HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf
Säugercytokine und insbesondere auf die Klonierung und Expression
eines biologisch aktiven rekombinanten Rinder-GM-CSF,
welcher die hämatopoetische Zellentwicklung induzieren kann.
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Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor
(GM-CSF) bezieht sich auf ein Protein, das die Entwicklung
von Granulocyten- und Makrophagen-Vorläuferzellen aus
Knochenmark-Vorgängern induzieren kann. GM-CSF scheint auch die
Aktivität von reifen differenzierten Granulocyten und
Makrophagen zu regulieren. Mäuse-GM-CSF wurde ursprünglich als 23
Kilodalton-Protein identifiziert, das in Präparaten
vorkommt, die aus mit Endotoxin konditionierter Mäuselunge
erhalten wurden, welches die Entwicklung von Granulocyten- und
Makrophagen-Vorläuferkolonien in Weich-Agar-Kulturen
stimulierte. Siehe Burgess et al., J. Biol. Chem. 252:1998
(1977). Eine Human-GM-CSF-Aktivität wurde aus
konditioniertem Plazentamedium von Nicola et al., Blood 54:614 (1979)
teilweise gereinigt. Human-GM-CSF ist auch in Kulturen der
humanen T-Lymphoblasten-Zellinie Mo identifiziert worden,
und von Gasson et al., Science 226:1339 (1984) wurde
gezeigt, daß er die Aktivität von reifen neutrophilen
Granulocyten moduliert. Die Klonierung und Expression von
rekombinantem Human-GM-CSF aus verschiedenen Quellen wurde
von Cantrell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6250
(1985); Wong et al., Science 228:810 (1985); und Lee et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360 (1985) beschrieben.
Cantrell et al. isolierten Human-GM-CSF-Sequenzen aus
cDNA-Banken, die aus der Zellinie HUT-102 hergestellt
wurden. Es wurde gezeigt, daß die isolierten Human-Sequenzen
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die Synthese eines biologisch aktiven GM-CSF unter
Verwendung eines Hefe-Expressionssystems steuern.
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Im Hinblick auf sein Potential als therapeutisches Mittel
zur Behandlung verschiedener Cytopenien und seine
offensichtliche Wirkung auf reife Granulocyten und Makrophagen
besteht in der Tiermedizin ein Interesse an Rinder-GM-CSF
(bGM-CSF). Therapeutische Zusammensetzungen, welche
biologisch aktiven rekombinanten bGM-CSF oder aktive Homologa
umfassen, könnten eingesetzt werden, um die
Immunreaktionsfähigkeit auf infektiöse Pathogene zu erhöhen oder die
Wiederherstellung normaler Blutzellpopulationen im Anschluß an
Virusinfektionen oder andere Zustände, die zur
hämatopoetischen Zellsuppression führen, zu unterstützen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Rinder-GM-CSF-
Proteine und DNA-Segmente bereit, die im wesentlichen aus
einer Nukleotidsequenz mit einem einzigen offenen
Leseraster, die für Rinder-GM-CSF codiert, bestehen. Vorzugsweise
werden solche Segmente in Form eines Gens bereitgestellt,
welches in einer rekombinanten Transkriptionseinheit
exprimiert werden kann, welche regulatorische Elemente umfaßt,
die von einem mikrobiellen oder Virus-Operon abgeleitet
sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante
Expressionsvektoren, welche die DNA-Segmente umfassen,
mikrobielle Expressionssysteme, welche die rekombinanten
Expressionsvektoren umfassen, und Verfahren zum Herstellen
der Proteine unter Verwendung der mikrobiellen
Expressionssysteme bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1 veranschaulicht die Nukleotidsequenz eines
cDNA-Klons, der für bGM-CSF codiert, welcher unter
Verwendung einer von Human-GM-CSF-cDNA abgeleiteten
Sonde isoliert wurde. Initiations- und
Terminationscodons des offenen Leserasters von bGM-CSF sind
unterstrichen.
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Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete
Aminosäuresequenz der codierenden Region des
cDNA-Klons von Fig. 1. Für das vollständige
Translationsprodukt, einschließlich eines mutmaßlichen
hydrophoben Signalpeptids, codiert die Sequenz, die
bei Nukleotid 1 beginnt und bei Nukleotid 429 endet.
Die Sequenz, die für das reife Protein codiert,
beginnt bei Nukleotid 52 (durch einen Pfeil
angezeigt), dem ersten Nukleotid des Codons, welches
Alanin 18 in Fig. 2 entspricht.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Ein DNA-Segment, das für bGM-CSF codiert, wurde aus einer
cDNA-Bank isoliert, die durch reverse Transkription von
polyadenylierter RNA hergestellt wurde, die aus einer
Interleukin-2-abhängigen Rinder-T-Lymphocyten-Zellinie, BT2,
isoliert wurde, die erstmals von Picha und Baker, Immunol.
57:131 (1985) beschrieben wurde. Ein cDNA-Fragment, welches
der codierenden Sequenz von Human-GM-CSF entspricht und
zusätzliche 5'- und 3'- flankierende Sequenzen einschließt,
wurde eingesetzt, um die Bank mit
DNA-Hybridisierungsmethoden zu durchsuchen. Klone, die an die Sonde hybridisierten,
wurden durch Spaltung mit Restriktionsendonuklease, Agarose-
Gelelektrophorese und zusätzliche Hybridisierungsexperimente
("Southern blots") mit den elektrophoretisch getrennten
Fragmenten analysiert. Nachdem mehrere Klone isoliert worden
waren, welche an die Human-cDNA-Sonde hybridisierten, wurde
das hybridisierende Segment eines bGM-CSF-Klons subkloniert
und durch herkömmliche Methoden sequenziert. Eine
cDNA-Sequenz, welche die codierenden Regionen des bGM-CSF-Gens
umfaßte, wurde in einen stark exprimierenden Säugervektor
unter der regulatorischen Kontrolle eines SV40-Viruspromotors
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eingefügt, und das daraus hervorgehende Konstrukt wurde
verwendet, um Affen-COS-2-Zellen zu transfizieren. Das
Plasmidkonstrukt steuerte die Synthese eines 22 Kilodalton-Proteins
mit GM-CSF-Aktivität in Kulturen von nicht-adhärenten
Rinderknochenmarkzellen. Es wurde auch ein Hefevektor
konstruiert, welcher ein sezerniertes Fusionsprotein exprimieren
konnte, welches die biologische Aktivität von bGM-CSF
aufwies.
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Alternativ dazu können Expressionsvektoren zusammengebaut
werden, welche synthetische oder von cDNA-abgeleitete
DNA-Fragmente umfassen, die für bGM-CSF oder bioäquivalente
Homologa codieren, die funktionell mit induzierbaren
Elementen verbunden sind, die von den Genen von Bakterien, Hefe,
Bakteriophagen oder Viren abgeleitet sind. Im Anschluß an
die Transformation oder Transfektion geeigneter Zellinien
können solche Vektoren induziert werden, so daß sie
rekombinantes Protein exprimieren.
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In Nukleinsäure-Ausführungsformen stellt die vorliegende
Erfindung DNA-Segmente bereit, die im wesentlichen aus einer
Nukleotidsequenz mit einem einzigen offenen Leseraster
bestehen, die für Rinder-GM-CSF codiert. Wie bereits
angemerkt, bestehen solche DNA-Segmente vorzugsweise im
wesentlichen aus einem Gen, das für bGM-CSF codiert, welches in
einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert werden
kann, welche induzierbare regulatorische Elemente umfaßt,
die von einem mikrobiellen oder Virus-Operon abgeleitet
sind. In bevorzugten Aspekten umfassen die DNA-Segmente
mindestens eine, aber wahlweise mehr als eine,
Sequenzkomponente, die von einer cDNA-Sequenz oder Kopie davon
abgeleitet ist. Solche Sequenzen können verknüpft oder flankiert
sein mit DNA-Sequenzen, die durch den Zusammenbau
synthetischer Oligonukleotide hergestellt sind. Zu Beispielen für
solche Sequenzen gehören solche, die im wesentlichen zu der
in Fig. 2 wiedergegebenen Nukleotidsequenz homolog sind,
aber für ein Polypeptid codieren, welches als Aminoende den
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Alaninrest hat, der an Position 18 angegeben ist.
Gegebenenfalls können die codierenden Sequenzen Codons einschließen,
die für eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren codieren,
welche am N-Ende liegen, z.B. ein N-terminales ATG-Codon,
das Methionin spezifiziert, welches im Leseraster mit der
Nukleotidsequenz verknüpft ist. Aufgrund der Degeneriertheit
des Codes kann es eine erhebliche Schwankungsbreite der
Nukleotidsequenzen geben, die für die gleiche
Aminosäuresequenz codieren; eine beispielhafte DNA-Ausführungsform ist
diejenige, die der Sequenz der Nukleotide 52-429 von Fig. 2
entspricht. Die vorliegende Erfindung stellt auch
rekombinante Klonierungs- oder Expressionsvektoren bereit, die
eines der vorstehenden DNA-Seqmente umfassen. Zu den Vektoren
können regulatorische Elemente gehören, wie sie im folgenden
ausführlicher beschrieben werden.
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Was die Verfahrensaspekte angeht, stellt die vorliegende
Erfindung Verfahren zum Herstellen von gereinigtem rbgm-CSF
oder bioäquivalenten Homologa davon bereit, umfassend das
Kultivieren geeigneter Wirt/Vektor-Systeme, um die
rekombinanten Translationsprodukte der synthetischen Gene der
vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
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In Protein-Ausführungsformen stellt die vorliegende
Erfindung im wesentlichen homogene rekombinante
bGM-CSF-Polypeptide bereit, die frei von kontaminierenden endogenen
Materialien und gegebenenfalls ohne damit verbundene
Glycosylierung gemäß dem nativen Muster sind. Zu solchen Proteinen
gehört als eine Ausführungsform bGM-CSF mit N-terminalem
Methionyl. Eine zusätzliche Ausführungsform ist ein Rinder-
GM-CSF-Protein, das als Fusionsprotein mit einem
Polypeptidleader, umfassend die Sequenz Asp-Tyr-Lys-(Asp&sub4;)-Lys,
exprimiert wird.
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Was Aspekte der Zusammensetzung und des Anwendungsverfahrens
angeht, stellt die vorliegende Erfindung tierärztliche
therapeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge von
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einem der bGM-CSF-Proteine der Erfindung und ein geeignetes
Verdünnungsmittel oder einen geeigneten Träger umfassen, und
Verfahren zum Stimulieren der hämatopoetischen
Zellentwicklung oder zum Modulieren oder Erhöhen der Immunantwort in
einem zu den Rindern gehörenden Säuger, die das Verabreichen
einer wirksamen Menge von einer der vorstehenden
Zusammensetzungen umfassen, bereit. Die Verwendung in Verbindung
oder Mischung mit anderen Rinder-Lymphokinen, z.B. bIL-1α
oder bIL-1β, wird ebenfalls in Betracht gezogen.
DEFINITIONEN
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"Rinder-Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierender
Faktor" und "bGM-CSF" beziehen sich auf ein endogenes
sekretorisches Protein des Rinds, welches die hämatopoetische
Zellentwicklung induzieren und reife Granulocyten und
Makrophagen aktivieren kann. So wie es in der gesamten
Beschreibung verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "reifer bGM-CSF"
ein Protein mit der biologischen Aktivität von bGM-CSF und
eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen mit der in Fig.
2 veranschaulichten Polypeptidsequenz homolog ist, die mit
der Aminosäure 18 (Alanin) beginnt und mit der Aminosäure
143 (Lysin) endet. Das vorhergesagte Molekulargewicht des
Proteins, welches der in Fig. 1 wiedergegebenen Sequenz
entspricht, beträgt 16.200 Dalton, wobei eine Glycosylierung
nicht mitgerechnet ist.
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"Im wesentlichen homolog", was sich sowohl auf
Nukleinsäureals auch Aminosäuresequenzen beziehen kann, bedeutet, daß
eine bestimmte betrachtete Sequenz, z.B. eine mutierte
Sequenz, sich von einer Referenzsequenz durch eine oder
mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen
unterscheidet, was im Ergebnis nicht zu einer nachteiligen
funktionellen Verschiedenheit zwischen der Referenzsequenz und der
betrachteten Sequenz führt. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung werden Sequenzen mit mehr als 90% Homologie,
äquivalenter
biologischer Aktivität und äquivalenten
Expressionseigenschaften als im wesentlichen homolog betrachtet. Für
die Zwecke der Bestimmung der Homologie sollte die
Verkürzung der reifen Sequenz außer Acht gelassen werden.
Sequenzen mit geringeren Homologiegraden, vergleichbarer
Bioaktivität und äquivalenten Expressionseigenschaften werden als
Äquivalente betrachtet.
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"Rekombinant", so wie es hier verwendet wird, bedeutet, daß
ein Protein von rekombinanten (z.B. mikrobiellen oder
Säuger-) Expressionssystemen abgeleitet ist. "rbGM-CSF"
bedeutet rekombinanter bGM-CSF. "Mikrobiell" bezieht sich auf
rekombinante Proteine, die in bakteriellen oder pilzlichen
(z.B. Hefe-) Expressionssystemen hergestellt sind. Als
Produkt definiert "rekombinant mikrobiell" ein Rinder-Protein,
das im wesentlichen frei von nativen endogenen Substanzen
ist und nicht mit einer damit verbundenen nativen
Glycosylierung einhergeht. In den meisten bakteriellen Kulturen,
z.B. E. coli, exprimiertes Protein ist frei von Glycan;
Protein, das in Hefe exprimiert ist, hat ein
Glycosylierungsmuster, das sich von demjenigen unterscheidet, welches in
Säugerzellen exprimiert wird.
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"DNA-Segment" bezieht sich auf ein DNA-Polymer in Form eines
getrennten Fragments oder als Bestandteil eines größeren
DNA-Konstrukts, welches von DNA abgeleitet worden ist, die
mindestens einmal in im wesentlichen reiner Form isoliert
worden ist, d.h. frei von kontaminierenden endogenen
Materialien und in einer Menge oder Konzentration, welche die
Identifizierung, Manipulation und Rückgewinnung des Segments
und seiner Nukleotidsequenzbestandteile durch biochemische
Standardmethoden, z.B. unter Verwendung eines
Klonierungsvektors ermöglicht. Solche Segmente werden in Form eines
offenen Leserasters bereitgestellt, das nicht durch interne
nicht-translatierte Sequenzen oder Introns unterbrochen ist,
welche typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden
sind. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können
stromabwärts
von dem offenen Leseraster vorhanden sein, wo sie
die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen
nicht stören. "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf ein
Heteropolymer von Desoxyribonukleotiden. Im allgemeinen
werden DNA-Segmente, die für die Proteine codieren, die durch
diese Erfindung bereitgestellt werden, aus cDNA-Fragmenten
und kurzen Oligonukleotidlinkern, oder aus einer Reihe von
Oligonukleotiden zusammengesetzt, um ein synthetisches Gen
zu ergeben, welches in einer rekombinanten
Transkriptionseinheit exprimiert werden kann, welche regulatorische
Elemente umfaßt, die von einem mikrobiellen oder Virus-Operon
abgeleitet sind.
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"Rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein
Plasmid, welches eine Transkriptionseinheit umfaßt, die eine
Anordnung von (1) einem genetischen Element oder genetischen
Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der
Genexpression, z.B. Promotoren oder Enhancern, (2) einer
Strukturseguenz oder codierenden Sequenz, welche in mRNA transkribiert
und in Protein translatiert wird, und (3) geeigneten
Initiations- und Terminationssequenzen der Transkription umfaßt.
Struktureinheiten, die zur Verwendung in
Hefe-Expressionssystemen vorgesehen sind, schließen vorzugsweise eine
Leadersequenz ein, welche die extrazelluläre Sekretion von
translatiertem Protein durch eine Wirtszelle ermöglicht.
Alternativ dazu kann, wenn ein rekombinantes Protein ohne
eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, sie
einen N-terminalen Methioninrest einschließen. Dieser Rest
kann anschließend von dem exprimierten rekombinanten Protein
abgespalten werden oder auch nicht, um ein Endprodukt zu
ergeben.
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"Rekombinantes Expressionssystem" bedeutet eine im
wesentlichen homogene Monokultur von geeigneten
Wirtsmikroorganismen, z.B. Bakterien wie E. coli oder Hefen wie S.
cerevisiae, in deren chromosomale DNA eine rekombinante
Transkriptionseinheit stabil integriert ist, oder die die
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rekombinante Transkriptionseinheit als Bestandteil eines
darin vorkommenden Plasmids tragen. Im allgemeinen sind die
Zellen, aus denen das System besteht, die Nachkommen einer
einzigen Ausgangstransformante. Rekombinante
Expressionssysteme, wie sie hierin definiert sind, exprimieren
heterologes Protein, wenn die regulatorischen Elemente induziert
werden, die mit dem DNA-Segment oder dem synthetischen Gen,
das exprimiert werden soll, verknüpft sind.
Test zur Bestimmung der biologischen Aktivität von bGM-CSF
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Knochenmarkzellen von Menschen oder Rindern können in Tests
zum Nachweisen der biologischen Aktivität von bGM-CSF
verwendet werden; Rindermark wird jedoch wegen der größeren
Empfindlichkeit bevorzugt. Der Test wird so durchgeführt,
wie es im folgenden beschrieben ist.
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1-2 g zerkleinertes Knochenmark(BM)-Gewebe wird in 3-7 ml
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,02 M
Natriumphosphat, 1,2 M NaCl, pH 7,2) zentrifugiert und bis zum
dreifachen des ursprünglichen Volumens in frischer PBS
resuspendiert, und 8 ml der daraus hervorgehenden Suspension
werden auf 5 ml 54% Percoll/PBS in 15 ml-Zentrifugenröhrchen
geschichtet. Die Röhrchen werden mit 1500 Upm 20 min lang
zentrifugiert. Die Zellen an der Grenzfläche werden entfernt
und einmal in PBS durch Zentrifugation gewaschen. Die
pelletierten Zellen werden in α-Minimal Essential Medium (α-MEM,
Gibco) ohne Serum bis zu einer Konzentration von 2 x 10&sup6;
Zellen/ml resuspendiert und 30 ml 2 h lang bei 37ºC in 5%
CO&sub2; in T75-Kulturgefäßen (Falcon Plastics, Oxnard CA, USA)
inkubiert. Nicht-adhärente Zellen werden durch vorsichtiges
Absaugen entfernt, in warmem Medium gewaschen und in α-MEM,
welches 15% fötales Rinderserum enthält, auf eine Zelldichte
von 1,25 x 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
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Von der Probe werden Dreifach-Verdünnungsreihen in
gewebekulturbehandelten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
hergestellt, so daß das Endvolumen jeder Vertiefung 50 ul
beträgt. Danach werden auch 50 ul der BM-Zellsuspension in
jede Vertiefung gegeben. Die Platten werden 96 h lang
inkubiert, wonach jede Vertiefung weitere 5 h lang mit 25 ul
Medium, welches 80 uCi/ml [³H]-Thymidin (80 Ci/mM, New England
Nuclear NET-0277) enthält, versetzt wird. Die Inhalte jeder
Vertiefung werden auf Glasfaserstreifen übertragen, wobei
ein automatisches Mehrfachprobennahmegerät verwendet wird,
und der Radionuklideinbau wird durch
Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Aktivitätseinheiten werden ausgedrückt
als der Kehrwert der Verdünnung, welche 50% des maximalen
Werts ergibt, der für die eingebaute radioaktive Markierung
in einem bestimmten Test gemessen wurde.
Protein- und Endotoxin-Tests
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Die Proteinkonzentrationen können durch jedes geeignete
Verfahren bestimmt werden. Jedoch wird der
Bio-Rad-Gesamtproteintest (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA)
bevorzugt. Die Endotoxingehalte in Proteinzusammensetzungen
können mit einem handelsüblichen Kit, der von Whittaker
Bioproducts, Walkersville, Maryland, U.S.A. erhältlich ist
(Quantitative Chromogenic LAL QCL-1000) oder einem
gleichwertigen Kit bequem getestet werden. Dieses Verfahren
verwendet ein modifiziertes Limulus-Amöbocyten-Lysat und ein
synthetisches farberzeugendes Substrat, um das Endotoxin
durch eine Farbreaktion nachzuweisen. Gereinigtes
rekombinantes Protein wird auf die Anwesenheit von Endotoxin in
mehreren Verdünnungsstufen untersucht. Der Test wird
vorzugsweise kurz nach der Beendigung der Reinigung und vor der
Lagerung bei -70ºC durchgeführt. Um die Möglichkeit einer
bakteriellen Kontamination während des Reinigungsverfahrens
selbst zu minimieren, sollten sterile Puffer eingesetzt
werden.
Die native bGM-CSF-Sequenz
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Die Nukleotidsequenz eines cDNA-Klons, der aus einer Rinder-
BT2-Zellbank isoliert wurde, ist in Fig. 1 angegeben. Das
offene Leseraster und die entsprechende Aminosäuresequenz
von bGM-CSF sind in Fig. 2 veranschaulicht. In Fig. 2 sind
Nukleotide und Aminosäuren durchnumeriert, beginnend mit dem
Initiator-Methionin des bGM-CSF-Vorläufers, welcher ein
mutmaßliches 17 Aminosäuren langes hydrophobes Signalpeptid
einschließt. Wie es hierin definiert ist, beginnt die reife
Sequenz mit einem GCA-Codon, welches den Alaninrest
spezifiziert, der mit einem Pfeil an Rest 18 angezeigt ist. Die
vorhergesagte Aminosäuresequenz von bGM-CSF schließt eine
Asn-His-Ser-Sequenz bei den Aminosäureresten 44-46 und eine
Asn-Asp-Thr-Sequenz bei den Resten 54-56 ein, welche
potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen bereitstellen.
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Ein rekombinantes DNA-Segment, das für die Aminosäuresequenz
von bGM-CSF codiert, kann durch Durchsuchen geeigneter cDNA-
Banken unter Verwendung geeigneter Sonden oder durch
Zusammenbau von künstlich hergestellten Oligonukleotiden erhalten
werden.
Konstruktion von Expressionsvektoren
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Reifer bGM-CSF kann in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder
anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren
exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme könnten
ebenfalls eingesetzt werden, um bGM-CSF herzustellen, wobei
RNAS verwendet werden, die von den DNA-Konstrukten der
vorliegenden Erfindung abgeleitet sind. Geeignete
Klonierungsund Expressionsvektoren zur Verwendung in bakteriellen,
pilzlichen und Hefe-Wirten sind beschrieben von Pouvels, et
al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New
York, 1985), deren relevante Offenbarung hiermit durch
Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung wird.
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Hefe-Systeme, die vorzugsweise Saccharomyces-Arten wie
S. cerevisiae verwenden, können zur Expression der
rekombinanten Proteine dieser Erfindung eingesetzt werden. Hefen
von anderen Gattungen, z.B. Pichia oder Kluyveromyces sind
ebenfalls als Produktionsstämme für rekombinante Proteine
eingesetzt worden.
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Im allgemeinen gehören zu brauchbaren Hefe-Vektoren
Ursprungspunkte der Replikation und selektierbare Marker,
welche die Transformation sowohl von Hefe als auch von E. coli
erlauben, z.B. das Ampicillinresistenz-Gen von E. coli und
das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und ein Promotor, der von
einem stark exprimierten Hefe-Gen abgeleitet ist, um die
Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz
zu induzieren. Solche Promotoren können von Hefe-Operons
abgeleitet werden, die u.a. für glycolytische Enzyme wie
3-Phosphoglyceratkinase (PGK), den α-Faktor, saure
Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die
heterologe Struktursequenz wird in passender Phase mit
Translationsinitiations- und Terminationssequenzen und vorzugsweise
einer Leadersequenz, welche die Sekretion des translatierten
Proteins in das extrazelluläre Medium steuern kann,
zusammengebaut. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz für
ein Fusionsprotein codieren, welches ein N-terminales
Identifikationspeptid (z .B. Asp-Tyr-Lys- (Asp)&sub4;-Lys) oder
eine andere Sequenz, die gewünschte Eigenschaften wie z.B.
die Stabilisierung oder die vereinfachte Reinigung des
exprimierten rekombinanten Produkts verleiht, einschließt.
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Brauchbare Hefe-Vektoren können unter Verwendung von
DNA-Sequenzen von pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli
(Apr-Gen und Ursprung der Replikation) und von
Hefe-DNA-Sequenzen, die einen durch Glucose reprimierbaren Alkohol-
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dehydrogenase-2- (ADH2) -Promotor einschließen,
zusammengesetzt werden. Der ADH2-Promotor ist von Russel et al., J.
Biol. Chem. 258:2674 (1982) und Beier et al., Nature 300:724
(1982) beschrieben worden. Solche Vektoren können auch ein
TRP1-Gen von Hefe als selektierbaren Marker und den 2
u-Ursprungspunkt der Replikation von Hefe enthalten. Eine
Leader-Sequenz von Hefe, z.B. der α-Faktor-Leader, welcher
die Sekretion von heterologen Proteinen aus einem Hefe-Wirt
steuert, kann zwischen den Promotor und die
Translationsinitiationssequenz und in Phase mit dem Struktur-Gen, das
exprimiert werden soll, eingefügt werden. Siehe Kurjan et
al., Cell 30:933 (1982) und Bitter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:5330 (1984). Die Leader-Sequenz kann so
modifiziert werden, daß sie in der Nähe ihres 3'-Endes eine oder
mehrere brauchbare Restriktionsstellen enthält, um die
Fusion der Leader-Sequenz mit fremden Genen zu erleichtern.
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Geeignete Arbeitsvorschriften zur Transformation von Hefe
sind Fachleuten bekannt; eine beispielhafte Methode ist von
Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978)
beschrieben, wobei auf Trp+-Transformanten in einem
Selektionsmedium, das aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase,
0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 ug/ml Adenin und
20ug/ml Uracil besteht, selektiert wird.
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Wirtsstämme, die durch Vektoren transformiert sind, welche
den ADH2-Promotor umfassen, werden zur Expression in einem
reichen Medium kultiviert, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton
und 1% Glucose besteht, das mit 80 ug/ml Adenin und 80 ug/ml
Uracil ergänzt ist. Die Derepression des ADH2-Promotors
erfolgt bei Erschöpfung der Glucose im Medium, Rohe
Hefeüberstände werden durch Filtration gewonnen und vor der weiteren
Reinigung auf 4ºC gehalten oder eingefroren.
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Brauchbare Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien
werden durch Einfügen einer DNA-Struktursequenz, die für
bGM-CSF codiert, zusammen mit geeigneten
Translationsinitiations- und Terminationssignalen in einer funktionsfähigen
Lesephase mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der
Vektor umfaßt einen oder mehrere phänotypisch selektierbare
Marker und einen Ursprungspunkt der Replikation, um die
Amplifikation in dem Wirt zu gewährleisten. Zu geeigneten
prokaryotischen Wirten zur Transformation gehören E. coli,
Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene
Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und
Staphylococcus, obwohl auch andere nach Wahl eingesetzt
werden können.
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Als repräsentatives, aber nicht beschränkendes Beispiel
können brauchbare Expressionsvektoren zur Verwendung in
Bakterien einen selektierbaren Marker und bakteriellen
Ursprungspunkt der Replikation umfassen, die von im Handel
erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, welche genetische Elemente
des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017)
umfassen. Zu solchen handelsüblichen Vektoren gehören z.B.
pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und
pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) 8 Diese "Rückgrat"-
Abschnitte von pBR322 werden mit einem geeigneten Promotor
und der Struktursequenz, die exprimiert werden soll,
kombiniert.
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Ein besonders brauchbares bakterielles Expressionssystem
verwendet den PL-Promotor des Phagen λ und den thermolabilen
Repressor cI857ts. Zu Plasmidvektoren, die von der American
Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des
λPL-Promotors enthalten, gehören das Plasmid pHUB2, das in
E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092) vorkommt und pPLc28, das in
E. coli RR1 (ATCC 53082) vorkommt. Zu weiteren brauchbaren
Promotoren zur Expression in E. coli gehören der T7-RNA-
Polymerase-Promotor, der von Studier et al., J. Mol. Biol.
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189:113 (1986) beschrieben ist, der lacZ-Promotor, der von
Lauer, J. Mol. Appl. Genet. 1:139-147 (1981) beschrieben ist
und als ATCC 37121 erhältlich ist, und der tac-Promotor, der
von Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 412) beschrieben ist und
als ATCC 37138 erhältlich ist.
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Im Anschluß an die Transformation eines geeigneten
Wirtsstammes und das Wachstum des Wirtsstammes bis zu einer
geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch
geeignete Mittel (z.B. Temperaturänderung oder chemische
Induktion) dereprimiert und die Zellen werden während eines
weiteren Zeitraums kultiviert. Die Zellen werden
typischerweise durch Zentrifugation gewonnen, durch physikalische
oder chemische Mittel aufgebrochen und der sich daraus
ergebende Rohextrakt zur weiteren Reinigung zurückbehalten. Die
Zellen werden z.B. in einem 10 l-Fermenter kultiviert, wobei
eine maximale Belüftung und kräftiges Rühren zum Einsatz
kommen. Vorzugsweise wird ein Antischaummittel (Antifoam A)
eingesetzt. Die Kulturen werden bei 30ºC in dem
Superinduktionsmedium, welches von Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82:88 (1985) offenbart wurde, das gegebenenfalls
Antibiotika enthält, wachsen gelassen, bei einer Zelldichte,
welche A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,4-0,5 entspricht, durch Erhöhen der
Temperatur auf 42ºC dereprimiert und 2-20, vorzugsweise 3-6 Stunden
nach der Temperaturerhöhung geerntet. Die Zellmasse wird zu
Beginn durch Filtration oder andere Mittel konzentriert,
dann bei 10.000 x g 10 min lang bei 4ºC zentrifugiert,
worauf das rasche Einfrieren des Zellpellets erfolgt.
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Es können auch verschiedene Säugerzellkultursysteme
eingesetzt werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Zu
Beispielen für Säugerexpressionssysteme gehören die COS-7-
Linien von Affennierenfibroblasten, die von Gluzman, Cell
23:175 (1981) beschrieben sind, und andere Zellinien, die
einen kompatiblen Vektor exprimieren können, z.B. die
Zellinien C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK. Säugerexpressionsvektoren
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können einen Ursprungspunkt der Replikation, einen
geeigneten Promotor und Enhancer und auch jedwede notwendige
ribosomale Bindungsstellen, Polyadenylierungsstelle, Spleiß-
Donor- und Akzeptorstellen,
Transkriptionsterminationssequenzen und 5'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen
umfassen. DNA-Sequenzen, die von dem SV40-Virusgenom
abgeleitet sind, z.B. der SV40-Ursprung, frühe Promotor,
Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen, können
verwendet werden, um die erforderlichen nicht-transkribierten
genetischen Elemente bereitzustellen. Zusätzliche Details
betreffend die Verwendung eines stark exprimierenden Vektors
zur Herstellung eines rekombinanten bGM-CSF sind in Beispiel
1 unten angegeben&sub8;
Proteinreinigung
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Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur
hergestellt wurde, wird gewöhnlich isoliert durch eine zu Beginn
erfolgende Extraktion aus Zellpellets, gefolgt von einem
oder mehreren Aussalzschritten, wäßrigen
Ionenaustauschschritten oder Größenausschlußchromatographieschritten.
Schließlich kann die Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) für die abschließenden Reinigungsschritte eingesetzt
werden. Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von rbGM-
CSF zum Einsatz kommen, können durch jedwedes passende
Verfahren aufgebrochen werden, wozu abwechselnde
Gefrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanisches Aufbrechen oder die
Verwendung von zell-lysierenden Mitteln gehören.
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Die Fermentation von Hefe, welche bGM-CSF als sezerniertes
Protein exprimiert, erleichtert die Reinigung erheblich.
Sezerniertes rekombinantes Protein, das das Ergebnis einer
Fermentation in großem Maßstab ist, kann durch Verfahren
gereinigt werden, die den von Urdal et al., J. Chromatog.
296:171 (1984) offenbarten analog sind. Diese
Literaturstelle beschreibt zwei aufeinanderfolgende Umkehrphasen-
HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem Human-GM-CSF
auf einer präparativen HPLC-Säule.
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Diese Vorgehensweise kann wie folgt eingesetzt werden. Eine
Hefebrühe, die rbGM-CSF enthält, wird zuerst durch einen
0,45u-Filter filtriert und mit einer Fließgeschwindigkeit
von 100 ml/min auf eine 5 cm x 30 cm Säule gepumpt, welche
mit 15-20 u C-4-Umkehrphasen-Siliciumdioxid gepackt ist
(Vydac, the Separations Group, Hesperia, CA, USA). Die Säule
wird in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser (Lösungsmittel A)
vor der Auftragung der Hefebrühe äquilibriert und mit diesem
Lösungsmittel nach der Auftragung der Brühe auf die Säule
gespült, bis die optische Extinktion des herausfließenden
Mediums sich den Grundlinienwerten annähert. Zu diesem
Zeitpunkt wird ein Gradient von 0,1% Trifluoressigsäure in
Acetonitril (Lösungsmittel B) eingerichtet, der von 0% bis
100% Lösungsmittel B mit einer Änderungsrate von 2% pro
Minute und einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min führt.
Nach dem Einsetzen des Gradienten werden in einminütigem
Abstand Fraktionen gesammelt und Aliquots der Fraktionen durch
Polyacrylamid-Gelelektrophorese und
Fluorescamin-Proteinbestimmung auf den Proteingehalt und mit einem geeigneten Test
auf die bGM-CSF-Aktivität hin untersucht. bGM-CSF
enthaltende Fraktionen dieses Säulendurchlaufs werden dann
vereinigt und mit 2 Volumina 0,9 M Essigsäure, 0,2 M Pyridin,
ph 4,0 verdünnt. Das vereinigte und verdünnte Material wird
dann auf eine zweite 5 cm x 30 cm-Säule gepumpt, die mit
15-20 u Siliciumdioxid (Vydac) gepackt ist, welche in 75%
Lösungsmittel A2 (0,9 M Essigsäure, 0,2 M Pyridin, pH 4,0)
und 25% Lösungsmittel B2 (60% n-Propanol in 0,9 M
Essigsäure, 0,2 M Pyridin, pH 4,5) äquilibriert worden ist. Im
Anschluß an die Auftragung des Materials wird die Säule mit
zusätzlichem Äquilibrierungslösungsmittel gespült und dann
ein Gradient eingerichtet, der von 25% bis 100%
Lösungsmittel B2 mit einer Änderungsrate von 1% Lösungsmittel B2
pro Minute führte um rbGM-CSF von der Säule zu eluieren.
Verabreichung von bGM-CSF
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Bei der Anwendung wird gereinigter Rinder-GM-CSF einem
Säuger zur Behandlung in einer Weise verabreicht, die der
Indikation angemessen ist. So kann z.B. bGM-CSF, der als
Stimulator der Hämatopoese oder als Modulator der Funktion von
Immuneffektorzellen verabreicht wird, durch Bolus-Injektion,
kontinuierliche Infusion, verzögerte Freisetzung aus
Implantaten oder eine andere geeignete Methode abgegeben werden.
Typischerweise wird bGM-CSF in Form einer Zusammensetzung
verabreicht, die gereinigtes Protein in Verbindung mit
physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipientien oder
Verdünnungsmitteln umfaßt. Neutral gepufferte Kochsalzlösung oder
Kochsalzlösung, die mit artgleichem Serumalbumin vermischt
ist, sind Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel.
Vorzugsweise wird das Produkt als Lyophilisat unter Verwendung
von Sucrose als Verdünnungsmittel formuliert. Geeignete
Dosierungen können in Feldversuchen bestimmt werden; im
allgemeinen genügen Dosierungen von 10 ng bis 1 ug/kg/Tag, um
eine gewünschte biologische Wirkung zu induzieren.
Beispiel 1: Isolierung von cDNA, die für bGM-CSF codiert,
und Expression von aktivem Protein in
COS-7-Zellen
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Eine cDNA-Polynukleotidsonde wurde aus einem 550 Basenpaare
(bp) umfassenden HincII/NcoI-Fragment der Struktursequenz
einer menschlichen GM-CSF-cDNA durch Nick-Translation unter
Verwendung von DNA-Polymerase I hergestellt. Diese Sonde
schließt das gesamte offene Leseraster für Human-GM-CSF und
zusätzlich einige 3'- und 5'-nicht-codierende flankierende
Sequenzen ein. Das eingesetzte Verfahren war im wesentlichen
das gleiche wie das von Maniatis et al., supra, offenbarte.
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Eine cDNA-Bank wurde durch reverse Transkription von
polyadenylierter mRNA konstruiert, die aus Gesamt-RNA isoliert
wurde, welche aus Rinder-BT2-Zellen extrahiert wurde. Die
Zellen wurden in RPMI 1640-Medium plus 10% fötales
Rinderserum 16 Stunden lang in Gegenwart von 5% Phytohämagglutin-A
(PHA-P) und 10 ng/ml Phorbolmyristatacetat (PMA) kultiviert,
um die maximale GM-CSF-spezifische Messenger-RNA-Produktion
anzuregen. Die cDNA wurde doppelsträngig gemacht, wobei DNA-
Polymerase I verwendet wurde, mit T4-DNA-Polymerase mit
glatten Enden versehen, mit EcoRI-Methylase methyliert, um
EcoRI-Spaltstellen in der cDNA zu schützen, und mit EcoRI-
Linkern verknüpft. Die daraus hervorgehenden Konstrukte
wurden mit EcoRI verdaut, um alle bis auf eine Kopie der Linker
an jedem Ende der cDNA zu entfernen, und mit von EcoRI
geschnittenen und dephosphorylierten Armen des Bakteriophagen
λgt10 verknüpft (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical
Approach, Glover, Hrsg., IRL Press, S. 49-78). Die
verknüpfte DNA wurde in Phagenpartikel gepackt, wobei ein im
Handel erhältlicher Kit zum Erzeugen einer Bank von
Rekombinanten verwendet wurde (Stratagene Cloning Systems, San
Diego, CA, USA 92121). Rekombinanten wurden auf dem E. coli-
Stamm C600(hf1&supmin;) ausplattiert und mit
Standard-Plaquehybridisierungs-Methoden unter mäßig strigenten Bedingungen
(60ºC, 6xSSC) durchsucht. Beim Durchsuchen von ungefähr
100.000 Plaques wurden vier Klone aus der Bank isoliert,
welche an die cDNA-Sonde hybridisierten. Die Klone wurden
plaquegereinigt und verwendet, um Bakteriophagen-DNA
herzustellen, welche mit EcoRI verdaut wurde. Die Verdaue wurden
auf einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt, auf
Nylonfilter übertragen und erneut auf Hybridisierung getestet.
Die Klone wurden mit EcoRI verdaut und in ein mit
EcoRI-geschnittenes Derivat (pGEMBL) des Standard-Klonierungsvektors
pBR322 subkloniert, welches einen Polylinker mit einer nur
einmal vorkommenden EcoRI-Stelle, einer BamH1-Stelle und
zahlreichen anderen nur einmal vorkommenden
Restriktionsstellen enthielt. Ein beispielhafter Vektor dieser Art wurde
beschrieben von Dente et al., Nucleic Acids Research 11:1645
(1983). Die Restriktionskartierung zeigte das Vorhandensein
einer Insertion von ungefähr 800 bp in einem der Klone an.
Diese Insertion wurde subkloniert und sequenziert. Der Klon
bGM-CSF 4.7 enthielt ein DNA-Segment, welches ein offenes
Leseraster einschließt, das für ein Protein mit 143
Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 16,2
Kilodalton (Kd) codiert, das ungefähr 71% Homologie zu
Human-GM-CSF und 52% Homologie zu Mäuse-GM-CSF aufweist.
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Ein stark exprimierender Vektor (HiXP) wurde aus SV40,
Adenovirus 2 und pBR322-DNA zusammengesetzt, umfassend in
dieser Reihenfolge: (1) ein SV40-Fragment, enthaltend den
Ursprungspunkt der Replikation, frühe und späte Promotoren
und Enhancer; (2) ein Adenovirus-2-Fragment, enthaltend den
hauptsächlichen späten Promotor, das erste Exon und einen
Teil des ersten Introns des dreigeteilten späten Leaders;
(3) eine synthetische Sequenz, umfassend eine HindIII-
Stelle; eine Spleiß-Akzeptorstelle, die zweiten und dritten
Exons des dreigeteilten Leaders von Adenovirus 2 und eine
Mehrfach-Klonierungsstelle; (4) zusätzliche SV40-Sequenzen,
enthaltend frühe und späte Polyadenylierungsstellen; (5)
Adenovirus-2-Sequenzen einschließlich der virusassoziierten
RNA-Gene; und (6) pBR322-Elemente zur Replikation in
E. coli.
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Ein 470 bp umfassendes EcoRI/HindIII-Fragment von dem
bGM-CSF-Klon 4.7 wurde in die
HiXP-Mehrfach-Klonierungsstelle eingefügt, um einen HiXP-Expressionsvektor für bGM-
CSF zu ergeben. Dieser Vektor und ein Kontrollvektor ohne
Insertion wurden in Affen-COS-7-Zellen transfiziert, wobei
DEAE-Dextran gefolgt von einer Chloroquinbehandlung
verwendet wurde, wie von Luthman et al., Nucleic Acids Res.
11:1295 (1983) und McCutchan et al., J. Natn. Cancer Inst.
41:351 (1968) offenbart ist. Die Zellen wurden dann in
Kultur drei Tage lang wachsen gelassen, um die transiente
Expression der insertierten Sequenz zu ermöglichen. Die
Zellkulturüberstände wurden dreifach auf GM-CSF-Aktivität
getestet, wobei ein Rinderknochenmark-Proliferationstest
-
verwendet wurde, der in dieser Beschreibung an anderer
Stelle beschrieben ist. Die Überstände von Kontrollkulturen
wiesen in dem Test keine nachweisbare biologische Aktivität
auf, wogegen die Überstände von Zellen, die mit dem
HiXP/bGM-CSF-Plasmid transfiziert waren, durchschnittlich
648 Einheiten/ml GM-CSF-Aktivität enthielten. Die SDS-PAGE
zeigte das Vorhandensein eines 22 Kd-Proteins in den
Überständen der mit bGM-CSF-transfizierten COS-7, welches in den
Überständen der Kontrollkulturen nicht auftrat.
Beispiel 2: Expression von bGM-CSF in einem Hefesystem
-
Um bGM-CSF als sezerniertes Fusionsprotein in Hefe zu
exprimieren, wurde ein 510 bp-Fragment, welches die codierende
Region des bGM-CSF-Gens enthielt, aus dem bGM-CSF-cDNA-Klon
4.7 durch Spaltung mit BamHI und Sau3a isoliert. Das
Fragment wurde in mit BamH1 geschnittenes pBC120, ein Derivat
von pα3, welches ein Hefeplasmid ist, das als ATCC 53220
hinterlegt ist, eingefügt. pBC120 schließt ein: (1) einen
Ursprungspunkt der Replikation und ein Apr-Gen von pBR322,
welches die Selektion und Replikation in E. coli ermöglicht;
(2) das TRP1-Gen und den 2u-Ursprungspunkt der Replikation
zur Selektion und Replikation in S. cerevisiae; (3) den
Alkoholdehydrogenase-2- (ADH2) -Promotor der Hefe, gefolgt
von der prä-pro-α-Faktor-Leadersequenz der Hefe, um die
Expression und Sekretion von Fremdprotein aus Hefe zu
ermöglichen; (4) eine Sequenz, die für das N-terminale Epitop
oder den Identifizierungs-Leader Asp-Tyr-Lys- (Asp&sub4;) -Lys
("Flagge") codiert, die benachbart zu und im Leseraster mit
der α-Faktor-Leadersequenz fusioniert ist; und (5)
einen Ursprungspunkt der Replikation für den
einzelsträngigen Bakteriophagen f1, welcher von dem pEMBL-Vektor
abgeleitet ist, der von Dente et al., Nucleic Acids Research
11:1645 (1983) beschrieben ist, welcher die Produktion von
einzelsträngigen DNA-Kopien des Plasmids in geeigneten
-
E. coli-Stämmen ermöglicht.
-
Das daraus hervorgehende Plasmid pBC158 enthält die folgende
Sequenz:
-
Um die 53 bp-Sequenz (oben in Klammern) zwischen Segmenten,
die für den Identifizierungs-Leader und reifen bGM-CSF
codieren, zu entfernen, wurde eine in vitro-Mutagenese durch
ein Verfahren, welches dem von Walder und Walder, Gene
42:133 (1986) beschriebenen ähnlich ist, wie folgt
durchgeführt.
-
Einzelsträngige DNA wurde durch Transformieren des
E. coli-Stamms JM107 und Superinfizieren mit dem
Helferphagen IR1 erzeugt. Die einzelsträngige DNA wurde isoliert und
mit einem mutagenen Oligonukleotid mit der Sequenz
5'-GACGATGACAAGGCACCTACTCGC-3', hybridisiert, was die
dazwischenliegende unerwünschte Sequenz erfolgreich entfernt. Die
Bedingungen der Hybridisierung und Transformation der Hefe
waren im wesentlichen gleich wie die von Walder und Walder,
supra, offenbarten. Die Hefetransformanten wurden durch
Wachstum auf einem tryptophanfreien Medium selektiert,
vereinigt und die DNA im wesentlichen so wie von Holm et al.,
Gene 42:169 (1986) beschrieben extrahiert. Diese DNA, die
ein Gemisch aus Wild-Typ- und Mutanten-Plasmid-DNA enthielt,
wurde verwendet, um E. coli RR1 zu transformieren, so daß es
eine Ampicillinresistenz aufwies. Die daraus hervorgehenden
Kolonien wurden durch Hybridisierung an eine radioaktiv
markierte Probe des vorstehenden mutagenen Oligonukleotids
unter stringenten Bedingungen (z.B. 55ºC, 6xSSC) durchsucht.
Hybridisierende Kolonien wurden dann selektiert und die
Plasmid-DNA (pBC159) gereinigt und einer
Restriktionskartierung unterworfen, um die Plasmidkonstruktion zu
verifizieren.
-
Die gereinigte Plasmid-DNA wurde dann eingesetzt, um einen
diploiden Hefestamm von S. cerevisiae (XV2181) durch
Standardmethoden, wie sie z.B. in EPA 0165654 offenbart sind, zu
transformieren, wobei auf Tryptophanprototrophe selektiert
wurde. Die daraus hervorgehenden Transformanten wurden
kultiviert, um die Expression eines
Flaggen-bGM-CSF-Fusionsproteins zu erhalten. Kulturen, die auf biologische Aktivität
hin untersucht werden sollten, wurden in 20-50 ml YPD-Medium
(1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 1% Glucose) bei 37ºC bis zu
einer Zelldichte von 1-5 x 108 Zellen/ml wachsen gelassen. Die
Zellen wurden dann durch Zentrifugation entfernt und das
Medium wurde durch einen 0,45 u-Zelluloseacetatfilter
filtriert. Überstände, die von dem transformierten Hefestamm
erzeugt worden waren, wurden dann durch Reaktion mit einem
monoklonalen Mäuse-Antikörper, gefolgt von Meerrettich-
Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-Antikörper
getestet, um das Vorhandensein des Flaggenpeptids nachzuweisen,
und auch in einem Rinderknochenmark-Proliferationstest auf
GM-CSF-Aktivität hin getestet, was die Expression eines
biologisch aktiven Proteins bestätigte.