ
ＡＭ65及びｐＡＭ90のそれぞれをＨｉｎｄIII及びＰｖ
ｕIIで切断し、そして小ＨｉｎｄIII−ＰｖｕIIＤＮＡ
断片（521ｂｐ）をアガロースゲル中での電気泳動によ
り単離した。ｐＡＭ90のＨｉｎｄIII−ＰｖｕII小断片
をｐＡＭ２のＨｉｎｄIII−ＰｖｕII大断片と連結する
ことによりｐＡＭ92（Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４）を得、そして
ｐＡＭ65のＨｉｎｄIII−ＰｖｕII小断片をｐＡＭ21の
ＨｉｎｄIII−ＰｖｕII大断片と連結することによりプ
ラスミドｐＡＭ76（Ｄ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｂ_４）を得る。上記４
種類のプラスミドＤＮＡの構造を制限酵素分析により確
認する。

対応するクローンを、Ｅ．コリＨＢ101／ｐＡＭ65、ｐ
ＡＭ90、ｐＡＭ94及びｐＡＭ76と称する。

パートII．サッカロミセス・セレビシューにおけるイン
ターフェロンα−２／α−３ハイブリド遺伝子の造成及
びクローニング 下記のすべてのハイブリドインターフェロン蛋白質コー
ド配列はＰＨＯ５プロモーター及びＰＨＯ５転写停止シ
グナルに連結され、酵母２μベクターｐＪＤＢ207にク
ローン化され、そして酵母Ｓ．セレビシエーＧＲＦ18株
に形質転換された。

例６．発現プラスミドｐ31ＲＴ（Δ７２）の造成 プラスミドｐＪＤＢ207／ＩＦ２（５_１）Δ７２（ヨー
ロッパ特許出願NO.100,561）をＨｉｎｄIII及びＥｃｏ
ＲＩで消化し、そしてインターフェロンα−２のカルボ
キシル末端及びＰＨ05転写停止シグナルを含んで成る47
0ｂｐ断片をゲル電気泳動及び電気溶出により〔R.Yang
等、Methods Enzym.68,176(1979)〕ミクローコロジオン
バックを用いて単離する。プラスミドｐ31Ｒ（ＥＰ100,
561を参照のこと）をＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩにより
消化し、そして同じ技法を用いて4.1ｋｂベクター部分
を単離する。200ｎｇのベクター及び挿入部ＤＮＡを
Ｅ．コリＴ_２ＤＮＡリガーゼを用いて連結しそしてＥ．
コリＨＢ101をアンピシリン耐性に形質転換した後、Ｐ
ＨＯ５プロモーター、インターフェロンα−２のＣ−末
端及びＰＨＯ５転写停止シグナルを含有するｐ31ＲＴ
（Δ７２）と称するプラスミドを単離し、そしてその構
造を制限酵素分析により確認する。

例７．プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ10
4、ＡＭ114、及びＡＭ119の造成 ＰＨＯ５発現プラスミドｐ31ＲＴ（Δ７２）（例６を参
照のこと）を、Ｅ．コリのＤＮＡポリメラーゼＩのKlen
ow断片を用いてｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰＯ及びｄ
ＴＴＰによりフィルインする。次に、平滑末端を細菌ア
ルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸化する。プラス
ミドｐＪＣ334、ｐＡＭ90及びｐＪＣ337（例４及び５）
を、ＴａｑＩにより（ｐＪＣ334及びｐＡＭ90）、又は
ＴａｑＩ及びＥｃｏＲＩにより（ｐＪＣ337）消化し、
そして３′のくぼんだ末端を上記のようにして対応する
デオキシヌクレオチドによりフィルインする。約560ｂ
ｐのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動及び電気溶出によ
りミクロ−コロジオンバックを用いて上記のようにして
単離する。プラスミドｐ31ＲＴ（Δ７２）の調製された
ベクター部分200ｎｇ及び溶出されたＤＮＡ断片200nmを
Ｔ_４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しそしてＥ．コリＨＢ
101をアンピシリン耐性に形質転換することにより、プ
ラスミドｐ31Ｒ／ＩＦＮＡＭ104（ハイブリドインター
フェロン“Ｄ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”コード配列を含有す
る）、ｐ31ＲＩＦＮＡＭ119（ハイブリドインターフェ
ロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”コード配列を含有する）、及
びｐ31ＲＩＦＮＡＭ114（ハイブリドインターフェロン
“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”コード配列を含有する）がそれぞ
れ得られる。これらのプラスミドをＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIIIで切断することにより、ＰＨＯ５プロモーター
／ＩＦＮ蛋白質コード配列／ＰＨＯ５転写停止シグナル
の配置を有する約1300ｂｐのＤＮＡ断片をアガロース電
気泳動及び電気溶出により単離する。この断片をプラス
ミドｐＪＤＢ207のＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ部位の間
にクローン化する。プラスミドを酵母株ＧＲＦ18に形質
転換してＬｅｕ^＋にする（ＥＰ100,561、及び例１４を
参照のこと）。生ずるクローンをＳ．セレビシエーＧＲ
Ｆ18／ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ104、ＧＲＦ18
／ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ114、及びＧＲＦ18
／ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ119と称する。

例８．プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ129
の造成 プラスミドｐＡＭ94（例５）をＴａｑＩにより完全消化
し、そしてＥｃｏＲＩにより（１０ｎｇ／ｍの臭化エ
チシウムの存在下で）部分消化する。約580ｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動及び電位溶出により単
離し、そしてプラスミドｐ31ＲＴ（Δ７２）（例６を参
照のこと）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断されそして
ゲル精製されたベクター部分に連結する。Ｅ．コリＨＢ
101をアンピシリン耐性に形質転換した後、プラスミド
ｐ31ＲＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ129を単離する。インター
フェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”コード領域を含有するこ
のプラスミドをＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで消化し、
そして1300ｂｐＤＮＡ断片を例７に記載したようにして
ｐＪＤＢ207に連結する。このプラスミドを上記のよう
にして酵母株ＧＲＦ18に形質転換する。生ずるクローン
をＳ．セレビシエーＧＲＦ18／ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／
ＩＦＮＡＭ129と称する。

例９．プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ10
6、ＡＭ110及びＡＭ112の造成 プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５ＩＦＮ／ＡＭ104、ＡＭ
114及びＡＭ129（例７及び例８を参照のこと）をＢａｍ
ＨＩ及びＰｖｕIIで消化し、そしてインターフェロンコ
ード領域のそれぞれのＣ−末端を含有する6.8Ｋｂのベ
クター部分をアガロース電気泳動及び電気溶出により単
離する。同様にして、プラスミドｐＪＤＢ207Ｒ／（α
−２）Δ７２（ヨーロッパ特許出願NO.100,561）をＢａ
ｍＨＩ及びＰｖｕIIで消化し、そして800ｂｐのＤＮＡ
断片を単離する。対応する断片の連結及びＥ．コリＨＢ
101の形質転換により、プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５
／ＩＦＮＡＭ106（ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１
Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”コード領域を含有する）、ＡＭ112（ハ
イブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”コード
領域を含有する）、及びＡＭ110（ハイブリドインター
フェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”コード領域を含有する）
が生ずる。酵母株ＧＲ18を通常通り形質転換する。生ず
るクローンをＳ．セレビシエーＧＲＦ18／ｐＪＤＢ207
ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ106、ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦ
ＮＡＭ112、及びｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ110
と称する。

例１０．プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＤＭ
１及びＤＭ２の造成 プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ119（例
７）をＨｉｎｄIII及びＢｇｌIIで消化し、そしてイン
ターフェロンコード領域のＮ−末端部分を含有する7.5
Ｋｂベクター部分をアガロースゲル電気泳動及び電気溶
出により単離する。同様にして、プラスミドｐＪＤＢ20
7ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ114及びｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／
ＩＦＮＡＭ104（例７を参照のこと）のそれぞれを前記
と同じ酵素で消化し、そしてインターフェロンコード領
域のＣ−末端を含有する約600ｂｐのＤＮＡ断片を単離
する。対応する断片をＴ_４ＤＮＡリガーゼで連結する。
Ｅ．コリＨＢ101を形質転換した後、ハイブリドインタ
ーフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”コード領域を含有する
プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＤＭ１、及び
ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”コー
ド領域を含有するｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＤＭ２
を得る。酵母株ＧＲＦ18を前記のようにして形質転換す
る。生ずるクローンをＳ．セレビシエーＧＲＦ18／ｐＪ
ＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＤＭ１、及びＳ．セレビシエ
ーＧＲＦ18／ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＤＭ２と称
する。

例１１．プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＨＲ
ｉ43の造成 プラスミドｐＪＤＢ207Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ７２（ヨ
ーロッパ特許出願NO.100,561）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕ
IIにより消化し、そして6.8ＫｐのＤＮＡ断片を単離す
る。同様にして、プラスミドｐＪＤＢ207Ｒ／ＩＦ（α
−３）（ＥＰ100,561）を前記と同じ酵素で消化し、そ
して800ｂｐのＤＮＡ断片を単離する。２個のＤＮＡ断
片の連結及びＥ．コリＨＢ101のアンピシリン耐性への
形質転換により、ハイブリドインターフェロン“Ｄ_１Ｄ
_２Ｂ_３Ｂ_４”コード領域を含有するプラスミドｐＪＤＢ
207ＰＨＯ５／ＩＦＮＨＲｉ43を得る。上記のように、
酵母株ＧＲＦ18を形質転換する。生ずるクローンをＳ．
セレビシエーＧＲＦ18ｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＨ
Ｒｉ43と称する。

例１２．サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ18の形質
転換及びインターフェロン生産の誘導 プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５／ＩＦＮＡＭ129“Ｂ_１
Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”をサッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ
18株（α、ｈｉｓ３−11、ｈｉｓ３−15、ｌｅｕ２−
３、ｌｅｕ２−112、ｃａｎ^Ｒ）に、Hinnen等、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA75,1929(1978)に記載されている方法
と類似する方法により導入する。１μｇのプラスミドＤ
ＮＡを１００μのスフェロプラスト懸濁液に加え、そ
してこの混合物をポリエチレングリコールで処理する。
スフェロプラストを１０ｍの再形成寒天と混合し、そ
してロイシンを含有しない酵母最少培地プレートにプレ
ートする。３０℃にて３日間インキュベートした後、約
1000個の形質転換された細胞を得る。

酵母形質転換プレートからの１個の単酵母コロニーを、
100ｍのエルレンマイヤーフラスコ中１０ｍの酵母
最少培地に拾い上げ、そして３０℃、200ｒｐｍにて２
４時間、約２〜３×１０^７細胞／ｍの濃度にまで培養
する。細胞を２０ｍの低−ｐｉ最少培地〔２０ｇ／
のグルコースを補完した“ディフコアミノ酸不含酵母最
少培地”であって、ディフコの処方（Difco Manual、デ
ィフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、米国）に従って
調製したものであるが、但し１ｇ／のKH₂PO₄の代りに
0.03ｇ／のKH₂PO₄＋１ｇ／のＫＣが使用されてい
る〕により１回洗浄する。３ｍの再懸濁細胞を用いて
1000ｍのエルレンマイヤフラスコ中300ｍの低−ｐ
ｉ最少培地、及び300ｍの正常最少培地のそれぞれに
接種する。３０℃、160ｒｐｍにてインキュベーション
を行う。ＰＨＯ５プロモーターの誘導を、Ｔｏｈ−ｅ等
J.Bacteriol.113,727(1973)に記載されているようにし
て全体細胞中での酸性ホスファターゼの出現を測定する
ことにより追跡する。細胞を約１〜２×１０^７細胞／ｍ
まで増殖せしめる（26〜30時間のインキュベーショ
ン）。

例１３．酵母細胞抽出物の調製及びインターフェロン力
価の決定 １〜２×１０^７／ｍの濃度の培養液（例１２を参照の
こと）300ｍから細胞をソルバルＧＳＡローター中４
℃、8000ｒｐｍにて５分間の遠心分離により集める。こ
の細胞を100ｍの水で１回洗浄し、６ｍの氷冷した
細胞溶解混合物〔0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)、
１ｖ／ｖ％トリトンＸ−100、0.0001ＭＰＭＳＦ（メル
ク）〕中に再懸濁し、そして３０ｍのコレックスチュ
ーブに移す。懸濁液を再度ソルバルＳＳ−34ローター中
で8000ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、そして３ｍ
の細胞溶解混液に０℃にて再懸濁する。４ｇのガラス
ビーズ（直径0.4mm）を細胞に加え、そして懸濁液をボ
ルテックスミキサー（サイエンティフィック・インスツ
ルメンツ社、米国）上で最高速度で３０秒間振とうし、
そして次に氷浴中で１分間冷却する。この振とう操作を
５〜10回、９０％以上の細胞が破壊されるまで（光学顕
微鏡下で点検する）反復する。細胞断片及びガラスビー
ズを、ソルバルＨＢ−４ローター中４℃、8000ｒｐｍに
て１０分間遠心分離することにより、除去する。上清を
エッペンドルフチューブに移し、液体窒素中で凍結し、
そして−６０℃にて貯蔵する。インターフェロン活性
を、S.Rubinstein等、J.Virol.37,755(1981)に従って決
定する。７×１０^９ユニット／ｍ細胞抽出液である。

例１２及び１３に記載したのと同様にして、Ｓ．セレビ
シエーＧＲＦ18株を、プラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５
／ＩＦＮＡＭ119（“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”）、ＡＭ106
（“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”）、ＡＭ112（“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３
Ｂ_４”）、ＤＭ１（“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”）、ＤＭ２
（“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”）、ＡＭ110（“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３
Ｄ_４”）、及びＨＲｉ４３（“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”）に
より形質転換する。得られた菌株を培養する。細胞を収
得し、そして前記のようにしてインターフェロン力価を
決定する。

Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN AM119：5・10⁹
ユニット・ml Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN AM106：7・10⁷
ユニット・ml Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN AM112：2・10⁸
ユニット・ml Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN DM1：3・10⁹ユ
ニット・ml Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN DM2：5・10⁹ユ
ニット・ml Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN AM110：3・10⁸
ユニット・ml Ｓ．セレビシエーGRF18/pJDB207PHO5/IFN HRi43：5・10⁹
ユニット・ml 同じ条件下で、Ｓ．セレビシェーＧＲＦ18／ｐＪＤＢ20
7Ｒ／ＩＦ（α−２）及び／ＩＦ（α−３）（ＥＰ100,5
61）はそれぞれ１×１０^８及び３×１０^９ユニット／ｍ
の力価を与える。

例１４．３０規模での、形質転換された酵母細胞によ
るハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”の
製造 酸性ホスファターゼプロモーターＰＨＯ５の下流にハイ
ブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”の遺伝子
を有するプラスミドｐＪＤＢ207ＰＨＯ５ＩＦＮＡＭ129
を担持する酵母菌株ＧＲＦ18をＹＮＢ培地の寒天表面上
にストリークする。このプレートを３０℃にて、コンフ
ルエント増殖が観察されるまでインキュベートする。無
菌ループを用いて表面培養物の一部分を次に組成の前培
養培地ＩＦＮ／２１を収容した振とうフラスコに移す。

１の脱イオン水中 酵母エキス（ディフコ） １０．０ｇ Ｌ−アスパラギン・Ｈ_２Ｏ ６．６ｇ KH₂PO₄ １．０ｇ MgSO₄・7H₂O １．９ｇ Ｌ−ヒスチジン ０．０２ｇ Ｄ−グルコース（−水和物） ３３．０ｇ 500ｍのフラスコは１個のバッフルを有し、そして100
ｍの培地を収容する。培地は脱イオン水を用いて調製
し、そして約6.0のpH値を有する。グルコースは別に殺
菌する。接種した後、第１培養物を３０℃にて２４時
間、５cmスローの回転振とう機上で250回／分のスピー
ドでインキュベートする。この第１前培養フラスコが第
２前培養スラスコのための接種物を提供する。第２前培
養フラスコには１ｖ／ｖ％の接種物を加える。培地及び
培養条件は第１前培養の場合と同じである。第２前培養
段階の十分な数のフラスコを一緒にして３０発酵槽の
ための１ｖ／ｖ％の接種物を得る。製造用発酵槽は３０
の実働容積を有し、４個のバッフルを有し、そして直
径115mmの６枝羽根ディスクタービン撹拌機１個を有す
る。撹拌速度は600回／分とし、空気を１ｖ／ｖ／分で
吹き込み、そして0.3ｂａｒの上圧をかける。発酵温度
は３０℃である。発酵槽を次の培地と共に殺菌する。

１の脱イオン水当り 酵母エキス（ディフコ） ２．０ｇ Ｌ−アスパラギン・Ｈ_２Ｏ ６．６ｇ MgSO₄・7H₂O １．０ｇ Ｌ−ヒスチジン ０．０２ｇ Ｄ−グルコース（−水和物） ３３．０ｇ グルコースは別に殺菌し、これを加えて最終容量を３０
にする。

接種の後、発酵pHを6.0より下らないように水酸化ナト
リウムを添加することにより調製する。醗酵は約１８時
間、又はインターフェロンの最高収量が達成されるまで
続ける。

酵母の増殖の便利な測定値である光学濃度が６〜７ＯＤ
ユニットに達する。グルコースは多く消費されるがしか
し完全には消費されず、酸性ホスファターゼ活性の誘導
にインターフェロンの生産が伴う。

インターフェロン力価は実験室で機械的細胞破砕により
調製された粗抽出物について測定することができ、そし
て７×１０^９ユニット／細胞抽出物である。粗抽出物
中の蛋白質含量は約１mg／ｍである。

醗酵の終点において、所望により培養液１０℃に除去し
た後に取り出し、そしてハイブリドインターフェロンを
回収する。

pH6.0の３０の培養液を１０℃に冷却し、そしてシャ
ープレス遠心分離機により細胞を分離する。透明な上清
はＩＦＮ活性を含有しない。得られた細胞塊を、バッフ
ァーＸ〔２ｍＭTris(pH8.0)、５ｍＭＥＤＴＡ，0.5ＭＮ
ａＣ，２０μＭフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド〕により1400ｍに調整し、そしてこれはpH8.0であ
る。５〜10℃に冷却した後、懸濁液を、ポリフレタン撹
拌ディスク及び0.5〜0.75mm直径のガラスビーズ500ｍ
を備え、そして3,000ｒｐｍの撹拌速度及び１０／時
の供給速度を有するダイノーミル（タイプＫＤＬ Ｐｉ
ｌｏｔ、0.6）に通し、こうして細胞を破砕する。上
清はpH８である。破砕された細胞を有する懸濁液を遠心
分離により透明にする。遠心分離はソルバル６ＳＡロー
ター中で12,000ｒｐｍ、４℃にて２０分間行う。

同様にして、それぞれプラスミドｐＪＤＰ207ＰＨＯ５
／ＩＦＮ ＡＭ119、ＡＭ106、ＡＭ112、ＤＭ１及びＤ
Ｍ２を含有するＳ．セレビシエーＧＲＦ18株を培養し、
そして対応するハイブリドインターフェロンを含有する
透明な溶液を得ることができる。

例１５．Ｅ．コリＨＢ101／ｐＡＭ94株の抽出物の調製
及びＩＦＮ活性の決定 Ｅ．コリＨＢ101／ｐＡＭ94株を650mmにおける光学濃度
８まで、0.4％のカザミノ酸及び２％のグルコースを含
有するＭ９培地１中で増殖せしめる。細胞を沈降せし
め、そして0.1ＭTris−ＨＣ(pH8.0)、0.5ＭＮａＣ
、５ｍＭＥＤＴＡ及び１００μＭＰＭＳＦを含有する
緩衝液中に再懸濁する（160ｍの緩衝液中１６ｇの細
胞）。リゾチウムを１mg／ｍの最終濃度に添加する。
次に、この溶液を氷上に３０分間保持する。この懸濁液
中の細胞をソルバル・オムニミックスを用いて６０秒間
３回の設定で破壊する。破壊された細胞を含有する懸濁
液をソルバル６５Ａローター中で12,000ｒｐｍ、４℃に
て２０分間遠心分離することにより透明にする。上清
を、Rubinstein等（前掲）の方法を用いてＩＦＮ活性に
ついて測定する。

５×１０^７ユニット／ｍ細胞抽出物のＩＦＮ活性が見
出される。

同様にして、Ｅ．コリＨＢ101／ｐＡＭ90、ｐＪＣ344、
及びｐＪＣ342を培養し、そして上記のようにしてイン
ターフェロン力価が５×１０^８５×１０^７及び５×１０
^６ユニット／ｍ細胞抽出物であると決定される。

例１６．ハイブリドーマ細胞の調製 ａ）免疫原の由来 K.Cantell博士（ヘルシンキ）から入手した半精製天然
ヒト白血球ＩＦＮ（ＩＦＮα）のサンプル（比活性13×
10^６ＩＵ／mg）蛋白質を免疫原として使用する。

ｂ）免疫感作方法 10〜14週令の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス７匹を、４個の足
パッドにフロインドの安全アジュバン（ディフコ）に懸
濁した４×１０^５ＩＵのＩＦＮαを注射することにより
免疫感作する。３０日目に、フロインドの不完全アジュ
バンド中ＩＦＮα４×１０^５ＩＵを投与し、そして６０
日目にＰＢＳ中ＩＦＮα６×１０^５ＩＵの追加免疫射注
（ｉ．ｐ．）を行う。

ｃ）細胞融合 すべての融合実験は、G.Kohler及びC.Milstein〔Natur
e,256,495(1975)〕の方法に従って、非分泌性Ｓｐ２／
０−Ａｇ14骨髄腫セルライン〔M.Shu/man,C.D.Wilde及
びＧ．Ｋｈｌｅｒ，Nature,276,269(1978)〕を用いて
行う。１０^８個の脾細胞を１０^７個の骨髄細胞と、１ｍ
の５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ1500，セル
バの存在下で混合する。洗浄した後、細胞を４８ｍの
標準的ドルベコの最少必須培地（ギブコNO0422501）に
再懸濁する。１融合当たり３×１０^６個の正常マウス腹
腔浸潤細胞をフィーダー細胞として加える。細胞を４８
個の１ｍコスターウエルに分配し、そして１週間に３
回標準的ＨＡＴ培地を３〜６週間にわたって加える。ハ
イブリドーマ細胞の増殖が見えるようになったとき、上
清を免疫沈澱−バイオアッセイ組合せ法（例１９）によ
りスクリーニングする。合計221個のハイブリドーマの
内、１０ハイブリドーマが抗ＩＦＮα抗体を生産するこ
とが見出される。ハイブリドーマ細胞をミクロタイター
プレート上での限界稀釈法により少なくとも１回クロー
ン化する。ハイブリドーマ144ＢＳが特に安定であり、
そして大量の免疫グロブリンを分泌するためこれを選択
してさらに検討する。

例１７．モノクローナル抗体の単離及び精製 ８〜10週令のＢａｌｂ／ｃマウス（ティーファーム、シ
ッセルン、スイス）を0.3ｍのプリスタン（アルドリ
ッチ）により腹腔内前処理する。２〜３週間後、２〜５
×１０^６個のクローン化されたハイブリドーマ細胞及び
0.2ｍのプリスタンを腹腔内接種する。８〜10日後、
腹水を集め、そして800×ｇで遠心分離しそして−２０
℃で貯蔵する。

解凍した腹水を50000×ｇにて６０分間遠心分離する。
表面に浮上する脂肪層を注意深く除去し、そして蛋白質
濃度を10〜12mg／ｍに調整する。飽和硫酸アンモニウ
ム溶液0.9容量を０℃にて滴加することにより粗免疫グ
ロブリンを沈澱せしめ、そして２０ｍＭTris−ＨＣ／
５０ｍＭＮａＣ(pH7.9)に溶解し、そして同じ緩衝液
に対して透析する。２０ｍＭTris−ＨＣ／25〜400ｍ
ＭＮａＣ(pH7.9)の緩衝液グラジエント系を用いるＤ
ＥＡＥ−Ｄ52セルロース（ワットマン）クロマトグラフ
ィーにより免疫グロブリン画分を得る。免疫グロブリン
を硫酸アンモニウムにより再び沈澱せしめ、そして１０
mg／ｍの濃度でＰＢＳ中に溶解する。

ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドケル電気泳動に
よりモノクローナル抗体144ＢＳが９５％以上の純度で
あることが示される。

例１８．モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスの
決定 クローン化されたハイブリドーマ細胞により生産される
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、クラス
及びサブクラス特異的ラビット抗体（バイオネティック
ス）を用いるオークテルロニーの既知の寒天ゲル免疫拡
散法により決定する。この結果を酵素イム／アッセイ(E
LISA)により次のようにして確認する。

ミクロタイタープレートを、５０μのＰＢＳ中クラス
−又はサブクラス−特異的血清（バイオネティクス）の
ラビット免疫グロブリン調製物１μｇ／ウエルによりコ
ートする。

プレートの遊離結合能を、0.2（Ｗ／Ｖ）％NaN³を含有
するＰＢＳ(pH7.4)中１％ウシ血清アルブミンの緩衝液
により飽和する。モノクローナル抗体を含有する100μ
のプローブを３７℃にて１時間、ウエル中でインキュ
ベートする。プレートをＰＢＳで洗浄し、次にプレート
のコテーィングに使用したのと同じ特異性を有する、ホ
スファターゼに接合したラビット免疫グロブリン調製物
と共にインキュベートする。固定された酵素を、0.5ｍ
ＭＭｇＣ_２及び0.02Ｗ／Ｖ％NaN₃を含有するジエタノ
ールアミン緩衝液(pH9.8)中酵素基質ｐ−ニトロフェニ
ルホスフェートの溶液（１０％）とインキュベートする
ことにより発色せしめ、そして405nmにて光学濃度を測
定する。モノクローナル抗体144ＢＳはクラスＩｇＧ_１
κ（カッパー）に属する。

例１９．コンバインド・イムノアッセイ−バイオアッセ
イ ５０μの粗天然ヒト白血球ＩＦＮ又は組換ＩＦＮαポ
リペプチド（例２０ａ）（１０^４ＩＵ／ｍ）を等容量
の試験溶液、例えばハイブリドーマの培養上清又は精製
されたモノクローナル抗体のＰＢＳ溶液と混合し、そし
てミクロチューブ（エッペンドルフ3810）中で３７℃に
て２時間インキュベートする。次に、５０μのあらか
じめ力価検定された抗マウスＩｇ抗体（ノルディック）
を加え、そしてこの混合物を３７℃にて１時間、そして
次に４℃にて１６時間インキュベートし、遊離のモノク
ローナル抗体及びＩＦＮに結合したモノクローナル抗体
が免疫複合体を形成する。チューブを12,000ｒｐｍ、４
℃にて５分間遠心する。免疫沈澱物を１ｍの冷緩衝化
塩溶液(pH7.2)により１回洗浄し、そして次に200μの
緩衝化塩溶液(pH2.2)に溶解する。これによって遊離し
たＩＦＮ活性をJ.A.Armstrongs,Appl.Microbiol21、723
(1971)による標準的バイオアッセイにおいて測定する。
メンゴ（Ｍｅｎｇｏ）ウイルスの細胞変性効果の阻害
（ウエル当り400プラーク形成ユニットをＨｅｐ２細胞
（３×１０^４細胞／ウエル）を用いてミクロタイタープ
レート中で測定する。

例２０．インターフェロン特異性の決定 ａ）組換ＩＦＮαポリペプチドの由来 それぞれＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＢ及びＩＦＮαＤに近縁
のＬｙＩＦＮ−α−１、ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩ
ＦＮ−α−３ポリペプチドはヨーロッパ特許出願NO.76,
489に記載されている。ＩＦＮαＡ及びＩＦＮαＪはJ.D
avis博士（バイオジュン、ジュネーブ）及びC.Weissman
n教授（スイス、チューリッヒ大学）から入手し、そし
てＩＦＮαＣはWeizmann Institute of Science,Depart
ment of Virology,Rehorvot,イスラエルから入手した。

ｂ）比較のために使用されるＩＦＮに対するモノクロー
ナル抗体の由来 モノクローナル抗体１Ｋ２及び２Ｋ２は英国特許NO.2,1
08,510に記載されているようにして調製する。ＭＡｂＮ
Ｋ２及びＹＯＫはセルテック（バークシャー）から得ら
れ、ＩＹ−１及びＩＹ−２はインター・イエダ（イスラ
エル）から得られ、Ｓ−１、Ｓ−２、Ｓ−３及びＳ−４
はC.Favre博士、ＵＮＩＣＥＴ、ダーディリー（フラン
ス）から得られ、そしてＭＡｂ１／２４はM.Aguet,，チ
ューリッヒ大学（スイス）から得られる。

ｃ）反応性の決定 ＩＦＮαサブタイプに対する種々のモノクローナル抗体
の反応性の決定は例１９に記載したコンバインド・イム
トプレシピテーション−バイオアッセイ、及びD.S.Sech
er,Nature290,501(1981)により記載されたタンデム・ラ
ジオイムノアッセイにより行われる。結果を第４表にま
とめる。

モノクローナル抗体144ＢＳ、１Ｋ２及び２Ｋ２はヒト
ＩＦＮβ（レンチュラー、ラオプハイム、西独）又はヒ
トＩＦＮγ（バイオサイエンス、エムメンブリュッケ、
スイス）と反応しない。

空欄結合未決定 （およその値） 第４表の結果は、モノクローナル抗体144ＢＳがユニー
クな結合パターンを示すことを示している。特に、ＩＦ
ＮαＡに対する低い結合性及びＩＦＮ−α−２、ＩＦＮ
−α−３及びＩＦＮ−α−１ポリペプチドに対する高い
結合性が注目される。

さらに、第４表の結果は第５表に概略示すエピトープ分
析を可能にする。

第５表の分析から、各ＩＦＮαサブタイプのエピトープ
の結合わせがユニークであることが明らかになる。さら
に、この分析は、タンデムイムノアッセイにおいてＩＦ
Ｎαの特定のサブタイプの決定をその他のサブタイプを
排除して行うためのモノクローナル抗体の適切な対を予
想することを可能にする。例えば、モノクローナル抗体
144ＢＳとモノクローナル抗体ＮＫ−２、Ｓ−３、ＩＹ
−１、又はＩ／２４のいずれかとの組合わせがＩＦＮα
Ｄによる妨害を伴わないでＩＦＮαＢを検出するために
有用であり、そしてモノクローナル抗体144ＢＳとモノ
クローナル抗体ＹＯＫとの組合わせがＩＦＮαＢの存在
下でＩＦＮαＤを検出するために有用である。

例２１．免疫吸着カラムの調製 １ｍのアフィーゲル１０（ビオーラド）を製造物の指
示に従って１７mgのモノクローナル抗体144ＢＳとカッ
プリングせしめる。アフィーゲル１０を焼結ガラスフィ
ルター上でまず冷蒸留水によりそして次に0.1ＭNaHCO₃
溶液(pH8.0)（カップリング緩衝液）により洗浄する。
カップリング緩衝液中５０％ゲルの懸濁液をプラスチッ
クチューブに移し、等容量の精製されたモノクローナル
抗体と混合し、そして室温にて４時間撹拌する。カップ
リングの後、ゲルをカップリング溶液で洗浄し、そし
て、未反応部位をブロックするため0.1ｍの１Ｍエタ
ノールアミンＨＣ(pH8.0)を室温にて１〜２時間処理
する。１０ｍＭNaN₃の存在下でＰＢＳによりゲルを洗浄
し、そしてその中に４℃にて保持する。

例２２．イムノアフィニティクロマトグラフィーによる
組換ＩＦＮαの精製 組換ＩＦＮαを生産するＥ．コリ例えばＥ．コリＨＢ10
1／ｐＡＭ94（例１５参照のこと）の破砕された細胞の
懸濁液を、ソルバル６ＳＡローター中12,000ｒｐｍ、４
℃にて２０分間遠心分離することにより透明にする。ポ
リエチレンアミン（ポリイミンＰ、フルカ、pH8.0）を
上清い最終濃度が0.25Ｗ／Ｖ％となるように加える。こ
の溶液を１時間撹拌し、そして次に遠心分離する。ペレ
ットを廃棄し、そして上清を硫酸アンモニウム６５％飽
和にする。この混合物を１時間撹拌し、そして次に遠心
分離する。上清を廃棄し、ペレットを１０倍容量（15〜
20ｍ）のＰＢＳ(pH7.2)に懸濁する。この溶液を0.02
％NaN₃を含有するＰＢＳに対して一夜透析する。

透析された溶液を例２１のイムノアフィニティーゲル１
ｍと混合する。この混合物を１時間おだやかに撹拌
し、そしてカラムに充填し、そして５カラム容量のＰＢ
Ｓ、0.2％トリトンメ−100及び0.5ＭＮａＣを含有す
る５カラム容量のＰＢＳ、及び５カラム容量のＰＢＳに
より次々と洗浄する。この方法に代えて、イムノアフィ
ニティーゲルをまずカラムに詰め、そして前記透析され
た溶液を頂部に加え、そして次に上記のようにして洗浄
する。組換ハイブリドＩＦＮα（“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ
_３Ｄ_４”）は、0.1Ｍクエン酸及び0.3ＭＮａＣを含有
する酸性緩衝液pH2.5により溶出される。活性ＩＦＮ画
分を１ＭTrisにより中和し、ＰＢＳに対して透析し、そ
して限外濾過平床膜×Ｍ10（アミコン）を用いて約0.1m
g／ｍに濃縮する。

１７mgのモノクローナル抗体144ＢＳを含有する例２１
の免疫吸着カラムの最大能力は約1.2mgのＩＦＮ−α−
２及びＩＦＮ−α−３ポリペプチド、0.8mg以上のＩＦ
Ｎα−１型ポリペプチド、1.15mgのハイブリドインター
フェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”、1.25mgのハイブリドイ
ンターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”）、1.25mgのハイ
ブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、0.44mg
のハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”、
1.6mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ
_４”、1.6mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２
Ｄ_３Ｂ_４”、1.15mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ
_１Ｂ_２Ｄ_３Ｄ_４”、及び1.25mgのハイブリドインターフ
ェロン“Ｄ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”である。免疫吸着ゲルは能
力の実質的な喪失を伴わないで５０回までの分離に使用
することができる。この方法によって精製された組換Ｉ
ＦＮα−２、ＩＦＮ−α−３、ＩＦＮ−α−１型ポリペ
プチド及びハイブリドインターフェロンはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ中で均一である。

例２３．イムノドット分析 イムノドット分析をR.Hawkes等、Anal.Biochem.119、142
(1982)に従って行う。天然インターフェロン又は組換イ
ンターフェロンを含有するプローブを異る濃度でニトロ
セルロースシート上にスポットする。ドットを空気乾燥
し、そしてニトロセルロースの残留結合能を１０％ウマ
血清を含有するTris緩衝液（0.15ＭＮａＣ，0.01ＭTr
is−ＨＣ，pH7.6）中でのインキュベーションにより
ブロックする。次にニトロセルロースのストリップをモ
ノクローナル抗体144ＢＳの溶液（２３μｇ／ｍ）と
共にインキュベートし、そして同様にして調製されたス
トリップを比較用モノクローナル抗体２Ｋ２溶液（３９
μｇ／ｍ）、陰性対照としての正常マウス免疫グロブ
リンの溶液（１：100稀釈）、又は陽性対照としてのポ
リクローナル抗−ヒトインターフェロンαマウス血清の
溶液（エンゾ、１：100稀釈）と共にインキュベートす
る。洗浄後、すべてのストリップを、パーオキシダーゼ
ブラベルされたラビット抗−マウス免疫グロブリン（ノ
ルディック、１：400稀釈）で処理し、そして結合した
第２抗体をパーオキシダーゼ基質４−クロロ−１−ナフ
トールにより発色せしめる。

モノクローナル抗体はドット当り0.4ｎｇ以上の濃度の
ＩＦＮαＤタイプポリペプチド（例えばＩＦＮ−α−
３）及びドット当り１０ｎｇのＩＦＮαＢタイプポリペ
プチド（例えばＩＦＮ−α−２）を染色し、他方モノク
ローナル抗体２Ｋ２はＩＦＮαＤタイプポリペプチド
（ドット当り４ｎｇ）のみを認識する。

例２４．ビーズ−ラジオ−イムノ−タンデム−アッセイ ａ）^１２５Ｉによるモノクローナル抗体144ＢＳの放射
性ラベル化 0.1mgのモノクローナル抗体144ＢＳをF.C.Greenwood
等、Biochem.J.89、114(1963)の標準的方法に従って、
^１２５Ｉヨウ化ナトリウム（１ｍＣ）及びクロラミンＴ
によりヨード化する。反応生成物をイオン交換カラムビ
オ−ラドＡＧ１×８により精製し、そしてＰＢＳで稀釈
することにより活性を４×１０^５ｃｐｍ／ｍに標準化
する。同様にして、モノクローナル抗体２Ｋ２をヨード
化する。モノクローナル抗体ＹＯＫ及びＮＫ２はセルテ
ックから放射性ラベルされた形で市販されている。

ｂ）マクロビーズへのモノクローナル抗体144ＢＳのカ
ップリング ポリスチレンビーズ（直径6.3mm、スフェロテックＡ
Ｇ、チュリッヒ）を４℃にて１６時間、５ｍＭＥＤＴＡ
及び0.1％NaN₃を含有するＰＢＳのカップリング緩衝液
（pH８）中１mg／ｍのＭＡｂ144ＢＳの溶液中で、１
０ｍの溶液当り２０個のビーズの比率でおだやかに揺
動することによりインキュベートする。次に、コートさ
れたビーズを、１０％のウマ血清及び0.1％のNaN₃を含
有するブロッキング緩衝液に移し、そして使用するまで
少なくとも２４時間、この中に保持する。

他のＭＡｂのカップリングも同様にして行う。

ｃ）アッセイ方法 プラスチックチューブ（ファルコン、５ｍ）を、１０
％のウマ血清及び0.1％のNaN₃を含有するＰＢＳのブロ
ッキング緩衝液0.5ｍにより一夜コートする。緩衝液
を吸引除去し、そしてブロッキング緩衝液中ＩＦＮ含有
試験溶液又は標準溶液0.2ｍをチューブの底に直接加
える。例２４ｂのＭＡｂ−カップリングされそしてブロ
ックされたビーズをきれいなティッシュ上で短時間乾燥
し、そしてＩＦＮ溶液を収容するチューブ中に泡が生じ
ないように注意深く移す。ビーズをおだやかに揺動させ
ながら４〜６時間室温にてインキュベートする。ＩＦＮ
溶液を吸引除去し、そして各ビーズを２ｍずつのブロ
ッキング緩衝液で３回洗浄する。次にビーズを、80×10
³ｃｐｍに相当する^１２５Ｉ−ラベル第２抗体（例２４
ａ）0.2ｍ中で４℃にて１６時間インキュベートし、
ＰＢＳで３回洗浄し、そして計数のため新しいチューブ
に移す。

第６表は、固相第１抗体（ビーズにカップリングしてい
る）と^１２５Ｉ−ラベル第２抗体との異る組み合わせに
より得られたＩＦＮ−α−３及びＩＦＮ−α−２ポリペ
プチドの標準溶液についての結果を示す。

ＩＦＮ−α−３の検出のためにはＭＡｂ144ＢＳとＭＡ
ｂＹＯＫとの組合わせにより、そしてＩＦＮ−α−２の
検出のためにはＭＡｂ144ＢＳとＭＡｂＮＫ２との組合
わせにより、最良の結果が得られる。

第４図は、固相にカップリングしたＭＡｂ144ＢＳと放
射性ラベル化形のＭＡｂＮＫ２との組合わせを用いる定
量的力価検定実感の結果を示す。このアッセイは、ＩＦ
ＮαＢタイプポリペプチドの１〜5000ＩＵ／ｍ（２ｐ
ｇ／ｍ〜１０ｎｇ／ｍ）について直接的結果を与え
る。ＩＦＮ−α−２と“標準αＢ”タイプポリペプチド
（セルテックより入手）の検定曲線の差異は２つのＩＦ
Ｎ標品のバイオアッセイ測定における偏差に基く。

固相にカップリングしたＭＡｂ144ＢＳと放射性ラベル
化形のＭＡｂＹＯＫとの組合わせを用いるＩＦＮαＤタ
イプポリペプチドの定量的測定実験においても同様の結
果が得られる。このアッセイは、１ＩＵ／ｍ（２ｐｇ
／ｍ）以上のＩＦＮαＤタイプポリペプチドを確実に
検出する。固相にカップリングしたＭＡｂ144ＢＳとＭ
ＡｂＮＫ２との組合わせも、ＩＦＮαＦタイプポリペプ
チドの測定のために使用することができる。

ｄ）短縮されたアッセイ法（同時アッセイ） 例２４ｃ）に記載した一般的方法を使用し、ＭＡｂとカ
ップリングしたビーズを室温にて３時間、試験溶液（0.
1ｍ）及び放射性ラベルされた第２抗体（0.1ｍ）と
一緒にインキュベートし、この間の洗浄を省略する。

第５図は、前記の短縮された同時アッセイが、150ＩＵ
／ｍ以上を含有するＩＦＮαＢタイプポリペプチド
（例えばＩＦＮ−α−２）の迅速なスクリーニングのた
めに確実に使用され得るが、しかし例２４ｃ）のアッセ
イ法より感度が低いことを示す。第５図中、ｂｇはバッ
クグラウンドである。

ｅ）ビーズ−ラジオ−イムノ−タンデムアッセイのため
の試験キット 例２４ｃ）に記載したアッセイのための試験キットは次
のものを含む。

◎プラスチックチューブファルコン５ｍ 100個 ◎１０％ウマ血清及び0.1％NaN₃を含有するＰＢＳ中モ
ノクローナル抗体144ＢＳでコートされたポリスチレン
ビーズ6.3mm 100個 ◎比活性４×１０^５ｃｐｍ／ｍの^１２５Ｉラベル化モ
ノクローナル抗体ＹＯＫ ２０ｍ ◎比活性４×１０^５ｃｐｍ／ｍの^１２５Ｉラベル化モ
ノクローナル抗体ＮＫ２ ２０ｍ ◎１０^４ＩＵ／ｍのＩＦＮ−α−１標準溶液 ２ｍ
◎１０^４ＩＵ／ｍのＩＦＮ−α−２標準溶液 ２ｍ
◎１０^４ＩＵ／ｍのＩＦＮ−α−３標準溶液 ２ｍ
◎１０％ウマ血清及び0.1％NaN₃を含有するＰＢＳ 1
000ｍ ◎換算曲線 例２５．酵素−免疫測定（ＥＬＩＳＡ） ａ）アルカリ性ホスファターゼによるモノクローナル抗
体144ＢＳのラベル化 1.4ｍのＰＢＳ中1.4mgのＭＡｂ144ＢＳを、Voller
等、Bull.World Health Organ.53、55(1976)の標準的方
法に従って、グルタルアルデヒド（0.2ｖ／ｖ％）を用
いて、５mgのアルカリ性ホスファターゼ（ＳＩＧＭＡ
P6774，タイプVII−Ｔ）を含有する溶液と２時間にわた
ってカップリングせしめる。接合体を、１ｍｍｏｌｅの
ＭｇＣ_２，１％ＢＳＡ及び0.02％NaN₃を含有するTris
緩衝液（0.05Ｍ，pH8.0）５ｍ中に移す。この溶液を
暗所に４℃にて保持する。

ｂ）アッセイ法 ポリプロピレンミクロタイタープレート（ダイナテック
・ラブス社）を、３７℃にて２時間そして４℃にて一
夜、pH8.6の緩衝液（0.02％のナトリウムアジドを含有
する炭酸塩緩衝化0.9％食塩溶液中モノクローナル抗体
ＮＫ２（セルテック，１０μｇ／ｍ）の溶液によりコ
ートする。このプレートをＰＢＳにより５回洗浄し、そ
してなお存在する蛋白質反応性部位をpH7.4の緩衝液
（ＰＢＳ中0.2％ゼラチン及び0.2％NaN₃）250μと共
に３７℃にて１時間インキュベーとすることにより飽和
する。このようにしてコートされたプレートはこの緩衝
液中４℃にて数日間保持することができる。

段階的に稀釈した試験溶液又はＩＦＮαサブタイプを含
有する標準溶液５０μ、５０μの緩衝液(pH7.4)、
及び緩衝液(pH7.4)により１：100稀釈されたホスファタ
ーゼラベル化抗体144ＢＳ（例２５ａ）の溶液５０μ
を混合し、そして、ミクロタイタープレートのウエル中
で３７℃にて２時間及び４℃にて３０分間インキュベー
トする。プレートをＰＢＳにて５回洗浄し、次に３７℃
にて３０分間ｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液
（１mg／ｍ、１０％ジエタノールアミン緩衝液、0.5
ｍＭＭｇＣ_２、pH9.8中）150μと共にインキュベー
トする。405mmでの光学濃度を測定することにより放出
されたｐ−ニトロフェノールの量を測定する。この量は
結合した酵素ホスファターゼの量に比例し、そしてそれ
故に試験溶液中のＩＦＮαサブタイプの量に比例する。

このアッセイ法は、ＩＦＮαＢタイプ（例えばＩＦＮ−
α−２）又はＩＦＮαＦタイプのポリペプチドの量を決
定するために使用することができる。ＩＦＮαＤタイプ
（例えばＩＦＮ−α−３）ポリペプチドの測定にために
は、ミクロタイタープレートをモノクローナル抗体ＮＫ
２の代りにＹＯＫ（セルテック）を使用してコートす
る。

ミクロタイタープレートをＭＡｂ144ＢＳによりコート
し、そして第２抗体としてそれぞれホスファターゼとカ
ップリングしたＭＡｂＮＫ２及びＹＯＫを用いる場合、
同様の結果が得られる。

ｃ）ＥＬＩＳＡのための試験キット 例２５ｂ）に記載したアッセイ法に使用するキットは次
のものを含む。

◎ポリプロピレンミクロタイタープレート。

◎炭酸緩衝化塩溶液（0.9％ＮａＣ、0.42％NaHCO₃、
0.072％Na₂CO₃、0.02％NaN₃）中モノクローナル抗体Ｎ
Ｋ２（１０μｇ／ｍ） ２０ｍ ◎Tris緩衝液（0.05Ｍ、１ｍＭＭｇＣ_２、１％ＢＳ
Ａ、0.02％NaN₃、pH8.0）中アルカリ性ホスファターゼに
カップリングしたＭＡｂ144ＢＳ（例10.1、0.3mg抗体／
ｍ） １ｍ ◎１０^４ＩＵ／ｍＩＦＮ−α−１標準溶液 ２ｍ ◎１０^４ＩＵ／ｍＩＦＮ−α−２標準溶液 ２ｍ ◎１０^４ＩＵ／ｍＩＦＮ−α−３標準溶液 ２ｍ ◎ＰＢＳ 300ｍ ◎ＰＢＳ中0.2％ゼラチン及び0.2％NaN₃の緩衝液(pH7.
4) 300ｍ ◎ジエタノールアミン緩衝液（１０％、0.5ｍＭＭｇＣ
_２、0.02％NaN₃、ＨＣによりpH8.9に調製）中ｐ−
ニトロフェニルホスフェート（１mg／ｍ） ５０ｍ
◎換算曲線 ◎色濃度スケール 例２６．沈澱及びクロマトグラフ法を用いるハイブリド
インターフェロンの精製 遠心分離（例13〜15を参照のこと）により透明にされた
インターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”含有溶液１
を、該溶液がpH2.2に達するまで２ＭＨＣを用いて酸
性化する。この溶液を４℃にて１時間撹拌し、そして沈
澱した蛋白質を遠心分離（ＧＳＡローターソルバル、1
2,000ｒｐｍ、４℃にて２０分間）により分離する。ペ
レットを廃棄し、そして上清を固体硫酸アンモニウムに
より３０％飽和にする。この溶液を４℃にて１時間撹拌
し、そして次に遠心分離する。次に、インターフェロン
を含有する上清を0.1ＭNH₄HCO₃(pH8.2)に対して透析す
る。インターフェロン活性が約１０^８ＩＵ／ｍである
ことが見出される。

製造者の指示によりＣｕ^＋＋イオンを負荷したキレート
化セファロース６Ｂ（ファルマシア）５０ｍを収容す
るカラムを250ｍの0.05Ｍ酢酸ナトリウム(pH7.0)及び
0.5ＭＮａＣを用いて平衡化する。200ｍの透析され
た溶液（上記を参照のこと）を４℃にてカラムに適用す
る。カラムを150ｍの平衡化緩衝液で洗浄する。結合
したインターフェロンの溶出は、250ｍの0.05Ｍ酢酸
ナトリウム(pH7.0)及び0.5ＭＮａＣ；並びに250ｍ
の0.05Ｍ酢酸ナトリウム(pH2.8)及び0.5ＭＮａＣの直
線グラジエントを用いて行い、次に150ｍの0.05Ｍ酢
酸ナトリウム(pH2.8)及び0.5ＭＮａＣにより洗浄す
る。

活性インターフェロン画分をプールし、そして0.05ＭTr
is−ＨＣ緩衝液(pH8.0)に対して透析する。透析され
た溶液中のインターフェロン活性は約１０^８ＩＵ／ｍ
である。カラムの最大能力は約７５mgのインターフェロ
ン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”である。

５０ｍのＱ−セファロース陰イオン交換体（ファルマ
シア）を含有するカラムを250ｍの0.05ＭTris−ＨＣ
緩衝液(pH8.0)を用いて緩衝化する。100ｍの上記透
析されたインターフェロン含有溶液を室温にてカラムに
適用する。次に、カラムを５０ｍの平衡化緩衝液によ
り洗浄する。結合したインターフェロンを200ｍの0.0
5ＭTris−ＨＣ(pH8.0)中０〜0.7ＭＮａＣの直線グ
ラジエントを用いて溶出する。

純粋なインターフェロンは約0.3ＭＮａＣにおいて溶
出する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析した場
合、活性画分は見かけ分子量19,000の単一バンドを示
す。イオン交換カラムの最大能力は約５０mgのハイブリ
ドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”である。

同様にして、ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ
_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ
_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”、及び“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３
Ｂ_４”を精製することができる。

例２７．ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ
_４”の凍結乾燥 モノクローナル抗体144ＢＳを用いるイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによるか又は常用のクロマトグ
ラフ法（例２６を参照のこと）により精製されたインタ
ーフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”を0.5ＭNH₄HCO₃に対し
て透析しそして次に凍結乾燥する。NH₄HCO₃を完全に除
去するため凍結乾燥されたサンプルに少容量の水を２回
加え溶液を再凍結乾燥する。

インターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”溶液の再構成を
次のようにして行う。0.5ＭNH₄HCO₃(pH8.2)を凍結乾燥
されたサンプルに加えて約0.1mg／ｍのインターフェ
ロン濃度を得る。再溶解したインターフェロンは２×１
０^８ＩＵ／mgの比活性を有し、この活性は凍結乾燥前の
対応する値と同一である。

例２８．ハイブリドインターフェロンの物理化学的特徴
付け この発明のハイブリドインターフェロン及び親インター
フェロンを、Laemmli、Nature227、680(1970)に記載され
ている方法に従ってポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気
泳動にかける。ハイブリドインターフェロンの見かけ分
子量（キロダルトン；ＫＤ）を第７表に要約する。第７
表はさらに、アンホラインを含有するＬＫＢポリアクリ
ルアミドゲルを用いて決定されたハイブリドインターフ
ェロンの等電圧（ｐＩ）をも含む。

この発明のハイブリドインターフェロンのアミノ酸配列
をアプライドバイオシステムスの470Ａ蛋白質シーケン
サー又は890Ｃベックマンシーケンサーを用いて決定す
る。いずれの場合も自働エドマン分解を行う。見出され
た構造は予想されるそれと完全に一致する。Ｎ−末端ア
ミノ酸はシステインである。

例２９．Daudi細胞における（２′−５′）オリゴイソ
アデニレートシンセターゼ活性に対するハイブリドイン
ターフェロンの効果 Daudi細胞を２×１０^５細胞／ｍで、第８表に示され
た濃度のハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ
_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”、
及び“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”を含有する１０％ウシ胎児血
清が補充されたＲＰＭＩ1640培地中に接種する。２４時
間処理した後、サンプル当り５×１０^６個の細胞を遠心
分離し（9000回／分）そして500μの冷細胞溶解緩衝
液〔２０ｍＭ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペ
ラジンエタンスルホン酸緩衝液(pH7.5)、５ｍＭＭｇＣ
_２、120ｍＭＫＣ、７ｍＭジチオスレイトール、１
０％グリセリン、0.5％ノニデットＰ40〕に再懸濁し、
そして氷上で２分間インキュベートする。次に、サンプ
ルを遠心分離し、（9000回／分、８分間、４℃）そして
上清を回収し、そして次のようにして（２′−５′）オ
リゴイソアデニレートシンセターゼ活性について測定す
る。

上清を５０μのポリ（ｒＩ）・（ｒＣ）アガロース
（Ｐ−Ｌビオケミカルス）と３０℃にて１５分間混合
し、そして非吸着物を遠心分離により除去する。ポリ
（ｒＩ）・（ｒＣ）に吸着された物質を2.5ｍＭ（α
^３２Ｐ）ＡＴＰ（400Ｃｉ／ｍ）（アメルシャム・イ
ンターナショナル）と共に３０℃にて２０時間インキュ
ベートし、細菌アルカリ性ホスファターゼ（シグマ）に
より処理し、そして次にMerlin等、Analyt.Biochem.11
0、190(1981)に記載されているようにして3.0ｍの１Ｍ
グリシン−ＨＣ緩衝液(pH2.0)により酸アルミナのカ
ラムから溶出する。第８表の結果は、インターフェロン
処理細胞中の（２′−５′）オリゴイソアデニレートシ
ンセターゼ活性の、非処理対照細胞中の酵素活性のレベ
ル（平均活性51.6±8.7pmol／時／１０^５細胞）に対す
る増加倍数として示される。

取り込まれたＡＴＰの量pmol／時／１０^５細胞として測
定。

例３０．医薬製剤（非経腸投与用） ヒトWISH細胞に対して1.3×１０^８ユニット／mgの比活
性を有する２mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ
_２Ｄ_３Ｄ_４”を３０ｍの５Ｎヒト血清アルブミンに溶
解する。得られた溶液を細菌学的フィルターに通し、そ
して濾過された溶液を無菌条件下で100本のバイアルに
分配する。これらはそれぞれ2.6×１０^６ユニットの純
粋なハイブリドインターフェロンを含有する。非経腸投
与用バイアルは好ましくは冷所、例えば−２０℃にて貯
蔵する。

同様にして、5.2×１０^６ユニット又は1.04×１０^７ユ
ニットを含有するバイアルを、それぞれ４mg又は８mgの
ハイブリドインターフェロンを用いて調製する。

同様にして、ハイブリドインターフェロン“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ
_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ
_３Ｄ_４”、“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”、又は“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３
Ｄ_４”（それぞれ比活性1.28×１０^８、２×１０^８、7.
7×１０^７、3.8×１０^７及び８×１０^７を有する）を含
有するバイアルを調製することができる。

例３１．毒性試験 ハイブリドインターフェロンＢ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４を、一回
投与としてマウス、ラット及びウサギに下記の表の通り
に投与した。0.1mg/ml蒸留水の濃度で被験物質を溶解
し、10ml/kg体重の速度で注射し、250×10⁶IU/kg（すな
わち１mg/kg）体重の投与量とした。さらにこれらの実
験に加えて、マウス及びモルモットについて急性安全性
試験を行った。

評価：ハイブリドインターフェロンＢ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４は
これらすべての研究において耐えられた。２種類の安全
性試験が満足できるものと考えられた。

なお、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ322／ＨＬｙｃＩＦＮ−
８′１及びＣＧ−ｐＢＲ322／ＨＬｙｃＩＦＮ−５_１を
含有するＥ．コリＨＢ101がそれぞれＮＲＲＬ Ｂ−125
32及びＮＲＲＬ Ｂ−12531として寄託されており、本
発明の出発プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−３及びＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α
−２の造成のために使用された。これらの造成方法は特
願昭57-174426号明細書に詳細に記載されている。ま
た、本発明のその他の出発プラスミド、例えばプラスミ
ドｐ31ＲＴ（Δ７２）等の造成方法は前記特許出願明細
書又は特願昭58-144542号明細書に詳細に記載されてい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、成熟ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−α
−３のアミノ酸配列を比較したものである。ＬｙＩＦＮ
−α−３のアミノ酸はＬｙＩＦＮ−α−２と異るものの
み示されている。 ＬｙＩＦＮ−α−３の他のアミノ酸配列はＬｙＩＦＮ−
α−２のそれと同一である。 第２図は、ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−α−３
のコード領域及び３′シストロン外領域のヌクレオチド
配列を示す。ＡＴＧ翻訳開始コドン、停止トリプレッ
ト、及び便利な制限部位にアンダーラインが付されてい
る。コードトリプレットに番号が付されている。 第３図は、プラスミドｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α
−２、及びｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３のＨｉ
ｎｄIII−ＰｓｔＩ小セグメントの制限地図を示す。中
白の太棒（ＬｙＩＦＮ−α−３）及び黒色の太棒（Ｌｙ
ＩＦＮ−α−２）は成熟ＩＦＮのコード領域の範囲を定
める。下部に、ＩＦＮポリペプチド（166アミノ酸）の
４部分への分割が示されている。 第４図及び第５図は、サンドイッチＲＩＡにおいて測定
された試験溶液中のＩＦＮ−α−２の量の関数として、
担体ビーズに結合した放射能を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (31)優先権主張番号 ８５１４７２６ (32)優先日 1985年６月11日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１２５３１ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１２５３２ (72)発明者 マルクス ゲルハルト グリュッター スイス国，4146 ホッホバルト，ネッテン ベルクベーク（番地なし) (72)発明者 セフィク アルカン スイス国，4125 リーエン，ビンゼンアッ カーシュトラーセ ３

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−
   α−２のアミノ酸１〜150とLyIFN−α−３のアミノ酸15
   1〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチド、
   Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−α−２のアミ
   ノ酸１〜92とLyIFN−α−３のアミノ酸93〜150とLyIFN
   −α−２のアミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を
   有するポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端方向に
   順にLyIFN−α−２のアミノ酸１〜60とLyIFN−α−３の
   アミノ酸61〜92とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３のア
   ミノ酸93〜150とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３のア
   ミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドから成る群から選択されるハイブリドインターフ
   ェロンポリペプチド。
2. 【請求項２】次の配列： を有し“Ｂ_１Ｂ_２Ｂ_３Ｄ_４”で表わされる特許請求の範
   囲第１項に記載のハイブリドインターフェロンポリペプ
   チド。
3. 【請求項３】次の配列： を有し“Ｂ_１Ｂ_２Ｄ_３Ｂ_４”で表わされる特許請求の範
   囲第１項に記載のハイブリドインターフェロンポリペプ
   チド。
4. 【請求項４】次の配列： を有し“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｄ_４”で表わされる特許請求の範
   囲第１項に記載のハイブリドインターフェロンポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】次の配列： を有し“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｂ_４”で表わされる特許請求の範
   囲第１項に記載のハイブリドインターフェロンポリペプ
   チド。
6. 【請求項６】次の配列： を有し“Ｂ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４”で表わされる特許請求の範
   囲第１項に記載のハイブリドインターフェロンポリペプ
   チド。
7. 【請求項７】次の配列： を有し“Ｂ_１Ｄ_２Ｂ_３Ｂ_４”で表わされる特許請求の範
   囲第１項に記載のハイブリドインターフェロンポリペプ
   チド。
8. 【請求項８】Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−
   α−２のアミノ酸１〜150とLyIFN−α−３のアミノ酸15
   1〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチド、
   Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−α−２のアミ
   ノ酸１〜92とLyIFN−α−３のアミノ酸93〜150とLyIFN
   −α−２のアミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を
   有するポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端方向に
   順にLyIFN−α−２のアミノ酸１〜60とLyIFN−α−３の
   アミノ酸61〜92とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３のア
   ミノ酸93〜150とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３のア
   ミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドから成る群から選択されるハイブリドインターフ
   ェロンポリペプチドの医薬として有効な量を含んで成る
   抗ウイルス剤。
9. 【請求項９】Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−
   α−２のアミノ酸１〜150とLyIFN−α−３のアミノ酸15
   1〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチド、
   Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−α−２のアミ
   ノ酸１〜92とLyIFN−α−３のアミノ酸93〜150とLyIFN
   −α−２のアミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を
   有するポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端方向に
   順にLyIFN−α−２のアミノ酸１〜60とLyIFN−α−３の
   アミノ酸61〜92とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３のア
   ミノ酸93〜150とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３のア
   ミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドから成る群から選択されるハイブリドインターフ
   ェロンポリペプチドの医薬として有効な量を含んで成る
   （２′−５′）オリゴアデニレートシンセターゼ増強又
   は抗癌剤。
10. 【請求項１０】Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN
    −α−２のアミノ酸１〜150とLyIFN−α−３のアミノ酸
    151〜166とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ド、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順にLyIFN−α−２の
    アミノ酸１〜92とLyIFN−α−３のアミノ酸93〜150とLy
    IFN−α−２のアミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配
    列を有するポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端方
    向に順にLyIFN−α−２のアミノ酸１〜60とLyIFN−α−
    ３のアミノ酸61〜92とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３
    のアミノ酸93〜150とLyIFN−α−２又はLyIFN−α−３
    のアミノ酸151〜166とから成るアミノ酸配列を有するポ
    リペプチドから成る群から選択されるハイブリドインタ
    ーフェロンポリペプチドの製造方法であって、該ハイブ
    リドインターフェロンをコードするDNA配列を含有する
    ハイブリドベクターにより形質転換された酵母又は細菌
    を培養し、そして該ハイブリドインターフェロンを単離
    することを特徴とする方法。