DE3854496T2

DE3854496T2 - Peptide und antikörper, die die bindung von blutplättchen verhindern.

Info

Publication number: DE3854496T2
Application number: DE3854496T
Authority: DE
Inventors: Mark Ginsberg; Edward Plow
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1987-07-08
Filing date: 1988-07-08
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2008-07-09
Also published as: FI891078L; DE3854496D1; US5284751A; JP3541122B2; ATE128183T1; JP3184878B2; NO890981L; US5470738A; DK110189D0; FI105276B; FI891078A0; JP2001190287A; JPH02500085A; US5498499A; DK175655B1; NO300505B1; EP0326595A4; NO890981D0; US5114842A; EP0326595B1

Description

Dieses ist eine "continuation-in-part"-Anmeldung der am 8. Juli 1987 eingereichten, anhängigen USA-Patentanmeldung Serial Number 070 953.

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle und Moleküle aus rekombinanter DNA, welche eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein Strukturgen für jenen Teil der Schweren Kette von GPIIb (hGPIIb) kodiert, der eine antigene Determinante bildet, wenn sich das mit den Plättchen assoziierte GPIIb-IIIa an Fibrinogen bindet. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante und Antikörper, welche mit den Polypeptid-Analoga immunreagieren.

Grundlage

Die Zell-Adhäsion umfaßt im allgemeinen das Erkennen spezifischer Adhäsionsproteine durch Zelloberflächenrezeptoren. Eine Familie von Zelloberflächenrezeptoren, welche von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind, sind die Integrine.
Gemäß Hynes, Cell, 48 : 549-554 (1987), sind die Integrine eine funktionell und strukturell verwandte Gruppe von Rezeptoren, welche mit einer umfassenden Vielfalt von Liganden, darunter mit extrazellulären Matrix-Glykoproteinen, Komplement und mit anderen Zellen, in Wechselwirkung treten. Die Integrine nehmen an der Zell-Matrix-Adhäsion sowie an der Zell-Zell-Adhäsion in vielen physiologisch wichtigen Vorgängen teil, darunter bei der embryonalen Entwicklung, bei der Hämostase, Thrombose, Wundheilung, bei Immun- und Nichtimmun-Verteidigungsmechanismen und bei der onkogenen Umwandlung. Zwei humangenetische Erkrankungen, nämlich die Thrombasthenie (das Glanzmann-Naegeli-Syndrom) und der Leukozyten-Adhäsionsdefekt, betreffen Mitglieder der Integrin-Familie.
Strukturell sind die Integrine heterodimere Komplexe, welche aus nicht-kovalent gebundenen alpha- und beta-Subeinheiten bestehen. Innerhalb der Integrin-Familie gibt es anerkannte Gruppen, welche durch das Vorliegen einer ähnlichen bzw. gleichen beta-Untereinheit miteinander verwandt sind; und die Glieder innerhalb jeder Gruppe zeichnen sich durch einzigartige alpha-Untereinheiten aus.
Beispielsweise ist das GPIIb-IIIa ein nicht-kovalenter, Ca&spplus;&spplus;-abhängiger, heterodimerer Komplex, der aus alpha- und beta-Untereinheiten besteht. Jennings et al, J. Biol. Chem., 257 : 10458-10466 (1982). Die alpha-Untereinheit, GPIIb, besteht aus einer Schweren Kette (hGPIIb) mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 120 kDa, und einer Leichten Kette (lGPIIb) von etwa 20 kDa, welche durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind. Die beta-Untereinheit, GPIIIa, ist ein aus einer einzelnen Kette bestehendes Polypeptid von etwa 100 kDa. Phillips et al, J. Biol. Chem., 252 : 2121-2126 (1977). Zelloberflächenmoleküle, welche mit dem GPIIb-IIIa immunologisch verwandt sind, sind auf einer Vielfalt von Zelltypen identifiziert worden. Siehe Thiagarajan et al, J. Clin. Invest., 75 : 896-901 (1985); Plow et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 6002-6006 (1986); und Fitzgerald et al, J. Biol. Ohem., 260 : 10893-10896 (1985).
Das GPIIb-IIIa trägt durch Wechselwirkungen mit RGD enthaltenden Proteinen, wie z. B. Fibrinogen [Bennett et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 2417-2421 (1983)], Fibronektin [Ginsberg et al, J. Olin. Invest., 71 : 619-624 (1983)] und von Willebrand-Faktor [Ruggeri et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 6038-6041 (1982)], zur Plättchenfunktion bei und ist daher eine Komponente des normalen Plättchen-Adhäsionsprotein-Rezeptors [Pytela et al, Science, 231 : 1559-1562 (1986); und Plow et al, J. Biol. Ohem., 259 : 5388-5391 (1984)].
Kürzlich aufgetauchte Beweise deuten darauf hin, daß das GPIIb-IIIa einer von mehreren Adhäsionsrezeptoren ist, denen eine ähnliche beta-Untereinheit und die funktionelle Eigenschaft des Erkennens der Tripeptid-Aminosäurenrestesequenz Arg- Gly-Asp (oder - unter Verwendung von Einzelbuchstabensymbolen - RGD) gemeinsam sind. Pytela et al, Science, 231 : 1559-1562 (1986); und Ruoslahti et al, Cell, 44 : 517-518 (1986). Zusätzlich zu dem GPIIb-IIIa umfaßt diese Gruppe von verwandten Rezeptoren den Vitronektin-Rezeptor (VnR) und den Fibronektin-Rezeptor (FnR), welche aus Osteosarkomzellen isoliert worden sind [Pytela et al, Cell, 40 : 191-198 (1985); Pytela et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 5766-5770 (1985); und Sanchez-Madrid et al, J. Exp. Med., 158 : 1785-1803 (1983)].
Die ähnlichen funktionellen, strukturellen und antigenen Eigenschaften dieser Proteine legen es nahe, daß GPIIb-IIIa und VnR Glieder einer Gruppe von Adhäsionsrezeptoren sind, für welche die Bezeichnung "Zytoadhäsin" vorgeschlagen worden ist. Plow et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 6002-6006 (1986). Innerhalb der Zytoadhäsingruppe verbinden sich verschiedene alpha-Untereinheiten mit einer gemeinsamen oder sehr ähnlichen beta-Untereinheit, was zu funktionell unterscheidbaren Rezeptoren führt. Ginsberg et al, J. Biol. Chem., 262 : 5437-5440 (1987).
Wenigstens zwei andere Gruppen von heterodimeren Adhäsionsrezeptoren sind identifiziert worden, bei denen sich eine gemeinsame beta-Untereinheit mit einer Anzahl verschiedener alpha-Untereinheiten verbindet. Eine Gruppe findet sich auf Leukozyten vor und ist als die Leukozyten-Adhäsionsfamilie bezeichnet worden, welche LFA-1, Mac-1, P150,95, umfaßt. Sanchez- Madrid et al, J. Exp. Med., 158 : 1785-1803 (1983); und Springer et al, Ciba Found. Symp., 118 : 102-126 (1986). Die andere Gruppe ist weiter verbreitet und ist als die VLA-Familie bezeichnet worden. Hemler et al, J. Biol. Chem., 262 : 3300-3309 (1987). Die beta-Untereinheit der VLA-Familie [Hemler et al, J. Biol. Chem., 262 : 3300-3309 (1987)] beim Huhn ist kloniert und sequenziert worden und mit "Integrin" bezeichnet worden [Tamkun et al, Cell, 46 : 271-282 (1986)]. Die Sequenz des Hühner-Integrins ist die gleiche wie jene des GPIIIa [Fitzgerald et al, J. Biol. Chem., 262 : 3936-3939 (1987)] und jene der beta-Untereinheit der Leukozyten-Adhäsionsfamilie [Kishimoto et al, Cell, 48 : 681-690 (1987)]. Außerdem zeigen Teilsequenzen mehrerer alpha-Untereinheiten ebenfalls Ähnlichkeiten. Ginsberg et al, J. Biol. Chem., 262 : 5437-5440 (1987); Suzuki et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 8614-8618 (1986); und Charo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 8351-8356 (1986).
Die Stellen auf dem GPIIb-IIIa oder auf den anderen Zytoadhäsinen welche für deren Funktionen als Adhäsionsrezeptoren kritisch sind, sind derzeit unbekannt. Mehrere Beobachtungen legen es nahe, daß eine funktionell signifikante Stelle auf dem GPIIb-IIIa sich nahe dem Epitop befindet, das von dem monoklonalen Antikörper PMI-1 definiert wird. Dieser Antikörper bindet sich an die Schwere Kette des GPIIb [Shadle et al, J. Cell. Biol., 99 : 2056-2060 (1984)] und definiert eine Region des GPIIb, welche mit mehreren verschiedenen funktionellen Aktivitäten assoziiert ist. Erstens inhibiert der PMI-1 die Adhäsion von gewaschenen Plättchen an Kollagen. Shadle et al, J. Cell. Biol., 99 : 2056-2060 (1984)]. Zweitens wird die Oberflächenausrichtung dieser Region durch zweiwertige Kationen reguliert, weil die Expression des PMI-1 Epitops durch mM-Konzentrationen von Calcium oder Magnesium unterdrückt wird. Ginsberg et al, J. Clin. Invest., 78 : 1103-1111 (1986). Drittens wird die abnorme Regelung der Struktur dieser Stelle durch zweiwertige Kationen mit einem funktionellen Thrombasthenie-Zustand assoziiert. Ginsberg et al, J. Clin. Invest., 78 : 1103-1111 (1986). Viertens wird das Binden von PMI-1-Antikörpern mit Plättchen durch Stimulieren der Plättchen mit bis zu 100 µM Adenosindiphosphat (ADP) oder mit Epinephrin, 1 Einheit pro ml an Thrombin, oder mit 50 µg pro ml an Kälberhaut-Kollagen nicht wesentlich über den Hintergrund erhöht.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Es ist nunmehr gefunden worden, daß Zelloberflächenrezeptoren, welche einen Liganden spezifisch gebunden haben, von nicht-besetzten Rezeptoren durch das Vorliegen einer ligandeninduzierten Antikörper-Bindungsstelle (LIBS, "ligand-induced antibody binding site") unterschieden werden können. Es ist daher eine Klasse von antigenen Determinanten entdeckt worden, welche dann exprimiert werden, wenn sich ein Zelloberflächenrezeptor spezifisch an einen Liganden bindet, welche aber weder durch den nicht-besetzten Rezeptor noch durch den nicht-gebundenen Liganden exprimiert werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers vorgesehen, welcher mit einer ligandeninduzierten Bindungsstelle immunreagiert, welche durch einen Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, wobei der Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, die spezifisch aneinander gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Immunisieren eines Säugetieres mit dem Komplex;
(b) Entfernen von antikörperproduzierenden Zellen aus dem immunisierten Säugetier und Herstellen einer Suspension dieser Zellen;
(c) Behandeln dieser Zellen mit einem eine Transformation bewirkenden Mittel zur Erzeugung transformierter, antikörpererzeugender Zellen,
(d) Klonieren der in der Stufe (c) behandelten Zellen durch beschränkende Verdünnung in einem Gewebekulturmedium, in welchem nichttransformierte Zellen nicht wachsen können, zur Erzeugung klonierter Transformanden;
(e) Durchprüfen des Gewebekulturmediums der klonierten Transformanden auf das Vorliegen sezernierter Antikörpermoleküle, welche mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;
(f) Selektionieren eines klonierten Transformanden, welcher die sezernierten Antikörpermoleküle produziert, und Züchten desselben in einem Gewebekulturmedium; und
(g) Ernten der sezernierten Antikörpermoleküle aus dem Kulturmedium des selektionierten und klonierten Transformanden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers vorgesehen, der mit einer durch einen Liganden induzierten Bindungsstelle immunreagiert, welche ihrerseits durch einen Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind; und welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Immunisieren einer Maus mit dem Komplex;
(b) Entfernen der Milz aus dieser Maus und Herstellung einer Suspension der Milzzellen;
(c) Fusionieren der Milzzellen mit Mäuse-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors zur Erzeugung von Antikörpersezernierenden Hybridomen;
(d) Verdünnen und Kultivieren der fusionierten Zellen in getrennten Vertiefungen in einem Medium, in welchem die nichtfusionierten Myelomzellen nicht wachsen können;
(e) Durchprüfen des Überstandes in jeder ein Hybridom enthaltenden Vertiefung auf das Vorliegen sezernierter Antikörpermoleküle, welche mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;
(f) Selektionieren und Klonieren eines die Antikörpermoleküle sezernierenden Hybridoms; und
(g) Ernten der Antikörpermoleküle aus dem Überstand über den Klonen.
Weiterhin vorgesehen ist ein Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers, der mit einer durch einen Liganden induzierten Bindungsstelle immunreagiert, welche ihrerseits durch einen Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, wobei dieser Komplex einen Oberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Immunisieren einer Maus mit dem Komplex;
(b) Entfernen der Milz aus dieser Maus und Herstellung einer Suspension der Milzzellen;
(c) Fusionieren der Milzzellen mit Mäuse-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors zur Erzeugung von Antikörpersezernierenden Hybridomen;
(d) Verdünnen und Kultivieren der fusionierten Zellen in getrennten Vertiefungen in einem Medium, in welchem die nichtfusionierten Myelomzellen nicht wachsen können;
(e) Durchprüfen des Überstandes in jeder ein Hybridom enthaltenden Vertiefung auf das Vorliegen sezernierter Antikörpermoleküle, welche mit dem Zelloberflächenrezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;
(f) Selektionieren und Klonieren eines die Antikörpermoleküle sezernierenden Hybridoms;
(g) Transferieren der Klone, intraperitoneal, in eine Maus; und
(h) Ernten des Aszites oder von Serum aus der Maus, welcher Aszites oder welches Serum den gewünschten Antikörper enthält.
Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren für den in-vivo- Nachweis des Vorliegens eines Rezeptor-Liganden-Komplexes, wobei der Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Intravenöses Verabreichen einer wirksamen Menge einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung an ein Human-Subjekt, welche Zusammensetzung ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel und Antikörpermoleküle enthält, welche mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren, wobei die Antikörpermoleküle an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind;
(b) Verharrenlassen des Subjektes, an welches die Zusammensetzung verabreicht wurde, während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die Antikörpermoleküle mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex in vivo immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden; und
(c) Testen auf das Vorliegen irgendeines in der Stufe (b) gebildeten Immunreaktionsproduktes und dadurch auf das Vorliegen des Komplexes in dem Subjekt.
Noch weiterhin vorgesehen ist ein Verfahren zum Testen auf das Vorliegen eines Rezeptor-Liganden-Komplexes in einer Gefäßflüssigkeitsprobe, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Ausbilden eines Immunreaktionsgemisches durch Vermischen einer Gefäßflüssigkeitsprobe mit einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung, welche Antikörpermoleküle enthält, die mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;
(b) Aufrechterhalten des Gemisches während einer Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die Antikörpermoleküle mit jedwedem, in der Probe vorhandenem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden, und
(c) Nachweisen des Vorliegens irgendeines in der Stufe (b) ausgebildeten Immunreaktionsproduktes und dadurch des Vorliegens des Komplexes in der Probe.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Testen einer plättchenhältigen Gefäßflüssigkeitsprobe auf das Vorliegen von Plättchen, welche einen GPIIb-IIIa-Liganden-Komplex exprimieren, vorgesehen, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Ausbilden eines Immunreaktionsgemisches durch Vermischen der Gefäßflüssigkeitsprobe mit einer wirksamen Menge einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung, welche von dem Hybridom PMI-1 oder PMI-2 produzierte Anti-GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle enthält;
(b) Aufrechterhalten des Gemisches während einer Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die Antikörper mit jedweden, in der Probe vorhandenen, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden; und
(c) Nachweisen des Vorliegens von jedwedem, in der Stufe b) gebildetem Immunreaktionsprodukt.
Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren für den Nachweis des Vorliegens eines Thrombus in vivo, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
a) Intravenöses Verabreichen einer wirksamen Menge einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung an ein Human-Subjekt, welche Zusammensetzung ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel und Anti-GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle enthält, welche an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind; wobei die Antikörpermoleküle jene sind, die von dem Hybridom PMI-1 oder PMI-2 produziert worden sind;
b) Verharrenlassen des Subjektes, an welches die Zusammensetzung verabreicht wurde, während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die Antikörpermoleküle mit an Fibrinogen gebundenen Plättchen in vivo immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden; und
c) Testen auf das Vorliegen von jedwedem, in der Stufe b) gebildetem Immunreaktionsprodukt.
Ein diagnostisches System in Kitform zum Testen auf das Vorliegen eines Rezeptor-Liganden-Komplexes in einer Gefäßflüssigkeitsprobe ist ebenfalls vorgesehen, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, und welches System umfaßt:
a) eine Packung, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält, welche ihrerseits Antikörpermoleküle enthält, welche mit dem genannten Rezeptor- Liganden-Komplex immunreagieren, jedoch mit dem Zelloberflächenrezeptor oder dem Liganden, wenn jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren.
Weiterhin vorgesehen ist ein diagnostisches System in Kitform zum Testen auf das Vorliegen eines Zellrezeptor-Liganden- Komplexes in vivo, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, und welches System umfaßt:
a) eine Packung, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält, welche ihrerseits Antikörpermoleküle enthält, welche mit dem genannten Rezeptor- Liganden-Komplex immunreagieren, jedoch mit dem Zelloberflächenrezeptor oder dem Liganden, wenn jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren, wobei die genannten Antikörpermoleküle an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind.
Weiterhin vorgesehen ist ein diagnostisches System in Kitform zum Testen einer Gefäßflüssigkeitsprobe auf das Vorliegen von Plättchen, welche einen GPIIb-IIIa-Liganden-Komplex exprimieren, welches System umfaßt:
a) eine Packung, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - Anti-GPIIb- IIIa-Antikörpermoleküle enthält, wobei die genannten Anti- GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle von dem Hybridom PMI-1 oder PMI-2 erzeugt worden sind.
Weiterhin vorgesehen ist ein diagnostisches System in Kitform zum Testen auf das Vorliegen eines Thrombus in vivo, welches System umfaßt:
a) eine Packung, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält, welche von dem Hybridom PMI-1 oder PMI-2 erzeugte Anti-GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle enthält, wobei die genannten Antikörpermoleküle an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind.
Weiterhin ist nunmehr entdeckt worden, daß Plättchen- GPIIb-IIIa-Liganden-Komplexe zwei kryptische LIBS vom Typus antigener Determinanten exprimieren, welche von Antikörpermolekülen erkannt werden, die von den Hybridomen PMI-1 und PMI-2 erzeugt worden sind. Außerdem ist aus der DNA-Sequenz, welche für jenen Teil des GPIIb-Proteins kodiert, der die kryptische Determinante in vivo bildet, ein Polypeptid abgeleitet worden, welches befähigt ist, die von dem monoklonalen Antikörper PMI-1 erkannte, kryptische Determinante nachzuahmen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist daher ein DNA-Segment vorgesehen, welches nicht mehr als etwa 12.000 Nukleotid-Basenpaare, einschließlich einer Sequenz, umfaßt, welche Sequenz ein Strukturgen definiert, das für einen Teil des GPIIb-Proteins kodiert, der eine Aminosäurenrestesequenz aufweist, wie dieselbe in der Fig. 1 etwa vom Rest 50 bis zu etwa dem Rest 140 dargestellt ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist auch ein Molekül einer rekombinanten DNA vorgesehen, welches einen Vektor umfaßt, der wirksam an ein DNA-Segment gebunden ist, welches ein Strukturgen definiert, das für einen Teil des GPIIb-Proteins kodiert, der eine Aminosäurenrestesequenz aufweist, wie dieselbe in der Fig. 1 etwa vom Rest 50 bis zu etwa dem Rest 145 dargestellt ist.
Weiterhin vorgesehen ist ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hPGIIb-Determinante, welches nicht mehr als etwa 50 Aminosäurenreste umfaßt und welches eine Aminosäurenrestesequenz enthält, welche durch die Formel:
-PSPSPIHPAHHKRDRRQ-
dargestellt wird.
Ebenfalls vorgesehen sind Hybridomen, welche mit PMI-1 bzw. PMI-2 bezeichnet werden und welche Antikörpermoleküle erzeugen, welche mit an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren.
Ebenfalls vorgesehen ist eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, welche von dem Hybridom PMI-1 erzeugte Antikörpermoleküle enthält, welche mit an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz und eine entsprechende Aminosäurenrestesequenz einer cDNA, welche für einen Teil des Vorläuferproteins von GPIIb kodiert, wobei die Nukleotidsequenz von links nach rechts und in der Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende dargestellt ist, und wobei für die Nukleotidbasen der aus Einzelbuchstaben bestehende Code verwendet wird, und wobei die Nukleotidsequenz als eine ununterbrochene lineare Reihe von Basen, von der Base 1 bis zu der Base 1104, dargestellt ist. Die Aminosäurenrestesequenz ist von links nach rechts und in der Richtung vom Amino-Ende zu dem Carboxy-Ende dargestellt, wobei für diese Aminosäurenrestesequenz der aus Einzelbuchstaben für die einzelnen Aminosäurenreste bestehende Code verwendet wird, und wobei die Aminosäurenrestesequenz als eine ununterbrochene, lineare Reihe von Resten, von dem Rest 1 (R) am Amino-Ende bis zu dem Rest 227 (S) am Carboxy-Ende, dargestellt ist.
Der Leserahmen wird durch Anordnung der abgeleiteten Aminosäurenrestesequenz unter der Nukleotidsequenz auf solche Art und Weise, daß der jeden Aminosäurerest darstellende Einzelbuchstabe unter der ersten Base in dem entsprechenden Codon angeordnet ist, angezeigt.
Die jeweiligen Anordnungen der Aminosäurenrestesequenzen, welche innerhalb des GPIIb-Vorläuferproteins dem mit p129-145 bezeichneten Polypeptid bzw. dem mit p114-156 bezeichneten Polypeptid entsprechen, sind in dem großen bzw. kleinen Kasten dargestellt. Die jeweiligen Anordnungen des mit p19-34 bezeichneten Polypeptides bzw. des mit p53-65 bezeichneten Polypeptides sind durch die doppelte Unterstreichungslinie bzw. durch die Einfachlinienunterstreichung dargestellt. Die Aminosäurenrestesequenz eines vorgeschlagenen Amino-Endes für die Leichte Kette des GPIIb ist durch die strichlierte Linie dargestellt, wobei der Pfeil die potentielle Spaltstelle für die Erzeugung der Schweren und Leichten Ketten des GPIIb markiert.
Die Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung, welche die Wirkung des Polypeptides p129-145 auf das Binden des Antikörpers PMI-1 an Plättchen veranschaulicht. Die Plättchen wurden mit EDTA auf eine Konzentration von 5 mM vermischt, um ein volles Freilegen des PMI-1-Epitops auf dem hGPIIb zu ermöglichen. Danach wurden die Plättchen mit verschiedenen Konzentrationen des Polypeptides p129-149, welche in einen Bereich von 0 bis 100 µM fielen, und mit dem mit ¹²&sup5;I markierten PMI-1-Antikörper vermischt, wie dies in Beispiel 9 beschrieben ist. Der Prozentsatz des an die Plättchen gebundenen, mit ¹²&sup5;I markierten PMI-1 wurde gegen die zu dem Test zugesetzte Konzentration des Polypeptides aufgetragen.
Die Fig. 3 veranschaulicht das wie in Beispiel 10 beschrieben bestimmte Freilegen des PMI-1-Epitops auf stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen. Es wurde die Menge des mit ¹²&sup5;I markierten PMI-1 bestimmt, welche mit an Fibrinogen gebundenen Plättchen unter den Bedingungen von (1) Keinem Stimulus; (2) einer Reizung mit 50 µM ADP, oder (3) einer Reizung mit 50 µM Epinephrin, immunreagiert, und als Prozentsatz, bezogen auf die Menge an ¹²&sup5;I-PMI-1, welche immunologisch an nichtstimulierte Plättchen in Gegenwart von 5 mM EDTA gebunden wird, ausgedrückt.
Die Fig. 4 zeigt die von einem Kurvenschreiber aufgezeichneten Kurven, welche die in Beispiel 11 beschriebene Wirkung der Polypeptide p129-145 und p144-156 auf die Plättchenaggregation veranschaulichen. Dargestellt ist eine lineare Kurve, welche sich beim Aufzeichnen des Prozentsatzes des durchgelassenen Lichtes gegen die Zeit in min ergibt, wobei eine 100%ige Lichtdurchlässigkeit eine maximale Plättchenaggregation anzeigt. Auf der Tafel A ist der Prozentsatz des Lichtes abgebildet, der von einer Kontrollösung von an Plättchen reichem Plasma (PRP) in Tyrodeschem-Puffer (strichlierte Linie) bzw. von einem PRP, welches außerdem 1 mM an dem Polypeptid p129-145 enthält (zusammenhängende Linie), durchgelassen wird. Auf der Tafel B ist der Prozentsatz des Lichtes abgebildet, der von der Kontrollösung (strichlierte Linie) und von einem PRP, welches weiterhin 1 mM an dem Polypeptid p144-156 enthält (zusammenhängende Linie), durchgelassen wird.
Die Fig. 5 zeigt eine graphische Darstellung, welche die Expression von zwei verschiedenen, durch Liganden induzierten Bindungsstellen durch Plättchen-GPIIb-IIIa veranschaulicht. Jede LIBS war durch das spezifische Binden eines Liganden, in der Form eines Polypeptides, welches die Aminosäurenrestesequenz RGDS aufweist, unter Bildung eines GPIIb-IIIa-Liganden-(GPIIb- Polypeptid)-Komplexes induziert worden. Der Prozentsatz der LIBS-Expression durch verschiedene Polypeptid-Konzentrationen wurde wie in Beispiel 13A beschrieben bestimmt.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäuren

Alle hierin identifizierten Aminosäurenreste haben die natürliche L-Konfiguration. In Übereinstimmung mit der Standard-Polypeptid-Nomenklatur [J. Biol. Chem., 243, 3557- 59 (1969)] sind die Abkürzungen für Aminosäurenreste wie in der folgenden Konkordanztabelle gezeigt: Konkordanztabelle SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstaben-Notation 3-Buchstaben-Notation L-Tyrosin Glycin L-Phenylalanin L-Methionin L-Alanin L-Serin L-Isoleucin L-Leucin L-Threonin L-Valin L-Prolin L-Lysin L-Histidin L-Glutamin L-Glutaminsäure L-Tryptophan L-Arginin L-Asparaginsäure L-Asparagin L-Cystein
Bemerkt sei, daß alle Aminosäurenrestesequenzen hierin durch Formeln dargestellt werden, deren Ausrichtung von links nach rechts der herkömmlichen Richtung vom Amino-Ende zum Carboxy-Ende entspricht. Weiterhin sei bemerkt, daß ein Strich am Anfang oder Ende einer Aminosäurenrestesequenz eine Bindung an eine weitere Sequenz aus einem Aminosäurerest oder aus mehreren Aminosäurenresten bis zu einer Gesamtzahl von etwa 50 Resten in der Polypeptidkette anzeigt.
Polypeptid und Peotid: "Polypeptid" und "Peptid" sind Ausdrücke, welche hierin austauschbar verwendet werden, um eine lineare Reihe von nicht mehr als etwa 50 Aminosäurenresten zu bezeichnen, welche durch Peptidbindungen zwischen der alpha- Aminogruppe und der Carboxylgruppe benachbarter Reste aneinander gebunden sind.
Protein: "Protein" ist ein Ausdruck, der hierin verwendet wird, um eine lineare Reihe von mehr als 50 Aminosäurenresten zu bezeichnen, welche wie in einem Polypeptid aneinander gebunden sind.
Nukleosid und Nukleotid: Eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, welche aus einem Zuckerrest (einer Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhältigen, heterocyclischen Base besteht. Die Base ist an den Zuckerrest über den glykosidischen Kohlenstoff (das 1'-Kohlenstoffatom der Pentose) gebunden, und diese Kombination von Base und Zucker ist ein Nukleosid. Enthält das Nukleosid eine Phosphatgruppe, welche an die 3'- oder 5'-Position der Pentose gebunden ist, dann wird es als Nukleotid bezeichnet.
Basenpaar (bp): Eine über Wasserstoffbindungen zusammengehaltene Partnerschaft von Adenin (A) mit Thymin (T) oder von Zytosin (C) mit Guanin (G) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül.
Rezeptor: Die Ausdrücke "Rezeptor" und "Rezeptorprotein" werden hierin verwendet, um ein biologisch aktives, proteinartiges Molekül zu bezeichnen, welches sich spezifisch an (oder mit) andere(n) Moleküle(n) bindet bzw. verbindet.
Ligand und verwandter Ligand: Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf ein Molekül, welches einen Strukturteil enthält, der durch spezifische Wechselwirkung mit einem speziellen Rezeptorprotein verbunden ist.
Durch einen Liganden induzierte Bindungsstelle (LIBS):
Eine LIBS ist eine neo-antigene Determinante, welche durch einen Zelloberflächenrezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, aber weder durch den nicht-besetzten Rezeptor noch durch den nicht-gebundenen Liganden exprimiert wird. Eine LIBS kann entweder "strukturell" oder "sequentiell" sein. Eine LIBS kann das Ergebnis spezifischer Veränderungen des Rezeptors sein, die durch das Binden mit dem Liganden induziert worden sind, nämlich eine "kryptische antigene Determinante" sein, oder sie kann durch eine Kombination von Rezeptor- und Ligandenaminosäurenresten an einer Rezeptor-Liganden-Kontaktstelle ausgebildet werden.
Kryptische antigene Determinante: Bezieht sich auf eine neo-antigene Determinante, welche durch Veränderungen in der Struktur oder in der Ausrichtung der Membranoberfläche eines Rezeptorproteins nach dem Binden an dessen ihm verwandten (spezifischen) Liganden ausgebildet worden ist. Die hierin beschriebenen Rezeptorproteine exprimieren normalerweise keine kryptische antigene Determinante, sofern nicht der Rezeptor einen spezifisch daran gebundenen Liganden aufweist.

B. DNA-Segmente

In lebenden Organismen steht die Aminosäurenrestesequenz eines Proteins oder Polypeptides über den genetischen Code in direkter Beziehung zu der Desoxyribonukleinsäure- (DNA) -Sequenz des Strukturgens, welches für das betreffende Protein kodiert. Somit kann ein Strukturgen aufgrund der Aminosäurenresteseguenz, nämlich des Proteins oder Polypeptides, für welche(s) es kodiert, definiert werden.
Ein wichtiges und wohlbekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redundanz. Dies bedeutet, daß für die meisten Aminosäuren, welche zur Herstellung von Proteinen verwendet werden, mehr als ein Kodierungs-Nukleotid-Triplett (Codon) für einen speziellen Aminosäurerest kodieren oder denselben bezeichnen kann. Daher kann eine Anzahl verschiedener Nukleotidsequenzen für eine besondere Aminosäurenrestesequenz kodieren. Solche Nukleotidsequenzen werden als funktionell äquivalent angesehen, weil sie in allen Organismen zu der Erzeugung der gleichen Aminosäurenrestesequenz führen können. Gelegentlich kann einer gegebenen Nukleotidsequenz eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins einverleibt werden. Solche Methylierungen haben jedoch keinerlei Einfluß auf die Kodierungsbeziehung.
Ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Strukturgen, das für ein Protein kodiert, welches eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz enthält, nämlich für ein mit dem GPIIb verwandtes Protein kodiert. Eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz ist eine Sequenz von wenigstens etwa 10 Resten, deren Sequenz mit einem Teil der in der Fig. 1 dargestellten Aminosäurenrestesequenz von etwa dem Rest 50 bis zu etwa dem Rest 227 homolog oder vorzugsweise identisch ist.
Ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung umfaßt eine DNA-Sequenz, welche für eine Aminosäurenrestesequenz kodiert, welche in der Fig. 1 von etwa dem Rest 50 bis zu etwa dem Rest 145 dargestellt ist. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist ein DNA-Segment vorgesehen, welches eine DNA-Sequenz enthält, welche für eine Aminosäurenrestesequenz kodiert, die in der Fig. 1 von etwa dem Rest 50 bis etwa zu dem Rest 227 dargestellt ist. Ebenfalls vorgesehen ist ein DNA-Segment, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Aminosäurenrestesequenz kodiert, die in der Fig. 1 von etwa dem Rest 146 bis zu etwa dem Rest 227 dargestellt ist. Vorzugsweise kodiert ein DNA-Segment dieser Erfindung für eine Aminosäurenrestesequenz, welche in der Fig. 1 von etwa dem Rest 1 bis zu etwa dem Rest 227 dargestellt ist. Vorzugsweise liegt die DNA-Sequenz als eine ununterbrochene, lineare weihe von Codons vor, wobei jedes Codon für einen Aminosäurerest kodiert, der in den oben beschriebenen Aminosäurenrestesequenzen vorgefunden wird, nämlich als eine DNA-Sequenz, welche keine Introns enthält.
Somit stellt ein DNA-Segment, welches im wesentlichen aus der Nukleotidsequenz besteht, die in der Fig. 1 von etwa der Base 148 bis zu etwa der Base 435 dargestellt ist, eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Ein DNA-Segment, welches im wesentlichen aus der Nukleotidsequenz besteht, die in der Fig. 1 von etwa der Base 148 bis zu etwa der Base 681 dargestellt ist, stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar. Vorzugsweise besteht ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung im wesentlichen aus der Nukleotidsequenz, welche in der Fig. 1 von etwa der Base 1 bis zu etwa der Base 1104 dargestellt ist.
Ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung, welches für eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz kodiert, kann leicht nach chemischen Verfahren synthetisiert werden, z. B. nach dem Phosphotriesterverfahren von Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc., 103 : 3185 (1981). Selbstverständlich können bei der chemischen Synthese der Kodierungssequenz irgendwelche gewünschten Modifikationen einfach dadurch angebracht werden, daß man die geeigneten Basen an die Stelle jener setzt, welche für die natürlich vorkommende Aminosäurenrestesequenz kodieren.
Es werden jedoch DNA-Moleküle bevorzugt, welche Sequenzen enthalten, die mit den in der Fig. 1 dargestellten genau homolog sind.
Weiterhin können DNA-Segmente, welche im wesentlichen aus Strukturgenen bestehen, welche für mit dem GPIIb verwandte Proteine kodieren, aus diese Gene enthaltenden, rekombinanten DNA- Molekülen erhalten werden. Beispielsweise enthält das rekombinante DNA-Molekül HEL-41 vom Plasmidtypus die in der Fig. 1 dargestellte DNA-Sequenz und kodiert somit für die in der Fig. 1 dargestellte Aminosäurenrestesequenz vom Rest 1 bis zu dem Rest 227. Eine mit dem HEL-41 transformierte Kultur von Escherichia coli (E. coli) ist gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrages am 7. Juli 1987 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer 67456 erhalten.
Ein DNA-Segment, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für eine mit dem GPIIb-verwandte Aminosäurenrestesequenz kodiert, kann unter Anwendung wohlbekannter Verfahren dadurch hergestellt werden, daß man die entsprechenden Restriktionsfragmente aus dem obigen, hinterlegten Plasmid funktionsfähig miteinander verknüpft (ligiert). Die auf diese Art und Weise erzeugten DNA- Moleküle der vorliegenden Erfindung haben typischerweise kohäsive Enden, nämlich "überhängende", einzelsträngige Teile, die sich über den doppelsträngigen Teil des Moleküls hinaus erstrecken. Das Vorhandensein von kohäsiven Enden auf den DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch die Ribonukleinsäure-(RNA)-Äquivalente der oben beschriebenen DNA-Segmente vorgesehen.

C. Rekombinante DNA-Moleküle

Ein rekombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung kann dadurch erzeugt werden, daß man einen Vektor mit einem DNA-Segment der vorliegenden Erfindung funktionsfähig verknüpft.
Der hierin verwendete Ausdruck "Vektor" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, welches einer autonomen Replikation in einer Zelle fähig ist, und an welches ein anderes DNA-Segment funktionsfähig derart ligiert werden kann, daß eine Replikation des an den Vektor gebundenen Segmentes zustandegebracht werden kann. Vektoren, welche befähigt sind, die Expression von Genen zu steuern, welche für Proteine kodieren, die mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenzen aufweisen, werden hierin als Expressionsvektoren" bezeichnet. Somit ist ein rekombinantes DNA-Molekül (rDNA) ein DNA-Hybridmolekül, welches wenigstens zwei Nukleotidsequenzen enthält, die normalerweise in der Natur nicht zusammen vorgefunden werden.
Die Auswahl des Vektors, an welchen ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung funktionsfähig gebunden ist, hängt - wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist - direkt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, z. B. von der Expression von Proteinen und von der zu transformierenden Wirtszelle; wobei es sich dabei um Beschränkungen handelt, die der Technik des Konstruierens von rekombinanten DNA-Molekülen innewohnen. Ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehener Vektor ist jedoch wenigstens befähigt die Replikation und vorzugsweise auch die Expression des Gens zu steuern, welches für ein Protein kodiert, das eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz aufweist, wobei dieses Gen in DNA-Segmenten enthalten ist, an welche er funktionsfähig gebunden ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält ein gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehener Vektor ein prokaryontisches Replikon, nämlich eine DNA-Sequenz, welche befähigt ist, in einer damit transformierten, prokaryontischen Wirtszelle, wie z. B. einer Bakterien-Wirtszelle, die autonome Replikation und die Erhaltung des rekombinanten DNA-Moleküls extrachromosomal zu steuern. Solche Replikons sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Außerdem enthalten jene Ausführungsformen, welche ein Prokaryonten-Replikon aufweisen, auch ein Gen, dessen Expression einem mit dem Gen transformierten, bakteriellen Wirt eine Arzneimittelresistenz verleiht. Typische bakterielle Arzneimittelresistenz-Gene sind jene, welche eine Resistenz gegenüber Ampicillin oder Tetracyclin verleihen.
Jene Vektoren, welche ein Prokaryonten-Replikon enthalten, können auch einen Prokaryonten-Promotor enthalten, welcher befähigt ist, die Expression (Transkription und Translation) des für eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz kodierenden Gens in einer damit transformierten, bakteriellen Wirtszelle, wie z. B. E. coli, zu steuern. Ein Promotor ist ein die Expression steuerndes Element, welches durch eine DNA-Sequenz gebildet wird, die das Binden von RNA-Polymerase und den Ablauf der Transkription ermöglicht. Promotorsequenzen, welche mit bakteriellen Wirten verträglich sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren zur Verfügung gestellt, welche passende Restriktionsstellen für das Einsetzen eines DNA-Segmentes der vorliegenden Erfindung enthalten. Typische Beispiele für solche Vektor-Plasmide sind die von den Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) erhältlichen pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329 und die von Pharmacia, Piscataway, NJ, erhältlichen pPL und pKK223.
Expressionsvektoren, welche mit Eukaryontenzellen verträglich sind, und zwar vorzugsweise jene, welche mit Wirbeltierzellen verträglich sind, können ebenfalls zur Bildung der rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Expressionsvektoren für Eukaryontenzellen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können aus verschiedenen kommerziellen Quellen bezogen werden. Typischerweise sind solche Vektoren vorgesehen, welche die passenden Restriktionsstellen für das Einsetzen des gewünschten DNA-Segmentes enthalten. Typische Beispiele für solche Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.) und pTDT1 (ATCC Nr. 31255).
Bei bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Expressionsvektoren für Eukaryontenzellen, welche für den Aufbau der rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einen Selektionsmarker, der in einer Eukaryontenzelle wirksam ist, und zwar vorzugsweise einen Arzneimittelresistenz- Selektionsmarker. Ein bevorzugter Arzneimittelresistenz-Marker ist das Gen, dessen Expression zu einer Neomycinresistenz führt, nämlich das Neomycin-Phosphotransferase-(neo)-Gen. Southern et al, J. Mol. Appl. Genet., 1 : 327-341 (1982).
Die Verwendung retroviraler Expressionsvektoren zur Ausbildung der rDNAs der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls vorgesehen. Der hierin verwendete Ausdruck "retroviraler Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, welches eine Promotorsequenz enthält, die aus der langen, endständigen Repeat- (LTR)-Region eines Retrovirus-Genoms stammt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor typischerweise ein retroviraler Expressionsvektor, der vorzugsweise in Eukaryontenzellen replikationsinkompetent ist. Der Aufbau und die Verwendung von retroviralen Vektoren ist von Sorge et al, Mol. Cell. Biol., 4 : 1730-37 (1984), beschrieben worden.
Eine Vielfalt von Methoden ist entwickelt worden, um die DNA über komplementäre kohäsive Enden funktionsfähig an Vektoren zu binden. Beispielsweise können zu dem einzusetzenden DNA- Segment und zu der Vektor-DNA komplementäre, homopolymere Stränge hinzugefügt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären, homopolymeren Schwänzen unter Bildung von rekombinanten DNA-Molekülen miteinander verbunden.
Synthetische Linker, welche eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, stellen eine alternative Methode zum Verbinden des DNA-Segmentes mit Vektoren dar. Das DNA-Segment, welches, wie vorstehend beschrieben, durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen entstanden ist, wird mit Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase oder E. coli-DNA-Polymerase I behandelt, nämlich mit Enzymen, welche 3'-überhängende, einzelsträngige Enden durch ihre 3'-5'-exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und die 3'-zurückgesetzten Enden mit ihren polymerisierenden Aktivitäten ausfüllen. Durch die Kombination dieser Aktivitäten entstehen daher DNA-Segmente mit stumpfen Enden. Die stumpfendigen Segmente werden dann mit einem großen molaren Überschuß an Linkermolekülen in Gegenwart eines Enzyms inkubiert, welches befähigt ist, die Ligation der stumpfendigen DNA-Moleküle zu katalysieren, wie z. B. der Bakteriophagen-T4-DNA-Ligase. Die Reaktionsprodukte sind daher DNA-Segmente, welche an ihren Enden polymere Linkersequenzen tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit dem entsprechenden Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor ligiert, der mit einem Enzym gespalten worden ist, welches Enden erzeugt, welche mit denen des DNA- Segmentes kompatibel sind.
Synthetische Linker, welche eine Vielfalt von Restriktionsendonukleasen-Stellen enthalten, sind im Handel von einer Anzahl von Quellen erhältlich, darunter von International Biotechnologies, Inc., New Haven, CN.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch RNA-Äquivalente der oben beschriebenen, rekombinanten DNA-Moleküle vorgesehen.

D. Transformierte Zellen und Kulturen

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bakterienzellen sind bevorzugte Prokaryonten-Wirtszellen und sind typischerweise ein E.coli-Stamm, wie z. B. der von den Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD, erhältliche E.coli-Stamm DH5. Bevorzugte Eukaryonten-Wirtszellen umfassen Hefe- und Säugetierzellen, vorzugsweise die Zellen von Wirbeltieren, wie z. B. jene aus einer Mäuse-, Ratten-, Affen- oder Human-Fibroblasten-Zellinie. Bevorzugte Eukaryonten-Wirtszellen umfassen Zellen aus dem Ovarium des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), welche von der ATCC als CCL61 erhältlich sind, und Zellen aus den Embryonen von Schweizer NIH-Mäusen, NIH/3T3, welche von der ATCC als CRL 1658 erhältlich sind.
Eine bevorzugte, transformierte Zellinie ist E. coli, welche das rekombinante DNA-Molekül HEL41 enthält, nämlich eine Kultur, welche am 7. Juli 1987 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, hinterlegt worden ist und die Hinterlegungsnummer 67456 erhalten hat.
Das Transformieren der entsprechenden Wirtszellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung geschieht nach wohlbekannten Verfahren, welche typischerweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Hinsichtlich der Transformation von Prokaryonten-Wirtszellen, siehe z. B. Cohen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972); und Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Hinsichtlich der Transformation von Wirbeltierzellen mit rDNAs enthaltenden, retroviralen Vektoren, siehe z. B. Sorge et al, Mol. Cell. Biol., 4 : 1730-37 (1984); Graham et al, Virol., 52 : 456 (1973); und Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : 1373-76 (1979).
Erfolgreich transformierte Zellen, nämlich jene Zellen, welche ein rekombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung enthalten, können nach wohlbekannten Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, welche durch Einführen einer rDNA der vorliegenden Erfindung entstanden sind, zur Erzeugung monoklonaler Kolonien kloniert werden. Die Zellen aus diesen Kolonien können geerntet und lysiert werden, und ihr DNA-Gehalt kann auf das Vorliegen der rDNA unter Anwendung eines Verfahrens, wie z. B. des von Southern, J. Mol. Biol., 98 : 503 (1975) oder von Berent et al, Biotech., 3 : 208 (1985), beschriebenen, geprüft werden.
Zusätzlich zu dem direkten Prüfen auf das Vorliegen der rDNA kann eine erfolgreiche Transformation durch wohlbekannte, immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA befähigt ist, die Expression eines mit dem GPIIb verwandten Proteins zu steuern. Beispielsweise erzeugen Zellen, welche erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, Proteine, welche GPIIb-Antigenität zeigen. Proben von Zellen, von denen vermutet wird, daß sie transformiert worden sind, werden geerntet und auf das mit dem GPIIb verwandte Protein unter Verwendung von für diese Antigene spezifischen Antikörpern geprüft, wie z. B. von jenen, welche durch ein Hybridom der vorliegenden Erfindung erzeugt worden sind.
Somit ist gemäß der vorliegenden Erfindung auch -zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen als solchen - eine Kultur dieser Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur, oder eine Kultur, welche aus einer monoklonalen Kultur abgeleitet ist, in einem Nährmedium vorgesehen. Vorzugsweise enthält die Kultur auch ein Protein, welches GPIIb-Antigenität zeigt.
Nährmedien, welche zum Kultivieren der transformierten Wirtszellen verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können aus mehreren kommerziellen Quellen bezogen werden. Bei Ausführungsformen, bei welchen die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, wird vorzugsweise ein "serumfreies" Medium verwendet.

E. Verfahren zur Erzeugung der mit dem GPIIb verwandten Proteine

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Proteinen, welche GPIIb-Antigenität zeigen. Proteine, welche GPIIb-Antigenität zeigen, sind Proteine, welche mit Antikörpern immunreagieren, welche ihrerseits durch natürlich vorkommendes GPIIb induziert worden sind. Proteine, welche GPIIb-Antigenität zeigen, sind als Antigene und zum Aufziehen von Antikörpern brauchbar, von denen ein jedes bzw. ein jeder in den diagnostischen Systemen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das vorliegende Verfahren erfordert das Initiieren einer Kultur, welche ein Nährmedium umfaßt, das Wirtszellen, vorzugsweise Humanzellen, enthält, welche mit einem rekombinanten DNA- Molekül der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind, das zur Expression eines Gens befähigt ist, welches für eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz kodiert. Die Kultur wird während einer Zeitspanne aufrechterhalten, welche dafür ausreicht, daß die transformierten Zellen ein Protein exprimieren, welches eine mit dem GPIIb verwandte Aminosäurenrestesequenz enthält. Das exprimierte Protein wird dann aus der Kultur rückgewonnen.
Verfahren zum Rückgewinnen eines exprimierten Proteins aus einer Kultur sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen das Fraktionieren des proteinhältigen Teiles der Kultur unter Anwendung wohlbekannter, biochemischer Techniken. Beispielsweise können die Verfahren der Gelfiltration, der Gelchromatographie, der Ultrafiltration, der Elektrophorese, des Ionenaustausches, der Affinitätschromatographie und dgl., wie dieselben für Proteinfraktionierungen bekannt sind, angewendet werden, um die in der Kultur vorgefundenen, exprimierten Proteine zu isolieren. Zusätzlich können immunchemische Verfahren, wie z. B. die Immunaffinität, die Immunadsorption und dgl. mehr, unter Anwendung wohlbekannter Methoden durchgeführt werden.

F. Die Polypeptide

Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält nicht mehr als etwa 50, meistens weniger als etwa 35, und vorzugsweise weniger als etwa 25 Aminosäurenreste, und es enthält wenigstens etwa 10 Reste. Außerdem ist ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch seine Aminosäurenrestesequenz und durch seine neuen, funktionellen Eigenschaften gekennzeichnet.

1. Polypeptid-Analoga zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante

Allgemein gesprochen ist gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid vorgesehen, welches eine Aminosäurenrestesequenz enthält, welche befähigt ist, eine kryptische antigene Determinante nachzuahmen, welche von der Schweren Kette der alpha-Untereinheit eines RDG-bindenden Zytoadhäsionsproteins exprimiert wird. Die Aminosäurenrestesequenz des Polypeptid-Analogons zu der kryptischen Determinante entspricht der Sequenz von etwa 15 Aminosäurenresten am Carboxy-Ende der Schweren Kette der alpha-Untereinheit des Zytoadhäsins.
Ein bevorzugtes Polypeptid-Analogon zu der kryptischen Determinante der Schweren Kette der alpha-Untereinheit des Zytoadhäsins ist befähigt, eine kryptische hGPIIb-Determinante nachzuahmen, welche dann gebildet wird, wenn das hGPIIb Fibrinogen bindet. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante wenigstens die folgende Aminosäurenrestesequenz:
-PAHHKRDRRQ-,
welche die in der Fig. 1 gezeigten Aminosäurenreste 137 bis 145 darstellt.
In höherem Maße bevorzugt enthält ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante wenigstens die folgende Aminosäurenrestesequenz:
-PSPSPIHPAHHKRDRRQ-,
welche die in der Fig. 1 gezeigten Aminosäurenreste 129 bis 145 darstellt.
Bevorzugte Analoga zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante umfassen jene, deren Aminosäurenrestesequenzen in der Tabelle 1 dargestellt sind.

Tabelle 1

Bezeichnung a) Aminosäurenrestesequenz
p136-145 PAHHKRDRRQ
p133-145 PIHPAHHKRDRRQ
p131-145 PSPIHPAHHKRDRRQ
p129-145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ.
a) Die Bezeichnung jedes Polypeptides stellt die jeweils enthaltene, in der Fig. 1 gezeigte Aminosäurenrestesequenz dar.
Die in der Tabelle 1 dargestellten Polypeptide sind weiterhin durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, das Binden der nachstehend beschriebenen PMI-1-Antikörper-Moleküle mit dem hGPIIb zu neutralisieren (kompetitiv zu hemmen), wenn das hGPIIb als ein GPIIb-IIIa/Fibrinogen-Komplex vorliegt.
Das hierin verwendete Wort "Komplex" bezieht sich auf das Produkt einer spezifischen Bindungsreaktion, wie z. B. einer Antikörper-Antigen- oder Rezeptor-Liganden-Reaktion. Beispielhafte Komplexe sind Immunreaktionsprodukte, GPIIb-IIIa-Fibrinogen-Bindungsreaktionsprodukte, und Zytoadhäsin-Liganden-Bindungsreaktionsprodukte.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen ist das Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante weiterhin durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, die Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen kompetitiv zu hemmen. Ein beispielhaftes Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante, welches zur Hemmung der Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen befähigt ist, ist das Polypeptid p129-145.
Bemerkt sei, daß ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante gemäß der vorliegenden Erfindung nicht identisch mit der Aminosäurenrestesequenz des hGPIIb sein muß, vorausgesetzt, daß dieses Analogon befähigt ist, die Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen kompetitiv zu hemmen und/oder befähigt ist, das Binden der nachstehend beschriebenen PMI-1-Antikörpermoleküle an das hGPIIb kompetitiv zu hemmen, wenn das hGPIIb als ein GPIIb-IIIa/Fibrinogen-Komplex vorliegt. Daher kann ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante verschiedenen Veränderungen, wie z. B. Insertionen, Deletionen und Substitutionen, nämlich entweder konservativen oder nicht-konservativen Substitutionen, unterworfen werden, wenn solche Veränderungen gewisse Vorteile bei der Verwendung der Analoga mit sich bringen.
Konservative Substitutionen sind jene, wobei ein Aminosäurerest durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest ersetzt wird. Beispiele konservativer Substitutionen umfassen den Ersatz von einem hydrophoben Rest, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen, oder den Ersatz von einem polaren Rest durch einen anderen, wie z. B. einen Austausch zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und Asparaginsäure, oder zwischen Glutamin und Asparagin, und dgl. mehr. Der Ausdruck "konservative Substitution" umfaßt auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten Stamm-Aminosäure, vorausgesetzt, daß ein solches Polypeptid auch die erforderliche Bindungsaktivität zeigt.
Hat ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Sequenz, welche mit der Sequenz des hGPIIb nicht identisch ist, weil eine oder mehrere konservative oder nicht-konservative Substitutionen durchgeführt worden sind, dann werden gewöhnlich nicht mehr als etwa 20%, und meistens nicht mehr als 10% der Aminosäurenreste ausgetauscht, ausgenommen solche Fälle, wo zusätzliche Reste an dem einen oder an dem anderen der beiden Enden zu dem Zwecke der Schaffung eines "Linkers" hinzugefügt worden sind, mit welchem die Polypeptide dieser Erfindung bequemerweise an ein Label oder an eine feste Matrix oder an einen antigenen Träger gebunden werden können. Labels, feste Matrizes und Träger, welche mit den Polypeptiden dieser Erfindung verwendet werden können, sind nachstehend beschrieben.
Linker aus Aminosäurenresten bestehen gewöhnlich aus wenigstens einem Rest, sie können 40 oder mehr Reste umfassen, aber meistens umfassen sie 1 bis 10 Reste. Typische Aminosäurenreste, welche zum Verknüpfen verwendet werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- und Asparaginsäure oder dgl. mehr. Außerdem kann sich eine Polypeptidsequenz dieser Erfindung von der natürlichen Sequenz dadurch unterscheiden, daß die Sequenz durch eine Acylierung der endständigen NH-Gruppe modifiziert worden ist, z. B. durch eine Acetylierung, oder durch eine Thioglykolsäure-Amidierung, durch eine Amidierung der endständigen Carboxylgruppe z. B. durch Ammoniak, Methylamin usw., modifiziert worden ist.
Wird ein erfindungsgemäßes Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante an einen Träger über einen Linker gekuppelt, um eine Substanz zu bilden, welche auf dem Fachgebiet als ein Träger-Hapten-Konjugat bekannt ist, dann ist dieses erfindungsgemäße Analogon befähigt, Antikörper zu induzieren, welche fit dem hGPIIb immunreagieren, wenn dasselbe als ein Komplex aus mit Plättchen assoziiertem GPIIb-IIIa und Fibrinogen vorliegt. Im Hinblick auf das wohlbegründete Prinzip einer immunologischen Kreuzreaktivität sind gemäß der vorliegenden Erfindung daher antigenisch verwandte Varianten des Polypeptides p129-149 vorgesehen. Eine "antigenisch verwandte Variante" ist ein Polypeptid, welches einen Sequenzteil des Polypeptides p129-145 enthält, der wenigstens sechs Aminosäurenreste umfaßt, und welches befähigt ist, Antikörpermoleküle zu induzieren, weiche mit dem Polypeptid p129-145 und hGPIIb immunreagieren, wenn das hGPIIb als ein Komplex aus mit Plättchen assoziiertem GPIIb-IIIa und Fibrinogen vorliegt.

2. Die lGPIIb-Polypeptide

Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein lGPIIb-Polypeptid vorgesehen, welches wenigstens die folgende Aminosäurenrestesequenz enthält:
-RQIFLPEPEQPSR-,
welche die in der Fig. 1 gezeigten Aminosäurenreste 144-156 darstellt.
Ein lGPIIb-Polypeptid ist weiterhin durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, Antikörpermoleküle zu induzieren, welche mit lGPIIb immunreagieren, welche aber mit hGPIIb nicht immunreagieren. Ein mit p144-156 bezeichnetes, bevorzugtes lGPIIb-Polypeptid hat eine durch die Formel:
RQIFLPEPEQPSR
dargestellte Aminosäurenrestesequenz.
Sowohl ein hGPIIb-Polypeptid als auch ein lGPIIb-Polypeptid der vorliegenden Erfindung können nach irgendwelchen Techniken synthetisiert werden, welche den Fachleuten auf dem Polypeptid-Gebiet bekannt sind. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der zahlreichen, zur Verfügung stehenden Techniken findet sich in J. M. Steward und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983, für die Festphasen-Peptidsynthese; und in E. Schroder und K. Kubke, "The Peptides", Bd. 1, Academic Press (New York), 1965, für die klassische Synthese in Lösung.

G. Impfstoffe

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Polypeptid dieser Erfindung oder eine antigenisch verwandte Variante hievon in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, wässerigen Verdünnungsmittel zur Bildung eines Impfstoffes verwendet, welcher, wenn er in einer wirksamen Menge verabreicht wird, befähigt ist, Antikörper zu induzieren, welche mit dem hGPIIb immunreagieren.
Das Wort "Impfstoff" wird hierin in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, welche als Wirkstoff ein Polypeptid dieser Erfindung enthält, das für die Herstellung von Antikörpern gegen die Schwere oder Leichte Kette des GPIIb verwendet wird.
Wird ein Polypeptid zum Induzieren von Antikörpern verwendet, dann versteht es sich von selbst, daß das Polypeptid allein, oder an einen Träger gebunden, als Konjugat, oder als ein Polypeptidpolymer verwendet werden kann, doch werden die verschiedenen Ausführungsformen der Polypeptide dieser Erfindung hierin insgesamt wegen der einfacheren Ausdrucksweise mit dem Ausdruck "Polypepdid" und dessen verschiedenen grammatikalischen Formen bezeichnet.
Für ein Polypeptid, das weniger als etwa 35 Aminosäurenreste enthält, ist es vorzuziehen, zum Zwecke des Induzierens der Produktion von bereits erwähnten Antikörpern das Peptid an einen Träger gebunden zu verwenden.
Wie bereits erwähnt worden ist, können ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurenreste an das Amino-Ende oder Carboxy-Ende des Polypeptides angehängt werden, um das Binden des Polypeptides an einen Träger zu unterstützen. Es hat sich erwiesen, daß an das Amino- oder Carboxy-Ende des Polypeptides angehängte Cysteinreste zur Bildung von Konjugaten über Disulfidbindungen besonders nützlich sind. Es können jedoch auch andere auf dem Fachgebiet wohlbekannte Verfahren zur Herstellung von Konjugaten angewendet werden. Beispielhafte zusätzliche Verfahrensweisen des Verknüpfens umfassen die Verwendung von Michael-Additionsreaktionsprodukten, von Dialdehyden, wie z. B. Glutaraldehyd; siehe Klipstein et al, J. Infect. Dis., 147, 318-326 (1983), und dgl.; oder die Anwendung der Carbodiimidtechnologie, wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimides zur Bildung von Amidbindungen mit dem Träger. Für einen Bericht über das Konjugieren oder Kuppeln von Proteinen durch aktivierte, funktionelle Gruppen, siehe Aurameas et al, Scand. J. Immunol., Bd. 8, Beil.-1.7, 7-23 (1978).
Nützliche Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind im allgemeinen selbst Proteine. Beispiele solcher Träger sind "Keyhole Limpet"-Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine, wie z. B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Humanserumalbumin (HSA), rote Blutzellen, wie z. B. Schaf-Erythrozyten (SRBC), Tetanus-Toxoid, Cholera-Toxoid sowie Polyaminosäuren, wie z. B. Poly(-D-Lysin: D-Glutaminsäure) und dgl. mehr.
Die Wahl des Trägers hängt in höherem Maße von der letztendlichen Verwendung des Impfstoffes ab und basiert auf Kriterien, die mit der vorliegenden Erfindung kaum etwas zu tun haben. Beispielsweise sollte ein Träger ausgewählt werden, der in dem besonderen zu impfenden Tier keine ungünstige Reaktion hervorruft.
Der vorliegende Impfstoff enthält eine wirksame, immunogene Menge eines Polypeptides dieser Erfindung, und zwar typischerweise als ein an einen Träger gebundenes Konjugat. Die wirksame Menge des Polypeptides oder Proteins pro Einheitsdosis hängt unter anderem von der Spezies des zu impfenden Tieres, dem Körpergewicht des Tieres und dem gewählten Impfschema ab, wie dies auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist. Die Impfstoffe enthalten typischerweise Polypeptid- oder Proteinkonzentrationen von etwa 10 µg bis etwa 500 mg pro Impfung (Dosis), vorzugsweise etwa 50 µg bis etwa 50 mg pro Dosis.
Der Ausdruck "Einheitsdosis" bezieht sich, im Zusammenhang mit den Impfstoffen der vorliegenden Erfindung, auf physikalisch gesonderte Einheiten, welche als Einheitsdosierungen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des wirksamen Materials enthält, welche so berechnet ist, daß sie die gewünschte immunogene Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, nämlich dem Träger oder Vehikel, erbringt. Die Einzelvorschriften für die neue Einheitsdosis eines Impfstoffes dieser Erfindung werden diktiert durch und sind unmittelbar abhängig von (a) den einzigartigen Kennmerkmalen des wirksamen Materials und der besonderen, zu erzielenden immunologischen Wirkung; und (b) den Beschränkungen, die auf dem betreffenden Fachgebiet hinsichtlich des Zusammensetzens solcher wirksamer Materialien für den immunologischen Gebrauch in Tieren gelten, wobei eine solche immunologische Verwendung hierin im einzelnen beschrieben ist, und wobei es sich um Merkmale der vorliegenden Erfindung handelt.
Die Impfstoffe werden typischerweise aus dem getrockneten, festen Polypeptid-Konjugat durch Dispergieren des Polypeptid- Konjugates in einem physiologisch tolerierbaren (annehmbaren) Verdünnungsmittel oder Vehikel, wie z. B. Wasser, Kochsalzlösung oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung, zur Bildung einer wässerigen Zusammensetzung, hergestellt. Solche Verdünnungsmittel sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) , auf den Seiten 1465-1467 erörtert.
Die Impfstoffe können auch als Teil des Verdünnungsmittels ein Adjuvans enthalten. Adjuvanzien, wie z. B. vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA), unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA) und Alaun, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannte Materialien und sind im Handel aus mehreren Quellen erhältlich.

H. Antikörper und Antikörperzusammensetzungen

1. Antikörperzusammensetzungen

Der Ausdruck "Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hierin verwendet, um Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, nämlich Moleküle, welche eine Antikörper-Bindungsstelle oder ein Paratop enthalten, zu bezeichnen. Beispiele von Antikörpermolekülen sind intakte Immunglobulinmoleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und jene Teile eines Immunglobulinmoleküls, welche das Paratop enthalten, einschließlich jener Teile, die auf dem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab') und F(v) bekannt sind.
Eine "Antikörper-Bindungsstelle" ist jener strukturelle Teil eines Antikörpermoleküls, der aus den variablen und hypervariablen Regionen der Schweren und Leichten Ketten besteht und der ein Antigen spezifisch bindet (mit demselben immunreagiert). Der Ausdruck "immunreagiert" in seinen verschiedenen Formen bedeutet das Binden zwischen einem eine antigene Determinante enthaltenden Molekül und einem eine Antikörper-Bindungsstelle enthaltenden Molekül, wie z. B. einem ganzen Antikörpermolekül oder einem Teil desselben.
Der Ausdruck "antigene Determinante" bezieht sich auf den tatsächlichen Strukturteil des Antigens, der durch eine Antikörper-Bindungsstelle immunologisch gebunden wird. Der Ausdruck wird auch als durch "Epitop" austauschbar verwendet.
Eine Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörpermoleküle enthält, welche mit a) hGPIIb oder lGPIIb, und b) wenigstens einem spezifischen Polypeptid dieser Erfindung immunreagieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält eine Antikörperzusammensetzung dieser Erfindung mehr als eine Spezies von Paratop, welches befähigt ist, mit dem GPIIb immunzureagieren.
Beispielsweise ist eine Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welche Antikörpermoleküle enthält, welche mit Komplexen aus mit Plättchen assoziiertem GPIIb- IIIa/Fibrinogen und mit einem Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante immunreagieren, aber mit dem Polypeptid p53-64, dessen Aminosäurenrestesequenz in der Tabelle 2 dargestellt ist, im wesentlichen nicht immunreagieren, befähigt, an Fibrinogen gebundene Plättchen von Plättchen, welche kein Fibrinogen gebunden haben, zu unterscheiden. Die bevorzugten Antikörperzusammensetzungen sind daher jene, welche Antikörpermoleküle enthalten, welche a) mit hGPIIb, wenn dieses hGPIIb als ein Komplex aus mit den Plättchen assoziiertem GpIIb-IIIa/Fibrinogen vorliegt, und b) mit dem Polypeptid p129- 145 immunreagieren, und welche im wesentlichen von einer Immunreaktion mit dem Polypeptid p53-64 frei sind.
Eine Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird typischerweise durch Immunisieren eines Säugetieres mit einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung erzeugt, wodurch in dem Säugetier Antikörpermoleküle induziert werden, welche die richtige Polypeptid-Immunspezifität aufweisen. Die Antikörpermoleküle werden dann aus dem Säugetier gesammelt und nach wohlbekannten Techniken, wie z. B. durch Immunaffinitätschromatographie, im gewünschten Ausmaß isoliert. Die so erzeugte Antikörperzusammensetzung kann unter anderem in den diagnostischen Verfahren und Systemen der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von an Fibrinogen gebundenen Plättchen in einer Körperprobe verwendet werden.

2. Monoklonale Antikörperzusammensetzung

Eine monoklonale Anti-LIBS-Antikörperzusammensetzung ist gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorgesehen. Der Ausdruck "monoklonale Antikörperzusammensetzung" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, welche nur eine Spezies von Antikörper-Bindungsstellen enthalten, welche befähigt ist, mit einem besonderen Antigen in Immunreaktion zu treten. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung zeigt somit typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für jedes Antigen, mit welchem sie immunreagiert. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung kann daher ein Antikörpermolekül enthalten, welches eine Mehrzahl von Antikörper-Bindungsstellen aufweist, von denen eine jede für ein anderes Antigen immunspezifisch ist, z. B. einen dispezifischen monoklonalen Antikörper enthalten.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung ist typischerweise aus Antikörpern zusammengesetzt, welche von Klonen einer einzelnen, ein Hybridom genannten Zelle erzeugt worden sind, wobei dieses Hybridom nur eine einzige Art von Antikörpermolekülen sezerniert (produziert). Die Hybridomzelle wird durch Fusionieren einer Antikörper-erzeugenden Zelle und einer Myelomzelle oder einer anderen sich immerwährend fortsetzenden Zellinie ausgebildet. Solche Antikörper wurden erstmals von Köhler und Milstein, Nature, 256 : 495-497 (1975), beschrieben, welche Beschreibung durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird.
Gemäß einer Ausführungsform ist eine monoklonale Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörpermoleküle enthält, welche mit einer LIBS immunreagieren, die durch einen Zelloberflächenrezeptor- Liganden-Komplex, vorzugsweise durch eine kryptische antigene Determinante des Rezeptors in dem Komplex, exprimiert worden ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform enthält eine monoklonale Antikörperzusammensetzung Antikörpermoleküle, welche mit hGPIIb und einem Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante, vorzugsweise dem p129-145, immunreagieren. Die in diesen Zusammensetzungen enthaltenen Antikörpermoleküle immunreagieren mit dem hGPIIb an der funktionellen GPIIb-Stelle oder in deren Nähe, sie hemmen aber nicht das Binden von Fibrinogen durch das mit den Plättchen assoziierte GPIIb-IIIa, und sie können mit dem mit den Plättchen assoziierten GPIIb-IIIa immunologisch reagieren, wenn dasselbe gebundenes Fibrinogen aufweist. Eine bevorzugte monoklonale Antikörperzusammensetzung dieses Typus enthält Antikörpermoleküle, welche von dem Hybridom PMI-1 (ATCC HB 9476) erzeugt werden können, nämlich PMI-1- Antikörpermoleküle.

3. Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörperzusammensetzungen

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers vorgesehen, welcher (a) mit einer durch einen Liganden induzierten Bindungsstelle (LIBS) immunreagiert, welche ihrerseits durch einen Zelloberflächenrezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, und (b) weder mit dem nicht-besetzten Rezeptor noch mit dem nicht-gebundenen Liganden des Rezeptor-Liganden-Komplexes immunreagiert. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:
(a) Immunisieren eines Tieres mit einem Zelloberflächenrezeptor-Komplex oder mit einem Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante. Dies wird typischerweise dadurch bewirkt, daß man eine immunologisch wirksame Menge, nämlich eine Menge, welche zur Erzeugung einer Immunantwort ausreicht, des Immunogens an ein immunologisch kompetentes Säugetier verabreicht. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Nagetier, wie z. B. ein Kaninchen, eine Ratte oder eine Maus. Das Säugetier wird dann während einer Zeitspanne gehalten, welche dafür ausreicht, daß das Säugetier Zellen produziert, welche Antikörpermoleküle sezernieren, welche mit dem Rezeptor- Liganden-Komplex immunreagieren.
(b) Dann wird eine Suspension von Antikörper-erzeugenden Zellen, die aus dem immunisierten Säugetier entfernt worden sind, hergestellt. Dies wird typischerweise dadurch bewirkt, daß man die Milz aus dem Säugetier entfernt und die einzelnen Milzzellen in einem physiologisch tolerierbaren Medium unter Anwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Methoden mechanisch trennt.
(c) Die suspendierten, Antikörper-erzeugenden Zellen werden mit einem transformierenden Mittel behandelt, welches zur Erzeugung einer transformierten ("unsterblich gemachten") Zellinie befähigt ist. Transformierende Mittel und deren Verwendung zur Erzeugung von unsterblich gemachten Zellinien sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen DNA-Viren, wie z. B. das Epstein-Bar-Virus (EBV), das Affen-"Simian"-Virus 40 (SV40) das Polyomavirus und dgl., RNA-Viren, wie z. B. das Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (MoMuLV), das Rous-Sarkom-Virus und dgl., Myelomzellen, wie z. B. P3X63-Ag8.653, Sp2/O-Ag14 und dgl.
Bei bevorzugten Ausführungsformen führt die Behandlung mit dem transformierenden Mittel zur Erzeugung eines Hybridoms durch Fusionieren der suspendierten Milzzellen mit Mäuse-Myelomzellen aus einer geeigneten Zellinie durch die Verwendung eines geeigneten Fusionspromotors. Das bevorzugte Verhältnis beträgt etwa 5 Milzzellen pro Myelomzelle in einer Suspension, welche etwa 10&sup8; Splenozyten enthält.
Die verwendete Zellinie sollte vorzugsweise vom sogenannten "arzneimittelresistenten" Typus sein, so daß nicht-fusionierte Myelomzellen in einem selektiven Medium nicht überleben, während Hybridzellen darin überleben. Die gebräuchlichste Klasse sind 8-Azaguanin-resistente Zellinien, denen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase fehlt, und welche daher von einem HAT- Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) -Medium nicht erhalten werden. Es wird im allgemeinen auch bevorzugt, daß die verwendete Myelom-Zellinie vom sogenannten "nicht-sezernierenden" Typus ist, insofern, als sie selbst keinerlei Antikörper produziert, obgleich sezernierende Typen verwendet werden können. In gewissen Fällen können jedoch sezernierende Myelom-Zellinien bevorzugt werden. Obgleich der bevorzugte Fusionspromotor Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 4000 ist (das im Handel als PEG 1000 usw. erhältlich ist), können auch andere auf dem Fachgebiet bekannte Fusionspromotoren verwendet werden.
(d) Die transformierten Zellen werden dann kloniert, und zwar vorzugsweise auf Monoklonalität. Das Klonieren wird zugsweise in einem Gewebekulturmedium durchgeführt, in welchem nicht-transformierte Zellen nicht wachsen können. Sind die transformierten Zellen Hybridomen, dann wird dies typischerweise durch Verdünnen und Kultivieren des Gemisches aus nicht-fusionierten Milzzellen, nicht-fusionierten Myelomzellen und fusionierten Zellen (Hybridomen) in getrennten Behältern und in einem selektiven Medium, in welchem die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht wachsen können, während einer Zeitspanne, die das Absterben der nicht-fusionierten Zellen ermöglicht (während etwa einer Woche) durchgeführt. Die Verdünnung kann eine Art von beschränkender Verdünnung sein, wobei das Volumen des Verdünnungsmittels statistisch dahingehend berechnet wird, daß eine gewisse Anzahl von Zellen (z. B. 1 bis 4) in jedem getrennten Behälter (z. B. in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte) isoliert werden. Das Medium ist ein solches (z. B. ein HAT-Medium), in welchem die arzneimittelresistenten (z. B. 8-Azaguanin-resistenten), nicht-fusionierten Myelomzellen nicht wachsen können.
(e) Das Gewebekulturmedium der klonierten Transformanden wird unter Anwendung wohlbekannter immunologischer Techniken auf das Vorliegen von sezernierten Anti-LIBS-Antikörpermolekülen geprüft.
(f) Sobald in der Stufe (e) ein gewünschter Transformand identifiziert worden ist, wird er ausgewählt und in einem geeigneten Gewebekulturmedium während einer geeigneten Zeitspanne gezüchtet, wonach der gewünschte Antikörper aus dem Kulturüberstand rückgewonnen wird. Das geeignete Medium und die geeignete Zeitdauer des Kultivierens sind entweder bekannt oder lassen sich leicht feststellen.
Zur Erzeugung einer viel höheren Konzentration eines geringfügig weniger reinen, monoklonalen Antikörpers können Mäuse, vorzugsweise syngene oder semisyngene Mäuse, mit dem gewünschten Hybridom geimpft werden. Das Hybridom wird nach einer geeigneten Inkubationszeit die Ausbildung von Antikörper-produzierenden Tumoren verursachen, was zu einer hohen Konzentration an dem gewünschten Antikörper (etwa 5 bis 20 mg/ml) im Blutstrom und im peritonäalen Exsudat (im Aszites) der Wirtsmaus führen wird.
Medien, die zur Herstellung dieser Zusammensetzungen brauchbar sind, sind sowohl auf dem Fachgebiet wohlbekannt als auch im Handel erhältlich, und sie umfassen synthetische Kulturmedien, durch Inzucht erzeugte Mäuse und dgl. mehr. Ein beispielhaftes, synthetisches Medium ist "Dulbecco's Minimal Essential Medium" [DMEM; Dulbecco et al, Virol., 8 : 396 (1959)], das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mg Glutamin und 20% Fetalkälberserum ergänzt worden ist. Ein beispielhafter Inzucht-Mäusestamm ist Balb/c.
Die nach dem obigen Verfahren erzeugten monoklonalen Antikörperzusammensetzungen können z. B. in diagnostischen und therapeutischen Modalitäten eingesetzt werden, bei welchen die Ausbildung eines LIBS-enthaltenden Immunreaktionsproduktes erwünscht ist. Beispielhafte Reaktionsprodukte umfassen ein GPIIb- oder GPIIIa-enthaltendes Immunreaktionsprodukt.

I. Hybridomen und Herstellungsverfahren

Die Hybridomen der vorliegenden Erfindung sind jene, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Fähigkeit besitzen, eine monoklonale Anti-LIBS-Antikörperzusammensetzung zu erzeugen.
Ein bevorzugtes Hybridom der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet daß es Antikörpermoleküle erzeugt, die mit einer kryptischen antigenen Determinante eines Zelloberflächenrezeptors immunreagieren.
Verfahren zur Erzeugung von Hybridomen, welche Antikörpermoleküle mit einer gewünschten Immunspezifität produzieren (sezernieren), nämlich Antikörpermoleküle, welche die Fähigkeit aufweisen, mit einem speziellen Protein, einem identifizierbaren Epitop auf einem speziellen Protein und/oder einem Polypeptid eine Immunreaktion einzugehen, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Besonders gut anwendbar ist die von Niman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 4949-4953 (1983), und von Galfre et al, Meth. Enzymol., 73 : 3-46 (1981), beschriebene Hybridomentechnologie, welche Beschreibungen durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden.
Die Hybridomenkultur PMI-1 ist gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrages am 7. Juli 1987 bei der American Type Tissue Collection (ATCC), Rockville, MD 20852, USA, hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer HB 9476 erhalten. Die Hybridomenkultur PMI-2 wurde in ähnlicher Weise am 22. Dezember 1987 bei dem ATCC hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer HB 9615 erhalten.

J. Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen

Ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Modulieren der Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen in vivo verwendet werden.
Beispielsweise kann ein Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante in einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung verwendet werden, welche, nachdem sie in einer wirksamen Menge an ein Human-Subjekt verabreicht worden ist, zur kompetitiven Hemmung der Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen befähigt ist. Es wird angenommen, daß diese Hemmung zu einer verringerten Rate einer Thrombusbildung führt. So kann die in-vivo-Verabreichung eines Polypeptid-Analogons zu einer kryptischen hPGIIb-Determinante zum Modulieren irgendeiner physiologischen Antwort verwendet werden, die durch eine Plättchenaggregation ausgelöst wird, wie z. B. der Gerinnung und von irgendwelchen entzündlichen Antworten.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen durch die intravenöse Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung gehemmt werden, welche im wesentlichen aus Antikörpermolekülen besteht welche mit einem Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante vorzugsweise dem p129-145, immunreagieren. Vorzugsweise liegen die Antikörpermoleküle als monoklonale Antikörperzusammensetzung vor und sind in höherem Maße bevorzugt jene, welche von dem Hybridom PMI-1 erzeugt worden sind.
Die verabreichten das Polypeptid oder die Antikörpermoleküle enthaltenden Zusammensetzungen haben die Form von Lösungen oder Suspensionen, wobei jedoch Polypeptide auch in der Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder von Pulvern vorliegen können. In jedem Fall enthalten die Zusammensetzungen typischerweise etwa 0,1 µM bis etwa 1,0 M, vorzugsweise etwa 1,0 µM bis etwa 10 mM, des Wirkstoffes.
Die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, welche Polypeptide oder Antikörpermoleküle als Wirkstoffe enthält, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare Zusammensetzungen, und zwar entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, hergestellt; es können jedoch auch feste Formen hergestellt werden, welche zum Auflösen oder Suspendieren in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind. Das Präparat kann auch emulgiert sein. Der therapeutische Wirkstoff wird oft mit Arzneistoffträgern vermischt, welche pharmazeutisch annehmbar und mit dem Wirkstoff verträglich sind, und welche wohlbekannt sind. Geeignete Arzneistoffträger sind z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dgl. und Kombinationen hievon. Außerdem kann die Zusammensetzung gewünschtenfalls kleine Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie z. B. an Netz- oder Emulgiermitteln, oder an den pH-Wert puffernden Mitteln, welche die Wirksamkeit des Wirkstoffes erhöhen.
Eine Polypeptidzusammensetzung oder eine Zusammensetzung von Antikörpermolekülen können als neutralisierte, pharmazeutisch annehmbare Salzformen zu der therapeutischen Zusammensetzung formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen die Säureadditionssalze (welche mit den freien Aminogruppen des Polypeptides oder Antikörpermoleküls gebildet werden), welche mit anorganischen Spuren, wie z. B. mit Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure, oder mit solchen organischen Säuren, wie z. B. Essig-, Wein-, Mandelsäure und dgl., gebildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch aus anorganischen Basen stammen, wie z. B. von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Ferrihydroxid, oder von solchen organischen Basen, wie z. B. Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Prokain und dgl., abgeleitet sein.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, welche Polypeptide oder Antikörpermoleküle enthalten, werden herkömmlicherweise intravenös verabreicht, wie etwa durch Injizieren von z. B. einer Einheitsdosis. Der Ausdruck "Einheitsdosis" bezieht sich im Zusammenhang mit einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf physikalisch gesonderte Einheiten, welche als Einheitsdosierungen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Aktivmaterial enthält, welche so berechnet ist, daß sie in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, nämlich dem Träger oder Vehikel, die gewünschte therapeutische Wirkung hervorbringt.
Die Zusammensetzungen werden auf eine Art und Weise verabreicht, welche mit der Dosisformulierung vereinbar ist, und sie werden in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt, dem Vermögen des Subjektes, den Wirkstoffauszunützen, sowie von dem gewünschten Grad der Hemmung des Rezeptor-Liganden-Bindens ab. Die jeweils erforderlichen, genauen zu verabreichenden Wirkstoffmengen hängen von dem Ermessen des behandelnden Arztes ab und sind für jedes Individuum eigentümlich. Geeignete Dosierungsbereiche sind jedoch in der Größenordnung von 1 bis mehrere mg des Wirkstoffes pro Individuum pro Tag und hängen von dem Verabreichungsweg ab. Geeignete Schemata für die anfängliche Verabreichung und für Verstärkungs-"Booster"-Impfungen sind ebenfalls variabel, jedoch besteht ein typisches Beispiel hiefür in einer anfänglichen Verabreichung, auf welche wiederholte Dosen in ein- oder mehrstündigen Intervallen durch eine Folgeinjektion oder durch eine andere Verabreichung folgen. Alternativ ist eine kontinuierliche, intravenöse Infusion vorgesehen, welche ausreicht um im Blut therapeutisch wirksame Konzentrationen aufrechtzuerhalten. Für ein einer kryptischen hGPIIb-Determinante entsprechendes Polypeptid fallen therapeutisch wirksame Konzentrationen im Blut in einen Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM, und sie betragen vorzugsweise etwa 1,0 mM. Therapeutisch wirksame Konzentrationen von Antikörpermolekülen der vorliegenden Erfindung im Blut fallen in einen Bereich von etwa 0,1 µM bis etwa 10 µM, und sie betragen vorzugsweise 1,0 µM.

K. Diagnostische Systeme

Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung in Kitform enthält - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - ein exprimiertes Protein, Polypeptid, eine Antikörperzusammensetzung oder eine monoklonale Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, jeweils als ein getrennt verpacktes Reagens. Typischerweise liegen auch Anweisungen für den Gebrauch des verpackten Reagens bei.
Die "Gebrauchsanweisungen" umfassen typischerweise eine bestimmte Ausdrucksweise, mit welcher die Konzentration der Reagenzien oder wenigstens ein Parameter des Testverfahrens, wie z. B. die relativen, zu vermischenden Mengen des Reagens und der Probe, die Zeitspannen, während welchen die Gemische aus dem Reagens/der Probe aufrechterhalten werden sollen, die Temperatur, Pufferbedingungen und dgl. beschrieben werden.
Gemäß einer Ausführungsform umfaßt ein diagnostisches System zum Testen auf an Fibrinogen gebundene Plättchen in einer plättchenhältigen Gefäßflüssigkeitsprobe, wie z. B. Blut oder Plasma, eine Packung, welche Moleküle enthält, die mit einem Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante, vorzugsweise dem p129-145, immunreagieren. In höherem Maße bevorzugt sind die Antikörpermoleküle jene, welche von dem Hybridom PMI-1 erzeugt worden sind, und welche mit dem hGPIIb immunreagieren. Vorzugsweise liegen die Antikörpermoleküle als eine monoklonale Antikörperzusammensetzung vor. Weiterhin bevorzugt sind Kits, worin die Antikörpermoleküle an ein Radionuklid- Label gebunden sind, wobei es sich vorzugsweise um mit ¹²&sup5;I markierte PMI-1-Antikörpermoleküle handelt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung zum Testen auf das Vorliegen eines Thrombus in vivo verwendbar. Das System umfaßt eine Packung, welche Antikörpermoleküle enthält, die mit einem Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante, vorzugsweise mit dem p129-145, immunreagieren. In höherem Maße bevorzugt liegen die Antikörpermoleküle als eine monoklonale Antikörperzusammensetzung vor, welche im wesentlichen aus PMI-1- Antikörpermolekülen besteht, die mit dem hGPIIb immunreagieren. Die Antikörpermoleküle sind an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung somit weiterhin ein Label oder Anzeigemittel, welches befähigt ist, die Bildung eines Komplexes anzuzeigen, welcher ein Antikörpermolekül oder ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält.
Die hierin verwendeten Ausdrücke "Label" und "Anzeigemittel" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen beziehen sich auf einzelne Atome und Moleküle, welche entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt sind, welches zum Anzeigen des Vorliegens eines Komplexes dient. In-vivo-Labels oder -Anzeigemittel sind jene, welche im Körper eines Human-Subjektes verwendbar sind, und sie umfassen ¹¹¹In, &sup9;&sup9;Tc, &sup6;&sup7;Ga, ¹&sup5;&sup6;Re und ¹³²I. Jedes Label oder Anzeigemittel kann an ein exprimiertes Protein, Polypeptid, oder an ein Antikörpermolekül, welches einen Teil eines Antikörpers oder einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung bildet, gebunden sein oder kann demselben einverleibt sein, oder kann gesondert verwendet werden; wobei diese Atome oder Moleküle allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden können. Derartige Labels sind als solche in der klinischen, diagnostischen Chemie wohlbekannt und stellen einen Teil dieser Erfindung nur insofern dar, als sie zusammen mit ansonsten neuen Proteinverfahren und/oder -systemen verwendet werden.
Das Anbringen von Labels, nämlich das Markieren von Polypeptiden und Proteinen, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Beispielsweise können Antikörpermoleküle, welche durch ein Hybridom erzeugt werden, dadurch markiert werden, daß in dem Kulturmedium als Komponenten zur Verfügung gestellte, radioisotopenhältige Aminosäuren auf dem Weg über den Stoffwechsel aufgenommen werden. Siehe z. B. Galfre et al, Meth. Enzymol., 73 : 3-46 (1981). Die Techniken des Konjugierens oder Kuppelns von Proteinen durch aktivierte, funktionelle Gruppen sind in besonderem Maße anwendbar. Siehe z. B. Aurameas et al, Scand. J. Immunol., Bd. 8, Beil. 7 : 7-23 (1978); Rodwell et al, Biotech., 3 : 889-894 (1984); und die US-PS 4 493 795.
Die diagnostischen Systeme können auch, vorzugsweise als eine getrennte Packung, ein spezifisches Bindungsmittel enthalten. Ein "spezifisches Bindungsmittel" ist ein molekulares Gebilde, welches befähigt ist, eine Reagenzienspezies der vorliegenden Erfindung selektiv zu binden, welches aber selbst kein Produkt einer Proteinexpression, kein Polypeptid und auch kein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung ist. Beispiele für spezifische Bindungsmittel sind Antikörpermoleküle, Komplement- Proteine oder Fragmente hievon, Protein A und dgl. mehr. Vorzugsweise kann das spezifische Bindungsmittel das Antikörpermolekül oder Polypeptid dieser Erfindung dann binden, wenn dasselbe als Teil eines Komplexes vorliegt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindungsmittel markiert. Enthält das diagnostische System jedoch ein spezifisches Bindungsmittel, welches nicht markiert ist, dann wird das Mittel typischerweise als ein Verstärkungsmittel oder -reagens verwendet. Bei diesen Ausführungsformen ist das markierte, spezifische Bindungsmittel befähigt, das Verstärkungsmittel spezifisch zu binden, wenn das Verstärkungsmittel an einen eine Reagensspezies enthaltenden Komplex gebunden ist.
Die diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung können im Rahmen einer "ELISA"-Aufmachung verwendet werden, um das Vorliegen oder die Menge von an Fibrinogen gebundenen Plättchen in einer Körperflüssigkeitsprobe, wie z. B. Serum, Plasma oder Urin, nachzuweisen bzw. zu bestimmen. Der Ausdruck "ELISA" bezieht sich auf einen "Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay", nämlich auf einen Enzymimmunoassay, bei welchem ein an eine feste Phase gebundener Antikörper oder ein ebensolches Antigen sowie ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat zum Nachweisen und Quantifizieren der Menge eines in einer Probe vorhandenen Antigens oder Antikörpers verwendet werden. Eine Beschreibung der ELISA-Technik findet sich in Kapitel 22 der 4. Aufl. von "Basic and Clinical Immunology von D. P. Sites et al, veröffentlicht 1982 von Lange Medical Publications, Los Altos, CA; und in den US-PSen Nrn. 3 654 090, 3 850 752 und 4 016 043, welche allesamt durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen kann daher das exprimierte Protein, Polypeptid oder das Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung zur Bildung eines festen Trägers an einer festen Matrix befestigt werden, welcher in den gegenständlichen diagnostischen Systemen gesondert verpackt wird.
Das Reagens wird typischerweise an der festen Matrix durch Adsorption aus einem wässerigen Medium befestigt, obwohl auch andere Befestigungsweisen angewendet werden können, welche dem Fachmann wohlbekannt sind.
Verwendbare feste Matrizes sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Solche Materialien umfassen das vernetzte Dextran, welches unter dem Warenzeichen SEPHADEX von der Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist; Agarose; Kügelchen von Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von etwa 1 µm bis etwa 5 mm, welche von den Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhältlich sind; Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztes Polyacrylamid, Bahnen auf der Basis von Nitrozellulose oder von Nylon, wie z. B. Blätter, Streifen oder Schaufeln ("paddles"); oder Röhrchen, Platten oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, wie z. B. jene, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid angefertigt sind.
Die Reagenzienspezies, das markierte, spezifische Bindungsmittel oder das Verstärkungsreagens irgendeines hierin beschriebenen, diagnostischen Systems können in Lösung, als flüssige Dispersion oder als ein im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, zur Verfügung gestellt werden. Ist das Anzeigemittel ein Enzym, dann kann das Substrat des Enzyms ebenfalls in einer gesonderten Packung eines Systems zur Verfügung gestellt werden. In diesem diagnostischen Testsystem können auch ein fester Träger, wie z. B. die vorstehend beschriebene Mikrotiterplatte, und ein oder mehrere Puffer als gesondert verpackte Elemente enthalten sein.
Die hierin in bezug auf diagnostische Systeme erörterten Verpackungen sind jene, die normalerweise in diagnostischen Systemen benützt werden. Solche Verpackungen umfassen Glas- und Kunststoff- (z. B. Polyethylen-, Polypropylen- und Polycarbonat-)-Flaschen, -Fläschchen, Kunststoff-Hüllen und mit einer Kunststoffolie laminierte Hüllen und dgl. mehr.

L. Testverfahren

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist jedwedes Verfahren vorgesehen, das zu einem Nachweis von GPIIb, und insbesondere von einem Komplex, der an Fibrinogen gebundenes GPIIb enthält, führt, wie derselbe in einem Thrombus oder in an Fibrinogen gebundenen Plättchen vorgefunden wird, und zwar dadurch, daß man einen Komplex erzeugt, der ein exprimiertes Protein, Polypeptid oder ein in einem Antikörper oder einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltenes Antikörpermolekül enthält. Den Fachleuten wird klar sein, daß es zahlreiche, wohlbekannte Verfahrensweisen der klinischen, diagnostischen Chemie gibt, welche zur Bildung dieser Komplexe herangezogen werden können. Somit gilt, daß hierin zwar beispielhafte Testverfahren beschrieben sind, daß die Erfindung aber nicht darauf beschränkt ist.

1. Nachweis eines Thrombus

Ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines Thrombus in einem Humansubjekt ist vorgesehen. An das Subjekt wird eine wirksame Menge einer Antikörperzusammensetzung oder einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welche Anti-hGPIIb-Antikörpermoleküle enthält, die an ein invivo-Anzeigemittel gebunden sind, intravenös verabreicht. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen sind die markierten Antikörpermoleküle jene, welche mit dem hGPIIb und mit dem Polypeptid p129- 145, aber nicht mit dem p53-64, immunreagieren, und in höherem Maße bevorzugt jene, die von dem Hybridom PMI-1 erzeugt worden sind.
Das Subjekt wird dann während einer vorbestimmten Zeitspanne verharren gelassen, welche dafür ausreicht, daß die markierten Antikörpermoleküle mit dem als Teil eines Thrombus vorliegenden hGPIIb reagieren und einen Komplex bilden, und vorzugsweise wird das Subjekt während einer zusätzlichen Zeitspanne verharren gelassen, welche dafür ausreicht, daß eine wesentliche Menge von jeglichen, nicht-umgesetzten Antikörpermolekülen aus dem Körper ausgeschieden werden. Das Subjekt wird dann auf das Vorliegen und vorzugsweise auf die Lokalisierung irgendeines markierten Komplexes, der sich gebildet hat, untersucht.

2. Nachweis von an Fibrinogen gebundenen Plättchen in einer Körperprobe

Es können verschiedene heterogene und homogene, kompetitive oder nicht-kompetitive Testschemata für den Nachweis des Vorliegens und vorzugsweise das Bestimmen der Menge von an Fibrinogen gebundenen Plättchen in einer plättchenhältigen Körperprobe, vorzugsweise einer Körperflüssigkeitsprobe, wie z. B. in Blut oder in einem plättchenhältigen Blutanteil, angewendet werden. Beispielsweise werden eine mit Heparin konservierte (nicht-geronnene) Blutprobe und mit 1²&sup5;I markierte PMI-1-Antikörpermoleküle vermischt. Das so gebildete Immunreaktionsgemisch wird unter den Bedingungen für einen biologischen Test während einer Zeitspanne aufrecht erhalten, welche dafür ausreicht, daß jedwede, an Fibrinogen gebundene Plättchen mit den markierten Antikörpern unter Bildung eines markierten Immunreaktionsproduktes immunreagieren. Die markierten Immunreaktionsprodukte werden dann von den nicht-umgesetzten, markierten Antikörpern abgetrennt, und zwar typischerweise durch ein Zentrifugieren, welches ausreicht, um alle in der Probe vorhandenen Plättchen zu pelletieren. Dann wird die Menge des gebildeten, markierten Immunreaktionsproduktes festgestellt.
Die Bedingungen eines biologischen Tests sind jene, bei welchen die biologische Aktivität der Antikörper- und Polypeptidmoleküle dieser Erfindung sowie jene der an Fibrinogen gebundenen Plättchen, auf welche untersucht werden soll, aufrechterhalten wird. Diese Bedingungen umfassen einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis etwa 45ºC, vorzugsweise von etwa 37ºC, einen Bereich für den pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9, vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 7, und eine Ionenstärke, welche von jener von destilliertem Wasser bis zu jener von etwa 1M Natriumchlorid variiert und vorzugsweise etwa jener einer physiologischen Kochsalzlösung entspricht. Verfahren zum Optimieren solcher Bedingungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.

Beispiele

Durch die nachstehenden Beispiele soll die vorliegende Erfindung veranschaulicht, aber nicht eingeschränkt werden.

1. Isolierung von GPIIb-IIIa

A. Isolierung von Plättchen

60 ml von Human-Vollblut wurden in 5 ml von ACD (0,065 M Zitronensäure, 0,085 M Natriumcitrat, 2% Dextrose) mit einem Gehalt an Hirudin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei einer Endkonzentration von 0,06 Einheiten pro ml (U/ml) gesammelt und während 15 min bei 120 · g zentrifugiert. Der so entstandene Überstand, der als plättchenreiches Plasma (PRP) bezeichnet wird, wurde rückgewonnen, isoliert und während 15 min bei 1200 · g zur Bildung eines Pellets aus isolierten Plättchen weiter zentrifugiert.

B. Isolierung des GPIIb-IIIa aus Plättchen

Ein wie in Beispiel 1A hergestelltes Plättchenpellet wurde in 5 ml TBS (0,15 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,4, 5 · 10&supmin;&sup4; M CaCl, 10&supmin;&sup5; M Leupeptin) erneut suspendiert und während 10 min auf Eis bei maximaler Einstellung unter Verwendung eines Beschallungsgerätes vom Typus "Model W-375 Sonicator" (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY) beschallt. Die beschallte Suspension wurde zweimal unter Verwendung eines Trockeneis-Methanol- Eisbades zum Gefrieren gebracht und wieder aufgetaut und dann bei -20ºC gelagert. Das eingefrorene und wieder aufgetaute Plättchen-Sonikat wurde zuoberst auf 5 ml einer Saccharoselösung (40%ig, Vol./Vol., in TBS) geschichtet, und wurde bei 4ºC während 1 h bei 38.000 U/min (RPM) in einem Zentrifugenrotor vom Typus SW41 (Beckman Instruments, Fullerton, CA) zur Ausbildung eines milchigen, gefärbten unterständigen Anteils ("infranatant") zentrifugiert. Der milchige unterständige Anteil wurde dann rückgewonnen und bei 43.000 U/min in einem Zentrifugenrotor vom Typus SW50.1 (Beckman) bei 4ºC während 1 h zentrifugiert. Das so entstandene Pellet wurde erneut, nämlich typischerweise in 1-2 ml TBS, zur Bildung einer Lösung von Plättchenmembranen suspendiert deren Proteinkonzentration typischerweise unter Verwendung eines "Bio-Rad Protein Assay Kit" (Bio-Rad, Richmond, CA) nach den Anweisungen des Herstellers als in einen Bereich von 10 bis 25 mg/ml fallend bestimmt wurde.
Die Lösung der Plättchenmembranen wurde erneut in einem Zentrifugenrotor vom Typus SW50.1 wie oben zentrifugiert, und das so entstandene Pellet wurde in 2 ml eines Extraktionspuffers (0,03 M Tris, pH 7,4, 1 · 10&supmin;&sup5; M Leupeptin, 200 mM n-Octylbeta-D-glucopyranosid; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA) erneut suspendiert. Der so gebildete Extrakt von Plättchenmembranen wurde durch Verwirbeln gründlich vermischt und wurde dann während 30 min bei Raumtemperatur gehalten. Der Extrakt wurde anschließend bei 45.000 J/min während 1 h bei 4ºC in einem Zentrifugenrotor vom Typus SW50.1 zentrifugiert, und der so gebildete Überstand aus einem Plättchenmembranenextrakt wurde rückgewonnen.
Der rückgewonnene Überstand wurde auf eine Gelfiltrationssäule vom Typus "LKB Ultrogel Aca 34" (3 · 97 cm, LKB Instruments, Gaithersburg, MD) aufgebracht, welche mit 1 l Säulenpuffer (0,03 M Tris, pH 7,4, 0,1 mM CaCl, 0,1% n-Octyl-beta-D- glucopyranosid) äquilibriert worden war; und von der so entstandenen, aus der Säule austretenden Flüssigkeit wurden 5 ml- Fraktionen gesammelt. Die optische Dichte jeder Fraktion bei 280 nm wurde bestimmt, und die Fraktionen rund um die mehreren Peaks herum wurden unter Bildung einer Ansammlung für jeden Peak vereinigt. Die Proben aus jeder Ansammlung wurden durch Elektrophorese in 6%igen Polyacrylamid-Plattengelen, unter Anwendung der von Laemmli, in Nature (London), 227 : 680-685 (1970), beschriebenen, reduzierenden Puffer und Verfahrensweisen und unter Verwendung von Proteinstandards mit einem niedrigen Molekulargewicht, die in einen Größenbereich von 14,4 kDa bis 92,5 kDa fielen (Bio-Rad, Richmond, CA), analysiert. Diejenige Ansammlung, welche überwiegend zwei Proteinspezies mit dem GPIIb bzw. dem GPIIIa entsprechenden Molekulargewichten, nämlich 120 kDa bzw. 100 kDa, enthielt, wurde rückgewonnen. Die Proteinkonzentration des so hergestellten, isolierten GPIIb- IIIa-Präparates wurde typischerweise unter Verwendung der Bio-Rad-Protein-Test-Kits als in einen Bereich von 0,3 bis 0,8 mg/ml fallend bestimmt.

2. Herstellung eines polyklonalen Anti-GPIIb-IIIa-Antiserums

Durch Immunisieren mit einer Zusammensetzung, welche vollständiges Freundsches Adjuvans und 100 µg des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten, isolierten GPIIb-IIIa-Proteins enthielt, wurden Kaninchen-Anti-GPIIb-IIIa-Antikörper hergestellt. Die Verstärkungs- "Booster" -Injektionen von GPIIb-IIIa wurden an mehreren intradermalen Stellen (und zwar typischerweise 100 µg, verteilt über 4 Stellen) in unvollständigem Freundschem Adjuvans gemäß einem wöchentlichen Schema während drei Wochen und im Anschluß daran gemäß einem zweiwöchentlichen Schema während weiterer drei Monate verabreicht.

3. Aufbau einer cDNA-Genbank. Durchprüfen mit Antikörpern und Identifizieren der cDNA-Klone

Nach dem Guanidiniumisothiocyanat/Cäsiumchlorid-Verfahren wurde die zelluläre Gesamt-RNA aus HEL-Zellen hergestellt. Aus der Gesamt-RNA-Fraktion wurde die Poly-(A&spplus;)-RNA mit Hilfe von zwei Chromatographie-Zyklen auf Oligo-(dT)-Zellulose isoliert und gereinigt. Gemäß Standard-Verfahrensweisen wurde aus 10 µg HEL-Poly-(A&spplus;)-RNA unter Verwendung von AMV-Reverser Transcriptase (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, FL) und von Randum-Oligodesoxynukleotid-Primern doppelsträngige cDNA synthetisiert. Nach ihrer Größe ausgewählte cDNA wurde in die EcoRI- Stelle des Phagen gt11 ligiert, unter Verwendung des von Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, erhältlichen Integrierungsextraktes vom Typus "Gigapack Packaging Extract" gemäß den Vorschriften des Herstellers in den Phagen integriert, und dann auf E. coli Y1088 plattiert und amplifiziert. Das Plattieren des Phagen auf E.coli Y1090, das Induzieren der Synthese der Fusionsproteine, die Übertragung auf Nitrozellulosefilter und das Durchprüfen der Filter mit dem in Beispiel 2 hergestellten, polyklonalen Kaninchen-GPIIb-IIIa-Antiserum wurden unter Anwendung des auf Immunperoxidase basierenden Vectastain ABC-Verfahrens (Vector Laboratories, Burlingame, CA) nach den Anweisungen des Herstellers, wie von Young et al, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 1194-1198 (1983), beschrieben, durchgeführt. Positive, rekombinante Klone wurden durch Plaques gereinigt, amplifiziert und als Platten-Lysat gesammelt.
Durch das anfängliche Durchprüfen von 200.000 Rekombinanten mit dem polyklonalen Kaninchen-GPIIb-IIIa-Antiserum wurden sechs immunreaktive Klone identifiziert. Zur Prüfung der Immunreaktivität des beta-Galactosidase-cDNA-Fusionsproteins von positiven Klonen mit dem monoklonalen Antikörper PMI-1 wurden, wie von Young et al, in Science, 222 : 778-782 (1983), beschrieben, Phagen-Lysogene in dem E.coli-Stamm Y1089 erzeugt. Die Lysate aus den IPTG-induzierten Kulturen wurden durch erneutes Suspendieren der Pellets aus Bakterienzellen in reduzierendem Gel-Probenpuffer hergestellt, wonach die Proben auf 6%igen SDS- Polyacrylamid-Gelen laufen gelassen wurden, wie von Towbin et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 26 : 4350-4354 (1979), beschrieben, auf Nitrozellulose übertragen und unter Anwendung des Vectastain-ABC-Verfahrens mit PMI-1 als Sonde durchgeprüft wurden.
Bei einem dieser Klone, nämlich dem HEL41, welcher ein Insert von 1,1 Kilobasen (kb) enthielt, wurde festgestellt, daß er die Synthese eines bakteriellen Fusionsproteins von 140 kDa steuert, welches Kennmerkmale aufweist, die mit dem Umstand vereinbar sind, daß dasselbe GPIIb-Epitopen besitzt. Diese Kennmerkmale umfaßten: (1) Die blockierbare Reaktivität der polyklonalen Anti-GpIIb-IIIa-Antikörperzusammensetzung mit dem durch den HEL41-Klon kodierten Fusionsprotein wurde durch vorherige Absorption mit isoliertem GPIIb-IIIa blockiert; (2) spezifische Reaktion von an Hand des Fusionsproteins durch Affinitätschromatographie gereinigten Antikörpern mit GPIIb in Immunblots von Plättchen-Lysaten und gereinigtem GPIIb-IIIa; und (3) Immunpräzipitation von GPIIb-IIIa aus oberflächenmarkierten Plättchen durch das durch Affinitätschromatographie gereinigte Antiserum. Der durch Affinitätschromatographie gereinigte Antikörper zeigte keine Reaktion mit der alpha-Untereinheit des Vitronektin-Rezeptors (VnR) in Western Blots und führte auch zu keiner Immunpräzipitation des verwandten Endothelzellen-Zytoadhäsins. Außerdem war das von dem HEL41 kodierte Fusionsprotein mit dem monoklonalen Antikörper PMI-1 immunreaktiv, was einen weiteren Beweis dafür darstellt, daß dieser Klon für Epitope kodiert, welche auf dem GPIIb zur Verfügung stehen.

4. DNA-Sequenzierung und Sequenz-Analyse

Rekombinante Phagen-DNA aus dem HEL41 wurde an Hand der Technik mit flüssigen Kulturen gereinigt, mit EcoRI verdaut und in den M13mp18 subkloniert. Die DNA-Sequenz für jeden Strang wurde gemäß dem Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren von Sanger et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 (1977), unter Verwendung von ³&sup5;S-dATP und von den von Biggin et al, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 3963-3965 (1983), beschriebenen Puffer-Gradienten-Gelen bestimmt. Die cDNA-Sequenz wurde unter Anwendung des von Strauss et al, in Anal. Biochem., 154 : 353-360 (1986), beschriebenen DNA-Sequenzierungsverfahren, das mit einem spezifischen Primer gesteuert wird, verlängert. Die 20-meren Oligonukleotid-Sequenzierprimer wurden auf einem DNA- Synthesegerät vom Typus "Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer" synthetisiert. Um Mehrdeutigkeiten aufzulösen, wurden beide Stränge sequenziert.
Die Nukleotidsequenz des Klons HEL41 ist in der Fig. 1 dargestellt und hat die folgenden Merkmale. Das Insert besteht aus einem offenen Leserahmen von 681 Basen, mit einem an der Position 682 beginnenden TAG-Stopcodon, auf welches 420 Basen einer 3'-untranslatierten Sequenz folgen. Die ersten 120 Nukleotide am 5'-Ende des Klons besitzen die Kennmerkmale der Übereinstimmung von repetitiven Alu-Sequenzen, was darauf hinweist, daß dieser Klon von einer unvollständig verarbeiteten mRNA abgeleitet sein mag.
Die cDNA-Sequenz des Klons HEL41 kodiert für einen offenen Leserahmen von 227 Aminosäuren (Fig. 1). Die für die Leichte Kette des GPIIb festgestellte Sequenz am N-Ende, wie dieselbe von Charo et al, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 8351-8356 (1976), berichtet worden ist, kann innerhalb des Klons als die Aminosäurenreste 157 bis 171 identifiziert werden. Die übereinstimmende, repetitive Alu-Sequenz translatiert im Rahmen und begründet die ersten 40 der von dem HEL41 kodierten Aminosäurenreste.
Durch den Vergleich der abgeleiteten Aminosäurensequenzen von GPIIb-alpha-Untereinheiten mit jenen von VnR-alpha-Untereinheiten [Suzuki et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 8614- 8618 (1986)] durch Matrixanalyse [George et al, PIR Report No. REL-0286, National Biomedical Research Foundation (1986)] wurden zwei Regionen mit Ähnlichkeit nachgewiesen, welche konservative Substitutionen zulassen. Eine dieser Regionen, welche etwa 50 Aminosäurenreste umfaßt, ist in der Nähe des Carboxyl-Endes der Schweren Ketten lokalisiert. Die zweite Region von etwa 15 Resten befindet sich in der Nähe des Amino- Endes der Leichten Ketten und enthält Cysteinreste, welche an der Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Schweren und Leichten Ketten beider Proteine beteiligt sein mögen. Die Bewertung der statistischen Signifikanz der Beziehung zwischen der Sequenz von GPIIb-alpha-Untereinheiten und jener von VnR- alpha-Untereinheiten mit dem "Relate"-Programm unter Verwendung einer Mutationsdatenmatrix ergab eine niedrige Wahrscheinlichkeit dafür, daß man diesen Grad von Ähnlichkeit, wie er zwischen den zwei Sequenzen vorliegt, durch Zufall findet (p < 0,0001). Die Analyse der Beziehung zwischen der Sequenz von GPIIb-alpha-Untereinheiten und jener von FnR-alpha-Untereinheiten [Argraves et al, J. Biol. Chem., 261 : 12922-12924 (1986)] ergab eine ähnliche niedrige Wahrscheinlichkeit dafür, daß man diesen Grad von Ähnlichkeit, wie er zwischen den zwei Sequenzen vorliegt, durch Zufall findet (P < 0,0005).
Eine Computer-Suche ergab keine anderen offensichtlichen Ähnlichkeiten zwischen diesem Teil des GPIIb und anderen Sequenzen, welche in der NBRF-Protein-Datenbank vorhanden sind. Außerdem konnten keine signifikanten Gleichheiten in einem direkten Vergleich mit der veröffentlichten Teilsequenz für das Nervenzellen-Adhäsionsmolekül, N-CAM, nachgewiesen werden.

5. Polypeptid-Synthese

Auf der Basis der aus der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäurenrestesequenz wurden auf einem Synthesegerät vom Typus "Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer" und unter Anwendung des Verfahrens von Hagenmaier et al, Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Chem., 353 : 1973 (1982), mit symmetrischen Anhydriden Polypeptide chemisch synthetisiert, welche den hierin benützten, verschiedenen GPIIb-Regionen entsprachen.
Die Aminosäurenrestesequenzen der synthetisierten Polypeptide und deren Lokalisierung innerhalb der in Fig. 1 dargestellten, abgeleiteten Aminosäurenrestesequenz des GPIIb sind in Tabelle 2 angeführt.

Tabelle 2

Bezeichnung Aminosäurenrestesequenz
p19-34 WEAKAGRSPEVRSSRS
p53-65 REQNSLDSWGPKV
p129-145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ
p136-145 PAHHKRDRRQ
p144-156 RQIFLPEPEQPSR

6. Herstellung monoklonaler Antikörperzusammensetzungen

Monoklonale Antikörperzusammensetzungen, welche aus isoliertem Immunglobulin IgG (IgG) bestanden, wurden aus der Aszitesflüssigkeit einer Maus, welche die Mäuse-Hybridomen-Zellinie PMI-1 (ATCC-Nummer HB 9476) enthielt, unter Verwendung von Protein-A-Sepharose isoliert, welche typischerweise von Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ) bezogen worden war, und welche nach den Anweisungen des Herstellers benützt wurde. Die Proteinkonzentration des isolierten IgG wurde unter Verwendung des Bio-Rad- Protein-Test-Kits (Bio Rad, Richmond, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Zur Herstellung einer Zusammensetzung des monoklonalen Antikörpers PMI-1 mit einem Gehalt an mit ¹²&sup5;I markierten Antikörpermolekülen wurden 350 µl an PBS (0,15 M NaCl, 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,09) mit einem Gehalt von 1 mg/ml an dem oben isolierten PMI-1-IgG mit 40 µg Chloramin-T und 1 mCi an trägerfreiem Na¹²&sup5;I (Amersham, Arlington Heights, IL) vermischt. Das so entstandene Gemisch wurde während 5 min bei etwa 20ºC aufrechterhalten und wurde dann mit 20 µl einer 2 mg/ml-Natriummetabisulfitlösung (2 mg/ml) und 20 µl einer Kaliumiodidlösung vermischt. Dann wurden 800 µl PBS mit einem Gehalt von 1% an BSA beigemengt, worauf ein weiteres Zumischen von Diisopropylfluorphosphat bis auf eine Endkonzentration von 10 mM vorgenommen wurde. Das so entstandene Gemisch wurde während 60 min bei 22ºC aufrechterhalten und wurde dann gegen PBS dialysiert. Die spezifische Aktivität des so entstandenen, mit ¹²&sup5;I markierten PMI-1 waren etwa 4,5 µCi pro µg.
Zusammensetzungen, welche Fab-Fragmente aus dem oben isolierten IgG enthielten, wurden durch Verdauen mit Papain (200 : 1, Gew./Gew., von IgG zu Papain) während 6 h bei 37ºC gemäß den Verfahren von Mage et al, Methods in Enzymology, 70 : 142-150 (1980), hergestellt. Nicht-verdautes IgG und Fc- Fragmente wurden durch Chromatographie auf Protein-A-Sepharose entfernt. Die so entstandenen, Fab-Fragmente enthaltenden Zusammensetzungen waren dann gebrauchsfertig, oder sie wurden, je nach Bedarf, unter Anwendung der gleichen Verfahren, wie sie oben für die monoklonalen Antikörperzusammensetzungen beschrieben worden sind, mit ¹²&sup5;I markiert.
Monoklonale Antikörperzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, welche eine andere Immunspezifität als jene des PMI- 1 aufweisen, werden ebenfalls wie oben für den PMI-1 beschrieben hergestellt. Beispielsweise wurden solche Zusammensetzungen unter Verwendung der Mäuse-Hybridomen-Zellinie PMI-2 (ATCC-Nummer HB 9615) hergestellt.

7. ELISA-Tests

A. Polypeptid-ELISA

Die in den monoklonalen Antikörperzusammensetzungen PMI-1 und Tab enthaltenen Antikörpermoleküle wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, mit den Polypeptiden p129-145 und p144-156 immunzureagieren. (Tab ist ein nicht-verwandter, als Kontrolle eingesetzter, monoklonaler Antikörper.) 50 µl einer Überzugslösung (0,1 M NaHCO&sub3;, pH 9,5, 0,1% NaN&sub3;) mit einem Gehalt von 20 µM an Polypeptid wurden unter Vermischen in die Vertiefungen von flachbödigen Mikrotiterplatten mit jeweils 96 Vertiefungen (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) eingebracht. Die Platten wurden dann während 60 min bei 37ºC gehalten, um ein Adsorbieren des Polypeptides an den Wänden der Vertiefungen zu ermöglichen. Die Überzugslösung wurde durch Schütteln entfernt, die Vertiefungen wurden zweimal mit Waschpuffer (0,01 M Tris, pH 7,4, 0,05% Tween 20, 0,15 M NaCl, 200 mg/ml Merthiolat) gespült, und 50 µl einer Blockierungslösung [5%iges Rinderserumalbumin (BSA; Gew./Vol.) in Überzugslösung] wurden in jede Vertiefung (als festem Träger) unter Vermischen eingebracht, um die überschüssigen Proteinstellen zu blockieren.
Die Vertiefungen wurden während 60 min bei etwa 37ºC gehalten, wonach dann die Blockierungslösung entfernt wurde. In jede Vertiefung wurden unter Vermischen 50 µl einer Lösung eingebracht, welche enthielt: (a) Kaninchen-Anti-Polypeptid-Antikörper, hergestellt wie in Beispiel 8 und verdünnt, 1 : 200, in einem Verdünnungspuffer (Waschpuffer mit einem Gehalt an 5 mM EDTA und 1 mg/ml BSA), (b) 1,5 nM an dem wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellten, monoklonalen Antikörper-IgG PMI-1, oder (c) TAB-Hybridomen-Aszites-Flüssigkeit (die von Dr. R. McEver, University of Texas, San Antonio, TX, zur Verfügung gestellt worden war), verdünnt 1 : 320.000 in Verdünnungspuffer. Die so entstandenen, aus festen/flüssigen Phasen bestehenden Immunreaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur während 60 min gehalten, um die Bildung eines ersten, an die feste Phase gebundenen Immunreaktionsproduktes zwischen dem an die feste Phase gebundenen Polypeptid und den beigemengten Antikörpern zu ermöglichen. Die festen und flüssigen Phasen wurden dann voneinander getrennt, die Vertiefungen wurden zweimal mit Waschpuffer gespült, und überschüssige Flüssigkeit wurde durch Schütteln entfernt.
In jede Vertiefung wurden unter Vermischen 50 µl einer Lösung eingebracht, welche mit Merrrettich-Peroxidase markiertes Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (Tago Inc., Burlingame, CA), verdünnt 1 : 2000 in Verdünnungspuffer, oder Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA), verdünnt 1 : 2000 in Verdünnungspuffer, enthielt, um ein zweites, aus einer festen und einer flüssigen Phase bestehendes Immunreaktionsgemisch (ein markierendes Immunreaktionsgemisch) zu bilden. Die Vertiefungen wurden während 50 min bei Raumtemperatur gehalten, um die Bildung eines zweiten Immunreaktionsproduktes zwischen dem markierten Antikörper und jeglichem, an die feste Phase gebundenem Antikörper des ersten Immunreaktionsproduktes zu ermöglichen, wonach zweimal mit Waschpuffer gespült wurde, um die an die feste Phase gebundenen, das Label enthaltenden Immunreaktionsprodukte zu isolieren. Die überschüssige Flüssigkeit wurde dann aus den Vertiefungen entfernt.
Dann wurden in jede Vertiefung 50 µl einer chromogenen Substratlösung unter Vermischen eingebracht, welche 0,4 mg/ml o-Phenylendiamin und 0, 012%iges (Vol. /Vol.) Wasserstoffperoxid in CP-Puffer (243 ml 0,1 M Zitronensäure und 250 ml 0,2M dibasisches Natriumphosphat pro Liter HO) enthielt, um ein Farbentwicklungsreaktionsgemisch zu bilden. Nachdem das Entwicklungsreaktionsgemisch während 10 min bei etwa 20ºC aufrechterhalten worden war, wurden in jede Vertiefung 50 µl einer 2N HSO&sub4; unter Vermischen eingebracht, um die Entwicklungsreaktion zu stoppen; und die so entstandenen Lösungen wurden auf ihre dekadische Extinktion bei einer Wellenlänge des Lichtes von 490 nm unter Verwendung eines Platten-Lesegerätes vom Typus "Model 310 ELISA Plate Reader" (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) geprüft.
Die in der Tabelle 3 angeführten Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß der monoklonale Antikörper PMI-1 mit dem Polypeptid p129-145 immunreagiert, aber mit dem Polypeptid p144-156 nicht immunreagiert. Da der PMI-1, wie hierin nachstehend erörtert, mit einer kryptischen Determinante immunreagiert, welche von dem hGPIIb dann gebildet wird (bzw. auf demselben dann freigelegt wird) wenn das GPIIb-IIIa Fibrinogen bindet, zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchung an, daß das p129-145 die Fähigkeit hat, diese kryptische hGPIIb-Determinante nachzuahmen. Tabelle 3 Polypeptid-Antigen Monoklonaler Antikörper 1) BSA = Als negative Kontrolle verwendete, mit Rinderserumalbumin überzogene Vertiefungen. 2) Aus Dreifachversuchen erhaltene Mittelwerte für die optische Dichte ± Standardabweichung.

B. Kompetitiver ELISA

Die Polypeptide und isoliertes GPIIb-IIIa wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, als Antigen mit dem Festphasen-GPIIb-IIIa um eine Immunreaktion mit den in den monoklonalen PMI-1- bzw. Tab- Antikörperzusammensetzungen enthaltenen Antikörpermolekülen in Konkurrenz zu treten.
Der kompetitive ELISA-Test wurde wie in Beispiel 7A beschrieben durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß 1) anstatt des Polypeptides das wie in Beispiel 1 beschrieben isolierte GPIIb-IIIa in einer Konzentration von 20 µg/m in der Überzugslösung zum Überziehen der Vertiefungen der Mikrotiterplatte verwendet wurde; und daß 2) das GPIIb-IIIa oder das Polypeptid In einer Konzentration von 0,73 µM bzw. 25 µM in die Vertiefungen unter Vermischen unmittelbar vor dem Beimengen des Antikörpers eingebracht wurde, um das Immunreaktionsgemisch zu bilden.
Die in der Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß zwar das p129-145 und das GPIIb-IIIa das immunologische Binden der PMI-1-Antikörpermoleküle an das Festphasen-GPIIb-IIIa kompetitiv hemmen, das p144-156 dies jedoch nicht tut. Außerdem wurde festgestellt, daß weder das eine noch das andere dieser beiden Polypeptide eine signifikante Wirkung auf die Fähigkeit der Tab-Antikörpermoleküle, mit dem GPIIb- IIIa immunzureagieren, ausübt. Diese Ergebnisse zeigen an, daß das Polypeptid p129-145 die Fähigkeit hat, die Sekundärstruktur und die antigenen Determinanten der die p129-145-Aminosäurenrestesequenz enthaltenden hGPIIb-Region nachzuahmen. Tabelle 4 Kompetitor Monoklonale Antikörper 1) Aus Dreifachversuchen erhaltene Mittelwerte für die optische Dichte ± Standardabweichung.

8. Herstellung von Anti-Peptid-Antiseren

Durch Immunisieren von Kaninchen mit den in Beispiel 5 hergestellten Peptiden wurden Anti-Peptid-Antikörper erzeugt. Das Kuppeln der Peptide mit Hilfe von Glutaraldehyd an Thyroglobulin als antigener Träger (Rinder-Typus I, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde wie von J.G. Dockray, in Regulatory Peptides, 1 : 169-186 (1980), beschrieben durchgeführt, welche Literaturstelle durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird. Die anschließende Immunisierung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß 400 µg von an Thyroglobulin gekuppeltem Peptid für die Primärimmunisierung verwendet wurden.

9. Hemmung des Bindens von Antikörpern an mit den Plättchen assoziiertes GPIIb durch Polypeptide

A. Herstellung von Plättchen

Isolierte Plättchen, welche wie in Beispiel 1A hergestellt worden waren, wurden erneut in 2 ml eines calciumfreien Tyrodeschen Puffers (0,13 M NaCl, 0,0026 M KCl, 0,002 M MgCl-6HO, 5 mM Hepes, 0,012 M NaHCO&sub3;, pH 7,2) mit einem Gehalt von 1 mg/ml an BSA und von 1 mg/ml an Dextrose suspendiert. Die Plättchensuspension wurde dann auf eine Sepharose-CL2B-Säule (40 ml Gesamtbettvolumen, Pharmacia Inc., Piscataway, NJ), die mit dem gleichen Tyrodeschen Puffer äquilibriert worden war, aufgebracht.
Die Plättchen wurden aus dem Hohlraumvolumen der CL2B-Säule in einem Endvolumen von etwa 4 bis 5 ml rückgewonnen, sie wurden als gewaschene Plättchen und als Suspensionen der so entstandenen, gewaschenen Plättchen bezeichnet und mit einem Zählgerät vom Typus "Coulter Model II Counter" (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL) gezählt. Das gesamte Verfahren der Plättchenberstellung wurde in Kunststoffbehältern und bei Raumtemperatur durchgeführt.

B. Kompetitiver Plättchen-Test

Gewaschene Plättchen (2 · 10&sup8;/ml), welche wie in Beispiel 9A beschrieben in Tyrodeschem Puffer hergestellt worden waren, wurden mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) derart vermischt, daß eine Endkonzentration von 5 mM erhalten wurde, und sie wurden während 30 min auf 37ºC gehalten, um ein Freilegen des PMI-1-Bindungsepitops zu ermöglichen. Die Plättchen wurden dann mit dem Polypeptid p129-145 in den in der Fig. 2 angegebenen Konzentrationen vermischt, und sie wurden dann weiterhin mit dem in Beispiel 6 hergestellten, mit ¹²&sup5;I markierten PMI-1 vermischt, derart, daß sich in dem so entstandenen Immunreaktionsgemisch eine Konzentration von 1 µM an dem markierten Antikörper ergab. Dieses Gemisch wurde während 30 min auf 22ºC gehalten, um die Bildung von Immunreaktionsprodukten zu ermöglichen. Anschließend wurden die ¹²&sup5;I-PMI-1/Plättchen-Immunreaktionsprodukte von dem ungebundenen ¹²&sup5;I-PMI-1 durch Zentrifugieren des gesamten, aufrechterhaltenen Gemisches durch 0,3 ml einer 20%igen Saccharoselösung in einer Mikrozentrifuge vom Typus "Beckman Microfuge B" (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) unter Bildung eines Plättchenpellets isoliert. Die Menge des mit dem Plättchenpellet verbundenen, radioaktiven ¹²&sup5;I-PMI- 1 wurde durch Szintillationsspektrometrie bestimmt.
Die in der Fig. 2 dargestellten Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß das Polypeptid p128-145 das Binden der PMI-1- Antikörpermoleküle an das mit den Plättchenmembranen assoziierte GPIIb bei Fehlen von zweiwertigen Kationen kompetitiv hemmen kann. Die Fig. 2 zeigt auch, daß die ungefähre Kd der p129-145/pMI-1-Wechselwirkung 1,2 µM beträgt, weil eine 50%ige Hemmung bei einer Polypeptidkonzentration von 1,6 µM dann erzielt wurde, wenn die Antikörpermoleküle in einer Konzentration von 1 µM vorhanden waren.

10. Expression der kryptischen hGPIIb-Determinante durch an Fibrinogen gebundene Plättchen

Ein plättchenreiches Plasma (PRP) wurde wie in Beispiel 1a hergestellt und auf 3 aliquote Anteile aufgeteilt. In einem aliquoten Anteil wurden die Plättchen durch Beimengung von Adenosindiphosphat (ADP) auf eine Endkonzentration von 50 µm zur Erzeugung ADP-stimulierter Plättchen und zur Expression funktioneller GPIIb-IIIa-(Fibrinogen-Rezeptoren) durch dieselben stimuliert. In dem zweiten aliquoten Anteil wurde die GPIIb- IIIa-Expression durch Beimengung von Epinephrin bis auf eine Endkonzentration von 50 µM stimuliert. In beiden Fällen banden die auf den stimulierten Plättchen exprimierten GPIIb-IIIa-Fibrinogen-Rezeptoren das in dem Plasma vorhandene Fibrinogen unter Bildung von an Fibrinogen gebundenen Plättchen. Als negative Kontrolle erhielt der dritte aliquote Anteil des PRP keinen Stimulus, so daß dort nicht-stimulierte Plättchen vorlagen.
Mit jedem der aliquoten PRP-Anteile wurden dann mit ¹²&sup5;I markierte PMI-1-Fab-Fragmente, die gemäß den üblichen Techniken aus den in Beispiel 6 beschriebenen, mit ¹²&sup5;I markierten Antikörpern hergestellt worden waren, auf eine Endkonzentration von 0,8 µM vermischt. Die so gebildeten Immunreaktionsgemische wurden dann während 30 min auf 37ºC gehalten, um die Bildung von markierten Immunreaktionsprodukten, nämlich von Komplexen aus an Fibrinogen gebundenen Plättchen/¹²&sup5;I-PMI-1, zu ermöglichen. Die das Label enthaltenden Immunreaktionsprodukte wurden dann von dem ungebundenen ¹²&sup5;I-PMI-1 durch Zentrifugieren der Plättchen durch einen Saccharosepolster, wie dies in Beispiel 9B beschrieben ist, abgetrennt.
Die Fig. 3 veranschaulicht die Ergebnisse dieser Untersuchung und zeigt, daß die PMI-1-Antikörpermoleküle mit stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren, mit nicht-stimulierten Plättchen aber im wesentlichen nicht immunreagieren. Es wird angenommen, daß der ¹²&sup5;I-PMI-1, der in dem nicht-stimulierten, aliquoten Anteil des PRP als "gebunden" beobachtet wurde, auf nicht-spezifisches Binden ("Ankleben") und/oder auf das Vorliegen einer natürlich vorkommenden Hintergrundsmenge an stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen oder an infolge der Handhabung stimulierten und gebundenen Plättchen zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse zeigen daher an, daß das Binden von Fibrinogen, einem eine arg-gly-asp-(RGD)- Aminosäurenrestesequenz enthaltenden Liganden, durch das GPIIb- IIIa-Zytoadhäsin, zu der Expression einer ansonsten kryptischen, antigenen Determinante führt. Somit können PMI-1-Antikörpermoleküle, und Antikörpermoleküle einer ähnlichen Immunspezifität, verwendet werden, um auf das Vorliegen und die Menge von stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen in einer Gefäßflüssigkeitsprobe zu untersuchen.

11. Hemmung einer Plättchenaggregation durch Polypeptide

200 µl des wie in Beispiel 1A beschrieben hergestellten, plättchenreichen Plasmas (PRP) wurden mit 190 µl von Tyrodeschem Puffer mit einem Gehalt an BSA und Dextrose (von jeweils 1 mg/ml) sowie mit den verschiedenen, in der Fig. 4 angegebenen Mengen der Polypeptide p129-145 oder p144-156 vermischt. Dann wurden 10 µl ADP (80 µM in Tyrodeschem Puffer) beigemengt, um die Plättchenaggregation zu stimulieren. Das Gemisch wurde dann auf 37ºC gehalten, während die Veränderungen in der Lichtdurchlässigkeit des Gemisches unter Verwendung eines Aggregations-Meßgerätes vom Typus "Dual Sample Aggregation Meter" (Modell DP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO) überwacht wurden.
Das Aggregations-Meßgerät wurde unter Verwendung einer Lösung kalibriert, welche 200 µl PRP und 200 µl Tyrodeschen Puffer enthielt, um eine niedrige Grundlinie für die Lichtdurchlässigkeit von 5% für Kontroll-Aggregationen und von 10% für die Aggregationen in Gegenwart von Polypeptiden einzustellen. Die obere Grenze für eine Lichtdurchlässigkeit von 100% wurde unter Verwendung eines Gemisches von 100 ml PRP und 300 µl von Tyrodeschem Puffer gleichförmig eingestellt.

12. Immunreaktion der Leichten Ketten von GPIIb unter Verwendung von Anti-Peptid-Antiseren

Etwa 10&sup9; Plättchen, welche wie in Beispiel 1A hergestellt worden waren, wurden erneut in 1 ml von kaltem (nämlich 4ºC aufweisendem) PBS suspendiert und zur Bildung einer Plättchen- Markierungssuspension mit 200 µg Lactoperoxidase (Sigma) und 2 mCi eines trägerfreien Na¹²&sup5;I (16 mCi/µg, Amersham, Arlington Heights, IL) vermischt. Dieser Suspension wurde dann Peroxid in zwei 5 µl-Zugaben aus einer 0,06%igen Vorratslösung in Abständen von 5 min beigemengt, und die Suspension wurde während der gesamten Zeit auf 4ºC gehalten, damit eine Markierungsreaktion stattfinden kann. Anschließend wurde die Reaktion durch Beimengen von 200 µg Tyrosin gestoppt, und das Reaktionsgemisch wurde durch wiederholtes Zentrifugieren bei 1200 · g während 15 min fünfmal gewaschen, worauf zur Bildung einer Suspension von markierten Plättchen ein erneutes Suspendieren in kalter PBS vorgenommen wurde. Nach der fünften Zentrifugierungsstufe wurden die markierten Plättchen durch erneutes Suspendieren in 40 ml eines Lyse-Puffers (0,5% Triton X-100 [Vol./Vol.], 10 mM EDTA, 10 µg/ml Benzamidin und 100 Einheiten/ml Trasylol; alles von Sigma) zur Bildung eines Lysates der markierten Plättchen lysiert.
1 ml des Lysates der markierten Plättchen wurde mit 15 µl eines durch Wärme inaktivierten, normalen Kaninchenserums (NRS) vermischt und während 30 min auf 22ºC gehalten, wonach ein weiteres Beimengen von 100 µl einer 10%igen (Vol./Vol.) Lösung von Pansorbin (Behring Diagnostics, La Jolla, CA) vorgenommen wurde, welches letztgenannte in einem Immunreaktionspuffer (IPB: 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,156 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM Benzamidin-HCl, 10 µg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1% [Vol./Vol.] Triton X-100, 0,05% [Vol./Vol.] Tween 20, 0,02% [Gew./Vol.) NaN&sub3;, 5 Einheiten/ml Trasylol; alles von Sigma) hergestellt worden war, und worauf ein einminütiges Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge vom Typus "Beckman Microfuge B" und ein Isolieren des so entstandenen Überstandes zur Bildung eines gereinigten Lysates vorgenommen wurden. Dieses Reinigungsverfahren des Beimengens von NRS, des Aufrechterhaltens, des Beimengens von Pansorbin und des Zentrifugierens wurde zweimal wiederholt, wonach dann nochmals die gleiche Verfahrensweise, wiederum unter Verwendung von Pansorbin, jedoch unter Weglassung der NRS- und Aufrechterhaltungsstufen, angewendet wurde, um ein dreifach gereinigtes Lysat zu bilden.
Das dreifach gereinigte Lysat wurde dann mit 250 µl IPB, 4 µl des in Beispiel 8 hergestellten Anti-Polypeptid p144-156-Antiserums sowie mit in Beispiel 2 hergestelltem Anti-GPIIb-IIIa oder NRS und Rinderserumalbumin (BSA) auf eine Endkonzentration von 1% BSA in dem so entstandenen Gemisch vermischt. Dieses so entstandene Gemisch wurde dann während 12 bis 18 h auf 4ºC gehalten, weiterhin mit 100 µl von 10%igem Pansorbin vermischt und dann während 1 h auf 22ºC gehalten. Anschließend wurde das Gemisch während 1 min in einer Mikrozentrifuge vom Typus "Microfuge B" zentrifugiert, und das so entstandene Pellet wurde isoliert. Das isolierte Pellet wurde dann zweimal in IPB, einmal in 0,5 M LiCl und dann noch einmal in IPB gewaschen, wobei das Waschen jeweils das erneute Suspendieren in etwa 1 ml des bezeichneten Puffers, ein anschließendes Zentrifugieren während 1 min in einer Mikrozentrifuge vom Typus "Microfuge B" und das Isolieren des entstandenen Pellets umfaßte.
Die gewaschenen Pellets wurden dann zur Freisetzung jedweder vorhandener Immunkomplexe durch Erhitzen während 3 min auf 100ºC in etwa 100 ml des von Laemmli beschriebenen Probenpuffers aufgeschlossen. Siehe z. B. Laemmli, U. K., Nature (London), 227 : 680-685 (1970). Die solubilisierten Immunkomplexe wurden dann während 1 min in einer Mikrozentrifuge vom Typus "Microfuge B" zentrifugiert, und der so entstandene, die immunpräzipitierten Proteine enthaltende Überstand wurde durch Elektrophorese in einem 15%igen Polyacrylamid-Platten-Gel unter Verwendung von Laemmli-Puffern mit einem Gehalt von 5% an 2- Mercaptoethanol analysiert. Anschließend wurden die Gele getrocknet, und die darin enthaltenen Proteine wurden durch autoradiographische Belichtung auf einem Film vom Typus "Kodak X- Omat AR Film" (Eastman Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbar gemacht. Die Molekulargewichte der so entstandenen, sichtbar gemachten Proteine wurden auf der Basis der elektrophoretischen Mobilität in bezug auf mit ¹&sup4;C markierte Proteinstandards, welche mit ihrem Molekulargewicht in einen Bereich von 12.300 bis 97.400 Dalton fielen (New England Nuclear, Boston, MA), geschätzt.
Die auf diese Weise analysierten, markierten Lysate ergaben ein Protein, das auf den so entstandenen Gelen sichtbar gemacht wurde und das ein Molekulargewicht von etwa 20 kDa aufwies, und welches dem Protein der Leichten Ketten des GPIIb (lGPIIb) entspricht, wenn ein Anti-Polypeptid p144-156-Antiserum verwendet wurde, und welches im wesentlichen nicht nachgewiesen werden konnte, wenn ein polyklonales Anti-GPIIb-IIIa-Antiserum oder NRS verwendet wurden. Daher können das Anti-Polypeptid p144-156-Antiserum und Antikörperzusammensetzungen von ähnlicher Immunspezifität für den Nachweis des lGPIIb verwendet werden.

13. Expression von kryptischen antigenen GPIIb-IIIa-Determinanten durch Liganden-Bindung

A. Test auf das Binden von Antikörpern an Plättchen, welche kryptische, antigene Determinanten exprimieren, durch Vermischen

Es wurden, wie in Beispiel 9A beschrieben, gewaschene Plättchen auf eine Konzentration von 1 · 10&sup9; pro ml hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß der verwendete Tyrodesche Puffer zuerst durch Vermischen mit Chelex 100 (200-400 mesh, Natriumform, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) behandelt wurde, und dann aufrechterhalten wurde, um jedwede in dem Tyrodeschen Puffer vorhandene, zweiwertige Kationen komplex zu binden, und anschließend filtriert wurde, um die komplex gebundenen, zweiwertigen Kationen aus dem Puffer zu entfernen.
Die die oben hergestellten, gewaschenen Plättchen enthaltende Lösung wurde in aliquote Anteile aufgeteilt, wonach dann die Plättchen in jedem aliquoten Anteil entweder durch Vermischen mit ADP auf eine Endkonzentration von 50 µM, zur Bildung von ADP-stimulierten Plättchen, stimuliert wurden oder nicht stimuliert wurden.
Die monoklonalen Antikörperzusammensetzungen, welche entweder die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellten, mit ¹²&sup5;I markierten, ganzen Antikörpermoleküle, oder die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellten, mit ¹²&sup5;I markierten Fab-Fragmente hievon enthielten, wurden zuerst mit verschiedenen Polypeptiden und entweder mit zweiwertigen Kationen oder mit EDTA vermischt. Die Gemische aus mit ¹²&sup5;I markierten Antikörpern/Peptiden wurden dann mit aliquoten Anteilen von entweder stimulierten oder nicht-stimulierten Plättchen derart vermischt, daß die Antikörper oder die Fab-Fragmente jeweils in einer Konzentration von etwa 0,8 µM vorlagen. Die so entstandenen Immunreaktionsgemische wurden dann während 30 min auf 37ºC gehalten, um die Expression der kryptischen antigenen Determinante zu ermöglichen und um die Bildung von mit ¹²&sup5;I markierten Immunreaktionsprodukten, nämlich von Komplexen aus an einen Liganden gebundenen Plättchen/mit ¹²&sup5;I markierten Antikörpern oder mit ¹²&sup5;I markierten Fab-Fragmenten zu ermöglichen. Die das Label enthaltenden Immunreaktionsprodukte wurden dann von ungebundenem, mit ¹²&sup5;I markiertem Antikörper oder Fab-Fragment durch Zentrifugieren des die Plättchen enthaltenden, aliquoten Anteiles durch einen Saccharosepolster, wie in Beispiel 9B beschrieben, abgetrennt.
Die Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse des Prüfens des Bindens von markiertem Antikörper an die Plättchen in Gegenwart von Liganden unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers PMI-1. Tabelle 5 Von dem jeweiligen Liganden abhängige Zunahme im Binden des PMI-1-IgG oder der Fab-Fragmente hiervon an die Plättchen Antikörper-Spezies Ligand Zunahme im gebundenen PMI-1 Unstimuliert Stimuliert
1) Die Zunahme in der Menge des gebundenen PMI-1 wird jeweils ausgedrückt als die pro Plättchen als gebunden beobachteten Moleküle des PMI-1 ± eine Standardabweichung, wobei die Zunahme gleich der in Gegenwart der Liganden gebundenen Menge minus der bei Fehlen des Liganden, aber in Anwesenheit von 2 mM CaCl und 1 mM MgCl gebundenen Menge ist. Die in Gegenwart zweiwertiger Kationen, aber ohne Liganden für unstimulierte bzw. stimulierte Plättchen gebundene Menge waren 6769 ± 84 bzw. 6643 ± 157 Moleküle/Plättchen für PMI-1-IgG, und 3917 ± 212 bzw. 3785 ± 150 Moleküle/Plättchen für PMI-1-Fab.
2) Der benützte Ligand war entweder eines der angegebenen, wie in Beispiel 5 beschrieben synthetisierten Polypeptide, welches zu dem in Beispiel 13A beschriebenen Immunreaktionsgemisch bis auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben worden war; oder es war dies das Kontroll-Polypeptid H-12, das die Aminosäurensequenz HHLGGAKQAGDV aufwies und das aus der Gamma-Kette des Fibrinogens, bei den Resten 399-410, stammte, und zwar ebenfalls in einer Konzentration von 1 mM; oder es war dies eine 4,5 mM EDTA, welche bei Fehlen eines Liganden-Polypeptides als Kontrolle zugegeben worden war. In allen Fällen, wo die EDTA nicht enthalten war, waren 2 mM CaCl und 1 mM MgCl enthalten.
3) N.D. = Nicht bestimmt ("Not Determined").
Die Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung des Bindens von Antikörpern an die Plättchen in Gegenwart von Liganden, und zwar unter Verwendung einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung, welche von dem Hybridom PMI-2 erzeugte, ganze Antikörpermoleküle (nämlich einen monoklonalen PMI-2-Antikörper) oder Fab-Fragmente hievon enthält. Tabelle 6 Ligand Zweiwertiges Ion Gebundener PMI-2 Unstimuliert Stimuliert Keiner
1) Die Menge des gebundenen PMI-2-IgG wurde wie in Beispiel 13A beschrieben bestimmt, und sie wird ausgedrückt als unter den angegebenen Immunreaktionsbedingungen pro Plättchen gebundene Moleküle des PMI-2.
2) Der benützte Ligand war eines der angegebenen Polypeptide, welches wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt worden war, und welches auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben worden war; oder es war dies ein Polypeptid, welches eine Sequenz aufweist, die der Sequenz der Gamma-Kette des Fibrinogens von der Resteposition 400 bis zu der Resteposition 411 (400-411) entspricht, und welches ebenfalls auf eine Konzentration von 0,5 mM zugegeben worden war; oder es war dies Fibrinogenprotein (Fg), welches wie von Marguerie et al, in J. Biol. Chem., 254 : 5357-5363 (1979), beschrieben isoliert worden war, und welches bei einer Endkonzentration von 15 µM verwendet worden war; oder es wurde als Kontrolle überhaupt kein Ligand zugesetzt.
3) Das zugesetzte zweiwertige Kation war entweder 1 mM CaCl oder 5 mM EDTA.
Die in den Tabellen 5 und 6 dargestellten Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Fibrinogens (Fg), des von dem Fg abgeleiteten Peptides, 400-411, und der RGD enthaltenden Peptide, das GPIIb-IIIa zu binden und zu bewirken, daß von entweder dem PMI- oder dem PMI-2 erkannte, kryptische, antigene Determinanten unter Bedingungen freigelegt werden, unter denen diese antigenen Determinanten normalerweise unterdrückt sind, nämlich in Gegenwart physiologischer Konzentration von CaCl.
Die Ergebnisse zeigen auch, daß die von dem PMI-2 erkannte, kryptische, antigene Determinante nur bei einem Liganden- Binden mit stimulierten Plättchen, aber nicht mit unstimulierden Plättchen, induzierbar ist. Im Gegensatz hierzu ist die von dem PMI-1 erkannte, kryptische, antigene Determinante bei dem Binden von Polypeptid-Liganden sowohl mit stimulierten als auch mit nicht-stimulierten Plättchen induzierbar.
Die Ergebnisse zeigen weiterhin auch die strukturelle Spezifität des Liganden für das GPIIb-IIIa an. Ein umgekehrtes Peptid, SDGR, induziert die von dem PMI-2 erkannte, antigene Determinante nicht, und ein konservativer Ersatz, bei welchem der normalerweise vorgefundene Asparaginsäurerest (D) durch einen Glutaminsäurerest (E) ausgetauscht wird, führt zu einem Peptid, welches als ein eine kryptische, antigene Determinante induzierender Ligand beträchtlich weniger wirksam ist.
Wurde in dem obigen Test auf das Binden von Antikörpern an die Plättchen die Konzentration des Polypeptid-Liganden, RGDS, variiert, so wurde eine Dosis-Antwort-Kurve für das durch den Liganden bewirkte Induzieren von kryptischen, antigenen Determinanten, welche auf entweder stimulierten Plättchen oder auf unstimulierten Plättchen vorhanden sind, erzeugt. Die Ergebnisse in Form der Dosis-Antwort-Kurve sind in der Fig. 5 dargestellte wobei entweder PMI-1-IgG oder PMI-2-IgG für den Nachweis der kryptischen, antigenen Determinante verwendet wurde, und wobei die Ergebnisse als Prozentsatz der LIBS-Induktion ausgedrückt sind. Die Menge des in Gegenwart des Polypeptides gebundenen IgG wurde als Prozentsatz der maximalen Menge an gebundenem IgG nach einem vollständigen, durch den Liganden bewirkten Induzieren von Bindungsstellen (LIBS) ausgedrückt, wobei das als Moleküle des IgG pro Plättchen in Gegenwart von 4,5 mM EDTA und bei Fehlen der Peptide gemessene Binden des IgG als 100%ige Induktion angesehen wurde, und wobei das Binden des IgG In Gegenwart von 2 mM CaCl und von 1 mM MgCl sowie bei Fehlen der Peptide als 0%ige Induktion angesehen wurde.
Die in der Fig. 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der Polypeptid-Ligand zwei verschiedene, kryptische, antigene Determinanten bei ähnlichen, halbmaximalen Ligandenkonzentrationen von etwa 2 mM induziert. Die Ergebnisse zeigen außerdem, daß zwar die von dem PMI-2 erkannte Determinante auf stimulierten Plättchen, aber nicht auf unstimulierten Plättchen, induzierbar war, daß aber die von dem PMI-1 erkannte, kryptische, antigene Determinante unter Verwendung des RGDS-Polypeptides sowohl auf stimulierten als auch auf unstimulierten Plättchen induzierbar war.
Bemerkt sei, daß zwar beide monoklonalen Antikörper PMI-1 und PMI-2 monoklonale Anti-LIBS-Antikörper sind, daß aber die Spezifitäten dieser zwei Antikörper unterscheidbar sind. So kann durch das Besetzen eines Rezeptors mit einem Liganden mehr als eine LIBS induziert werden. Demzufolge können die Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden, um mehr als eine unterschiedliche, monoklonale Antikörperspezies zu erzeugen, welche mit einem Zelloberflächenrezeptor-Liganden-Komplex immunreagiert.

B. Test auf das Binden der Antikörper mit löslichem, gereinigtem GPIIb-IIIa, welches kryptische, antigene Determinanten exprimiert

Die Fähigkeit von verschiedenen Polypeptid-Liganden, die Expression einer kryptischen, antigenen Determinante zu induzieren, wurde unter Verwendung von löslichem, isoliertem GPIIb- IIIa untersucht.
Zu diesem Zweck wurde der in Beispiel 7B beschriebene, kompetitive ELISA-Test mit den folgenden Ausnahmen durchgeführt. Die Mikrotiterplatten wurden unter Verwendung einer Überzugslösung überzogen, welche das wie in Beispiel 1 beschrieben isolierte GPIIb-IIIa in einer Konzentration von 10 µg/ml enthielt. Nach dem Blockieren wurden alle verwendeten Lösungen vor ihrer Verwendung, wie in Beispiel 13A für den Tyrodeschen Puffer beschrieben, mit Chelex 100 behandelt. Es wurden Immunreaktionsgemische hergestellt, welche enthielten:
(1) 1,5 nM von dem in Beispiel 5 beschrieben hergestellten PMI-1-IgG, oder von dem wie in Beispiel 7A beschriebenen Tab- Hybridom;
(2) 2 mM CaCl;
(3) das wie in Beispiel 1 beschrieben isolierte GPIIb-IIIa, welches für den Test mit dem PMI-1 auf eine Endkonzentration von 40 µg/ml zugegeben worden war, und welches für den Tab-Test auf 4 µg/ml zugegeben worden war; und
4) das Polypeptid in einer Konzentration von 1 mM. Die Immunreaktionsgemische wurden während 16 bis 20 h auf 22ºC gehalten, um die Bildung eines ersten, an eine feste Phase gebundenen Immunreaktionsproduktes zwischen dem an die feste Phase gebundenen GPIIb-IIIa und den beigemengten Antikörpern zu ermöglichen.
Die Ergebnisse der obigen Untersuchungen sind in der nachstehenden Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Expression von durch den PMI-1 definierten, kryptischen, antigenen Determinanten, welche durch das Binden von Liganden an in Lösung befindliches GPIIb-IIIa induziert worden waren Ligand % exprimiert Kontrolle Tab
1) Der exprimierte Prozentsatz stellt ein Maß für die auf dem GPIIb-IIIa vorhandene, kryptische, antigene Determinante dar, welche durch das Binden des Polypeptid-Liganden induziert worden ist. Die Daten werden als Prozentsatz der maximalen Determinantenexpression dargestellt, welche unter Verwendung von GPIIb-IIIa in Gegenwart von 5 mM EDTA erhalten worden ist. Die Anzahl der Messungen, welche unter den jeweiligen Bedingungen durchgeführt worden sind, sind in Klammern angegeben; und die angeführten Ergebnisse stellen den Mittelwert dieser Messungen ± der Standardabweichung dar.
2) Der zugesetzte Ligand war ein Polypeptid, welches wie in Beispiel 5 beschrieben synthetisiert worden war, und dessen Sequenz in dem aufgezeigten Einzelbuchstaben-Code angegeben ist. "Kontrolle" bedeutet, daß kein Polypeptid zugegeben worden war.
Die Ergebnisse in der Tabelle 7 zeigen, daß die RGD-enthaltenden Polypeptid-Liganden die Expression einer kryptischen, antigenen Determinante durch das GPIIb-IIIa in analoger Weise zu jener induzieren, die unter Verwendung intakter Plättchen beobachtet wird (siehe z. B. die Tabelle 6). Die Spezifität der durch Liganden induzierten Expression wurde unter Verwendung von Polypeptiden verifiziert, welche umgekehrte Sequenzen (SDGR) oder konservative Substitutionen (GRGESP) aufwiesen, und sie wurde weiterhin dadurch verifiziert, daß kein signifikanter Einfluß des Liganden auf das Binden des monoklonalen Tab-Antikörpers beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die durch Liganden induzierte Expression der von dem monoklonalen Antikörper PMI-1 erkannten, kryptischen, antigenen Determinante eine dem GPIIb-IIIa innewohnende Eigenschaft ist und nicht von der Verbindung des GPIIb-IIIa mit Plättchen abhängig ist.
Die obige Beschreibung, einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und der Beispiele, soll die vorliegende Erfindung bloß veranschaulichen, ist aber nicht als einschränkend aufzufassen. Vielmehr können daran zahlreiche Abänderungen und Modifikationen vorgenommen werden, ohne dadurch den Erfindungsgedanken und den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante, welches nicht mehr als etwa 50 Aminosäurenreste umfaßt und welches eine Aminosäurenrestesequenz enthält, welche der durch die Formel:

-PSPSPIHPAHHKRDRRQ-

dargestellten Sequenz entspricht, wobei dieses Polypeptid- Analogon befähigt ist, (a) die Aggregation von an Fibrinogen gebundenen Plättchen kompetitiv zu hemmen; oder (b) das Binden von PMI-1-Antikörpermolekülen (ATCC HB9476) an hGPIIb, wenn dieses hGPIIb als ein GPIIb-IIIa/Fibrinogen- Komplex vorliegt, kompetitiv zu hemmen.

2. Polypeptid-Analogon zu einer kryptischen hGPIIb-Determinante, welches eine durch die Formel:

PSPSPIHPAHHKRDRRQ

dargestellte Aminosäurenrestesequenz aufweist.

3. Monoklonale Antikörperzusammensetzung, welche Antikörpermoleküle enthält, welche mit dem hGPIIb und mit einem durch die Formel:

PSPSPIHPAHHKRDRRQ

dargestellten Polypeptid immunreagieren.

4. Antikörperzusammensetzung, welche im wesentlichen aus Antikörpermolekülen besteht, welche:

a) mit einem durch die Formel:

PSPSPIHPAHHKRDRRQ

dargestellten Polypeptid immunreagieren; und

b) mit einem durch die Formel:

REQNSLDSWGPKV

dargestellten Polypeptid im wesentlichen nicht immunreagieren.

5. Mit ATCC HB 9476 (PMI-1) bezeichnetes Hybridom, welches Antikörpermoleküle produziert, welche mit stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren.

6. Monoklonale Antikörperzusammensetzung, welche von dem Hybridom ATCC HB 9476 (PMI-1) produzierte Antikörpermoleküle enthält, die mit stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren.

7. Mit ATCC HB 9615 (PMI-2) bezeichnetes Hybridom, welches Antikörpermoleküle produziert, welche mit stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren.

8. Monoklonale Antikörperzusammensetzung, welche von dem Hybridom ATCC HB 9615 (PMI-2) produzierte Antikörpermoleküle enthält, die mit stimulierten, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren.

9. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf das Vorliegen eines Rezeptor-Liganden-Komplexes in einer Gefäßflüssigkeitsprobe, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, und welches System eine Packung umfaßt, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält, welche ihrerseits Antikörpermoleküle enthält, welche mit dem genannten Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, jedoch mit dem Zelloberflächenrezeptor oder dem Liganden, wenn jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren.

10. Diagnostisches System nach Anspruch 9, worin die Antikörpermoleküle mit einem Radionuklid markiert sind.

11. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf das Vorliegen eines Zellrezeptor-Liganden-Komplexes in vivo, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, und welches System eine Packung umfaßt, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält, welche ihrerseits Antikörpermoleküle enthält, welche mit dem genannten Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, jedoch mit dem Zelloberflächenrezeptor oder dem Liganden, wenn jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren, wobei die genannten Antikörpermoleküle an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind.

12. Diagnostisches System in Kitform zum Testen einer Gefäßflüssigkeitsprobe auf das Vorliegen von Plättchen, welche einen GPIIb-IIIa-Liganden-Komplex exprimieren, welches System eine Packung umfaßt, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - Anti-pIIb-IIIa-Antikörpermoleküle enthält, wobei die genannten Anti-GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle von dem Hybridom HB 9476 (PMI-1) oder HB 9615 (PMI-2) erzeugt worden sind.

13. Diagnostisches System nach Anspruch 12, wobei die Antikörpermoleküle mit einem Radionuklid markiert sind und als eine monoklonale Antikörperzusammensetzung vorliegen.

14. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf das Vorliegen eines Thrombus in vivo, welches System eine Packung umfaßt, welche - in einer Menge, welche zur Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält, welche von dem Hybridom HB 9476 (PMI-1) oder HB 9615 (PMI-2) erzeugte Anti- GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle enthält, wobei die genannten Antikörpermoleküle an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind.

15. Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers, der mit einer durch einen Liganden induzierten Bindungsstelle immunreagiert, welche ihrerseits durch einen Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind; und welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Immunisieren eines Säugetieres mit dem genannten Komplex;

(b) Entfernen von antikörperproduzierenden Zellen aus diesem immunisierten Säugetier und Herstellen einer Suspension dieser Zellen;

(c) Behandeln dieser Zellen mit einem eine Transformation bewirkenden Mittel zur Erzeugung transformierter, antikörpererzeugender Zellen,

(d) Klonieren der in der Stufe (c) behandelten Zellen durch beschränkende Verdünnung in einem Gewebekulturmedium, in welchem nichttransformierte Zellen nicht wachsen können, zur Erzeugung klonierter Transformanden;

(e) Durchprüfen des Gewebekulturmediums der klonierten Transformanden auf das Vorliegen sezernierter Antikörpermoleküle, welche mit dem genannten Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;

(f) Selektionieren eines klonierten Transformanden, welcher die genannten sezernierten Antikörpermoleküle produziert, und Züchten desselben in einem Gewebekulturmedium; und

(g) Ernten der sezernierten Antikörpermoleküle aus dem Kulturmedium des selektionierten und klonierten Transformanden.

16. Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers, der mit einer durch einen Liganden induzierten Bindungsstelle immunreagiert, welche ihrerseits durch einen Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind; und welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Immunisieren einer Maus mit dem genannten Komplex;

(b) Entfernen der Milz aus dieser Maus und Herstellung einer Suspension der Milzzellen;

(c) Fusionieren der Milzzellen mit Mäuse-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors zur Erzeugung von Antikörper- sezernierenden Hybridomen;

(d) Verdünnen und Kultivieren der fusionierten Zellen in getrennten Vertiefungen in einem Medium, in welchem die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht wachsen können;

(e) Durchprüfen des Überstandes in jeder ein Hybridom enthaltenden Vertiefung auf das Vorliegen sezernierter Antikörpermoleküle, welche mit dem genannten Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;

(f) Selektionieren und Klonieren eines diese Antikörpermoleküle sezernierenden Hybridoms; und

(g) Ernten der Antikörpermoleküle aus dem Überstand über den Klonen.

17. Verfahren zum Ausbilden eines monoklonalen Antikörpers, der mit einer durch einen Liganden induzierten Bindungsstelle immunreagiert, welche ihrerseits durch einen Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, wobei dieser Komplex einen Oberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Immunisieren einer Maus mit dem genannten Komplex;

(c) Fusionieren dieser Milzzellen mit Mäuse-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors zur Erzeugung von Antikörper- sezernierenden Hybridomen;

(e) Durchprüfen des Überstandes in jeder ein Hybridom enthaltenden Vertiefung auf das Vorliegen sezernierter Antikörpermoleküle, welche mit dem genannten Zelloberflächenrezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;

(f) Selektionieren und Klonieren eines diese Antikörpermoleküle sezernierenden Hybridoms;

(g) Transferieren dieser Klone, intraperitoneal, in eine Maus; und

(h) Ernten des Aszites oder von Serum aus dieser Maus, wenn der Aszites oder das Serum den gewünschten Antikörper enthält.

18. Verfahren für den in-vivo-Nachweis des Vorliegens eines Rezeptor-Liganden-Komplexes, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Intravenöses Verabreichen einer wirksamen Menge einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung an ein Human-Subjekt, welche Zusammensetzung ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel und Antikörpermolekülmittel enthält, welche mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nicht-gebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren, wobei die genannten Antikörpermoleküle an ein in-vivo-Anzeigemittel gebunden sind;

(b) Verharrenlassen des Subjektes, an welches die Zusammensetzung verabreicht wurde, während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die Antikörpermoleküle mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex in vivo immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden; und

(c) Testen auf das Vorliegen irgendeines in der Stufe (b) gebildeten Immunreaktionsproduktes und dadurch auf das Vorliegen des Komplexes in dem Subjekt.

19. Verfahren zum Testen auf das Vorliegen eines Rezeptor- Liganden-Komplexes in einer Gefäßflüssigkeitsprobe, wobei dieser Komplex einen Zelloberflächenrezeptor und einen Liganden enthält, welche jeweils spezifisch gebunden sind, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Ausbilden eines Immunreaktionsgemisches durch Vermischen einer Gefäßflüssigkeitsprobe mit einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung, welche Antikörpermoleküle enthält, die mit dem genannten Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren, aber mit dem Zelloberflächenrezeptor oder mit dem Liganden, wenn ein jeder dieser beiden in nichtgebundener Form vorliegt, nicht immunreagieren;

(b) Aufrechterhalten des Gemisches während einer Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die genannten Antikörper mit jedwedem, in der Probe vorhandenem Rezeptor-Liganden-Komplex immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden, und

(c) Nachweisen des Vorliegens irgendeines in der Stufe (b) ausgebildeten Immunreaktionsproduktes und dadurch des Vorliegens des Komplexes in der Probe.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Zelloberflächenrezeptor des Komplexes ein Zytoadhäsin ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Zytoadhäsin das Plättchen-Glykoprotein GPIIb-IIIa ist.

22. Verfahren zum Testen einer plättchenhältigen Gefäßflüssigkeitsprobe auf das Vorliegen von Plättchen, welche einen GPIIb-IIIa-Liganden-Komplex exprimieren, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Ausbilden eines Immunreaktionsgemisches durch Vermischen einer Gefäßflüssigkeitsprobe mit einer wirksamen Menge einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung, welche von dem Hybridom HB 9476 (PMI-1) und HB 9615 (PMI-2) produzierte Anti-GPIIb-IIIa-Antikörpermoleküle enthält;

(b) Aufrechterhalten des Gemisches während einer Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die genannten Antikörper mit jedweden, in der Probe vorhandenen, an Fibrinogen gebundenen Plättchen immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt bilden; und

(c) Nachweisen des Vorliegens von jedwedem, in der Stufe

b) gebildetem Immunreaktionsprodukt.