DE3856560T2

DE3856560T2 - Dem menschlichen gewebefaktor ähnliche dns-segmente, polypeptide und antikörper

Info

Publication number: DE3856560T2
Application number: DE3856560T
Authority: DE
Inventors: S. Thomas EDGINGTON; H. James MORRISSEY
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2008-03-30
Also published as: DK175703B1; WO1988007543A1; EP0309548B1; DE3856560D1; ATE246200T1; FI954347A0; AU1627488A; AU605864B2; EP0309548A4; US5622931A; CA1340544C; DK666888D0; EP1364969A3; FI885543L; NO885326L; FI100184B; NO885326D0; DK666888A; NO305211B1; PT87138B

Description

Querverweis auf eine korrespondierende Anmeldung
Dieses ist eine Teilfortführungsanmeldung der korrespondierenden anhängigen Anmeldungen mit der Seriennummer 033,047, die am 31. März 1987 angemeldet wurde und der Seriennummer 067,103, die am 25. Juni 1987 angemeldet wurde.
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül (rDNA), das ein strukturelles Gen trägt, das das schwere Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors (huTFh) kodiert. Insbesondere betrifft diese Erfindung einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, huTFh in Wirtszellen zu exprimieren, die diesen Vektor enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein synthetisches Polypeptidanalogon von huTFh und monoklonale Antikörper, die huTFh und die Polypeptidanaloga binden.
Hintergrund der Erfindung
Die Gerinnung von Blut involviert eine serielle Kaskade von Enzym-, Kofaktor-, proteolytischen und Gelierungsreaktionen; die durch eine Gruppe zellulärer und Plasmaproteine vermittelt wird, die als Koagulationsfaktoren bekannt sind. Die Einleitung dieser Kaskade kann vorkommen, wenn der zelluläre Rezeptor, der als Gewebefaktor (tissue factor, TF) bekannt ist, den Koagulationsfaktor VII oder dessen Derivat, Faktor VIIa, bindet, um einen katalytisch aktiven Komplex auszubilden. In der Abwesenheit von TF und ohne die fortgesetzte Bindung in einem Komplex leitet der Faktor VII/VIIa die Koagulation nicht ein. Daher ist die chemische und biologische Charakterisierung von TF zum Verständnis des Mechanismus der Koagulation eindeutig von Bedeutung.
Der Gewebefaktor ist ein membrangebundenes Glykoprotein, das normalerweise in der Zirkulation nicht löslich zu finden oder für Plasmaproteine, einschließlich Faktor VII/VIIa und andere Koagulationsfaktoren, zugänglich ist. Während der Gewebefaktor normalerweise nicht auf der Oberfläche von Zellen, die das Gefäßsystem ausbilden, exprimiert wird, kann seine Expression durch Monozyten innerhalb des Gefäßsystems durch Bestandteile infektiöser Agenzien wie bakterielle Lipopolysaccharide, Lymphokine, die aus Antigen – stimulierten T-Helferzellen abgeleitet sind, direkt durch einige T-Helferzellen und Immunkomplexe induziert werden. Bestimmte entzündliche Mediatoren von Monozyten/Makrophagenursprung, z. B. Interleukin 1 und Tumornekrosefaktor Alpha sowie bakterielle Lipopolysaccharide, können endotheliale Zellen stimulieren, die die humorale Oberfläche von Blutgefäßen auskleiden, um TF zu exprimieren. Die Expression von TF in dem Gefäßkompartiment resultiert typischerweise in verbreiteter intravaskulärer Koagulation oder der lokalisierten Einleitung der Gerinnung, d. h., der Thromogenese.
Der Gewebefaktor wird konstitutiv auf der Oberfläche einiger extravaskulärer Zellen in in vitro – Kultur exprimiert, einschließlich Fibroblasten, einigen bisher nicht identifizierten Arten von Gehirnzellen und bestimmten Epithelien, die von den zirkulierenden Plasmaproteinen durch Membranbarrieren abgetrennt sind. Die Gegenwart von TF auf diesen Zellen als Ergebnis eines Gewebeschadens resultiert in einer Gerinnungsbildung nach Kontakt mit Blut. Somit ist TF die Grundlage, auf der das hemostatische System eingeleitet wird.
Der Bericht von Howell, Am. J. Physiol, 31:1 (1912) war der erste, der vorgeschlagen hat, dass eine isolierte Gewebeproteinzubereitung, die TF enthält, die Koagulation nur unterstützen könnte, wenn dieses als Phospholipidprotein (Lipoprotein) – Komplex vorhanden ist. Die Rekonstituierung der funktionellen pro-koagulatorischen Aktivität von TF durch Relipidieren des isolierten Proteins war notwendig, da die Isolierung des TF-enthaltenden Gewebeproteins typischerweise in dem Entfernen der Phospholipide resultierte, die normalerweise mit dem TF-Protein assoziiert sind. Eine solche Rekonstituierung wurde durch eine Anzahl von Forschem untersucht. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Wiederherstellung der koagulatorischen Aktivität durch den Phospholipidtyp, das Verhältnis Phospholipid zu Protein und das Detergenz und die ionische Zusammensetzung der Wiederherstellungsmischung beeinflusst wird. Siehe Nemerson, J. Clin. Invest., 47 – 72 (1968); Nemerson, J. Clin. Invest., 48 – 322 (1969); und Carson et al., Science, 208:307 (1980).
Sowohl isolierte wie auch relipidierte TF-enthaltende Proteinzubereitungen wurden durch Extraktion aus den Geweben verschiedener Spezies hergestellt. Historisch betrachtet, waren die verwendeten Verfahren schwierig, zeitaufwendig und resultierten in geringen Ausbeuten, da der Gewebefaktor nur in extrem kleinen Mengen in natürlich vorkommenden Geweben vorhanden ist. Für einen Überblick der klassischen Verfahren, siehe Nemerson et al., Prog. Hem. Thromb., 6:237 – 261 (1982).
In jüngerer Zeit haben Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917 – 20 (1985), Bom et al., Thromb. Res., 42:635 – 643 (1986) und Guha et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83:299 – 302 (1986) die Isolierung des menschlichen Gewebefaktor (huTF) – Proteins unter Verwendung eines Verfahrens berichtet, das auf der Entdeckung basiert, dass entlipidisiertes Gewebefaktorprotein den Faktor VII/VIIa binden kann, wenn das Protein in einer wässrigen Lösung solubilisiert wird, die ein nichtionisches Detergenz und CaCl₂ enthält. Jedoch ist die Verwendung dieses Verfahrens, das ein Faktor VII/VIIa Affinitätsabsorbtionsmittel als ein Mittel zur Isolierung von Gewebefaktorprotein einsetzt, nicht nur durch die Schwierigkeit der Gewinnung wesentlicher Mengen isolierten Faktors VII/VIIa, sondern auch durch die Labilität des Faktors VII/VIIa eingeschränkt.
Broze et al., supra, haben vorgeschlagen, dass die Entwicklung monoklonaler Antikörper, die für huTF spezifisch sind und deren Verwendung als Immunaffinitätsabsorbtionsmittel, die Probleme umgehen könnten, die durch die eingeschränkte Verfügbarkeit des Faktors VII/VIIa bedingt sind. Jedoch wurden keinerlei Anti-huTF monoklonaler Antikörper in der Literatur berichtet. Des Weiteren immunreagieren zwei monoklonale Antikörper, die gegen Rinder TF [Carson et al., Blood, 662 – 156 (1985)] gezüchtet wurden, nicht mit huTF (Guha et al., supra).
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung ein DNA-Segment vor, das nicht mehr als ungefähr 12000 Nukleotidbasenpaare umfasst, einschließlich einer Sequenz, die ein strukturelles Gen definiert, das für ein schweres Ketten (huTF) – Protein des menschliches Gewebefaktors kodiert. Vorzugsweise kodiert das strukturelle Gen für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die durch 1 von ungefähr Rest 1 bis ungefähr Rest 263 dargestellt wird. Mehr bevorzugt hat das strukturelle Gen eine Nukleotidbasesequenz, die durch 2 von ungefähr Base 130 bis ungefähr Base 918 dargestellt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das DNA-Segment auch eine zweite Sequenz, die sich an den 5'-Terminus der ersten Sequenz anschließt und für eine Aminosäureleadersequenz kodiert, die an den Aminoterminus des huTFh-Proteins angebracht ist. Die ersten und zweiten DNA-Sequenzen definieren zusammen ein zusammengesetztes strukturelles Gen, das für ein schweres Kettenvorläufer (pre-huTFh) – Protein des menschliches Gewebefaktors kodiert. Vorzugsweise kodiert das zusammengesetzte strukturelle Gen für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die durch 1 von ungefähr Rest –32 bis ungefähr Rest 263 dargestellt wird. Mehr bevorzugt hat das zusammengesetzte strukturelle Gen eine Nukleotidbasensequenz, die durch 2 von ungefähr Base 34 bis ungefähr Base 918 dargestellt wird.
In einer anderen Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül vor, das einen Vektor umfasst, der operativ an ein erstes DNA-Segment gebunden ist, das ein strukturelles Gen definiert, das für ein schweres Kettenprotein des menschliches Gewebefaktors kodiert. Vorzugsweise umfasst das rekombinante DNA-Molekül des Weiteren ein zweites DNA-Segment, das sich an den 5'-Terminus des ersten Segments anschließt und für eine Aminosäureleadersequenz kodiert, die an besagtes Protein gebunden ist; besagte erste und zweite DNA-Segmente definieren zusammen ein zusammengesetztes strukturelles Gen, das eine Vorläuferform von besagtem Protein kodiert.
In einer anderen Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung ein Polypeptidanalogon einer menschlichen Gewebefaktorbindungsstelle vor, das nicht mehr als 50 Aminosäurereste umfasst und eine Aminosäuresequenz einschließt, die mit einer Sequenz korrespondiert, die durch die Formel: -VNQVYT- dargestellt wird.
Mehr bevorzugt schlägt die vorliegende Erfindung ein Polypeptidanalogon einer menschlichen Gewebefaktorbindungsstelle vor, das nicht mehr als 50 Aminosäurereste umfasst und eine Aminosäuresequenz einschließt, die mit einer Sequenz korrespondiert, die durch eine Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe bestehend aus:
ausgewählt ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörpermoleküle, die:

a) mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors immunreagieren;
b) mit einem Polypeptid immunreagieren, das durch eine Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe bestehend aus:
c) die nicht wesentlich mit einem Polypeptid immunreagieren, das durch die in 1 von Position 204 bis Position 226 gezeigte Formel dargestellt wird.

Auch werden von der vorliegenden Erfindung die Hybridomazellen TF8-5G9, TF9-10H10, TF9-5B7 und TF9-6B4 sowie monoklonale Antikörperzusammensetzungen, die Antikörpermoleküle umfassen, die durch diese Hybridomazellen hergestellt werden, vorgeschlagen.
Die vorliegende Erfindung schlägt auch ein Verfahren zur Untersuchung auf das Vorhandensein des schweren Ketteproteins des menschlichen Gewebefaktors in einer Körperflüssigkeitsprobe vor, umfassend die Schritte des:

a) Vermischens einer Körperprobe mit Antikörpern, die mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors immunreagieren, um eine Immunreaktionsmischung auszubilden;
b) die Aufbewahrung der Mischung für einen Zeitraum, der für besagte Antikörper ausreichend ist, um mit jeglichem in der Probe vorhandenen menschlichen Gewebefaktor zu immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt auszubilden; und
c) das Nachweisen des Vorhandenseins eines Immunreaktionsproduktes, das in Schritt b ausgebildet wurde.

Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis eines Thrombus in vivo vorgeschlagen, das die Schritte:

a) der intravenösen Verabreichung einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung an ein menschliches Subjekt, die ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel und eine Menge Antikörpermoleküle, die durch die Hybridomazelle TF9-10H10 hergestellt werden, die mit einem in vivo anzeigenden Mittel verbunden sind, umfasst, die dahingehend wirksam sind, dass sie mit dem menschlichen Gewebefaktor immunreagieren, der in einem Thrombus vorhanden ist;
b) des Aufbewahrens des verabreichten Subjekts für einen vorbestimmten Zeitraum, der für die Antikörpermoleküle ausreicht, um mit dem Gewebefaktor zu immunreagieren, der in vivo als Teil eines Thrombus vorhanden ist und ein Immunreaktionsprodukt auszubilden; und
c) das Untersuchen auf die Gegenwart eines Immunreaktionsproduktes, das in Schritt (b) gebildet wurde; umfasst.

Des weiteren wird ein Verfahren zur Neutralisierung der Fähigkeit des menschlichen Gewebefaktors, an den Koagulationsfaktor VII/VIIa in vivo zu binden, vorgeschlagen, das die intravenöse Verabreichung einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung an ein menschliches Subjekt umfasst, die ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst, das eine Menge Antikörpermoleküle enthält, die durch eine Hybridomzelle hergestellt werden, die aus der Gruppe bestehend aus TF8-5G9 und TF9-6B4 ausgewählt ist, die dahingehend wirksam sind, dass sie den vorhandenen menschlichen Gewebefaktor binden.
Die vorliegende Erfindung schlägt auch ein Verfahren zur Inhibierung der Bindung des menschlichen Gewebefaktors an den Koagulationsfaktor VII/VIIa in vivo vor, umfassend die intravenöse Verabreichung einer Polypeptidzusammensetzung an ein menschliches Subjekt, die ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst, das ein Polypeptid enthält, das aus der Gruppe bestehend aus:
ausgewählt ist, wobei besagtes Polypeptid in besagter Zusammensetzung in einer Menge vorhanden ist, die wirksam ist, um mit Faktor VII/VIIa zu reagieren.
In einer anderen Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung ein diagnostisches System in Kit-Form zur Untersuchung des Vorhandenseins des schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors in einer Probe vor, das eine Verpackung, die eine Antikörperzusammensetzung dieser Erfindung enthält, umfasst.
Vorzugsweise umfasst die Antikörperzusammensetzung monoklonale Antikörpermoleküle, die durch eine Hybridomzelle hergestellt werden, die aus der Gruppe der Hybridomzellen, bestehend aus:

a) TF8-5G9,
b) TF9-6B4,
c) TF9-10H10 und
d) TF9-5B7

Es wird auch ein Verfahren zur Isolierung des Blutkoagulationsfaktors VII/VIIa aus einer Probe vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst die Schritte des:

a) Vermischens der Probe mit einem festen Träger, der ein Polypeptid von Anspruch 15 umfasst, das an einer festen Matrix befestigt ist, wobei die Mischung eine Bindungsreaktionsmischung ausbildet;
b) die Aufbewahrung besagter Bindungsreaktionsmischung für einen Zeitraum, der für besagten Koagulationsfaktor zur Bindung an besagtes Polypeptid ausreichend ist und einen festen Phasenkomplex und einen Überstand ausbildet;
c) das Abtrennen des Überstands vom Komplex; und
d) die Rückgewinnung des Koagulationsfaktors aus dem abgetrennten Komplex von Schritt c).

Des weiteren wird eine Zusammensetzung vorgeschlagen, die eine wässrige Lösung eines biologisch aktiven schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors umfasst, die im wesentlichen frei von dem leichten Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors ist. Vorzugsweise ist das biologisch aktive schwere Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors in einem Phospholipid oder einem nicht-ionischen Detergenz dispergiert.
Es wird auch ein diagnostisches System in Kitform zur Untersuchung der Koagulationskompetenz in einer Flüssigkeitsprobe des vaskulären Systems vorgeschlagen. Es umfasst eine Verpackung, die eine Zusammensetzung einer wässrigen Lösung des biologisch aktiven schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors umfasst, die im wesentlichen frei von dem leichten Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors ist, wobei besagtes schweres Kettenprotein in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, um mindestens einen Assay durchzuführen. Vorzugsweise ist das schwere Kettenprotein in einem Phospholipid dispergiert.
In einer anderen Ausführungsform werden ein Verfahren zur Herstellung eines reifen schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors und das Proteinexpressionsprodukt dieses Verfahrens vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst die Schritt des:

a) Initiierens einer Kultur von Säugetierzellen in einem Nährmedium, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das einen Expressionsvektor umfasst, der zu besagten Zellen kompatibel ist, der operativ mit einem ersten DNA-Segment verbunden ist, das ein strukturelles Gen definiert, das für ein schweres Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors kodiert, und einem zweiten DNA-Segment, das zu dem 5'-Terminus von dem ersten Segment benachbart liegt und für eine Aminosäureniedersequenz kodiert, die mit dem Protein verbunden ist; wobei die ersten und zweiten DNA-Segmente zusammen ein zusammengesetztes strukturelles Gen definieren, das eine Vorläuferform des besagten Proteins kodiert;
b) die Aufbewahrung besagter Kultur für einen Zeitraum, der ausreicht, damit die Zellen ein Protein aus dem rekombinanten DNA-Molekül exprimieren und das reife Protein ausbilden; und
c) die Rückgewinnung des reifen Proteins aus der Kultur.

Kurze Zusammenfassung der Zeichnungen
Die Zeichnungen bilden einen Teil dieser Offenbarung:
1 illustriert die vollständige Aminosäuresequenz der reifen und Vorläuferformen der schweren Kettenproteine des menschlichen Gewebefaktors (jeweils huTFh und pre-huTFh), die von links nach rechts und in der Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus unter Verwendung des Einzelbuchstabeaminosäurekodes gezeigt werden. Die Aminosäuresequenz der hauptsächlich natürlich vorkommenden reifen Proteinform ist als 1 – 263 nummeriert. Die Sequenz der weniger häufig zu findenden reifen Form beginnt bei Aminosäurerest Nummer 3 und endet bei Rest 263.
Die Aminosäuresequenz, die mit der Leadersequenz (Vorläuferteil) des pre-huTFh-Proteins korrespondiert, die während des Reifungsprozesses entfernt wird, wird durch negative Zahlen bezeichnet. Die extrazelluläre Domäne und die Transmembranankerregion korrespondieren jeweils mit den Restepositionen 1 – 219 und 220 – 242.
2 illustriert die Nukleotidsequenz einer cDNA, die für die pre-huTFh- und huTFh-Proteine kodieren, gezeigt von links nach rechts und in der Richtung vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus unter Verwendung des Einzelbuchstabennukleotidbasenkodes. Das strukturelle Gen für huTFh fängt an der Base 130 an und endet an der Base 918.
Der Leserahmen wird durch das Plazieren der hergeleiteten Aminosäuresequenz oberhalb der Nukleotidsequenz angezeigt, so dass der Einzelbuchstabe, der jeden Aminosäurerest darstellt, oberhalb der mittleren Base des korrespondierenden Kodons lokalisiert ist.
3 ist eine Grafik, die den zur Messung der huTF prokoagulatorischen Aktivität verwendeten Koagulationsassay, wie er in Beispiel 2 beschrieben wird, illustriert. Es wird eine Log-Log-Grafik der menschlichen zitratversetzten Plasmakoagulations- (Gerinnungs-) zeit in Sekunden gegen die Konzentration des menschliche Gewebefaktor (huTF) Konzentration in Pikogramm pro Milliliter (pg/ml) gezeigt.
4 illustriert ein Autofluorogramm des Faktor VII/VIIa affinitätsisolierten huTFs, das in einem 10% Polyacrylamidgel elektrophoretisch behandelt wurde. Bahn A zeigt ¹²⁵I-markiertes huTF, das isoliert und mit Dithiothreitol (DTT) vor der Elektrophorese, wie in Beispiel 4 beschrieben, reduziert wurde. Bahn B zeigt Molekulargewichtsstandards mit apparenten Molekulargewichten, die in Kilodalton (k) angezeigt werden.
5 illustriert ein Autofluorogramm des Faktor VII/VIIa affinitätsisolierten huTFs, das in einem 15%-igen Polyacrylamid elektrophoretisch behandelt wurde. Die Isolierung, Markierung mit ¹²⁵I und die Elektrophorese von huTF wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Bahn A zeigt das isolierte huTF nach Reduktion mit DTT. Bahn B zeigt die gleiche Probe, die ohne Reduktion mit DTT elektrophoretisch behandelt wurde. Die oberen und unteren (mit „U" und „L^„ markierten) Banden korrespondieren mit den ungefähr 58 und 47 K Größenformen von huTF. Nach Autofluorographie wurden die oberen und unteren Banden ausgeschnitten, in SDS-Probenpuffer, der DTT enthält, rehydratisiert, in die Probenvertiefung eines zweiten 15%-igen Polyacrylamidgels eingeführt und einer Elektrophorese unterzogen. Bahn C zeigt die erneute Elektrophorese der unteren Bande, die aus Bahn B erhalten wurde. Spalte D zeigt die erneute Elektrophorese der oberen Bande, die aus Bahn B erhalten wurde. Die 12,5 und 47 Kilodalton (k) apparent molekulargewichtigen Proteine werden durch die Pfeile angezeigt.
6 illustriert ein Autofluorogramm des Faktor VII/VIIa affinitätsisolierten huTFs, das zuerst mit dem huTF-spezifischen monoklonalen Antikörper TF8-5G9 immunpräzipitiert worden war und dann in einem 8–17%igen Polyacrylamidgradientengel wie in Beispiel 4 beschrieben elektrophoretisch behandelt wurde. Bahn A zeigt ¹²⁵I-markiertes huTF, das nach DTT-Reduktion elektrophoretisch behandelt wurde. Bahn B zeigt die gleiche Probe, die ohne Reduktion elektrophoretisch behandelt wurde.
7 illustriert eine Autofluorogramm des Faktor VII/VIIa affinitätsisolierten huTFs, das in 15% Acrylamidgelen elektrophoretisch behandelt wurde. Die Isolierung, Markierung mit ¹²⁵I, Reduktion und Deglykosylierung wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Bahn 1 enthält die folgenden Proteinstandards, die als Marker mit apparentem Molekulargewichten (Mr) elektrophoretisch behandelt wurden, die in Kilodalton gezeigt werden; Lysozym, 14,3; Carbonsäureanhydrase, 30,0; Ovalbumin, 46,0; Rinderserumalbumin, 69,0; Phosphorylase b, 92,5; und Myosin, 200,0, alle von Amersham, Arlington Heigths, IL. erhalten. ¹²⁵I-huTF-enthaltende Proben wurden entweder mit DTT (Bahnen 2 und 3) oder ohne DTT (Bahnen 4 und 5) elektrophoretisch behandelt. Einige dieser ¹²⁵I-huTF-enthaltenden Proben wurden deglykolyliert (Bahnen 3 und 5), während andere vor der Elektrophorese nicht deglykosyliert (Bahnen 2 und 4) wurden.
Die ¹²⁵I-huTF-enthaltenden Proben, die in Bahnen 3 und 5 laufen gelassen wurden, wurden vor der Elektrophorese deglykosyliert, während die in Banden 2 und 4 dieses nicht wurden.
8 illustriert ein Autofluorogramm von immunaffinitäts-isoliertem huTF, das wie in Beispiel 9 beschrieben in 10%-igen Polyacrylamidgelen elektrophoretisch behandelt wurde. Bahn 1 enthält die folgenden Proteinstandards, die als Marken mit apparenten Molekulargewichten (Mr) elektrophoretisch behandelt wurden, die in Kilodalton angezeigt sind; Cytochrom C, 12,4; Lactoglobulin, 18,4; Carbonsäureanhydrase, 29,0; Laktatdehydrogenase, 36,0; Ovalbumin, 43,0; Glutamatdehydrogenase, 55,0; und Phosphorylase b, 95,5, die alle von Diversified Biotech (Newton Centre, MA) erhalten wurden.
Bahn 2 enthält ungefähr 20 μg Protein, wie unter Verwendung des BCA-Proteinassayverfahrens von Smith et al., Anal. Bioch., 150:76 – 85 (1985) bestimmt wurde und das unter Verwendung von DTT reduziert wurde. Die huTF schwere Kette (huTFh) ist bei ungefähr 47 Mr deutlich sichtbar und die huTF leichte Kette ist bei ungefähr 12,5 Mr schwach sichtbar. Protein wurde durch Färbung mit Coomassie-Blau, wie durch Laemmli, Nature, 227; 680 – 685 (1970) beschrieben, sichtbar gemacht.
9 ist eine Grafik, die die Dosis-Reaktionskurve der Inhibierung der huTF-iniziierten Koagulation durch nicht phospholipidierte (nicht lipidversetzte) Polypeptidanaloga von huTFh illustriert. Es wurde die Prozent-Inhibierung der Koagulation durch verschiedene Konzentrationen nicht lipidierter Polypeptide wie in Beispiel 12 beschrieben gemessen. Getestete Polypeptide umfassen p26-49 (Δ, TF26.49), p121-155 (O, TF121.155), p146-167 (
, TF146.167) und p204-226
, TF204.226).
10 ist eine Grafik, die die Dosis-Reaktionskurve der Inhibierung von huTF-initiierter Koagulation durch phospholipidierte (lipidversetzte) Polypeptidanaloga von huTFh illustriert. Die Prozent-Inhibierungen wurden durch die gleichen Verfahren und für die gleichen Analoga, wie sie in 9 beschrieben werden, gemessen.
11 illustriert die Restriktionskarten der EcoRI-Segmentinserts innerhalb der rekombinanten DNA-Plasmide pCTF64, pCTF314 und pCTF403. Die Inserts (☐☐) stellen überlappende Teile der Nukleotidsequenzen dar, die zusammen mit der vollständigen Nukleotidsequenz des pre-huTFh-Gens korrespondieren. Einzeln umfassen die Inserts Nukleotidreste, die von links nach rechts und in der Richtung vom 5' zum 3' zu der Nukleotidsequenz korrespondieren, die in 2 durch die Basenresten 1 – 486 gezeigt werden (enthalten in pCTF64), Reste 135 – 775 (enthalten in pCTF314) und Reste 776 – 1125 (enthalten in pCTF403). Es wird auch die ungefähre Position der Ristriktionsendonukleasespaltstellen innerhalb des Inserts gezeigt, die in der Konstruktion der verschiedenen rekombinanten DNA-Moleküle verwendet wurden, wie in Beispiel 16 beschrieben werden. Des weiteren wird die ungefähre Position des korrespondierenden pre-huTFh-Proteins mit seinem Leaderpeptid (☐) und die Transmembranankerdomäne (☐) intakt gezeigt.
12 ist eine Grafik, die die Dosis-Reaktionskurve der Inhibierung der huTF-initiierten Koagulation durch nicht phospholipidierte (nicht lipidversetzte) Polypeptidanaloga von huTFh illustriert. Die Prozent-Inhibierung (%) der Koagulation durch verschiedene Konzentrationen, die in der Molarität (M) von nicht lipidierten Polypeptiden ausgedrückt werden, wurde wie in Beispiel 12 beschrieben gemessen. Untersuchte Polypeptide umfassen p24 – 35 (Δ), p26 – 49 (
), p152 – 169 (☐) und die Peptide p40 – 71, p72 – 104, p94 – 123 und p161 – 189, die alle im wesentlichen keine Inhibierung aufzeigten und kollektiv durch geschlossene Kreise
gezeigt werden.
13 ist eine Grafik, die die Kinetiken der Inhibierung der Koagulation durch eine TF8-5G9-Antikörper-Zusammensetzung illustriert. Die Prozent-Inhibierung (%) der Koagulation wird über verschiedene Antikörperimmunreaktionszeiten grafisch aufgetragen, die wie in Beispiel 18 gemessen wurden.
14 ist eine Grafik, die die Dosis-Reaktion der Inhibierung der huTF-initiierten Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper zeigt. Die Prozent-(%)-Inhibierung der Koagulation durch verschiedene Konzentrationen des Anti-huTF-monoklonalen Antikörpers TF8-5G9 wurde wie in Beispiel 19 beschrieben gemessen.
15 ist eine Grafik, die die Dosis-Reaktion der Inhibierung der huTF-iniziierten Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper illustriert, wobei die Quelle von huTF ein menschliches Zellysat der Fibroblastenzelllinie GM1381 ist. Die Prozent-Inhibierung (%) der Koagulation durch verschiedene Konzentrationen des Anti-huTF-monoklonalen Antikörpers TF8-5G9 wurde wie in Beispiel 19 beschrieben gemessen. Offene Kreise (
) zeigen den TF8-5G9-Antikörper und geschlossene Kreise (
) zeigen einen irrelevanten Antikörper.
16 illustriert die Inhibierung der pro-koagulatorischen Aktivität von aufgereinigtem menschlichen Gehirn TF durch den Anti-TF monoklonalen Antikörper TF8-5G9. Die Gerinnungsaktivität von aufgereinigtem menschlichen Gehirn TF, das in Phospholipidvesikeln rekonstituiert worden war, wurde nach Vorinkubation für 30 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von aufgereinigtem IgG bestimmt. Kreise stehen für den Anti-TF-Antikörper TF8-5G9; Dreiecke stehen für einen irrelevanten Kontrollantikörper Pab100. Die Daten werden als Prozent-Inhibierung relativ zu der in der Abwesenheit von hinzugefügtem Antikörper beobachteten Aktivität ausgedrückt.
17 illustriert die Inhibierung der Faktor VII-Bindung an und Faktor Xa-Bildung durch kultivierte J82 Blasenkarzinomzellen, die mit aufgereinigten Anti-TF monoklonalen Antikörpern behandelt wurden. Die Werte für die Inhibierung der Geschwindigkeit der Faktor Xa-Bildung werden durch Dreiecke dargestellt; Werte für die Inhibierung der Faktor VII-Bindung werden durch Kreise dargestellt. Die Daten werden als Prozent-Inhibierung relativ zu den Werten, die für Zellen erhalten wurden, die ohne hinzugefügten Antikörper inkubiert worden waren, ausgedrückt. Bereich A, Wirkung des Antikörpers TF9-2C4; Bereich B, Wirkung des Antikörpers TF9-5B7.
18 illustriert eine Westernblotanalyse des immunaffinitätsisolierten huTFs, wie sie in Beispiel 25 beschrieben wird. 15% Polyacrylamidgele wurden wie folgt beladen. Bahn 1 enthält Molekulargewichtstandards mit apparenten Molekulargewichten, die links vom Bereich A in Kilodaltons (k) gezeigt werden; Bahn 2 enthält 1 μg aufgereinigtes menschliches Hämoglobin, das vor der Elektrophorese reduziert wurde; Bahn 3 enthält 0,5 μg isoliertes huTF, das vor der Elektrophorese reduziert wurde; und Bahn 4 enthält 0,5 μg nicht reduziertes und isoliertes huTF. Nach SDS-PAGE wurden die resultierenden Proteinbanden elektrophoresisch auf Nitrozellulose transferiert. Die so gebildeten Westernblots wurden mit 0,2 μg/ml affinitätsaufgereinigtem Kaninchen-Anti-huTF IgG (Abschnitt A), 1 μg/ml Kaninchen-Anti-Hämoglobin IgG (Abschnitt B), oder 1 μg/ml nicht immunes Kaninchen IgG (Abschnitt C) immunreagiert. Die apparenten Molekulargewichte der immungefärbten Banden werden rechts in kDa angezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen
Aminosäuren
Alle hierin identifizierten Aminosäurereste liegen in der natürlichen L-Konfiguration vor. Unter Beibehaltung der Standardpolypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243:3557 – 59, (1969), werden die Abkürzungen für Aminosäurereste in der folgenden Korrespondenztabelle gezeigt:
KORRESPONDENZTABELLE SYMBOLE
Es wird festgestellt, dass alle Aminosäuresequenzen hierin durch Formeln dargestellt werden, deren links nach rechts Orientierung in der konventionellen Richtung des Aminoterminus zum Carboxyterminus vorliegt. Des weiteren wird festgestellt, dass ein Strich am Anfang oder am Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung an ein Radikal wie N und OH (Wasserstoff und Hydroxyl) jeweils am Amino- und Carboxyterminus anzeigt oder eine weitere Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten bis zu einer Gesamtgröße von 50 Resten in der Polypeptidkette.
Polypeptide und Peptide: Polypeptide und Peptide sind hierin wechselseitig verwendete Begriffe zur Bezeichnung einer linearen Serie von nicht mehr als 50 Aminosäureresten, die aneinander durch Peptidbindungen zwischen den Alpha-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Reste verbunden sind.
Protein: Protein ist ein Begriff, der hierin verwendet wird, um eine lineare Serie von mehr als 50 Aminosäureresten zu bezeichnen, die aneinander wie in einem Polypeptid gebunden sind.
Nukleotid: Eine monomere Einheit einer DNA oder RNA, bestehend aus einem Zuckeranteil (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base. Die Base ist an den Zuckeranteil durch den glykosidische Kohlenstoff (1' Kohlenstoff der Pentose) gebunden und die Kombination von Base und Zucker ist ein Nukleosid. Wenn das Nukleosid eine Phosphatgruppe enthält, die an die 3'- oder 5'-Position der Pentose gebunden ist, wird sie als Nukleotid bezeichnet.
Rasenpaar (bp): Eine Partnerschaft von Adenin (A) mit Thymin (T) oder von Zytosin (C) mit Guanin (G) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül.
B. DNA-Segment
In lebenden Organismen ist die Aminosäuresequenz eines Proteins oder Polypeptids direkt über dem genetischen Kode mit der Deoxyribonukleinsäuresequenz (DNA) des strukturellen Gens verwandt, das für das Protein kodiert. Somit kann ein strukturelles Gen in Begriffen der Aminosäuresequenz definiert werden, d. h., als Protein oder Polypeptid, für welches es kodiert.
Eine wichtige und wohlbekannte Eigenschaft des genetischen Kodes ist seine Redundanz. Das bedeutet, dass für die meisten der Aminosäuren, die zur Herstellung von Proteinen verwendet werden, mehr als ein kodierendes Nukleotidtriplet (Kodon) für einen bestimmten Aminosäurerest kodiert oder diesen bezeichnen kann. Daher können eine Reihe verschiedener Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodieren. Solche Nukleotidsequenzen werden als funktionell gleichwertig angesehen, da sie in der Herstellung der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen resultieren. Gelegentlich kann eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in eine gegebene Nukleotidsequenz eingebracht werden. Jedoch haben solche Methylierungen in keinerlei Hinsicht eine Auswirkung auf das kodierende Verhältnis.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung werden dahingehend charakterisiert, dass sie eine DNA-Sequenz umfassen, die ein schweres Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors (huTFh) kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das DNA-Segment eine DNA-Sequenz, die ein Vorläuferprotein der schweren Kette eines menschlichen Gewebefaktors (pre-huTFh) kodiert. Das bedeutet, dass die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung durch die Gegenwart eines huTFh oder mehr bevorzugt, eines pre-huTFh strukturellen Gens charakterisiert sind. Des Weiteren sind DNA-Segmente bevorzugt, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein strukturelles Gen ausbildet, dass ein lösliches huTFh oder ein lösliches pre-huTFh Protein kodiert. Vorzugsweise ist das Gen in einer ununterbrochen linearen Serie von Kodons vorhanden, worin jedes Kodon für einen Aminosäurerest kodiert, der in dem huTFh- oder pre-huTFh- Protein zu finden ist, d. h., ein Gen, das frei von Introns ist.
Somit stellt ein DNA-Segment, das im Wesentlichen aus der in 2 gezeigten Sequenz von ungefähr Position 130 an seinem 5'-Terminus bis zu ungefähr Position 918 an seinem 3'-Terminus besteht und in der Lage zur Exprimierung von huTFh ist, eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Ein DNA-Segment, das im Wesentlichen aus der in 2 von ungefähr Position 34 bis ungefähr Position 918 gezeigten Sequenz besteht und in der Lage zur Exprimierung von pre-huTFh ist, stellt eine andere Ausführungsform der Erfindung dar.
Einem bevorzugten löslichen huTFh-Molekül fehlen die Aminosäurereste, die die letzten ungefähr 150 Basen am 5'-Terminus der DNA, die für huTFh kodieren. Somit stellt ein DNA-Segment, das im wesentlichen aus der in 2 gezeigten Sequenz von ungefähr Position 130 an seinem 5'-Terminus bis ungefähr Position 756 durch bis ungefähr Position 801 an seinem 3'-Terminus besteht und in der Lage zur Exprimierung löslichen huTFhs ist, eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung dar. Beispielhafte bevorzugte DNA-Segmente, die die löslichen huTFh strukturellen Gene ausbilden, sind solche, die eine Nukleotidbasensequenz, wie sie durch 2 von ungefähr Base 130 bis ungefähr Base 756, von ungefähr Base 130 bis ungefähr Base 771, von ungefähr Base 130 bis ungefähr Base 786 und von ungefähr Base 130 bis ungefähr Base 801 dargestellt werden, aufweisen.
Bevorzugte DNA-Segmente, die ein lösliches pre-huTFh kodieren, sind denen ähnlich, die lösliches huTFh kodieren, außer, dass sie Proteine kodieren, die eine Aminosäureleadersequenz wie die Aminosäurereste –32 bis 0, wie sie in 1 gezeigt werden, enthalten. Somit besteht ein bevorzugtes DNA-Segment, das ein strukturelles Gen ausbildet, das ein lösliches pre-huTFh kodiert, im wesentlichen aus der in 2 von ungefähr Position 3q4 an seinem 5'-Terminus bis ungefähr Position 756 durch bis ungefähr Position 801 an seinem 3'-Terminus gezeigten Sequenz. Beispielhafte bevorzugte lösliche pre-huTFh-kodierende DNA-Segmente sind solche mit einer durch 2 von ungefähr Base 34 bis ungefähr Base 756, von ungefähr Base 34 bis ungefähr Base 771, von ungefähr Base 34 bis ungefähr Base 786 und von Base 34 bis ungefähr Base 801 dargestellten Nukleotidbasensequenz.
Homologe DNA- und RNA-Sequenzen, die die oben genannten huTFh- und pre-huTFh-Proteine kodieren, einschließlich deren löslichen Formen sind wie zuvor diskutiert auch umfasst. DNA-Segmente, die huTFh- und pre-huTFh-Proteine kodieren, können leicht durch chemische Techniken synthetisiert werden, zum Beispiel, das Phosphotriesterverfahren von Metteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981). (Die hierin zitierten Offenbarungen des Standes der Technik werden hiermit durch Referenzieren aufgenommen.) Natürlich können durch chemisches Synthetisieren der kodierenden Sequenz jegliche gewünschten Modifikationen leicht durch das Substituieren der geeigneten Basen für die die native Aminosäuresequenz kodierenden Basen substituiert werden. Jedoch sind DNA-Moleküle, die exakt zu den in 2 gezeigten Sequenzen homolog sind, bevorzugt.
Des weiteren können DNA-Segmente, die im wesentlichen aus den strukturellen Genen bestehen, die für die huTFh- und pre-huTFh-Proteine kodieren, aus rekombinanten DNA-Molekülen, die diese Gene enthalten, erhalten werden. Zum Beispiel enthalten die plasmidartigen rekombinanten DNA-Moleküle pCTF64, pCTF314 oder pCTF403 jeweils DNA-Sequenzen, die verschiedene Teile der huTFh- und pre-huTFh-Proteine kodieren und zusammen besitzen sie die gesamte Sequenz der DNA, die zur Expression des jeweiligen Proteins notwendig ist.
Es wurden Kulturen von Escherichia coli (E. coli), die entweder mit pCTF64, pCTF314 oder pCTF403 transformiert sind, nach den Voraussetzungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 am 27. März 1987 hinterlegt und diesen wurden jeweils die folgenden Zugangsnummern 67370, 67368 und 67369 zugeteilt.
Es kann ein DNA-Segment, das eine DNA-Sequenz umfasst, die huTFh oder pre-huTFh kodiert, durch das operative Verbinden (Ligieren) geeigneter Restriktionsfragmente aus jedem der bekannten hinterlegten Plasmide unter Verwendung wohlbekannter Verfahren hergestellt werden. Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung, die in dieser Weise hergestellt werden, haben typischerweise kohäsive Termini, d. h., „überhängende" einzelsträngige Anteile, die über den Doppelstranganteil des Moleküls hinausreichen. Das Vorhandensein kohäsiver Termini auf den DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt.
Es werden von der vorliegenden Erfindung auch Ribonukleinsäure (RNA) – Äquivalente der oben beschriebenen DNA-Sequenz vorgeschlagen.
C. Rekombinante DNA-Moleküle
Die rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können durch das operative Verbinden eines Vektors mit einem DNA-Segment der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Vektor" ein DNA-Molekül, das zur autonomen Replikation in einer Zelle in der Lage ist, und an welches ein anderes DNA-Segment operativ so gebunden werden kann, dass es die Replikation des verbundenen Segments bewirkt. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von huTFh- und pre-huTFh-Genen zu dirigieren, werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Somit ist ein rekombinantes DNA-Molekül (rDNA) ein Hybrid-DNA-Molekül, das mindestens zwei Nukleotidsequenzen, die normalerweise nicht in der Natur zu finden sind, umfasst.
Die Wahl des Vektors, an welchen ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung operativ gebunden wird, hängt direkt, wie auf dem Gebiet wohl bekannt ist, von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, z. B., Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle, wobei diese Einschränkungen inhärent auf dem Gebiet der Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle sind. Jedoch wird ein Vektor, der für die vorliegende Erfindung vorgesehen ist, mindestens in der Lage sein, die Replikation und vorzugsweise auch die Expression der huTFh- oder pre-huTFh- strukturellen Gene zu dirigieren, die in den DNA-Segmenten enthalten sind, an welche er operativ gebunden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein Vektor, der von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird, ein prokaryontisches Replikon, d. h., eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit zum Dirigieren der autonomen Replikation und dem extrachromosomalen Erhalt des rekombinanten DNA-Moleküls in einer prokaryontischen Wirtszelle, wie einer bakteriellen Wirtszelle, die hiermit transformiert ist. Solche Replikons sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Zusätzlich umfassen diese Ausführungsformen, die ein prokaryontisches Replikon umfassen, auch ein Gen, dessen Expression eine Medikamentenresistenz an eine bakterielle Wirtszelle vermittelt, die hiermit transformiert ist. Typische bakterielle Resistenzgene sind solche, die Resistenz gegen Ampicillin oder Tetracyclin vermitteln.
Diese Vektoren, die ein prokaryontisches Replikon umfassen, können auch einen prokaryontischen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) der huTFh- oder pre-huTFh-Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, wie E. coli, die damit transformiert ist, zu dirigieren. Ein Promotor ist ein Expressionskontrollelement, das durch eine DNA-Sequenz ausgebildet wird, das es ermöglicht, dass die Bindung der RNA-Polymerase und die Transkription stattfindet. Promotorsequenzen, die mit bakteriellen Wirtszellen kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren zur Verfügung gestellt, die gut handhabbare Restriktionsschnittstellen zum Einfügen eines DNA-Segments der vorliegenden Erfindung enthalten. Typische Plasmidvektoren sind pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories, (Richmond, CA) und pPL und pKK223, die von Pharmacia, Piscataway, N.J., verfügbar sind.
Es können auch Expressionsvektoren, die mit eukaryontischen Zellen kompatibel sind, vorzugsweise solche, die mit Wirbeltierzellen kompatibel sind, verwendet werden, um die rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung auszubilden. Eukaryontische Zellexpressionsvektoren sind auf dem Gebiet wohlbekannt und aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich. Typischerweise werden solche Vektoren zur Verfügung gestellt, die einfachen Restriktionsschnittstellen zum Einfügen des gewünschten DNA-Segments enthalten. Typische Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2s (International Biotechnologies, Inc.) und pTDT1 (ATCC, #31255).
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die eukaryontischen Zellexpressionsvektoren, die zur Konstruktion der rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ein Selektionsmarker, der in einer eukaryontischen Zelle wirksam ist, vorzugsweise einen Medikamentenresistenzselektionsmarker. Ein bevorzugter Medikamentenresistenzselektionsmarker ist das Gen, dessen Expression in Neomycinresistenz resultiert, d. h., dass Neomycinphosphotransferasegen (neo). Southern et al, J. Mol. Appl. Genet., 1:327 – 341 (1982).
Auch die Verwendung von retroviralen Expressionsvektoren zur Ausbildung von rDNAs der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „retroviralen Expressionsvektor" ein DNA-Molekül, das eine Promotorsequenz umfasst, die aus der „long terminal repeat" (LTR) – Region eines Retrovirusgenoms abgeleitet ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor typischerweise ein retroviraler Expressionsvektor, der vorzugsweise replikationsinkompetent in eukaryontischen Zellen ist. Die Konstruktion und Verwendung retroviralen Vektoren wurde durch Sorge et al, Mol. Cell. Biol., 4:1730 – 37 (1984) beschrieben.
Es wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt, um DNA operativ an Vektoren mittels komplementärer kohäsiver Termini zu verbinden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymerabschnitte zu dem einzufügenden DNA-Segment und zu der Vektor DNA hinzugefügt werden. Das Vektor- und DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen verbunden, um rekombinante DNA-Moleküle auszubilden.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, stellen ein alternatives Verfahren zur Bindung des DNA-Segments an Vektoren zur Verfügung. Das durch Endonuklease-Restriktionsverdau, wie zuvor beschrieben, generierte DNA-Segment wird mit der Bakteriophagen T4 DNA-Polymerase oder E. coli DNA-Polymerase 1 behandelt, Enzymen, die herausragende 3'-einzelsträngige Termini mit ihren 3'-5' exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und die zurückgesetzten 3'-Enden mit deren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen. Die Kombination dieser Aktivitäten generiert somit stumpf endende DNA-Segmente. Die stumpf endenden Segmente werden dann mit einem großen molaren Überschuss an Verbindungsmolekülen in der Gegenwart eines Enzyms inkubiert, das in der Lage ist, wie Bakterien T4 DNA-Ligase, die Ligierung von stumpf endenden DNA-Molekülen zu katalysieren. Somit sind die Produkte der Reaktion DNA-Segmente, die polymere Linkersequenzen an deren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor ligiert, der mit einem Enzym gespalten wurde, das Termini produziert, die mit denen der DNA-Sequenz kompatibel sind.
Synthetische Linker, die eine Reihe von Restriktionsendonukleasestellen enthalten, sind von einer Reihe von Quellen verfügbar, einschließlich International Biotechnologies, Inc., New Haven, CN.
Auch von der Erfindung umfasst sind RNA Äquivalente der oben beschriebenen rekombinanten Moleküle.
D. Transformierte Zellen und Kulturen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung transformiert ist, vorzugsweise einer rDNA, das in der Lage ist, eine lösliche Form von huTFh oder pre-huTFh zu exprimieren. Die Wirtszelle kann entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryontische Wirtszellen und typischerweise ein Stamm von E. coli, wie zum Beispiel der E. coli-Stamm DH5, der von dem Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD, verfügbar ist. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen umfassen Hefe- und Säugetierzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie solche aus einer Maus, Ratte, Affe oder einer menschlichen Fibroblastenzelllinie. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen umfassen chinesische Hamster Ovar (CHO)-Zellen, die von der ATCC als CCL61 verfügbar sind und NIH Schweizer Mausembryozellen NIH/3T3, die von der ATCC als CRL 1658 verfügbar sind. Die Transformation der geeigneten Zellwirte mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung wird durch wohlbekannte Verfahren erreicht, die typischerweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Bezüglich der Transformation prokaryontischer Wirtszellen, siehe z. B. Cohen et al., Proc. Natl. Sci. USA, 69:2110 (1972); und Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Mammal. Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Bezüglich der Transformation von Wirbeltierzellen mit retroviralen Vektoren, die rDNAs enthalten, siehe z. B. Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730 – 37 (1984), Graham et al., Virol., 52:456 (1973); und Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1373 – 76 (1979).
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h., Zellen, die ein rekombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch wohlbekannte Techniken identifiziert werden. Zum Beispiel können Zellen, die aus der Einführung einer rDNA der vorliegenden Erfindung resultieren, kloniert werden, um monoklonale Kolonien herzustellen. Zellen aus solchen Kolonien können geerntet, lysiert werden und deren DNA-Inhalt kann auf die Gegenwart der rDNA unter Verwendung eines Verfahrens, wie des durch Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) oder Berent et al., Biotech., 3:208 (1985) beschriebenen, untersucht werden.
Zusätzlich zu der direkten Untersuchung auf die Gegenwart von rDNA kann die erfolgreiche Transformation durch wohlbekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA in der Lage ist, die Expression von huTFh oder pre-huTFh zu dirigieren. Zum Beispiel produzieren Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, Proteine, die eine huTFh- oder pre-huTFh- Antigenizität aufzeigen. Proben von Zellen, von denen angenommen wird, dass sie transformiert sind, werden geerntet und auf huTFh oder pre-huTFh unter Verwendung von Antikörpern untersucht, die spezifisch auf diese Antigene sind, wie solche, die durch eine Hybridomzelle der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Somit umfasst zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen die vorliegende Erfindung auch eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur, oder eine Kultur, die aus einer monoklonalen Kultur abgeleitet ist, in einem Nährmedium. Vorzugsweise enthält die Kultur auch ein Protein, das huTFh- oder pre-huTFh-Antigenizität aufzeigt und mehr bevorzugt biologisch aktives huTFh.
Für die Kultivierung transformierter Wirtszellen nützliche Nährmedien sind auf dem Gebiet wohlbekannt und können aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhalten werden. In Ausführungsformen, in denen die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, wird vorzugsweise ein „serumfreies" Medium verwendet.
E. Verfahren zur Herstellung von huTFh- und pre-huTFh-Proteinen
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die huTFh-Antigenizität aufweisen. Proteine, die huTFh-Antigenizität aufweisen, sind Proteine, die mit Antikörpern, die durch den nativen Gewebefaktor induziert werden, immunreagieren. Proteine, die huTFh-Antigenizität aufzeigen, sind als Antigene und zum Züchten von Antikörpern nützlich, von denen jeder in den diagnostischen Systemen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst das Initiieren einer Kultur, umfassend ein Nährmedium, das Wirtszellen enthält, vorzugsweise menschliche Zellen, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung transformiert sind, das in der Lage ist, ein huTFh- oder pre-huTFh-Protein zu exprimieren, vorzugsweise ein lösliches huTFh- oder lösliches pre-huTFh-Protein. Die Kultur wird für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die transformierten Zellen ausreichend ist, ein huTFh- oder pre-huTFh-Protein zu exprimieren. Das exprimierte Protein wird dann aus der Kultur zurückgewonnen. In bevorzugten Ausführungsformen zeigen die huTFhr-Proteine, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, zusätzlich eine huTFh biologische Aktivität, d. h., die Fähigkeit, an Faktor VII/VIIa zu binden. Diese Verfahren umfassen die Kultivierung von Säugetierwirtszellen, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das in der Lage ist, das pre-huTFh-Gen in den Zellen zu exprimieren. Die Kultivierung resultiert in der Expression des pre-huTFh-Proteins und anschließender intrazellulärer posttranslationaler Modifikation des pre-huTFh, um ein biologisch aktives huTFh-Protein auszubilden.
Verfahren zur Gewinnung eines exprimierten Proteins aus einer Kultur sind auf dem Gebiet wohlbekannt und umfassen die Fraktionierung des Protein-enthaltenden Anteils der Kultur unter Verwendung wohlbekannter biochemischer Techniken. Zum Beispiel können die Verfahren der Gelfiltrierung, Gelchromatographie, Ultrafiltrierung, Elektrophorese, Ionenaustausch, Affinitätschromatographie und ähnliche, wie sie zur Proteinfraktionierung bekannt sind, verwendet werden, um die exprimierten Proteine, die in der Kultur zu finden sind, zu isolieren. Zusätzlich können immunchemische Verfahren, wie Immunaffinität, Immunadsorption und ähnliche unter Verwendung wohlbekannter Verfahren durchgeführt werden.
F. huTFh- und pre-huTFh-Proteinzusammensetzungen und Expressionsprodukte
Auch von der Erfindung umfasst sind die huTFh- und pre-huTFh-Proteinexpressionsprodukte der rDNAs der vorliegenden Erfindung. In bevorzugten Ausführungsformen haben die huTFh- und pre-huTFh-Expressionsprodukte eine Aminosäuresequenz, die jeweils mit den Resten 1 – 263 und –32 – 263, wie in 1 gezeigt, korrespondiert. Vorzugsweise hat das exprimierte Protein mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95 % der Länge der pre-huTFh- und huTFh-Aminosäuresequenzlänge, die in 1 gezeigt wird.
In einer anderen Ausführungsform werden lösliche Formen von huTFh- und pre-huTFh und Zusammensetzungen, die lösliches huTFh- und/oder lösliches pre-huTFh enthalten, vorgesehen. Der Begriff „löslich", wie hierin verwendet, bezieht sich auf huTFh- und pre-huTFh-Moleküle, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im wesentlichen aus der extrazellulären Domäne der nativen huTFh- und pre-huTFh-Moleküle bestehen, d. h., dem Teil der huTFh- und pre-huTFh-Moleküle, der aminoterminal zu Rest 220, wie in 1 gezeigt, liegt. Lösliches huTFh- und lösliches pre-huTFh enthält daher keinen wesentlichen Anteil der Transmembranankerdomäne, die in den nativen Molekülen ausgebildet ist (Reste 220 – 242, wie in 1 gezeigt). Es wird festgestellt, dass die Begriffe „huTFh" und „pre-huTFh", wie hierin verwendet, falls nicht anderweitig spezifisch vorgetragen, die löslichen Formen dieser Proteine vorsehen und umfassen.
Da lösliches huTFh- und lösliches pre-huTFh eine hydrophobe Transmembranankerregion nicht enthalten, aggregieren sie im wesentlichen nicht in physiologisch tolerierbaren wässrigen Lösungen. Daher sind lösliches huTFh- und lösliches pre-huTFh weiterhin durch ihre Fähigkeit charakterisiert, eine wässrige Lösung unter Verwendung eines physiologisch verträglichen Verdünnungsmittels bei einer Proteinkonzentration von ungefähr 0,1 pg/ml bis ungefähr 100 ng/ml auszubilden, worin mindestens ungefähr 70%, vorzugsweise ungefähr 80 und mehr bevorzugt ungefähr 90 Gewichtsprozent des huTFh- oder pre-huTFh-Proteins, das vorhanden ist, in der nicht aggregierten (monomeren) Form vorliegt. Verfahren zur Bestimmung der Menge der Aggregation, die in einer Proteinlösung vorhanden ist, sind auf dem Gebiet wohlbekannt und umfassen die Größenfraktionierung durch Ausschlusssäulenchromatographie.
Ein bevorzugtes lösliches huTFh-Protein hat eine Aminosäuresequenz, die durch 1 von ungefähr Rest 1 an seinem Aminoterminus bis ungefähr Rest 209 bis ungefähr Rest 224 an seinem Carboxyterminus dargestellt wird. Somit sind bevorzugte lösliche huTFh-Proteine solche, die eine Aminosäuresequenz haben, die durch 1 von ungefähr Rest 1 bis ungefähr Rest 209, von ungefähr Rest 1 bis ungefähr Rest 214, von ungefähr Rest 1 bis ungefähr Rest 219 und von ungefähr Rest 1 bis ungefähr Rest 224 dargestellt werden.
Ein bevorzugtes lösliches pre-huTFh-Protein hat eine Aminosäuresequenz, die durch 1 von ungefähr Rest –32 an seinem Aminoterminus bis ungefähr Rest 209 bis ungefähr Rest 224 an seinem Carboxyterminus dargestellt wird. Somit sind bevorzugte lösliche pre-huTFh-Proteine solche, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die durch 1 von ungefähr Rest –32 bis ungefähr Rest 209, von ungefähr Rest –32 bis ungefähr Rest 214, von ungefähr Rest –32 bis ungefähr Rest 219 und von ungefähr Rest –32 bis ungefähr Rest 224 dargestellt werden.
In einer Ausführungsform sind die huTFh- und pre-huTFh-Expressionsprodukte nicht glykolsyliert, d. h., sie werden in einer prokaryontischen Zelle hergestellt, die mit einer rDNA der vorliegenden Erfindung transformiert ist. Eine nicht glykosylierte Form von huTFh und pre-huTFh ist als ein Immunogen nützlich und als ein Antigen in einem Inokulum und einem diagnostischem System der vorliegenden Erfindung.
Eukaryontisch hergestelltes huTFh und pre-huTFh sind typischerweise glykosyliert und zusätzlich dazu, dass sie antigen und immunogen sind, biologisch aktiv. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „biologisch aktiv" auf ein huTFh- und pre-huTFh-Protein oder Polypeptid mit der Fähigkeit, eine Faktor VII/VIIa-abhängige Koagulation zu induzieren.
Somit schlägt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung vor, umfassend eine wässrige Lösung, enthaltend biologisch aktives huTFh, das im wesentlichen frei von dem leichten Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors ist. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung auch im wesentlichen frei von Verbindungen, wie ionischen Detergenzien, z. B., Natriumdodecylsulfat (SDS), Polyacrylamid und gewebeabgeleiteten Proteinen mit einem apparenten Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 Daltons, wie durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt wird.
Die wässrigen huTFh-enthaltenden Lösungen enthalten biologisch aktives huTFh in einer Menge, die ausreichend ist, um die Koagulationskompetenz einer Flüssigprobe des vaskulären Systems wie Blut oder blutabgeleitete Produkte, wie zitratversetztes Plasma, zu untersuchen. Der Begriff „Koagulationskompetenz" bezieht sich auf die Fähigkeit der vasukären Flüssigkeitsprobe, in der Gegenwart biologisch aktiven huTFhs zu gerinnen. Typische huTFh-Proteinkonzentrationen, die ausreichen, um die Koagulationskompetenz zu untersuchen, sind ungefähr 0,1 pg/ml bis ungefähr 100 ng/ml, vorzugsweise ungefähr 1 pg/ml bis ungefähr 10 μg/ml und mehr bevorzugt ungefähr 10 pg/ml bis ungefähr 1 ng/ml unter Verwendung von Verhältnissen der Probe zum huTFh-Volumen, die ähnlich denen in Beispiel 2 sind. Natürlich sind Lösungen, die huTFh bei Konzentrationen enthalten, die höher sind als solche, die benötigt werden, um eine Koagulationskompetenz zu untersuchen, aber die auf eine bevorzugte Konzentration verdünnt werden können, auch vorgesehen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die huTFh-enthaltenden wässrigen Lösungen huTFh, das in einem Phospholipid oder nicht ionischen Detergenz dispergiert ist. Typische Phospholipid: huTFh-Protein-Gewichtsverhältnisse liegen im Bereich von ungefähr 5:1 bis ungefähr 12.000:1, vorzugsweise bei 50:1 bis ungefähr 5.000:1 und mehr bevorzugt bei ungefähr 100:1 bis 2.500:1.
G. Polypeptide
sDie Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten jeweils nicht mehr als ungefähr 50, eher weniger als ungefähr 35 und vorzugsweise weniger als ungefähr 25 Aminosäurereste und enthalten mindestens ungefähr 10 Reste. Zusätzlich sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch ihre Aminosäuresequenz und neue funktionelle Eigenschaften charakterisiert.
Somit ist eine Ausführungsform eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung ein Polypeptidanalogon einer huTFh-Bindungsstelle, das teilweise durch seine Fähigkeit zur kompetitiven Inhibierung der Bindung von huTFh an den Blutkoagulationsfaktor VII/VIIa charakterisiert ist. Vorzugsweise bindet ein Bindungsstellenanalogon der vorliegenden Erfindung den Faktor VII/VIIa ohne Ausbildung eines aktivierten Komplexes, d. h., ohne das Initiieren der Koagulation.
Der Begriff „Komplex", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Produkt einer spezifischen Bindungsreaktion, wie einer Antikörper-Antigen- oder Rezeptor-Liganden-Reaktion. Beispielhafte Komplexe sind Immunreaktionsprodukte und Gewebefaktor-Faktor VII/VIIa-Bindungsreaktionsprodukte, die hierin als TF:VII/VIIa bezeichnet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein huTF-Bindungsstellenanalogon mindestens die folgende Aminosäuresequenz: -VNQVYT-, die durch die Aminosäurereste 30 – 35, wie sie in 1 gezeigt werden, dargestellt wird. Mehr bevorzugt umfasst ein huTFh-Bindungsstellenanalogon mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
Diese Sequenzen stellen jeweils huTFh-Aminosäurereste 30 – 40 und 155 – 167, wie sie in 1 gezeigt werden, dar.
Noch mehr bevorzugt umfasst ein huTFh-Bindungsstellenanalogon eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
die jeweils durch die Aminosäurereste 25 – 49 und 146 – 167, wie sie in 1 gezeigt werden, dargestellt werden.

Bevorzugte huTF-Bindungsstellenpolypeptidanaloga umfassen solche, deren Aminosäuresequenzen in Tabelle 1 gezeigt werden. Tabelle 1

Bezeichnung	Aminosäuresequenz
p24 – 35	H-EWEPKPVNQVYT-OH
p26 – 49	H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH
p144 – 159	H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH
p146 – 167	H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH
p159 – 169	H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH
p157 – 169	H-YWKSSSSGKKTAK-OH
p161 – 189	H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH

Polypeptide p26-49, p146-167 und p161-189 werden auch durch ihre Fähigkeit charakterisiert, die Bindung von Anti-huTFh Antikörpermolekülen an huTFh zu neutralisieren (kompetitiv zu inhibieren). Andere Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die die Fähigkeit haben, die Bindung von Anti-huTFh-Antikörpern an huTFh zu neutralisieren, umfassen die in Tabelle 2 gezeigten. Tabelle 2

Bezeichnung	Aminosäuresequenz
p1 – 30	H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH
p40 – 71	H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH
p41 – 49	H-KSGDWKSKC-OH
p56 – 71	H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH
p72 – 104C	H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH
p94 – 123	H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKV-OH
p190 – 209	H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH

Es ist zu verstehen, dass ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht identisch zu der Aminosäuresequenz von huTF sein muss, so lange, wie die jeweiligen Polypeptide in der Lage sind, mit dem nativen Gewebefaktor um die Bindung an den Faktor VII/VIIa zu kompetieren und/oder in der Lage sind, die Bindung von Anti-huTFh-Antikörpermolekülen an huTFh zu inhibieren. Daher kann ein vorliegendes Polypeptid Gegenstand verschiedener Änderungen wie Einfügungen, Deletionen und Substitutionen sein, entweder konservativ oder nicht konservativ, wo solche Änderungen bestimmte Vorteile für deren Verwendung zur Verfügung stellen.
Konservative Substitutionen sind solche, bei denen eine Aminosäure durch einen anderen biologisch ähnlichen Rest ersetzt wird. Beispiele von konservativen Substitutionen umfassen die Substitution eines hydrophoben Restes wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für einander oder die Substitution eines polaren Restes für einen anderen wie zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin- und Asparaginsäuren oder zwischen Glutamin und Asparagin und ähnliche. Der Begriff „konservative Substitution" umfasst auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht substituierten Elternaminosäure, unter der Voraussetzung, dass das Polypeptid auch die vorausgesetzte Bindungsaktivität aufzeigt.
Wenn ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Sequenz hat, die nicht mit der Sequenz von nativem huTFh identisch ist, weil eine oder mehrere konservative oder nicht konservative Substitutionen durchgeführt wurden, normalerweise nicht mehr als ungefähr 20 % und eher nicht mehr als 10 % der Aminosäurereste substituiert sind, außer, wo zusätzliche Reste an einem der Enden für den Zweck des zur Verfügung Stellens eines „Linkers" hinzugefügt wurden, durch welchen die Polypeptide dieser Endung leicht handhabbar an einen Marker oder eine feste Matrix oder einen Träger gebunden werden können. Marker, feste Matrizen und Träger, die mit den Polypeptiden dieser Erfindung verwendet werden können, werden hiernach beschrieben.
Aminosäurelinker haben normalerweise mindestens einen Rest und können bis 40 oder mehr Reste, öfter 1 – 10 Reste haben. Typische Aminosäurereste, die zum Verbinden verwendet werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- und Asparaginsäure und ähnliche. Zusätzlich kann eine Polypeptidsequenz dieser Erfindung sich von der natürlichen Sequenz dadurch unterscheiden, dass die Sequenz durch terminale-NH₂ Acylierung modifiziert ist, z. B., Acetylierung, oder Thioglykolsäureamidierung, terminale Carboxylamidierung, z. B., Ammoniak, Methylamin, etc.
Wenn an einen Träger über einen Linker gekoppelt, um das auszubilden, was auf dem Gebiet als ein Träger-Haptenkonjugat bekannt ist, ist ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in der Lage, Antikörper zu induzieren, die mit huTFh immunreagieren. Im Hinblick auf die gut etablierten Prinzipien der immunologischen Kreuzreaktivität umfasst die vorliegende Erfindung daher Antigen-verwandte Varianten der Polypeptide, die in den Tabellen 1 und 2 gezeigt werden. Eine „Antigen-verwandte Variante" ist ein Polypeptid, das mindestens einen 6 Aminosäurerestsequenzanteil eines Polypeptids aus Tabelle 1 oder Tabelle 2 umfasst, und welches in der Lage ist, Antikörpermoleküle zu induzieren, die mit einem Polypeptid aus Tabelle 1 oder 2 und huTFh immunreagieren.
Auch von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird eine Zusammensetzung, umfassend eine wässrige Lösung eines Polypeptidanalogons der huTFh-Bindungsstelle, worin das Polypeptid in einem Phospholipid oder einem nicht ionischen Detergenz dispergiert ist. Typische Phospholipid: Polypeptidanalogon – Gewichtsverhältnisse liegen im Bereich von ungefähr 5:1 bis 200:1, vorzugsweise von ungefähr 30:1 bis 80:1 und mehr bevorzugt ungefähr 45:1 bis 55:1. Bevorzugte Polypeptidanaloga der huTFh-Bindungsstelle, die zur Verwendung geeignet sind und in einem Phospholipid dispergiert sind, sind solche, die in Tabelle 4, Abschnitt II, aufgelistet sind.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch jegliche Techniken synthetisiert werden, die den Fachleuten auch auf dem Gebiet der Polypeptide bekannt sind. Eine exzellente Zusammenfassung der vielen verfügbaren Techniken kann in J. M. Stewart und J. D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York); 1983, für Festphasenpeptidsynthese und E. Schroder und K. Kubke, „The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965, für klassische Lösungssynthese gefunden werden.
H. Inokula
In einer anderen Ausführungsform wird ein Polypeptid dieser Erfindung oder eine Antigen-verwandte Variante davon in einer pharmazeutisch verträglichen wässrigen Verdünnungszusammensetzung verwendet, um ein Inokulum auszubilden, das, wenn es in einer wirksamen Menge verabreicht wird, in der Lage ist, Antikörper zu induzieren, die mit huTFh immunreagieren. Das Wort „Inokulum" in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird hierin verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein Polypeptid dieser Erfindung als aktiven Inhaltsstoff enthält, das zur Herstellung von Antikörpern gegen huTFh verwendet wird. Wenn ein Polypeptid verwendet wird, um Antikörper zu induzieren, ist dies so zu verstehen, dass das Polypeptid allein verwendet werden kann oder an einen Träger als ein Konjugat gebunden werden kann oder als ein Polypeptidpolymer vorliegt, aber zur Vereinfachung der Beschreibung der verschiedenen Ausführungsformen der Polypeptide dieser Erfindung werden diese kollektiv hierin durch den Begriff „Polypeptid" und seine verschiedenen grammatischen Formen bezeichnet.
Für ein Polypeptid, das weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste enthält, ist es bevorzugt, das Peptid an einen Träger gebunden für den Zweck der Induktion der Herstellung von Antikörpern zu verwenden, wie bereits festgestellt wurde.
Wie bereits festgestellt wurde, kann ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste zu den Amino- oder Carboxy-Termini des Polypeptids hinzugefügt werden, um die Bindung des Polypeptids an den Träger zu unterstützen. Cysteinreste, die an die Amino- oder Carboxy-Termini der Polypeptids hinzugefügt werden, haben sich als besonders nützlich zur Ausbildung von Konjugaten über die Sulfidbindungen herausgestellt. Jedoch können auch andere auf dem Gebiet wohlbekannte Verfahren zur Herstellung von Konjugaten verwendet werden. Beispielhafte zusätzliche Verbindungsverfahren umfassen die Verwendung von Michael-Additionsreaktionsprodukten, Dialdehyden, wie Glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318 – 326 (1983) und ähnliche oder die Verwendung der Carbodiimid-Technologie wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids zur Ausbildung von Amindbindungen an den Träger. Für einen Überblick der Proteinkonjugation oder Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen, siehe Aurameas, et al., Stand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7, 7 – 23 (1978).
Nützliche Träger sind auf dem Gebiet wohlbekannt und sind normalerweise selbst Proteine. Beispiele solcher Träger sind Keyhole limpet hemocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine wie Rinderserumalbumin (BSA) oder menschliches Serumalbumin (HSA), rote Blutzellen wie Schafserythrozyten (SRBC), Tetanustoxin, Choleratoxin sowie Polyaminosäuren wie Poly (D-Lysin: D-Glutaminsäure) und ähnliche.
Die Wahl des Trägers hängt mehr von der letztendlichen Verwendung des Inokulums ab und basiert auf Kriterien, die die vorliegende Erfindung nicht sonderlich betreffen. Zum Beispiel sollte ein Träger, der keine unerwünschte Reaktion im jeweiligen Tier bewirkt, das zu Inokulieren ist, ausgewählt werden.
Das vorliegende Inokulum enthält eine wirksame immunogene Menge eines Polypeptids dieser Erfindung, typischerweise eines Konjugats, das an einen Träger gebunden ist. Die wirksame Menge des Polypeptids pro Dosiseinheit hängt unter anderem, wie auf dem Gebiet wohlbekannt ist, von der zu inokulierenden Tierspezies, dem Körpergewicht des Tieres und der gewählten Inokulationsart ab. Inokula enthalten typischerweise Polypeptidkonzentrationen von ungefähr 10 Mikrogramm bis ungefähr 500 Milligramm pro Inokulation (Dosis), vorzugsweise ungefähr 50 Mikrogramm bis ungefähr 50 Milligramm pro Dosis.
Der Begriff „Dosiseinheit", wie er sich auf die Inokula der vorliegenden Erfindung bezieht, bezeichnet physiologisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des aktiven Materials enthält, die berechnet ist, um die gewünschte immunogene Wirkung im Zusammenhang mit dem benötigten Verdünnungsmittel herzustellen; d. h., Träger oder Vehikel. Die Spezifikationen für die neue Einheitsdosis eines Inokulums dieser Erfindung werden durch die (a) Eigenheiten des aktiven Materials und der jeweiligen zu erzielenden immunologischen Wirkung und (b) den intärenten Einschränkungen auf dem Gebiet der Herstellung solcher aktiver Materialien für immunologische Zwecke in Tieren bestimmt und hängen direkt davon ab, wobei dieses die Eigenschaften der vorliegenden Erfindung sind.
Inokula werden typischerweise aus dem getrockneten festen Polypeptid-Konjugat durch Dispergieren des Polypeptids-Konjugats in einem physiologisch verträglichen (akzeptablen) Verdünnungsmittel wie Wasser, Salz oder phosphatgepufferte Salzlösung hergestellt, um eine wässrige Zusammensetzung auszubilden.
Inokula können auch ein Adjuvanz als Teil des Verdünnungsmittels enthalten. Adjuvanzien, wie vollständiges Freund's-Adjuvanz (CFA), unvollständiges Freund's-Adjuvanz (IFA) und Aluminium sind Materialien, die auf dem Gebiet wohlbekannt und von verschiedenen Quellen kommerziell verfügbar sind.
1. Antikörper und Antikörperzusammensetzungen
Der Begriff „Antikörper" in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird hierin verwendet, um Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen zu bezeichnen, d. h., Moleküle, die eine Antikörperkombinationsstelle oder ein Paratop enthalten. Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und solche Teile eines Immunglobulinmoleküls, das das Paratop enthält, einschließlich solcher Anteile, die auf dem Gebiet als Fab, Fab', F(ab')₂ und F(v) bekannt sind.
Eine Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist ein Anti-Peptidantikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er Antikörpermoleküle enthält, die mit huTFh und mit mindestens einem spezifischen Polypeptid dieser Erfindung immunreagieren.
Zum Beispiel ist eine Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die Antikörpermoleküle enthält, die mit huTFh und einem Polypeptidanalogon der Gewebefaktorbindungsstelle immunreagieren, aber im wesentlichen nicht mit p204-226 immunreagieren, in der Lage, die Fähigkeit des Gewebefaktors zu neutralisieren, an Faktor VII/VIIa zu binden. Somit sind bevorzugte Antikörperzusammensetzungen solche, die Antikörpermoleküle enthalten, die mit huTFh und p26-49 oder p146-167 immunreagieren und die im wesentlichen frei von einer Immunreaktion mit p204-226 sind.
Es ist festzustellen, dass polyklonale Antiseren, die gegen huTFh gezüchtet sind, Antikörper enthalten, die mit p204-226 immunreagieren. Somit ist die im Wesentlichen vorhandene Abwesenheit einer Anti-p204-226 – Immunreaktivität eine Eigenschaft, die die vorliegenden Antikörperzusammensetzungen von denen, die auf dem Gebiet beschrieben werden, unterscheidet.
Eine Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird typischerweise durch Immunisierung eines Säugetieres mit einem Inokulum der vorliegenden Erfindung hergestellt und dadurch Antikörpermoleküle in dem Säugetier induziert, die die geeignete Polypeptidimmunspezifität aufweisen. Die Antikörpermoleküle werden dann aus dem Säugetier entnommen und in dem gewünschten Ausmaß durch wohlbekannte Techniken isoliert, wie, z. B. durch Immunaffinitätschromatography. Die so hergestellte Antikörperzusammensetzung kann inter alia in den diagnostischen Verfahren und Systemen der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von huTFh in einer Körperprobe verwendet werden.
Monoklonale Antikörperzusammensetzungen sind auch durch die vorliegende Erfindung vorgesehen. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält innerhalb nachweisbarer Grenzen nur eine Spezies einer Antikörperbindungsstelle, die in der Lage ist, wirksam huTFh zu binden. Somit zeigt eine monoklonale Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung typischerweise eine einzelne Bindungsaffinität für huTFh auf, obwohl sie Antikörper enthalten kann, die in der Lage sind, Proteine zu binden, die nicht huTFh sind. In einer Ausführungsform enthält eine monoklonale Antikörperzusammensetzung Antikörpermoleküle, die mit huTFh und einem Polypeptidanalogon der Bindungsstelle des Gewebefaktors immunreagieren, vorzugsweise p26-49 oder p146-167.
In einer anderen Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung einen Anti-Koagulanz (neutralisierenden) MoAb vor, der Antikörpermoleküle enthält, die mit huTFh immunreagieren und die huTFh-initiierte Koagulation hemmen. Ein bevorzugter MoAb, der die Koagulation inhibiert, ist des weiteren dadurch charakterisiert, dass er mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung immunreagiert, vorzugsweise einem Polypeptidanalogon einer huTFh-Bindungsstelle und mehr bevorzugt einem Polypeptid, wie es in Tabelle 1 gezeigt wird.
In einer anderen Ausführungsform enthält ein antikoagulatorischer MoAb Antikörpermoleküle, die mit huTFh und einem huTFh: Faktor VII/VIIa Komplex immunreagieren und inhibiert (neutralisiert) die huTFh-initiierte Koagulation. Ein bevorzugter antikoagulatorischer MoAb wird weiterhin dadurch charakterisiert, dass er mit den huTFh-Polypeptiden p1-30 oder p26-49 immunreagiert und vorzugsweise nicht mit dem huTFh-Polypeptid p56-71 immunreagiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine nicht neutralisierende monoklonale Antikörperzusammensetzung, enthaltend Antikörpermoleküle, die nicht die Fähigkeit, des Gewebefaktors neutralisieren, die Koagulation einzuleiten. Vorzugsweise enthält eine solche Zusammensetzung Antikörpermoleküle, die mit huTFh und dem Polypeptid p1-30 immunreagieren und wird durch die Hybridomzelle TF9-10H10 hergestellt (sezerniert).
Eine monoklonale Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch das Initiieren einer monoklonalen Hybridomzellkultur hergestellt werden, die ein Nährmedium umfasst, das eine Hybridomzelle enthält, die Antikörpermoleküle der geeigneten Polypeptidspezifität sezerniert.
Die Kultur wird unter Bedingungen und für einen Zeitraum aufbewahrt, die für die Hybridomzelle ausreichen, die Antikörpermoleküle in das Medium zu sezernieren. Das Antikörper-enthaltende Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können dann weiter durch wohlbekannte Techniken isoliert werden.
Medien, die zur Herstellung dieser Zusammensetzungen nützlich sind, sind sowohl auf dem Gebiet wohlbekannt, wie auch kommerziell verfügbar und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzestmäuse und ähnliche. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbeccos minimales essentielles Medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)), das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mm Glutamin und 20 % fetalem Kälberserum supplementiert ist. Ein beispielhafter Inzest-Mausstamm ist Balb/c. Die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellten monoklonalen Antikörperzusammensetzungen können z. B. in diagnostischen und therapeutischen Modalitäten verwendet werden, in denen die Ausbildung eines huTFh-enthaltenden Immunreaktionsproduktes wünschenswert ist.
J. Hybridomzellen
Die Hybridomzellen der vorliegenden Erfindung sind dadurch charakterisiert, dass sie Antikörpermoleküle produzieren, die mit huTFh immunreagieren. Eine bevorzugte Hybridomzelle wird des Weiteren dahingehend charakterisiert, dass sie Antikörpermoleküle herstellt, die eine huTFh-initiierte Koagulation inhibieren und vorzugsweise mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung immunreagieren, vorzugsweise einem Polypeptidanalogon einer huTFh-Bindungsstelle und mehr bevorzugt einem in Tabelle 1 gezeigten Polypeptid. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen immunreagiert ein antikoagulatorisches MoAb mit nicht menschlichem Primaten TF.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform produziert eine Hybridomzelle dieser Erfindung Antikörpermoleküle, die mit huTFh und einem huTFh:Faktor VII/VIIa Komplex immunreagieren und eine huTFh-initiierte Koagulation neutralisieren. Vorzugsweise ist eine Hybridomzelle, die Antikörper herstellt, die mit einem huTFh:Faktor VII/VIIa Komplex immunreagieren, weiter durch die Fähigkeit von besagtem Antikörpermolekülen charakterisiert, mit den huTFh Polypeptiden p1-30 oder p26-49 zu immunreagieren, vorzugsweise mit beiden und mehr bevorzugt, worin besagte Antikörpermoleküle nicht mit Poly-huTFh-Polypeptid p56-71 immunreagieren.
Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellen, die Antikörpermoleküle mit einer gewünschten Immunspezifität, d. h. mit der Fähigkeit, mit einem bestimmten Protein und/oder Polypeptid zu immunreagieren, produzieren (sezenieren), sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Besonders anwendbar ist die Hybridomzelltechnologie, die durch Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949 – 4953 (1983), beschrieben wird. Bevorzugte Hybridomzellen sind die in Tabelle 5 in Beispiel 13 gezeigten.
Hybridomzellkulturen TF8-5G9, TF9-6B4 und TF9-10H10 wurden entsprechend den Voraussetzungen des Budapester Vertrags am 27. März 1987 bei der ATCC hinterlegt und diesen wurden die jeweiligen folgenden Zugangsnummern: HB9382, HB9381 und HB9383 zugeteilt.
K. Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen
Die Polypeptidanaloga der huTFh Faktor VII/VIIa-Bindungsstelle, Antikörperzusammensetzungen, monoklonale Antikörperzusammensetzungen und antikoagulatorische MoAbs der vorliegenden Erfindung können jeweils verwendet werden, um die Bindung von Faktor VII/VIIa durch den Gewebefaktor in vivo zu modulieren.
Zum Beispiel kann ein Polypeptidanalogon einer huTFh Faktor VII/VIIa-Bindungsstelle in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung verwendet werden, die an ein menschliches Subjekt in einer wirksamen Menge verabreicht wird, in der Lage sein, die Bindung des Faktors VII/VIIa an den Gewebefaktor kompetitiv zu inhibieren. Von der Inhibierung wird angenommen, dass sie in einer verringerten Geschwindigkeit der Gewebefaktor/Faktor VII/VIIa Komplexbildung resultiert. Somit kann die in vivo Verabreichung eines Polypeptidanalogons einer huTFh Faktor VII/VIIa-Bindungsstelle verwendet werden, um jegliche physiologische Reaktion zu modulieren, die durch die Gewebefaktorbindung an Faktor VII/VIIa eingeleitet wird, wie die Koagulation und einige entzündliche Reaktionen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid vorzugsweise verabreicht, wenn es in einem Phospholipid dispergiert ist, wie zuvor bereits beschrieben wurde.
Ein anderer Ansatz zur Modulierung der Bindung von Faktor VII/VIIa durch den Gewebefaktor in vivo, ist es, eine wirksame Menge einer Antikörperzusammensetzung (Anti-Peptid Antikörper) oder eines antikoagulatorischen MoAb der vorliegenden Erfindung intravenös zu verabreichen. Vorzugsweise sind die Antikörpermoleküle solche, die die paratope Region enthalten und die frei von der Fc-Region sind, wie Immunglobulinfragmente F(ab')₂, Fab und ähnliche. Therapeutisch wirksame Mengen eines antikoagulatorischen MoAb liegen im Bereich von 15 μg/kg Körpergewicht bis 5 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 100 μg/kg Körpergewicht, bis ungefähr 1 mg/kg Körpergewicht und mehr bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 150 μg/kg Körpergewicht bis ungefähr 500 μg/kg Körpergewicht.
In einer anderen Ausführungsform sind die Antikörpermoleküle eines MoAb, antikoagulatorische MoAb oder nicht-neutralisierende MoAb der vorliegenden Erfindung an ein Anti-Tumorreagenz gebunden, um eine Anti-Tumor therapeutische Zusammensetzung auszubilden. Eine wirksame Menge einer Anti-Tumor therapeutischen Zusammensetzung, die so gebildet wird, kann an ein menschliches Subjekt mit Tumorzellen verabreicht werden, die den Gewebefaktor auf ihrer Oberfläche exprimieren. Beispiele solcher Tumorzellen sind Karzinome der Brust und der Lunge.
Typisch für die hierin vorgeschlagenen Antitumoragenzien sind Radionukleotide wie ¹³¹I, ¹⁸⁸Re, ²¹²Bi und ähnliche. Verfahren zur Herstellung Radionukleotid-konjugierter monoklonaler Antikörper, therapeutischer Zusammensetzungen und deren Verwendung werden in Kozak et al., Trends In Biotech., 4:259 – 264 (1986), beschrieben.
Die Polypeptid- oder Antikörpermolekül- enthaltenden Zusammensetzungen, die verabreicht werden, haben die Form von Lösungen oder Suspensionen, jedoch können die Polypeptide auch die Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, langsam freisetzenden Formulierungen oder Pulver haben. In jedem Fall enthalten die Zusammensetzungen 0,1% – 95% des aktiven Inhaltstoffes, vorzugsweise 25 – 70%.
Die Herstellung der therapeutischen Zusammensetzungen, welche die Polypeptide oder Antikörpermoleküle als aktive Inhaltsstoffe enthalten, wird auf dem Gebiet gut verstanden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als Injektionsmittel, entweder als Flüssiglösungen oder Suspensionen hergestellt, jedoch können feste Formen, die für Lösungen oder Suspensionen in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, auch hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert werden. Der aktive therapeutische Inhaltsstoff wird oft mit Exzipienten vermischt, welche pharmazeutisch verträglich und mit dem aktiven Inhaltsstoff kompatibel sind. Geeignete Exzipienten sind z. B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glyzerin, Ethanol und ähnliche sowie Kombinationen davon. Zusätzlich, wenn dies erwünscht ist, kann die Zusammensetzung kleinere Mengen an weiteren Hilfsstoffen wie Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-puffernde Mittel, welche die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffes unterstützen, enthalten.
Eine Polypeptid- oder Antikörpermolekülzusammensetzung kann in die therapeutische Zusammensetzung als neutralisierte pharmazeutisch verträgliche Salzformen hineinformuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (aus den freien Aminogruppen des Polypeptids oder Antikörpermoleküls ausgebildet) und solche, die mit anorganischen Salzen ausgebildet werden, wie, z. B. Salzsäure oder Phosphorsäure oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnliche. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen hergestellt werden, können auch aus anorganischen Basen wie z. B. Natrium, Kalium, Amonium, Calcium oder Eisenhydroxyden abgeleitet werden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Prokain und ähnliche.
Die therapeutischen Polypeptid- oder Antikörpermolekül- enthaltenden Zusammensetzungen werden konventionell topisch oder intravenös verabreicht, wie zum Beispiel durch die Injektion einer Einheitsdosis. Der Begriff „Einheitsdosis", wenn in Bezug auf eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des aktiven Materials enthält, die berechnet ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem notwendigen Verdünnungsmittel, d. h. Trägem oder Vehikeln herzustellen.
Die Zusammensetzungen werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist und in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, der Kapazität des Blutkoagulationssystems des Subjekts, den aktiven Inhaltsstoff zu verwenden und dem Grad der Inhibierung oder Neutralisierung der Gewebefaktorbindungskapazität, sie wie gewünscht ist. Genaue Mengen des aktiven Inhaltsstoffes, der zur Verabreichung notwendig ist, hängen von der Beurteilung des praktischen Arztes ab und sind für jedes Individuum einzigartig. Jedoch liegen geeignete Polypeptiddosierungsbereiche in der Größenordnung von einem bis mehreren Milligramm des aktiven Inhaltsstoffes pro Individuum pro Tag vor und hängen von dem Verabreichungsweg ab. Geeignete Strategien zur einleitenden Verabreichung und Nachimpfungen sind auch variabel, erfolgen aber typischerweise durch eine einleitende Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosierungen bei Intervallen von einer oder mehreren Stunden durch eine anschließende Injektion oder eine andere Verabreichung. Andererseits ist eine kontinuierliche intravenöse Infusion ausreichend, um eine Konzentration von 10 Nanomolar bis 10 Mikromolar im Blut aufrechtzuerhalten.
L. Diagnostisches Systeme
Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung in Kitform umfasst ein exprimiertes Protein, Polypeptid, eine Antikörperzusammensetzung oder eine monoklonale Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als separat verpacktes Reagenz in einer Menge, die für mindestens eine Untersuchung ausreicht. Instruktionen zur Verwendung des verpackten Reagenzes sind typischerweise beigefügt.
„Instruktionen zur Verwendung" umfassen typischerweise einen ausdrücklichen Wortlaut, der die Reagenzkonzentration oder mindestens einen Assay-Verfahrensparameter beschreibt, wie die relativen Mengen von Reagenz und Probe, die zu vermischen sind, die Aufbewahrungszeiten für Reagenz/Probenmischungen, Temperatur, Pufferbedingungen und Ähnliches.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung des Weiteren einen Marken oder ein Anzeigemittel, das in der Lage ist, die Ausbildung eines Komplexes, der eine Reagenzspezies enthält, anzuzeigen.
Hierin verwendet bedeuten die Begriffe „Marker" und „Anzeigemittel" in ihren verschiedenen grammatischen Formen einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt in der Herstellung eines nachweisbaren Signals involviert sind, um die Gegenwart eines Komplexes anzuzeigen. „In vivo"-Marker oder anzeigende Mittel sind solche, die innerhalb des Körpers eines menschlichen Subjekts nützlich sind. Jeglicher Marker oder jegliches Anzeigemittel kann an ein exprimiertes Protein, Polypeptid oder Antikörpermolekül, das Teil einer Antikörper- oder einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist, gebunden werden oder darin eingefügt werden oder separat verwendet werden, und solche Atome und Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien eingesetzt werden. Solche Marker selbst sind in der klinischen diagnostischen Chemie wohlbekannt und stellen einen Teil dieser Erfindung nur dahingehend dar, dass sie mit den ansonsten neuen Proteinen, Verfahren und/oder Systemen verwendet werden.
Das Verbinden von Markern, d. h. Markieren von Polypeptiden und Proteinen, ist auf dem Gebiet wohlbekannt. Zum Beispiel können Antikörpermoleküle, die durch eine Hybridomzelle hergestellt werden, durch metabolische Aufnahme von Radioisotopen-enthaltenden Aminosäuren, die als eine Komponente in dem Kulturmedium zur Verfügung gestellt werden, markiert werden. Siehe zum Beispiel Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3 – 46 (1981). Insbesondere sind die Techniken der Proteinkonjugation oder Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen anwendbar. Siehe zum Beispiel Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8 Suppl. 7:7 – 23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889 – 894 (1984), und U.S. Pat. Nr. 4,493,795.
Die diagnostischen Systeme können auch vorzugsweise als separate Verpackung ein spezifisches Bindungsagens umfassen. Ein „spezifisches Bindungsagens" ist eine molekulare Einheit, die in der Lage ist, selektiv eine Reagenzspezies der vorliegenden Erfindung zu binden, aber ist selbst kein Proteinexpressionsprodukt, Polypeptid oder Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung. Beispielhafte spezifische Bindungsagenzien sind Antikörpermoleküle, Komplementproteine oder Fragmente davon, Protein A, Blutkoagulationsfaktor VII/VIIa, Rindergewebefaktor und Ähnliche. Vorzugsweise kann das spezifische Bindungsagens die Reagenzspezies binden, wenn die Spezies als Teil eines Komplexes vorhanden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindungsagens markiert. Jedoch, wenn das diagnostische System ein spezifisches Bindungsagens umfasst, das nicht markiert ist, dann wird das Agens typischerweise als ein Verstärkungsmittel oder Reagenz verwendet. In diesen Ausführungsformen ist das markierte spezifische Bindungsagens in der Lage, spezifisch die amplifizierenden Mittel zu binden, wenn das amplifizierende Mittel an einen Komplex gebunden ist, der eine Reagenzspezies enthält.
Die diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung können in einem „ELISA"-Format verwendet werden, um die Gegenwart oder Menge von huTFh in einer Körperflüssigkeitsprobe wie Serum, Plasma oder Urin nachzuweisen. „ELISA" bezeichnet einen Enzym-gebundenen Immunabsorbions-Assay, der einen Antikörper oder ein Antigen einsetzt, das an eine feste Phase gebunden ist, und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat, um die Menge eines Antigens oder Antikörpers, der in einer Probe vorhanden ist, nachzuweisen und zu bestimmen. Eine Beschreibung der ELISA-Technik ist in Kapitel 22 der 4. Ausgabe von Basic and Clinical Immunology von D. P. Sites et al., publiziert durch Lange Medical Publications of Los Altos, CA in 1982 und in den U. S. Patenten No. 3,654,090; Nr. 3,850,752 und Nr. 4,016,043 zu finden, welche alle hierin durch Referenzieren aufgenommen werden.
Somit können in bevorzugten Ausführungsformen das exprimierte Protein, Polypeptid oder Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung an eine Matrix gebunden werden, um einen festen Träger auszubilden, der separat in den jeweiligen diagnostischen Systemen verpackt werden kann.
Das Reagenz ist typischerweise an die feste Matrix durch Adsorption aus einem wässrigen Medium gebunden, obwohl andere Verfahren der Fixierung, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, verwendet werden können.
Nützliche festliche Matrizen sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Solche Materialien umfassen das vernetzte Dextran, das unter dem Markennamen SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) verfügbar ist; Agarose; Polystyrolkügelchen von ungefähr einem Mikron bis ungefähr 5 Millimeter im Durchmesser, die Abbott Laboratories of North Chicago, IL verfügbar sind; Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztes Polyacrylamid, Nitrocellulose- oder Nylon- basierende Gewebe wie Folien, Streifen oder Paddel; oder Röhrchen, Platten oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, wie solche, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt werden.
Die Reagenzspezies, das markierte spezifische Bindungsagens oder amplifizierendes Reagenz eines diagnostischen Systems, das hierin beschrieben wird, kann in Lösung, als Flüssigdispersion oder als im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, zur Verfügung gestellt werden. Wo die Anzeigemittel ein Enzym sind, kann das Substrat des Enzyms auch in einer separaten Verpackung eines Systems zur Verfügung gestellt werden. Ein fester Träger, wie die zuvor beschriebene Mikrotiterplatte und ein oder mehrere Puffer können auch als separat verpackte Elemente in diesem diagnostischen Assaysystem umfasst sein.
Die hierin diskutierten Verpackungen in Bezug auf die diagnostischen Systeme sind solche, die üblicherweise in diagnostischen Systemen verwendet werden. Solche Verpackungen umfassen Glas- und Plastik- (z. B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat) flaschen, Vials, Plastik- und Plastikfolie laminierte Umschläge und ähnliche.
M. Assay-Verfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft jegliches Verfahren, das in dem Nachweis von huTFh durch das Herstellen eines Komplexes resultiert, der ein exprimiertes Protein, Polypeptid oder Antikörpermolekül enthält, das in einer Antikörper- oder monoklonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, das es viele wohlbekannte klinische diagnostische Chemieverfahren gibt, die verwendet werden können, um diese Komplexe auszubilden. Daher ist die Erfindung nicht auf die beispielhaft hierin beschriebenen Assay-Verfahren eingeschränkt.
1. Thrombus-Nachweis
Es ist ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Thrombus in einem menschlichen Subjekt vorgesehen. Eine wirksame Menge einer monoklonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die Antikörpermoleküle enthält, die an in vivo anzeigende Mittel gebunden ist, wird intravenös in das Subjekt verabreicht. In bevorzugten Ausführungsformen sind die markierten Antikörpermoleküle solche, die mit huTFh immunreagieren sowie einem Polypeptid aus den Tabellen 1 und 2, aber nicht mit p204-226, mehr bevorzugt solche, die durch die Hybridomzellen TF8-5G9, TF9-6B4 oder TF9-10H10 hergestellt werden.
Das Subjekt wird dann für einen vorbestimmten Zeitraum aufbewahrt, der für die markierten Antikörpermoleküle ausreicht, um mit dem in einem Thrombus vorhandenen huTFh-Teil zu reagieren und einen Komplex auszubilden und vorzugsweise für einen zusätzlichen Zeitraum, der ausreicht, damit eine wesentliche Menge nicht reagierten Antikörpermoleküle den Körper verlässt. Das Subjekt wird dann auf die Gegenwart und vorzugsweise Lokalisierung eines jeglichen gebildeten Komplexes untersucht.
2. Nachweis von huTFh in einer Körperprobe
Es können verschiedene heterogene und homogene Assay-Protokolle eingesetzt werden, die entweder kompetitiv oder nicht kompetitiv sind, zum Nachweis des Vorhandenseins und vorzugsweise der Menge von huTFh in einer Körperprobe, vorzugsweise einer Körperflüssigkeitsprobe. Zum Beispiel werden eine flüssige Körperflüssigkeitsprobe und markiertes p26-49 mit einem festen Träger vermischt, der Antikörpermoleküle umfasst, die durch die Hybridomzellen TF8-5G9 oder TF9-10H10 hergestellt werden, die auf die innere Wand einer Mikrotiterplatte befestigt sind, um eine Fest-Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung auszubilden. Die Mischung wird unter biologischen Assay-Bedingungen für einen Zeitraum aufbewahrt, der ausreicht, damit jegliches huTFh, das in der Probe vorhanden ist, mit markiertem p26-49 um die Bindung der Antikörpermoleküle, die als fester Träger vorhanden sind, zu kompetitieren und ein Festphasen-Immunreaktionsprodukt auszubilden. Das nicht markierte p26-49 wird dann aus den Immunreaktionsprodukten abgetrennt. Die Menge an markiertem p26-49, das als Immunreaktionsprodukt gebunden ist, wird dann bestimmt und stellt als Differenz ein Maß der Gegenwart von huTFh dar.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind zur Illustration, aber nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht.
1. Herstellung eines Gewebefaktor- enthaltenden menschlichen Gehirnextraktes
Normale menschliche Gehirne, die bei Autopsien erhalten wurden, wurden entweder innerhalb von 12 Stunden prozessiert oder bei –80° Celsius (°C) gefroren gelagert. Die Meninges und das Zerebellum wurden entfernt und die verbleibenden Gehirnteile in einem gleichen Volumen kaltem (0°C) Aceton unter Verwendung eines Polytron Homogenisators (Brinkman Instruments, Co., Westbury, NY) homogenisiert. Das resultierende Homogenat wurde mit weiteren drei Volumen kaltem Aceton vermischt und die feste Gewebefraktion wurde durch Filtration unter Verwendung einer Glasfilterfritte zurückgewonnen. Acetonlösliches Material wurde aus den zurückgebliebenen Feststoffen sieben zusätzliche Male extrahiert, jedes Mal durch Vermischen mit zwei Volumen kaltem Aceton und anschließender Filtrierung. Nach der letzten Filtration wurde verbleibendes Aceton bei Atmosphärendruck aus den verbliebenen Feststoffen über Nacht bei 20 °C verdampfen gelassen.
Die zurückgebliebenen Gehirngewebefeststoffe wurden dann 5 Extraktionen ausgesetzt, jede durch Vermischen der Feststoffe mit einer 2 : 1 Heptan : Butanol Lösung bei einem Verhältnis von 1 g Gewebefeststoff pro 25 Milliliter (ml) Heptan : Butanol durchgeführt, gefolgt durch Filtration, um die Feststoffe zurückzugewinnen. Nach der letzten Filtration wurden die erhaltenen Gehirngewebefeststoffe wiederum über Nacht bei ungefähr 20°C unter Atmosphärendruck getrocknet, um ein entfettetes Gehirngewebepulver auszubilden, das bei –80°C bis zur Nutzung gelagert wurde.
25 g des Gehirn des Gehirngewebepulvers wurden anschließend mit 500 ml TS/EDTA-Puffer [100 millimolar (mM) NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,02% Natriumazid, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 % (v/v) Triton X-100 (Polyarylethylen 9 Octylphenylether)] vermischt und über Nacht bei 4°C gerührt. Die Mischung wurde dann bei 15.300 × g für eine Stunde zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 500 ml Puffer A resuspendiert [100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,02% Natriumazid, 2 % Triton X-100], um eine Aufschlämmung auszubilden. Nach Rühren für eine Stunde bei Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung wie oben beschrieben zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde zurückgewonnen, lyophilisiert und anschließen in 100 ml Puffer A solubilisiert, um eine huTF-enthaltende Gehirnextraktlösung zu bilden.
2. Koagulationsassay zur Messung der huTFh prokoagulatorischen Aktivität
Die huTFh prokoagulatorische Aktivität wurde in einem Einzelstadium – Koagulationsassay gemessen, der mit allen Reagenzien und Mischungen bei 37°C durchgeführt wurde. Eine Sammelprobe normalen menschlichen Plasmas wurde mit Zitrat durch das Vermischen von einem Volumen Plasma mit einem Volumen einer Lösung, enthaltend 20 mM Natriumzitratdihydrat und 140 mM NaCl, pH 7,4 versetzt. 100 Mikroliter einer Probe, enthaltend huTFh, das in TBS/BSA-Lösung (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 Rinderserumalbumin) verdünnt wurde, wurde mit 100 μl des Zitrat- versetzten Plasmas vermischt. 100 μl einer 25 mM CaCl₂-Lösung wurden dann zugemischt, um eine Koagulationsreaktionsmischung auszubilden, die leicht geschwenkt wurde, bis die Koagulation stattfand. Die Zeit zwischen der Zugabe von CaCl₂ und der Gerinnungsausbildung wurde gemessen. Eine Standardkurve der huTFh-Aktivität wurde dann durch grafische Auftragung der Verdünnung gegen die Koagulationszeit in Sekunden konstruiert. Eine beispielhafte Standardkurve wird in 3 gezeigt.
3. Herstellung eines Faktor VII enthaltenden festen Trägers zur Affinitätsisolierung von huTF
Menschlicher Faktor VII/VIIa wurde wie durch Fair, Blood, 62:784 – 91 (1983), welches hierdurch durch Referenzieren aufgenommen wird, beschrieben, isoliert. Dieser isolierte Faktor VII/VIIa wurde für die Kopplung an einer festen Agarosematrix durch Dialysieren von 5 Milligramm (mg) gegen 0,1 M 2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES) (pH 6,5), über Nacht bei 4°C aktiviert. Kalziumchlorid wurde zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. Faktor VII/VIIa wurde dann mit 4 ml AffiGel-15 aktivierten Agarosekügelchen (Biorad Laboratories, Richmond, CA) vermischt und die resultierende Kopplungsreaktionsmischung wurde durch Rotieren für 4 Stunden bei 4°C gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Biorad) verarbeitet.
Überschüssige Proteinbindungsstellen auf dem festen Träger wurden durch leichtes Schwenken des festen Trägers in 0,1 M Glycinethylester für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Danach wurde der feste Träger nacheinander auf einer Glasfilterfritte Trichter mit ungefähr 20 ml von jedem der (1) Puffer A, (2) Puffer A, enthaltend 1 M NaCl, (3) Puffer A enthaltend 5 mM EDTA und (4) Puffer A enthaltend 1 mM CaCl₂ gewaschen. Überschüssige Flüssigkeit wurde dann durch Vakuum entfernt, um eine halbtrockene feste Masse (Kuchen) auszubilden.
4. Faktor VII/VIIa-Affinitätsisolierung von huTF
20 ml einer Lösung, enthaltend 0,1 M Glycinethylester und 0,1 M MES, pH 6,5, wurden mit 22.5 ml Affigel-15 Agarosekügelchen (Biorad) vermischt, um eine Kopplungsreaktionsmischung auszubilden. Die Kopplungsreaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde aufbewahrt. Das resultierende Konjugat wurde auf einer Glasfilterfritte viermal mit 10 Volumen Puffer 1 gewaschen und unter Vakuum filtriert, um einen Glycinethylester-Agarosekuchen auszubilden.
30 ml der Gehirnextraktlösung, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurden über Nacht bei 4°C gegen 6 Liter Puffer A, enthaltend 1 mM Calciumchlorid, dialysiert. Der dialysierte Gehirnextrakt wurde mit dem Glycinethylester-Agarosekuchen vermischt, um eine Fest- Flüssigphasenreaktionsmischung auszubilden. Nach Aufbewahrung für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rotieren wurden die festen und flüssigen Phasen durch Filtration unter Verwendung einer Glasfilterfritte abgetrennt. Die flüssige Phase wurde zurückgewonnen und mit Trasylol (Aprotinin; Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) auf eine Endkonzentration von 10 Einheiten pro ml vermischt. Die zurückgewonnene flüssige Phase wurde mit dem in Beispiel 3 hergestellten Faktor VII/VIIa/Agarosekuchen vermischt, um eine zweite Feststoff/Flüssigphasenmischung herzustellen.
Diese Mischung wurde über Nacht bei 4°C unter Rotieren aufbewahrt, um die Ausbildung eines huTF-Faktor VII/VIIa enthaltenden Festphasenproduktes zu ermöglichen. Die festen und flüssigen Phasen wurden dann durch Filtration wie zuvor beschrieben abgetrennt. Die auf der Glasfilterfritte zurückbleibende feste Phase wurde mit 25 ml Puffer A, enthaltend 1 mM Calciumchlorid, gewaschen. Die feste Phase wurde dann auf eine Glaschromatographiesäule (0,5 × 15 cm; Biorad) transferiert und mit 6 ml des gleichen Waschpuffers gewaschen. Jegliches huTF, das an den festen Träger nach den o.g. Waschungen gebunden war, wurde dann durch Waschen des festen Trägers auf der Glassäule mit Puffer A, enthaltend 5 mM EDTA, freigesetzt (eluiert). Das eluierte Material wurde in 1 ml Fraktionen gesammelt und jede Fraktion wurde auf die Gegenwart von huTF wie in Beispiel 2 beschrieben untersucht. huTF-enthaltende Fraktionen wurden zusammengeführt und über Nacht gegen 6 Liter TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5), enthaltend 1% Triton X-100 (TBS/Triton) bei 4°C dialysiert.
Das so hergestellte Dialysat wurde anschließend mit vier Volumen kaltem Aceton vermischt, um das huTF-Protein zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde dann durch Zentrifugation bei 5.000 g für 30 Minuten bei ungefähr –10°C gesammelt. Das resultierende Pellet wurde unter Stickstoff getrocknet. Typisch Ausbeuten waren 2 μg huTF pro Gramm (Trockengewicht) des entfetteten Gehirngewebepulvers.
Eine Probe des so gebildeten isolierten huTFs wurde in TBS/Triton suspendiert und dann mit Na¹²⁵I (16 Mikrocurie pro Mikrogram, Amersham, Arlington Heights, IL) unter Verwendung von Iodogen gemäß den Vorgaben des Herstellers (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) markiert. Nach dem Markieren wurde überschüssiges nicht reagiertes ¹²³I von dem markierten huTF durch Entsalzungschromatography auf Sephadex G25 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) unter Verwendung von TBS/Triton abgetrennt.
¹²⁵I-markiertes huTF enthaltende Proben wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gemäß Laemmli, Nature, 227:680 – 685 (1970) evaluiert. Dithiothreitol (DTT, Sigma) wurde zu den Probenpuffern auf 100 mM für solche Proben hinzugefügt, die unter reduzierenden Bedingungen evaluiert wurden. Es wurden Immunpräzipitationen durch über Nacht Inkubation bei 4°C von ¹²⁵I-huTF in 1% Triton X100, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl mit 1/10 Volumen TF8-5G9 oder Pab 100 (ATCC TIB 115; eine Hybridomzelle, die einen SV40 großen T Antigen spezifischen Antikörper herstellt, der hier als negative Kontrolle verwendet wird) Hybridomzellkulturüberstand durchgeführt. Ziegen Anti-Maus IgG, das auf Agarosekügelchen immobilisiert war (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), wurde dann verwendet, um die primären Immunreaktionsprodukte zu adsorbieren. Die Kügelchen wurden ausgiebig mit dem gleichen Puffer gewaschen und das gebundene ¹²⁵I-huTF wurde durch Kochen für 5 Minuten in Probenpuffer mit und ohne DTT eluiert. Proteinbanden wurden nach SDS-PAGE durch Autofluorographie sichtbar gemacht.
Wenn isoliertes huTF radioiodiert, mit DTT reduziert und durch SDS-PAGE auf 10% Acrylamidgelen analysiert wurde, wurde eine einzelne große Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 47 kDa (4) beobachtet. Wenn jedoch nicht reduziertes huTF in ähnlicher Weise analysiert wurde, wurden zwei Banden bei ungefähr 58 und 47 kDa in relativ gleichen Mengen (6, Bahn B) beobachtet, was mindestens zwei verschiedene Formen vorschlägt.
Mögliche Erklärungen für die beiden Banden, die in der Abwesenheit einer Reduktion beobachtet werden, waren, dass die größere, d. h. langsamer wandernde Bande, stärker glykosyliert sein könnte, zusätzliches nicht prozessiertes Protein enthalten könnte oder ggf mit zusätzlichen disulfidbindungsgebundenen Polypeptiden assoziiert sein könnte. Das Vorhandensein einer einzelnen Bande nach Reduktion war mit den zwei ersten Vorschlägen inkonsistent. Die letztere Möglichkeit schien am wahrscheinlichsten, aber bedingt durch die geringe Größendifferenz wären zusätzliche Polypeptidketten wahrscheinlich klein genug, um an oder nahe der Farbfront zu wandern würden nach Reduktion nicht durch 10% Acrylamidgele aufgelöst werden. Eine Elektrophorese von reduziertem und nicht reduziertem huTF auf 15% Polyacrylamidgelen versagte dahingehend, eine einzelne diskrete Kette aufzuzeigen, obwohl verschiedene kleinere, schnell wandernde Banden beobachtet wurden (5, Bahnen A und B). Diese kleineren, weniger häufigen Polypeptide könnten Verunreinigungen darstellen, welche zuvor bereits festgestellt wurden [Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917 – 20 (1985) und Guha et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:299 – 302 (1986)]. Um diese Möglichkeiten aufzuklären, wurden die 47 kDa und 58 kDa-Banden aus dem nicht reduzierten Gel ausgeschnitten und jede wurde mit Dithiothreitol reduziert und einzeln einer SDS-PAGE auf einem 15 % Acrylamidgel ausgesetzt (5, Bahnen C und D). Das 58 kDa-Protein wurde bei 12,5 kDa als leichte Kette und eine 47 kDa schwere Kette aufgelöst. Wenn das 47 kDa-Protein untersucht wurde, wurde nur eine schwere Kette des gleichen Molekulargewichts beobachtet. Somit besaßen beide Formen schwere Ketten von ähnlichem Verhalten auf SDS-PAGE.
Um das Vorhandensein der leichten Kette direkt zu zeigen, wurde ¹²⁵I-huTF mit dem huTFspezifischen monoklonalen Antikörper TF8-5G9 immunpräzipitiert und einer Elektrophorese in der Gegenwart eines Reduzierungsmittels ausgesetzt. Es wurde hauptsächlich die 47 kDa-Bande zusammen mit einer diskreten Bande von ungefähr 12,5 kDa beobachtet ( 6, Bahn A). Die Elektrophorese der Probe ohne vorherige Reduktion ergab Banden von ungefähr 47 kDa und 58 kDa, jedoch keinerlei gering molekulargewichtige Polypeptide (6, Bahn B). Die Elektrophorese von nicht reduziertem huTF ergab auch kleinere Mengen eines 90 kDa-Proteins, das mit einem Dimer der huTF schweren Kette konsistent ist, das durch Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917 – 20 (1985), vorgeschlagen wurde.
Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die huTF leichte Kette proteolytisch aus der schweren Kette abgeleitet sein könnte, wurden die SDS-PAGE isolierten leichten und schweren Ketten einer N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse ausgesetzt.
Schwere und leichte Ketten wurden auf SDS-PAGE aufgelöst und auf aktivierte aminoderivatisierte Fiberglasfilter unter Verwendung der Methode des hohen pHs von Abersold et al., J. Biol. Chem. 261:4229 – 4238 (1983) elektrogeblottet. Die Proteinbanden wurden auf den Blots durch Fluoressenzfärbung (Abersold et al., Supra,) sichtbar gemacht, ausgeschnitten und sequenziert, während sie noch an das Fiberglas gebunden waren, in einem Applied Biosystems 470A-Protein Sequenziergerät mit Online HPLC-Analyse der PTH-Derivate. Alternativ dazu wurden die Proteinbanden auf dem Gel durch Färben mit Coomassie Blau sichtbar gemacht und zur Sequenzierung elektroeluiert. Beide Verfahren ergaben gleichwertige Ergebnisse.
Die Mikrosequenzierung der schweren huTF-Kette resultierte wiederholt in zwei gleichen Aminosäuresequenzen in ungefähr gleich molaren Mengen. In fast allen Fällen kam jede Aminosäurerest zweimal, zwei Zyklen voneinander entfernt, vor. Dieses ist ein klarer Beweis für ungleichmäßige N-Termini von zwei Varianten der huTF schweren Kette, welche sich an dem N-Terminus durch zwei Reste in der Länge unterscheiden. Der N-Terminus der längeren Variante wurde als Ser-Gly-X-X-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr-X-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser analysiert, worin X einen nicht spezifizierten Aminosäurerest darstellt.
Verschiedene Versuche, die leichte Kette zu sequenzieren, ergab keinerlei Sequenzinformation, was mit einem blockierten N-Terminus konsistent ist. Jedoch waren die schwere und die leichte Kette des huTF als Antigen zu unterscheiden, da zwei Kaninchen Anti-huTF Antiseren und 21 murine monoklonale Antikörper, die gegen isoliertes huTF gezüchtet worden waren, alle nur die schwere Kette gebunden haben. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die leichte Kette ein proteolytisches Fragment der schweren Kette ist. Zudem reagierte die leichte Kette nicht mit Antiserum auf beta-₂-Mikroglobulin.
Die Bedeutung der 12,5 kDa huTF leichten Kette ist derzeit unbekannt. Sie ist wahrscheinlich nicht künstlich während der Isolierung durch zufälligen Disulfidaustausch abgeleitet, da sie eine einzelne diskrete molekulare Spezies darstellt. Wenn affinitätsisoliertes huTF einer SDS-PAGE ohne Reduktion ausgesetzt wurde, wurde huTF-Aktivität aus Gelen eluiert, die sowohl mit den 58 kDa wie auch den 47 kDa Molekulargewichtsformen korrespondieren. Eine huTF-Aktivität, die mit diesen zwei Molekulargewichtsformen korrespondiert, wurde auch nachgewiesen, wenn grobes Gehirn und teilweise isolierte Plazentaextrakte einer Elektrophorese auf SDS-Gelen (Daten nicht gezeigt) ausgesetzt wurden. In allen Fällen war die Aktivität Faktor VII-abhängig, was eine huTF spezifische Aktivität anzeigt. Diese Entdeckungen zeigen, dass huTF allein den Faktor VII aktivieren kann und dass die leichte Kette für diese Funktion nicht benötigt wird.
Es ist von Interesse, dass die leichte Kette nur an ungefähr die Hälfte der huTF schweren Ketten disulfidgebunden ist. Entweder ist sie in vivo in einem wesentlichen Anteil von huTF nicht vorhanden oder sie ist vorhanden, aber über nicht kovalente Wechselwirkungen assoziiert, die durch Detergenzien aufgebrochen werden. Die leichte Kette von huTF kann in früheren Studien übersehen worden sein, da ihre geringe Größe in der Migration an der Färbemittelfront in einer SDS-PAGE resultieren würde und weil die publizierten Analysen von huTF nach Reduktion durchgeführt wurden. Die geringen Mengen, welche unter Verwendung derzeitiger Affinitätsverfahren isoliert werden können, machen es schwer, eine assoziierte kleine Polypeptidkette durch Proteinfärbung nachzuweisen.
Obwohl monomeres huTF eine Koagulation in vitro einleiten wird, kommt eine physiologische Einleitung der Koagulation durch huTF auf Zelloberflächen vor. Man kann spekulieren, dass die leichte Kette eine subtilere Rolle in der huTF-Funktion oder Organisation spielen kann, als man in einem einfachen Koagulationsassay nachweisen kann. Zum Beispiel kann die leichte Kette in dem Zusammensetzen des zwei Untereinheiten umfassenden Rezeptors für Faktor VII involviert sein, was als Hypothese aufgestellt wurde, um die wahrscheinlich positive kooperative Aktivität der Bindung von Faktor VII/VIIa an den Gewebefaktor zu erklären. Alternativ dazu kann die Organisation von huTF in Strukturdomänen auf der Zelloberfläche und die Regulation der huTF-Aktivität auf Zelloberflächen durch das huTF leichte Kettenmolekül vermittelt sein.
Die Rolle N-gebundener Oligosaccharide wurde durch das Deglykosylieren einer Probe des ¹²⁵I-huTF untersucht. Ungefähr 12,74 Nanogramm (ng) von markiertem huTF, enthaltend ungefähr 3,6 × 10⁵ Zählungen pro Minute (counts per minute, cpm) wurden mit 20 μl einer Lösung vermischt, die 0,4 Einheiten Glykopeptidase F (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA und 1% Triton X-100 enthält, vermischt und anschließend für 16 Stunden bei 37°C aufbewahrt. Das deglykosylierte Produkt wurde dann durch SDS-PAGE wie zuvor beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse der Deglykosylierungstudien, die in 7, Bahnen 4 und 5 gezeigt werden, zeigen an, dass die 58 kDa-Form von huTF ein höheres relatives Molekulargewicht als die 47 kDa Form aufzeigt, bedingt durch die Gegenwart zusätzlicher Proteinbereiche, d. h. der leichten Kette.
Das so isolierte huTF wurde wiederum Lipid-versetzt, um seine prokoagulatorische Aktivität zu rekonstituieren. Das Gewebefaktor: Lipid – Verhältnis, das notwendig ist, um ein wieder Lipid-versetztes Gewebefaktorprodukt mit einer maximalen Aktivität zur Verfügung zu stellen, wurde empirisch durch Auflösen des isolierten huTFs, das oben erhalten wurde, bei verschiedenen Konzentrationen in HBS-Pufferlösung (20 mM HEPES, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Natriumazid), die 0,1% BSA enthält, bestimmt. Die verschiedenen huTF-Verdünnungen wurden dann wie unten beschrieben wieder mit Lipiden versetzt und das Verhältnis, das die höchste wiedergewonnene Aktivität produziert, wie durch den in Beispiel 2 beschriebenen Koagulationsassay bestimmt, wurde dann zur späteren Verwendung hergestellt.
Lipide zur Relipidierung von huTF wurden durch das Extrahieren dieser aus Kaninchengehirn – Acetonpulver hergestellt, das von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erhalten wurde. Das Pulver wurde mit Heptan : Butanol (2 : 1, V/V) bei einem Verhältnis von 25 ml Heptan-Butanol pro Gramm Pulver vermischt und die darin enthaltenen Feststoffe wurden durch Filtration unter Verwendung eines Glasfrittentrichters zurück gewonnen. Dieser Extraktionsprozess wurde sechsmal mit den erhaltenen Feststoffen durchgeführt. Die erhaltenen Feststoffe wurden dann durch Rotationsverdampfung getrocknet, in Chloroform aufgelöst und bei –80°C gelagert: Bei Bedarf wurden Portionen der in Chloroform gelösten Feststoffe unter Stickstoff getrocknet und in einer Konzentration von 4 mg/ml in einer Lösung von frisch hergestelltem 0,25 % Natriumdeoxycholat aufgelöst, um eine Kaninchengehirnphospholipidlösung (RBPL) auszubilden.
Zur Relipidierung wurden 100 μl von jeder huTF-Verdünnung mit 100 μl der RBPL-Lösung, 0,76 ml HBS-Lösung, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (HBS/BSA) und 40 μl einer 100 mM Cadmiumchlorid-Lösung vermischt. Diese Mischung wurde bei 37°C für 2 Stunden aufgewahrt und die Aktivität von huTF, die darin enthalten war, wurde in dem Koagulationsassay, der in Beispiel 2 beschrieben wird, bestimmt.
5. Herstellung von Hybridomzellen und monoklonalen Antikörpern
Alle Hypridomazellen wurden unter Verwendung von Milzzellen aus weiblichen Balb/c-Mäusen hergestellt, die vom Scripps Clinic and Research Institute vivarium erhalten wurden, und im Altersbereich von 6 bis 8 Wochen lagen.
a) Maus TF8 Immunisierung
Fünf Mikrogramm (μg) von affinitätsisoliertem huTF, das in Beispiel 4 hergestellt worden war, wurden in normaler Salzlösung bei 100 μg/ml aufgelöst, mit R-700 Adjuvanz vereint, das von Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO, erhalten wurde, und anschließend in einem 1 : 1 Verhältnis (V/V) emulgiert. Die Emulsion wurde dann subkutan (s. c.) in die Maus TF8 injiziert.
Die Maus TF8 wurden zwei Wochen später in gleicher Weise unter Verwendung einer Emulsion, enthaltend denaturiertes huTF und R-700 Adjuvanz, inokuliert. Denaturiertes huTF wurde durch Kochen für 5 Minuten in TBS [150 mM CaCl, 50 mM Tris-Hcl (pH 7,5)], enthaltend 0,09% Triton X-100, 0,93% SDS, 0,2 M 2-Mercaptoethanol und huTF bei 270 μg/ml, hergestellt. Danach wurde das denaturierte huTF mit einem gleichen Volumen normaler Salzlösung, enthaltend 0,6 mg/ml Mausserumalbumin, vermischt. Anschließend wurden 4 Volumen Aceton zu der denaturierten huTF-Lösung hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei –20°C aufbewahrt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei ungefähr 13.000 g für 10 Minuten gesammelt, einmal mit einer 4 : 1 (V : V) Aceton : H₂O-Lösung gewaschen und dann in 200 μl normaler Salzlösung bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml suspendiert.
Ungefähr 4 Wochen nach der einleitenden Injektion wurden 33 μg affinitätsisoliertes (nicht denaturiertes) huTF in 0,1 ml normaler Salzlösung mit 0,1 ml vollständigem Freund's Adjuvanz (CFA) vermischt, um eine Emulsion auszubilden. Diese Emulsion wurde dann intraperitoneal (i. p.) in die Maus TF8 injiziert.
Ungefähr 8 Wochen nach der einleitenden Inokulation wurden 15 μg affinitätsisoliertes huTF in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) intravenös (i. v.) injiziert und ein identisches huTF/PBS-Inokulum wurde i. v. 24 Stunden später gegeben. Maus TF8-Milzzellen wurde zur Fusion 3 Tage später geerntet.
b) Maus TF9-Immunisierung
Maus TF9 wurde dem gleichen Inokulierungsplan wie Maus TF8 unterzogen, außer das beide Ribi-Adjuvanz-Injektionen huTF verwendeten, das vor der Emulgierung denaturiert worden war. Zusätzlich wurde das erste PBS-Inokulum i. p. verabreicht und 4,5 Monate nach dem CFA- enthaltenden Inokulum.
c) Hybridomzellenbildung
Das gleiche Fusionsprotokoll wurde für sowohl TF8- wie auch TF9- abgeleitete Milzzellen verwendet. Ungefähr 1 × 10⁸ Milzzellen aus jeder Maus wurden mit 2 × 10⁷ P3X63 Ag8.653.1 Myelomazellen in 200 μl eines Fusionsmediums, umfassend 30% W/V Polyethylenglycol (PEG 4.000, ATCC 25322-68-3) vermischt. Nach der Zellfusion wurden die resultierenden Hybridomzellen in Platten mit 36 Vertiefungen ausgesät, in HAT-Medium kultiviert (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) und anschließend auf die Fähigkeit hin untersucht, ein Antikörpermolekül herzustellen, das mit huTF reagiert.
Sowohl die aus TF8- wie auch aus TF9-Milzzellen abgeleiteten Fusionen resultierten in HAT-Medium resistenten Hybridomzellklonen. Die TF8-Fusion ergab 907 HAT resistente Hybridomzellen, wohingegen die TF9-Fusion 348 HAT resistente Hybridomzellen ergab.
6. Screening von Hybridomzellen auf die Herstellung von Anti-huTF Antikörpermolekülen
a) Festphasen RIA
100 μl Ziegen Anti-Maus IgG (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), die in 20 μg/ml TBS verdünnt waren, wurden in die Vertiefungen von Immulon 96-Well flexible Vinylmikrotiterplatten (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) gegeben. Die Platten wurden für eine Stunde bei 37°C aufbewahrt, um es den IgG zu ermöglichen, an die Wände der Vertiefungen zu adsorbieren. Nach dreimaligem Waschen mit TBS wurden 100 μl TBS/Triton, das 3% Ovalbumin enthält, zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um überschüssige Proteinverbindungsstellen zu blockieren.
Die Vertiefungen wurden dann für eine Stunde bei ungefähr 20 °C aufbewahrt und dann die Blockierungslösung durch Absaugen entfernt. 50 μl des Hybridomzellkulturüberstandes wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die resultierende Fest-Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung wurde bei 37°C für eine Stunde aufbewahrt. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit TBS gespült und überschüssige Flüssigkeit wurde durch Absaugen entfernt.
50 μl ¹²⁵I-markiertes huTF, das in Beispiel 4 hergestellt wurde, und ungefähr 1 ng huTF und ungefähr 5 × 10⁵ cpm in TBS/Triton enthält, wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine zweite Fest-Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung auszubilden. Die Vertiefungen wurden für 2 Stunden bei 37°C aufbewahrt und dann dreimal mit TBS/Triton gespült, um die Festphasen-gebundenen ¹²⁵I-huTF enthaltenden Immunreaktionsprodukte zu isolieren. Überschüssige Flüssigkeit wurde durch Absaugen entfernt und die Vertiefungen wurden trocknen gelassen. Einzelne Vertiefungen wurden ausgeschnitten und das ¹²⁵I, das in jeder Vertiefung enthalten war, wurde durch einen Gammazähler bestimmt.
Die Hintergrundradioaktivität (keinerlei Reaktion von huTF mit Antikörper) lag durchschnittlich bei ungefähr 200 – 300 cpm pro Vertiefung, während positive Reaktionen von huTF mit Antikörper 10.000 cpm pro Vertiefung ergaben. Hybridomzellen, die als positiv für die Herstellung von Anti-huTF Antikörpern beurteilt wurden, wurden ausgewählt und stellen die Hybridomzellen der vorliegenden Erfindung dar. Anschließend wurden solche Hybridomzellen in dem Dotblot-Assay, der unten beschrieben wird, untersucht.
b) Dot Blot ELISA
Aceton-präzipitiertes huTF, das in Beispiel 4 hergestellt wurde, wurde zweimal mit einer 4 : 1 (V/V) – Aceton : N₂O-Lösung extrahiert. Das Präzipitat, das zurückblieb, wurde in 20 μg/ml in TBS resuspendiert. 20 ng (1 μl) dieser huTF-Lösung wurde auf BA83 Nitrozellulosepapier (Schleicher und Schüll, Keene, NH) neben einer auf dem Papier in permanenter Tinte geschriebenen Zahl aufgetragen. Das aufgetragene huTF wurde luftgetrocknet und einzelne Flecken wurden dann als Papierkreise unter Verwendung eines Lochers ausgeschnitten. Einzelne Papierkreise wurden in einzelne Vertiefungen eines Gestells mit vielen Vertiefungen eingetaucht, die BLOTTO enthalten [Johnson et al., Gene.
Anal. Tech., 1 : 3 (1984)], und wurden bei 37°C für ungefähr 1 Stunde darin aufbewahrt.
Das BLOTTO wurde aus den Vertiefungen durch Absaugen entfernt und 200 μl Hybridomzellkulturüberstand wurden zu jeder Probe hinzugefügt. Die Vertiefungen wurden dann bei 37°C für 2 Stunden aufbewahrt. Die Papierkreise wurden zweimal mit TBS gewaschen, aus den Vertiefungen entfernt, und in einem einzigen größeren Behälter für eine zusätzliche Spülung in TBS zusammengegeben. Überschüssige Flüssigkeit wurde dann aus dem Behälter entfernt.
Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Maus IgG aus dem Protoblotreagenzkit (Promega Biotech, Ann Arbor, Ml) wurde 1 : 5.700 in BLOTTO verdünnt und mit den Papierkreisen in Kontakt gebracht. Die Protoblot-Lösung wurde bei 37°C für 30 Minuten aufbewahrt. Die Papierkreise wurden dann dreimal in TBS gespült. Gebundene alkalische Phosphatase wurde auf den Papierkreisen unter Verwendung der chromogenen Substrate, die in dem Protoblot-Kit zur Verfügung gestellt werden, gemäß den Instruktionen des Herstellers nachgewiesen.
c) Westernblot-Assay
Für Westernblot-Assays wurden ungefähr 10 μg huTF, das wie in Beispiel 4 beschrieben isoliert wurde, in Probenpuffer aufgelöst (2% SDS, 50 mM Dithiothreitol, 10% Glyzerin, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8) aufgelöst und für 5 Minuten gekocht. Es wurde dann einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem präparativen Gel wie dem durch Laemmli, Nature, 226:680 (1970), beschrieben, dessen Verfahren hier durch Referenzieren aufgenommen wird, in einer breiten Bahn, die auf jeder Seite durch kleinere Bahnen flankiert ist, die vorgefärbte Molekulargewichtsstandards enthalten (Diversified Biotech, Newton Centre, MA), ausgesetzt. Nach Elektrophorese und Elektroblotten auf Nitrozellulose, wie beschrieben durch Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350 (1979), deren Verfahren hiermit durch Referenzieren aufgenommen werden, wurde der Blot mit einer Lösung von 5% gepulverter, nicht fetter Milch in TBS blockiert und in einen Mehrfachhalter geklemmt (Miniblotter; Immunetics, Cambridge, MA). Sammelproben von 8 Hybridomzellkulturüberständen wurden in jeden der Steckplätze geladen und für eine Stunden beim 37°C inkubiert, wonach der Blot entfernt und mit TBA gespült wurde (TBS enthaltend 0,02% Natriumazid). Bahnen, die Antikörper gebunden hatten, wurden unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten zweiten Antikörpers mit einem chromogenen Substrat gemäß dem vom Hersteller vorgeschlagenen Verfahren (Protoblot; Promega Biotech, Madison, WI) entwickelt und sichtbar gemacht. Die Kulturüberstände aus positiven Sammelproben wurden einzeln bei einer ¹/₈ Verdünnung in 5% TBA mit gepulverter nicht fetter Milch nachuntersucht, um einzelne Hybridomzellklone zu identifizieren, die Anti-TF Antikörper herstellen.
Hybridomazellen, von denen festgestellt wurde, das sie positiv für die Produktion von Anti-huTF Antikörpern sind, wurden zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zum Beispiel wurden aus der oben genannten TF8-Fusion abgeleitete Hybridomzellen als Anti-huTF Antikörper produzierende Hybridomzellkulturen charakterisiert, wenn die Hybridomzellkulturüberstände eine Immunreaktion mit huTF in dem in Beispiel 6b beschriebenen Dot-Blot-Assay und dem in Beispiel 6a beschriebenen Festphasen RIA zeigten. Diese Charakterisierung ergab 4 TF8 Hybridomzelllinien, wie in Tabelle 5 in Beispiel 13 gezeigt wird.
Aus der TF9-Fusion abgeleitete Hybridomzellen wurden als Anti-huTF-Antikörper produzierende Hybridomzellkulturen charakterisiert, wenn die Hybridomzellkulturüberstände eine Immunreaktion mit huTF in dem in Beispiel 6a beschriebenen Festphasen RIA und in dem in Beispiel 6c beschriebenen Western-Blot-Assay aufzeigten. Diese Charakterisierungen ergaben 24 TF9 Hybridomzelllinien, von denen die meisten in Tabelle 5 in Beispiel 13 gezeigt werden.
Antikörpermoleküle, die von einer bestimmten Hybridomzelle hergestellt werden, die durch die vorgenannten Screening-Verfahren ausgewählt wurde, werden hierin durch Buchstaben und Zahlen bezeichnet, die 1) die immunisierte Maus anzeigen, (d. h. TF8 oder TF9), die die Milzzellen für eine bestimmte Fusion gespendet haben, und 2) die Kulturplatte mit 96 Vertiefungen, Reihe und Nummer der Vertiefung, aus der die einzelne HAT-Mediumresistente Hybridomzelle isoliert wurde (d. h. 5B7, 11D12, etc.). Die spezifischen bezeichnenden Buchstaben und Zahlen können hierin als ein Wort oder als durch einen Strich verbundene Worte oder als zwei Worte aufgelistet sein. Zum Beispiel bezeichnen die folgenden Buchstaben und Zahlen die drei gleichen monoklonalen Antikörpermoleküle: TF8- 5G9, TF8-5G9 und TF8-5G9.
7. Isolierung von Immunglobulin IgG
Immunglobulin IgG wurde aus Ascitesflüssigkeit einer Maus, die die Hybridomzelllinie TF8-5G9 (ATCC Nr. HB9382) enthält, unter Verwendung eines Biorad Laboratories MAPS II Systems gemäß den Instruktionen des Herstellers isoliert. Die Proteinkonzentration des isolierten IgG wurde unter Verwendung des BCA Protein Assay Reagens (Pierce Chemical Co.) gemäß den Vorgaben des Herstellers bestimmt.
B. Herstellung eines Anti-huTF enthaltenden festen Trägers zur Immunaffinitätsisolierung von huTF
Anti-huTF Antikörper wurden zur Kopplung an eine feste Agarosematrix durch Dialysieren von 10 mg MAPS isoliertem TF8-5G9 monoklonalen Antikörper, hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben, gegen 500 ml eines Dialysepuffers, enthaltend 0,1 M MES, pH 6,5 für 16 Stunden bei 4°C mit mindestens einem Wechsel des Dialysepuffers aktiviert. Die aktivierten TF8-5G9 Antikörper wurden dann mit 2 ml AffiGel-10 Agarosebeads (Biorad) vermischt und die resultierende Kopplungsreaktionsmischung wurde weiter gemäß den Instruktionen des Herstellers verarbeitet, um einen festen TF8-5G9/Agaroseträger auszubilden.
Überschüssige Proteinbindungsstellen auf festen Träger wurden dann blockiert, gewaschen und vakuumfiltriert, wie im Beispiel 3 beschrieben, um einen TF8-5G9/Agarosekuchen auszubilden.
9. Immunaffinitätsisolierung von huTF
Eine Gehirnextraktlösung, die ungefähr einer Hälfte eines menschlichen Gehirns entspricht, d. h. ungefähr 100 ml, und die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde über 3 Tage mit zwei Wechseln gegen eine Gesamtheit von 6 Litern von Puffer A bei 4°C dialysiert. Der dialysierte Gehirnextrakt wurde dann bei 10.000 × g für 1,5 Stunden zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde mit dem in Beispiel 4 hergestellten Glycinethylester-Agarosekuchen vermischt, um eine Fest-Flüssigphasen-Reaktionsmischung auszubilden.
Nachdem diese für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rotieren aufbewahrt wurde, wurden die festen und flüssigen Phasen durch Filtration unter Verwendung eines Glasfrittenfilters abgetrennt. Die huTF enthaltende flüssige Phase wurde zurück gewonnen und mit dem in Beispiel 8 hergestellten TF8-5G9/Agarosekuchen vermischt, um eine Fest-Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung auszubilden.
Die Immunreaktionsmischung wurde über Nacht bei 4°C unter Rotieren aufbewahrt, um die Ausbildung eines Gewebefaktor-enthaltenden Festphasen-Immunreaktionsprodukts zu ermöglichen. Die festen und flüssigen Phasen wurden dann durch Filtration wie zuvor beschrieben abgetrennt. Die feste Phase wurde zurückbehalten und dann mit 10 Volumen Puffer A gewaschen. Die feste Phase wurde dann auf eine Glaschromatographiesäule transferiert und nacheinander mit (1) 2 Volumen 1 M NaCl, enthaltend 1% Triton X-100, und (2) 2 Volumen 0,1 M Glycin, pH 4,0, enthaltend 1% Triton X-100 gewaschen.
Jegliches huTF, das immunologisch an den festen Träger nach den oben genannten Waschungen gebunden war, wurde dann durch das Waschen des festen Trägers, während er auf einer Filterfritte gehalten wurde, mit 20 ml 0,1 M Glycin, pH 2,5 und 1% Triton X-100 freigesetzt (eluiert). Eluiertes Material wurde dann jeweils wie in Beispiel 4 beschrieben gesammelt, auf huTF untersucht, zusammengeführt und dialysiert.
Das Dialysat wurde anschließend mit 4 Volumen kaltem Aceton vermischt, um das huTF-Protein zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde dann durch Zentrifugation bei 5.000 g für 30 Minuten bei ungefähr –10°C gesammelt. Das resultierende Pellet wurde unter Stickstoff getrocknet und 1 Teil des Pellets wurde durch SDS-Polyacrylamidgeleelektrophorese (SDS-PAGE) unter denaturierenden Bedingungen analysiert.
Die Ergebnisse dieser Analyse, die in 8 gezeigt werden, zeigen, dass huTF mit einer Ausbeute von 33 mg huTF pro Gramm entfettetes Gehirnpulver immunaffinitätsisoliert werden kann.
10. Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTF Antikörper
Zehn Mikroliter eines Hybridomkulturüberstandes wurden mit 90 μl HBS/BSA, enthaltend 2 ng des in Beispiel 4 hergestellten wieder mit Lipiden versetzten huTFs vermischt. Die Immunreaktionsmischungen, die so ausgebildet wurden, wurden bei 37°C für 30 Minuten aufbewahrt, um es den Anti-huTF Antikörpermolekülen zur ermöglichen, immunologisch an huTF zu binden und ein Immunreaktionsprodukt auszubilden. Die Immunreaktionsmischungen wurden anschließend auf eine huTF-prokoagulatorische Aktivität wie in Beispiel 2 beschrieben untersucht. Eine irrelevante IgG-Zubereitung wurde anstelle des Anti-huTF Antikörpers als negative Kontrolle verwendet.
Eine wirksame huTF-Konzentration wurde aus der Standardkurve extrapoliert, die wie in Beispiel 2 hergestellt wurde, unter Verwendung der in der Gegenwart des Inhibitors gemessenen Gerinnungszeit. Die Inhibierung wurde als ein Prozentverhältnis der wirksamen huTF-Konzentration über der verwendeten tatsächlichen huTF-Konzentration ausgedrückt. Es wurden monoklonale Antikörpermolekülzubereitungen, die mindestens 50% Inhibierung aufzeigen, als neutralisierende Antikörpermolekülzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
Es wurden eine Reihe von Kulturüberständen aus Hybridomzellen, die gegen isoliertes huTF gezüchtet wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben durch das oben genannte Verfahren auf deren Fähigkeit, eine Koagulation zu inhibieren, gemessen. Solche Hybridomzellen, für die herausgefunden wurde, dass sie die Initiation der Koagulation wesentlich inhibieren, werden in Tabelle 5 identifiziert.
Die Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper wurde auch unter Verwendung vorgefertigter huTF- Faktor VII -Komplexe erzielt. 10 μl, enthaltend ungefähr 1 ng wieder lipidversetztes huTF, hergestellt wie in Beispiel 4, wurde mit 70 μl HBS/BSA, 10 μl 20 mM Calciumchlorid und, wo angezeigt, mit 10 μl, enthaltend ungefähr 25 ng des, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellten Faktors VII vermischt. Diese Mischung wurde bei 37°C für 15 Minuten aufbewahrt, um es dem huTF zu ermöglichen, einen Komplex mit jeglichem in der Mischung verfügbaren Faktor VII auszubilden. Danach wurden 10 Mikroliter der Lösung weiter mit ungefähr 10 ng MAPS- isoliertem monoklonalen Antikörper, hergestellt wie in Beispiel 7, vermischt und diese zweite Mischung wurde bei 37 °C für 30 Minuten aufbewahrt. Die Inhibierung der Koagulation wurde dann in der resultierenden Mischung durch das erste Hinzufügen von 100 μl 20 mM Calciumchlorid, gefolgt durch 100 μl von entweder menschlichem Zitrat-versetzten Plasma oder Faktor VII erschöpftem Plasma, hergestellt wie in Beispiel 12, gemessen und die Gerinnungszeit in Sekunden beobachtet. Die Prozentinhibierung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben ausgedrückt und die Ergebnisse dieser Inhibierungen mit vorgefertigten huTF-Faktor VII-Komplexen wird in Tabelle 6a gezeigt. Tabelle 6 Inhibierung der huTF-Faktor VII – initiierten Koagulation durch Anti-huTF Antikörper 1. Koagulation mit Zitrat-versetztem menschlichen Plasma
II. Koagulation mit an Faktor VII verarmten menschlichem Plasma
Zusätzliche Studien zur Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper wurden unter Bedingungen durchgeführt, die die Inhibierung vor und nach der Assoziierung von TF mit dem Faktor VII/VIIa, um einen TF:Faktor VII/VIIa-Komplex auszubilden, vergleichen.
In diesen Studien wurde die Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper unter Verwendung vorgefertigter TF:VII/VIIa-Komplexe im wesentlichen wie oben in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, außer dass die verwendeten 10 μl monoklonale Antikörper enthaltende Lösung ein Hybridomzellkulturüberstand anstatt einer MAPS isolierten monoklonale Antikörper enthaltenden Lösung war. Im Vergleich dazu wurde die Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTF Antikörper durch das Ausbilden von Immunkomplexen zwischen diesen Antikörpern und wieder Lipidversetztem huTF, bevor diese mit Zitratbehandeltem Plasma, das Faktor VII/VIIa enthält, wie oben in Beispiel 10 beschrieben, vermischt wurden, untersucht.
Obwohl all die derzeit beschriebenen Antikörper in diesem vergleichenden Inhibierungsassay untersucht wurden, wurden nur solche als signifikant angenommen, die eine mehr als ungefähr 60%ige Inhibierung der Fähigkeit aufzeigten, die Koagulation, die durch einen huTF:VII/VIIa-Komplex eingeleitet wird, zu inhibieren. Diese MoAbs sind TF9-1B8, TF9-5B7, TF8-5C4, TF8-11D12 und TF8-212.
11. Polypeptidsynthese
Die Polypeptide, die mit den verschiedenen huTF-Regionen, die hierin verwendet werden, korrespondieren, wurden chemisch auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptid-Synthetisiergerät unter Verwendung des symmetrischen Anhydridverfahrens von Hagenmaier et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 353:1973 (1983) chemisch synthetisiert. Zusätzlich zu den in den Tabellen 1 und 2 synthetisierten Polypeptiden wurden auch die in Tabelle 3 unten aufgelisteten Peptide synthetisiert und umfassen Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die zur Herstellung von Anti-Polypeptidantikörpern nützlich sind, die in der Lage sind, mit huTF zu reagieren. Tabelle 3 Antigene Polypeptide

p121-155 H-TKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTL-OH

p204-226 H-DSPVECMGQEKGEFREIFYIIGA-OH

p225-244 H-GAWFWIILVIILAISLHK-OH

p245-263 H-CRKAGVGQSWKENSPLNVS-OH
12. Inhibierung der Koagulation durch Polypeptide
Die Fähigkeit der Polypeptide der vorliegenden Erfindung, eine huTF eingeleitete Koagulation zu inhibieren, wurde durch zuerst Inkubieren der Polypeptide in der Gegenwart von Faktor VII/VIIa und Kalziumionen und dann das Hinzufügen dieser Mischung zu Faktor VII/VIIa defizitärem Plasma und die Beurteilung der Gerinnungzeiten untersucht.
Menschlicher Faktor VII/VIIa wurde wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert. 10 Mikroliter einer Lösung von 200 ng dieses isolierten Faktor VII/VIIa pro ml HBS/BSA wurden zu einer Lösung, umfassend 100 μl HBS, 20 μl 25 mM CaCl₂ und 100 μl TBS/Triton, das das synthetische Polypeptid enthält, hinzugefügt. Verschiedene Mischungen wurden so hergestellt, die verschiedene Konzentrationen des Polypeptids enthalten und wurden dann für 15 Minuten bei 37°C aufbewahrt. Der wie in Beispiel 4 beschreiben hergestellte mit Lipid wieder versetzte Gewebefaktor wurde in HBS/BSA derart verdünnt, dass 10 μl eine Koagulationszeit von ungefähr 45 Sekunden ergeben, wenn in einem in Beispiel 2 beschriebenen Koagulationsassay getestet. Die oben aufbewahrte Mischung wurde weiter mit dieser 10 μl Verdünnung des wieder Lipid-versetzten huTF, mit 100 μl 25 mM CaCl₂ und mit 100 μl Faktor VII/VIIa- defizitärem Plasma vermischt (George King Bio-Medical, Inc., Overland Park, KA), das ein Teil Plasma zu 1,5 Teilen HBS verdünnt worden war. Die Gerinnungszeit wurde dann bestimmt und wie in Beispiel 2 beschrieben grafisch aufgetragen. Eine Verlängerung der Gerinnungszeit wurde dahingehend interpretiert, eine Inhibierung der Koagulation durch das synthetische Polypeptid anzuzeigen. Die Prozentinhibierung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben berechnet. Polypeptide, die mindestens 30% Inhibierung der Koagulation aufzeigen, wurden als Polypeptidanaloga der huTFh Bindungstelle betrachtet, d. h. Polypeptide p26-49, p146-167 und p161-189, wie in Abschnitt 1 der Tabelle 4 gezeigt.
Alternativ dazu wurde Faktor VII/VIIa- defizitäres Plasma in dem oben gezeigten Inhibierungsassay verwendet, das aus Plasma hergestellt wurde, das an Faktor VII/VIIa durch Immunaffinitätsabsorption mit monoklonalen Antikörpern verarmt war. Ein monoklonaler Antikörper gegen den menschlichen Faktor VII/VIIa wurde im wesentlichen wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt, außer dass der Faktor VII/VIIa, wie er in Beispiel 3 beschrieben isoliert wurde, als Immunogen anstatt huTFh verwendet wurde. Die resultierenden Hybridomzellen wurden durch ELISA untersucht, um eine Hybridomzelle zu identifizieren, die nicht mit den menschlichen Blutproteinen Protein S, Faktor IX, Faktor X und Faktor II reagieren, die von Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN verfügbar sind. Solch eine Hybridomzelle, FV11.F1.2H3-3.2, ist von Dr. T. S. Edgington (Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA) verfügbar. Immunglobulin IgG wurde aus Aszites einer Maus, enthaltend die Hybridomzelle FV11 F1.2H3-3.2, isoliert und das isolierte IgG wurde an einen festen Träger wie in Beispiel 8 beschrieben konjugiert. Der resultierende Anti-Faktor VII/VIIa monoklonale Antikörper – enthaltende feste Träger wurde verwendet, um Faktor VII/VIIa aus gesammeltem normalen Zitrat-versetzten Plasma unter Verwendung der in Beispiel 9 beschriebenen Immunaffinitätsprozedur zu entfernen, außer dass das die Flüssigphase enthaltende Plasma gesammelt und zurückbehalten wurde.
Die Fähigkeit einiger der Polypeptide, wenn in lipidversetzter Form verwendet, kompetitiv die Koagulation zu inhibieren, wurde in dem oben genannten Assay durch das Ersetzen der 100 μl des Lipid-versetzten synthetischen Polypeptids anstelle der 100 μl Lösung des synthetischen Polypeptids untersucht.
Lipid-versetzte synthetische Peptide wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 für das wieder Lipid-versetzen von isoliertem huTF hergestellt, außer das synthetisches Polypeptid für isoliertes huTF substituiert wurde. Es wurde das Verhältnis 52 : 1 von Lipid zu Polypeptid (Gew.-/Gew.) routinemäßig verwendet. Lipidversetzte Polypeptide, die mindestens 30 % Inhibitierung der Koagulation zur Verfügung stellten, wurden als Polypeptidanaloga der huTFh-Bindungsstelle bezeichnet, wenn sie in der lipidversetzten Form vorliegen, d. h. solche Polypeptide, die in Abschnitt II der Tabelle 4 gezeigt werden.
Tabelle 4 Inhibierung der huTF eingeleiteten Koagulation durch Polypeptidanaloga von huTFh
Es werden beispielhafte Dosis-Reaktionskurven, die erhalten wurden, während die oben genannten Polypeptidinhibitionsstudien durchgeführt wurden, in den 9 und 10 gezeigt.
13. Inhibierung einer Antikörper-huTF Immunreaktion durch Polypeptide
Die Vertiefungen einer Immulon U-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen, die aus flexiblem Vinyl hergestellt sind (Dynatech), wurden mit Ziege-Anti-Maus IgG (Boehringer-Mannheim) wie in Beispiel 6 beschrieben beschichtet, außer dass das Blockieren der überschüssigen Proteinbindungsstellen für 20 Minuten bei 37°C durchgeführt wurde.
50 μl eines Hybridomzellkulturüberstandes wurden in jede Vertiefung platziert und für eine Stunde bei 37°C aufbewahrt. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit TBS gespült und überflüssige Flüssigkeit wurde durch Absaugen entfernt.
Isoliertes huTF wurde auf Immunaffinitätssäulen wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellt. Die resultierenden Acetonpräzipitate, die isoliertes huTF enthalten, wurden in TBS/Triton aufgelöst und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Proteinassayreagenz (Pierce) gemäß den Ausführungen des Herstellers bestimmt. Kohlenhydratseitenketten auf huTF wurden unter Verwendung von Biotin-Hydrazid (ICN Biomedicals Inc., Plainview, NY) gemäß dem durch O'Shannessy et al., Immunol. Letters, 8:273 – 277 (1984) beschriebenen Verfahren unter Ausbildung einer biotinylierten huTF-Lösung biotinyliert.
50 μl einer biotinylierten huTF-Lösung, die auf 60 ng/ml TBS/Triton hergestellt wurde, wurde dann in jede Vertiefung mit 5 μM synthetischem Polypeptid platziert und für eine Stunde bei 37°C aufbewahrt. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit TBS/Triton gespült.
100 μl Streptavidin- konjugierte alkalische Phosphatase (Detek I-alk, Enzo Biochem Inc., New York, NY), 1/100 in TBS verdünnt, enthaltend 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 und 1 % BSA, wurden in jede Vertiefung platziert und für 30 Minuten bei 37°C aufbewahrt. Die Vertiefungen wurden dann vier Mal mit einer Lösung, enthaltend 10 mM Kaliumphosphat (pH 6,5), 2% BSA, 0,5% Triton X-100, 0,5 M Natriumchlorid und 1 mM EDTA, gespült, gefolgt durch eine Einzelspülung mit Nachweispuffer [0,1 M Tris HCl (pH 8,8), 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl₂].
100 μl einer Lösung, enthaltend 2 mM p-Nitrophenylphosphat in Nachweispuffer, wurden dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt und für eine Stunde bei 37 °C aufbewahrt. Die optische Absorbtion bei 405 Nanometern (nm) wurde dann für jede Vertiefung unter Verwendung eines Bio-Tek Microplate Readers (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gemessen.
Die Ergebnisse der kompetitiven Inhibierungsstudie werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5 Tabelle der Peptidwechselwirkungen mit monoclonalen Antikörpern

^a Jeder monoklonale Antikörper (Mab) wurde durch eine Hybridomzelle mit der gleichen Bezeichnung hergestellt. Alle monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung von Hybridomzellkulturüberständen wie in Beispiel 13 beschrieben untersucht.
^b Diese Antikörper wurden als nicht neutralisierende gemäß den Ergebnissen aus Beispiel 10 angesehen; alle anderen Antikörper wurden als neutralisierend gemäß diesen gleichen Ergebnissen angesehen.

Die Inhibierung wurde als signifikant angesehen, wenn der gemessene Absorbtionswert, der in der Gegenwart des Polypeptids erhalten wurde, mehr als eine Standardabweichung vom Durchschnittswert betrug, der für einen gegebenen Antikörper in der Abwesenheit des Polypeptids erhalten wurde.
14. Nachweis von huTF in einer Körperprobe durch Doppel-Positions-ELISA
huTF kann in einer Körperprobe wie Blut, Plasma, Speichel, Urin etc. durch Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern, die gleichzeitig an das gleiche huTF Molekül binden, nachgewiesen werden.
Immulonpolystyrolplatten mit U-Boden und 96 Vertiefungen (Dynatech) werden mit Ziege-Anti-Maus IgG (Boehringer-Mannheim) zuerst durch das Hinzufügen von 100 μl des IgG, das auf 10 μg/ml in TBS verdünnt ist, in jeder Vertiefung beschichtet und dann wird die IgG-Lösung in Kontakt mit der Vertiefung über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Die Vertiefungen werden dreimal mit TBS gespült und 100 μl TBS/Triton, enthaltend 3% BSA, werden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Vertiefungen werden dann für eine Stunde bei 37°C aufbewahrt, dreimal mit TBS gespült und überschüssige Flüssigkeit durch Absaugen entfernt.
100 μl eines Anti-huTF Antikörpermolekül-enthaltenden Kulturüberstandes aus einer ersten Hybridomzelle, TF9-6B4, wird zu jeder Vertiefung hinzugefügt und für eine Stunde bei 37°C aufbewahrt. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit TBS gespült und überschüssige Flüssigkeit wird durch Absaugen entfernt.
Immunaffinitätsisoliertes und Aceton-präzipitiertes huTF, das wie in Beispiel 9 hergestellt wurde, wird in TBS/Triton aufgelöst. Verdünnungen der huTF-Lösung werden im Bereich von 0,5 μg/ml bis 0,5 ng/ml in TBS/Triton hergestellt und 100 μl einer Verdünnung werden jeweils in eine Vertiefung der Immunlonplatte platziert. Die Verdünnungen von huTF werden in Kontakt mit dem ersten Antikörper für eine Stunde bei 37°C aufbewahrt. Die Verdünnungen werden dann entfernt und die Vertiefungen dreimal mit TBS/Triton gespült. Überschüssige Flüssigkeit wird durch Absaugen entfernt.
Anti-huTF Antikörper werden aus Ascites einer zweiten Hybridomzelle, TF9-10H10, durch in Beispiel 7 beschriebene Verfahren MAPS-isoliert. Die resultierende Antikörperlösung wird auf Protein untersucht und anschließend durch Biotinylierung wie in Beispiel 13 beschrieben markiert.
Der biotinylierte Anti-huTF Antikörper wird auf 60 ng/ml TBS/Triton verdünnt und 100 μl dieser Lösung werden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Vertiefungen werden bei 37°C für eine Stunde aufbewahrt, dann dreimal in TBS/Triton gespült.
Der gebundene biotinylierte Anti-huTF Antikörper wird dann unter Verwendung des Detek I-alk-Systems, das in Beispiel 13 beschrieben wird, nachgewiesen. Die als erster und zweiter Antikörper in diesem Assay verwendeten monoklonalen Antikörper können variiert werden, solange die beiden die Fähigkeit haben, gleichzeitig an huTF zu binden. Zum Beispiel, wenn TF9-6B4 als erster Antikörper verwendet wurde, kann TF9-11 D12 als zweiter Antikörper anstelle von TF9-10H10 verwendet werden. Somit beschreibt diese Erfindung jegliche Kombination von Antikörpern, die gleichzeitig in diesem Assay binden können.
15. Herstellung eines DNA-Segments, das die gesamte pre-huTFh kodierende Sequenz enthält
Es kann ein DNA-Segment, das die gesamte pre-huTFh kodierende Sequenz enthält, in der folgenden Weise unter Verwendung der rekombinanten Plasmide pCTF64, pCTF403 und pCTF314 hergestellt werden, deren Restriktionskarten in 11 gezeigt werden und unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Siehe, z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1983).
Die in 11 gezeigten Insertsegmente, die in den rekombinanten DNA-Plasmiden enthalten sind, haben den EcoRI-Linker 5'-GGAATTCC-3' (Collaborative Research, Lexington, MA) an jedem Terminus, um das Klonierungsverfahren zu erleichtern. Diese Linkersequenzen sind nicht in der Nukleoditsequenz vorhanden, die in 2 gezeigt wird, da sie nicht Teil der natürlich vorkommenden huTF DNA kodierenden Sequenz sind. Damit die folgenden Beschreibungen der Herstellung von rekombinanten DNA-Molekülen klar in Bezug auf die involvierten huTFh DNA-Sequenzen sind, werden Segmente, die durch Verdauungen generiert werden, die EcoRI-Termini enthalten und somit diese zusätzlichen Linker enthalten können, durch die Nukleotidbasennummern, die in 2 gezeigt werden, bezeichnet werden. Es ist zu verstehen, dass die Segmente dieser zusätzlichen Sequenzen an ihren Termini enthalten können.
Plasmid pCTF 64 wird mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Dralll verdaut, um ein DNA-Segment herzustellen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der in 2 von Base 1 bis Rest 296 gezeigten Sequenz korrespondiert. Das 302 Nukleotidbasenpaar (bp) Segment, das so hergestellt wird, wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert und dann durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoriliert.
Plasmid pCTF403 wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut, um ein DNA-Segment herzustellen, das eine Nukleotidsequenz, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 776 bis 1125 korrespondiert, einschließt. Das resultierende 352 bp Segment wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert.
Plasmid pCTF314 wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und das resultierende 647 bp Segment wird durch Größenfraktionierung isoliert. Dieses Segment umfasst ein Nukleotidsequenz, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 135 bis Rest 775 korrespondiert. Das 647 bp Segment wird durch Größenfraktionierung isoliert und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Das 352 bp Segment und das dephosphorylierte 647 bp Segment werden dann operativ durch Reaktion mit T4 DNA-Ligase verbunden (ligiert), wodurch ein 999 bp Segment mit einer Nukleotidsequenz ausgebildet wird, das mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 135 bis 1125 korrespondiert. Das 999 bp Segment wird dann mit der Restriktionsendonuklease Dralll verdaut, die das 999 bp Segment an einer Position zwischen den Basen 296 und 297 wie sie in 2 gezeigt werden, spaltet, wodurch ein 168 bp Segment und ein 831 bp Segment generiert wird. Das dephosphorylierte 302 bp Segment und das 831 bp Segment werden dann operativ unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase verbunden, um ein 1125 bp Segment einschließlich einer Nukleotidsequenz auszubilden, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 1 bis Rest 1125 korrespondiert.
Der Klonierungsplasmidvektor pUC8 wird durch Verdauung mit EcoRI linearisiert. Das oben hergestellte 1133 bp Segment und der EcoRI verdaute Vektor werden operativ unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase verbunden, um ein zirkuläres rekombinantes DNA-Molekül pUC-pre-huTFh auszubilden.
Der E. coli-Stamm RRI (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) wird mit pUC-pre-huTFh transformiert und erfolgreiche Transformanten werden auf der Basis von Ampizilinresistenz ausgewählt. Die ausgewählten Transformanten werden dann kloniert und auf das Vorhandensein eines rekombinanten DNA-Moleküls untersucht, das das pre-huTFh strukturelle Gen aufweist.
Die Untersuchung auf das Vorhandensein rekombinanter DNA-Moleküle mit dem pre-huTF strukturellen Gen wird durch Verdauen der rDNA aus jedem ausgewählten Transformanten mit EcoRI erreicht. Die resultierenden EcoRI-Fragmente werden in ein Muster gemäß ihrer Größe auf einem Agarosegel aufgelöst. Rekombinante DNA-Moleküle, die ein Dreibandenmuster produzieren, das mit den DNA-Segmenten 352 bp, 781 bp und 2682 bp korrespondiert, enthalten das pre-huTF strukturelle Gen. E. coli RR1 Transformanten mit rDNA, die das oben beschriebene EcoRI Verdauungsmuster herstellen, enthalten ein rekombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung und werden ausgewählt (zurückgewonnen).
Ein DNA-Segment, das einen wesentlichen Teil der pre-huTFh kodierenden Sequenz enthält, einschließlich der extrazellulären Ankerregion, aber nicht die Transmembranankerregion an dem Carboxyterminus und daher für ein lösliches huTFh-Protein kodiert, wird in der folgenden Weise hergestellt.
Plasmid pCTF64 wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut, um ein DNA-Segment herzustellen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 1 bis Rest 486 korrespondiert. Das 486 Nukleotidbasenpaar (bp) Segment, das so hergestellt wurde, wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert und dann durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Das dephosphoyilierte 486 bp Segment wird dann mit der Restriktionendonuklease Dralll verdaut, die das 486 bp Segment bei einer Position zwischen dem Basenrest 296 und 297 wie in 2 gezeigt, spaltet, wodurch ein 296 bp Segment und ein 190 bp Segment generiert werden. Das 296 bp Segment wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert.
Plasmid pCTF314 wird mit der Restriktionsendunuklease EcoRI verdaut, um ein DNA-Segment herzustellen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die mitder in 2 gezeigten Sequenz von Rest 135 bis Rest 775 korrespondiert. Das resultierende 641 bp Segment wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert und dann durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Das dephosphorylierte 641 bp Segment wird dann mit Dralll verdaut, das das 641 bp Segment an einer Position zwischen dem Basenrest 296 und 297, wie in 2 gezeigt, spaltet, wodurch ein 162 bp Segment und ein 479 bp Segment generiert werden. Das 479 bp Segment wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert.
Die oben hergestellten Segmente von 296 bp und 479 bp werden dann operativ durch Reaktion mit T4 DNA-Ligase verbunden (ligiert), wodurch ein 775 bp Segment mit einer Nukleotidadaptersequenz ausgebildet wird, die mit der in 2 von Rest 1 bis Rest 775 gezeigten Sequenz korrespondiert.
Der Klonierungsplasmidvektor pUC18 wird durch Verdau mit EcoRI linearisiert. Das oben hergestellte 775 bp Segment und der EcoRI verdaute Vektor werden operativ unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase verbunden, um das zirkuläre rekombinante Molekül pUC-pre-huTFh-T herzustellen.
E. coli RR1 wird mit pUC-pre-huTFh-T transformiert und Ampizillin resistente Transformanten, d. h. Klone, die pUC-pre-huTFh-T enthalten, werden ausgewählt.
Das rekombinante DNA-Molekül pUC-pre-huTFh-T wird mit EcoRI verdaut und das resultierende 775 bp Segment wird durch Größenfraktionierung isoliert.
Synthetische Oligonukleotidadaptersegmente mit den Sequenzen:
werden gemäß den Verfahren von Caruthers et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981) und Gait et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47:393 (1983) hergestellt, außer dass die so hergestellten Oligonukleotide nicht mit Polynukleotidkinase phosphoryliert werden, um die operative Bindung (Ligierung) dieser Oligonukleotide zueinander zu verhindern. Die Oligonukleotide werden annealed, um ein doppelsträngiges DNA-Linkersegment auszubilden, dass einen kohäsiven EcoRI-Terminus enthält und einen stumpfen Terminus gemäß den Verfahren von Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). Dieses Linkersegment wird dann operativ an das 775 bp Segment gebunden, das aus pUC-pre-huTFh-T erhalten wird, um ein 817 bp Segment auszubilden, das ein annealtes Segment an jedem Ende des 775 bp Segments enthält. Das resultierende 817 bp Segment wird dann mit EcoRI verdaut, um beide Termini des 817 bp Segments von stumpf in EcoRI-kohäsive unter Ausbildung eines 805 bp Segments zu überführen. Das resultierende 805 bp Segment wird durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels isoliert.
Der Klonierungsplasmidvektor pUC18 wird durch Verdauung mit EcoRI linearisiert. Das oben hergestellt 805 bp Segment und der EcoRI verdaute Vektor werden operativ unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase verbunden, um ein zirkuläres rekombinantes DNA-Molekül pUC-pre-huTFh-TR auszubilden.
E. coli RR1 wird mit pUC-pre-huTFh-TR transformiert und Ampizillin- resistente Transformanten, d. h. Klone, die pUC-pre-huTFh-TR enthalten, werden ausgewählt.
16. Herstellung von huTFh durch Expression der rekombinanten huTFh- kodierenden Sequenzen
Die Expression von rekombinantem huTFh aus rekombinanten DNA-Molekülen kann in einer Reihe von Expressionsmedien erreicht werden, einschließlich prokaryontischer bakterieller Zellen, nicht Wirbeltier prokaryontischen Zellen und höheren (Wirbeltier) eukariontischen Zellen. Beispiele solch Expressionsmedien sind E. coli, S. cerevisiae und chinesische Hamsterovarzellen (CHO).
Expression von pre-huTFh in E. coli
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das in der Lage ist, dass pre-huTFH strukturelle Gen in E. coli – Zellen zu exprimieren, kann durch das Isolieren eines pre-huTFH-Gen-enthaltenden DNA-Segments aus dem in Beispiel 15 hergestellten pUC-pre-huTFH rekombinanten DNA-Molekül und durch das operative Verbinden dieses Segments an einem prokaryontischen Expressionsvektor hergestellt werden.
Das rekombinante DNA-Molekül pUC-pre-huTFH wird mit EcoRI unter solchen Bedingungen verdaut, dass einige, aber nicht alle der EcoRI-Stellen, die in dem Plasmid vorhanden sind, gespalten werden. Dieses teilweise Verdauverfahren wird in mehr Detail in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982), beschrieben. Ein 1133 bp-Segment, einschließlich einer Nukleotidsequenz, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 1 bis Rest 1125 korrespondiert, wird aus den EcoRI-Teilverdauprodukten durch Größenfraktionierung isoliert.
Der prokaryontische Expressionsvektor pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) wird durch Verdau mit EcoRI linearisiert. Der verdaute Vektor und das 1133 bp pre-huTFh Strukturgen enthaltende Segment wird operativ unter Verwendung einer T4-DNA Ligase verbunden, um das zirkuläre rekombinante DNA-Molekül pKK-pre-huTFh auszubilden.
E. coli RR1 wird mit pKK-pre-huTFh transformiert und Ampicillin-resistente Transformanten, d. h. Klone, die pKK-pre-huTFh enthalten, werden ausgewählt.
b. Expression von huTFh in E. coli
Es wird ein rekombinantes DNA-Molekül, dass in der Lage ist, dass huTFh-Gen in E. coli zu exprimieren, durch das Manipulieren des 1133 bp-Segments, dass in Beispiel 16a hergestellt wurde, hergestellt. Dieses Segment wird zuerst mit alkalischer Phosphatease dephosphoryliert und dann mit der Restriktionsendonuklease Bbvl verdaut. Das resultierende 964 bp-Segment umfasst eine Nukleotidsequenz, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 164 bis Rest 1125 korrespondiert und wird durch Größenfraktionierung isoliert.
Synthetische Oligonukleotidadaptersegmente haben die Sequenzen:
und werden wie zuvor beschrieben hergestellt und annealed, um ein doppelsträngiges DNA-Linkersegment auszubilden, das kohäsive EcoRI- und Bbvl-Enden gemäß den Verfahren von Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979), ausbildet. Der Linker wird zuerst operativ an das 964 bp-Segment gebunden, um ein 1008 bp-Segment auszubilden. Das 1008 bp-Segment wird dann operativ an den EcoRI-verdauten Vektor pKK223-3 unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase gebunden, um das zirkuläre rekombinante DNA-Molekül pKK-huTFh auszubilden.
Das rekombinante DNA-Molekül pKK-huTFh unterscheidet sich von pKK-pre-huTFh nur darin, dass (1) ein Segment von Rest 1 bis Rest 129 fehlt und (2) ein neues Methioninkodon operativ vor Rest 130 gebunden wird, so dass die Proteinexpression (Translation) an dem eingefügten Methioninkodon beginnt.
Die rekombinanten DNA-Moleküle pKK-pre-huTFh und pKK-huTFh werden in einem prokaryontisches Wirtsmedium eingeführt, dass mit der Expression von huTFh- oder pre-huTFh-Protein kompatibel ist, das durch das darin enthaltene strukturelle Gen kodiert wird. Beispiele von Wirtszellen, die solche Medien enthalten, sind der E. coli Stamm RR1. Der Wirt wird mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert, unter mit Zellwachstum und Expression der rekombinanten DNA-kompatiblen Bedingungen kultiviert und das exprimierte Protein wird durch wohlbekannte Techniken geerntet.
C. Expression von pre-huTFh in CHO-Zellen
Es wird ein rekombinantes DNA-Molekül, das in der Lage ist, das pre-huTFh-Gen in Wirbeltierzellen zu exprimieren, unter Verwendung des in Beispiel 16a hergestellten 1133 bp-Segments hergestellt.
Synthetische Oligonukleotidadaptersegmente haben die Sequenzen:
und werden unter Verwendung der Verfahren von Caruthers et al., supra und Gait et al., supra hergestellt. Die Oligonukleotidadaptersegmente werden dann an jeden Terminus des 1133 bp-Segments unter Verwendung der durch Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:96 (1979) beschriebenen Verfahren gebunden. Die EcoRI kohäsiven Enden, die ursprünglich an dem 1133 bp-Segment vorhanden waren, werden hierdurch in Bglll kohäsive Termini überführt.
Der auf dem SV40-Virus basierenden eukaryontische Expressionsvektor pKSV-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) wird durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease Bglll linearisiert. Das Bglll-adaptierte 1133 bp-Segment und der Bglll-verdaute Vektor werden operativ unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase verbunden, um das zirkuläre rekombinante DNA-Molekül pSV-pre-huTFh auszubilden.
E. coli RR1 wird mit pSV-pre-huTFh transformiert und erfolgreiche Transformanten werden auf der Basis von Ampizillinresistenz ausgewählt und kloniert. Die ausgewählten Transformanten werden dann kloniert und auf die Gegenwart von pSV-pre-huTFh durch das Untersuchen jedes Klons auf die Gegenwart des exprimierten pre-huTFh-Proteins unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers TF8-5G9 untersucht.
d. Expression von huTFh in CHO-Zellen
Rekombinante DNA-Moleküle, die in der Lage sind, dass huTFh-Gen in Säugetierzellen zu exprimieren, werden durch Verdau von pSV-pre-huTFh aus Beispiel 16c mit der Restriktionsendonuklease Bglll hergestellt. Das resultierende 1153 bp-Segment wird durch Größenfraktionierung isoliert und anschließend mit der Restriktionsendonuklease Bbvl verdaut. Das resultierende 974 bp-Segment umfasst eine Nukleotidadaptersequenz, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 164 bis Rest 1125 korrespondiert und wird durch Größenfraktionierung isoliert.
Synthetische Oligonukleotidadaptersegmente mit den Sequenzen:
und werden wie zuvor beschrieben hergestellt und annealed, um ein doppelsträngiges DNA Linkersegment auszubilden, das kohäsive Bglll und Bbvl kohäsive Termini hält. Der Linker wird dann operativ an das 974 bp-Segment unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase gebunden, um ein 1018 bp-Segment auszubilden, einschließlich einer Nukleotidsequenz, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 130 bis 1125 korrespondiert.
Der Plasmidexpressionsvektor pKSV-10 wird durch Verdauung mit Bglll linearisiert und dann operativ an das 1018 bp-Segment unter Verwendung von T4 DNA-Ligase gebunden, um das zirkuläre rekombinante DNA-Molekül pSV-huTFh auszubilden.
Die rekombinanten DNA-Moleküle pSV-pre-huTFh und pSV-huTFh werden in ein eukariontisches Wirtsmedium eingeführt, das mit der Expression des huTFh- oder des pre- huTFh Proteins kompatibel ist, das durch das Strukturgen, das darin enthalten ist, kodiert wird. Beispiele von Wirtszellen, die ein solches Medium enthalten, sind CHO-Zellen.
Der Wirt wird mit dem rekombinanten DNA-Molekül transfiziert und stabile Transformanten werden durch wohlbekannte Techniken ausgewählt. Siehe, zum Beispiel, Graham et al., Virol., 52:456 (1973) und Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982). Transformierte Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die mit dem Zellwachstum und der Expression der rekombinanten DNA kompatibel sind und das exprimierte Protein wird durch wohlbekannte Techniken geerntet.
e. Expression von pre-huTFh in Hefe
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das in der Lage ist, das pre-huTFh-Gen in S. Cerevisiae zu exprimieren, wird durch das Herstellen von Oligonukleotidadaptersegmenten mit der Sequenz:
und das Verbinden dieser an die Termini des 1133 bp-Segments von Beispiel 16a, das zuvor beschrieben wurde, hergestellt. Das so hergestellte angepasste Segment hat Clal kohäsive Termini.
Der Hefeexpressionsvektor, pTDT1 (American Type Tissue Collection #ATCC 31255) wird durch Verdau der Restriktionsendonuklease Clal linearisiert. Das oben beschriebene Clal-adaptierte 1133 bp-Segment und der Clal-verdaute Vektor werden operativ unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase verbunden, um das zirkuläre rekombinante DNA-Molekül pY-pre-huTFh auszubilden.
E. coli RR1 wird mit pre-huTFh transformiert und Transformanten, die das pre-huTFh Strukturgen exprimieren, werden identifiziert und wie in Beispiel 16c beschrieben ausgewählt.
f. Expression von huTFh in Hefe
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das in der Lage ist, das huTFh Strukturgen in S. Cerevisiae zu exprimieren, wird durch verdauen von pY-pre-huTFh mit Clal hergestellt, um ein 1151 bp-Segment herzustellen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der in 2 gezeigten Sequenz von Rest 1 bis Rest 1125 korrespondiert. Nach Isolierung durch Größenfraktionierung wird das 1151 bp-Segment mit Bbvl verdaut, um ein 978 bp-Segment zu ergeben, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der in 2 gezeigten Nukleotidsequenz von Rest 164 bis Rest 1125 korrespondiert. Das 978 bp-Segment wird dann durch Größenfraktionierung isoliert.
Synthetische Oligonukleotidadaptersegmente, die die folgenden Sequenzen:
haben werden hergestellt und wie zuvor beschrieben annealed, um DNA-Adaptersegmente auszubilden, die Clal- und Bbvl-kohäsive Termini aufweisen. Das Adaptersegment wird zuerst an das 978 bp-Segment operativ gebunden, um ein 1020 bp-Segment auszubilden. Das 1020 bp-Segment wird anschließend an den Clal-verdauten pTDT1-Vektor gebunden, der wie in Beispiel 16e beschrieben unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase hergestellt wurde, um das zirkuläre rekombinante DNA-Molekül pY-huTFh auszubilden.
Die rekombinanten DNA-Moleküle pY-pre-huTFh und pY-huTFh werden in ein Hefewirtsmedium eingeführt, das mit der Expression des huTFh- oder pre-huTFh Proteins kompatibel ist, das durch das strukturelle Gen kodiert werden, das darin enthalten ist. Beispiele von Wirtszellen, die ein solches Medium enthalten, sind S. Cerevisiae-Zellen.
Der Wirt wird mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert und in Selektionsmedium kultiviert, um erfolgreich transformierte Zellen durch wohlbekannte Techniken zu isolieren. Siehe, zum Beispiel, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978); und Miyajima et al., Mol. Cell. Biol., 4:407 (1984). Transformierte Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die mit Zellwachstum und der Expression der rekombinanten DNA kompatibel sind und das exprimierte Protein wird durch wohlbekannte Techniken geerntet.
g. Herstellung von löslichem huTFh durch Expression von rekombinanten huTFh kodierenden Sequenzen Die Expression von löslichem huTFh aus rekombinanten DNA-Molekülen kann in einer Reihe von Expressionsmedien in einer Weise, die der in Beispiel 16 beschriebenen ähnlich ist, für pre-huTFh und huTFh erreicht werden. In diesem Beispiel wird ein 1133 bp pre-huTFh Strukturgen-enthaltendes Segment mit EcoRI kohäsiven Enden in Beispiel 16a hergestellt und anschließend in den Beispielen 16b bis f manipuliert, was in Vektoren resultiert, die in der Lage sind, entweder pre-hutFh oder huTFh in drei beispielhaften Expressionsmedien, E. coli, S. Cerevisiae, und CHO-Zellen zu exprimieren. In ähnlicher Weise wird das 805 bp-Segment, das ein lösliches pre-huTFh Strukturgen mit EcoRI kohesiven Enden enthält und in Beispiel 16a hergestellt wird gemäß den Beispielen 16b-f manipuliert, um Expressionsvektoren herzustellen, die in der Lage sind, eine lösliche Form von entweder pre-huTFh oder huTFh (d.h. pre-huTFH-TR oder huTFh-TR) in den gleichen Expressionsmedien herzustellen.
17. Inhibierung der Koagulation durch die Polypeptide p24-35 und p159-169
Die Polypeptide p24-35 und p159-169, deren Aminosäuresequenzen in Tabelle 7 gezeigt werden, wurden wie in Beispiel 11 beschrieben synthetisiert. Tabelle 7

Bezeichnung Aminosäuresequenz

p24-35 H-EWEPKPVNQVYT-OH

p159-169 H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH
Die Polypeptide p24-35 und p159-169 wurden dann auf ihre Fähigkeit hin untersucht, kompetitiv die huTFh-inhitiierte Koagulation wie in Beispiel 12 beschrieben zu inhibieren. Die Ergebnisse dieser Studie werden in 12 gezeigt und zeigen, dass p25-35 und p159-169 in der Lage sind, jeweils 45% und 25% der huTFh-initiierten Koagulation zu inhibieren, wenn sie in 10 μM Konzentrationen verwendet werden. Es sollte festgestellt werden, dass in dieser Studie Hintergrundinhibierungen, wie für solche Peptide, die als geschlossene Kreise in 12 gezeigt werden, geringer waren als in der in Tabelle 4 gezeigte Studie. Als ein Ergebnis, wurden Polypeptide, die mindestens 20% Inhibierung der Koagulation bei einer Konzentration von 10 μM in dieser Studie aufzeigten, als Polypeptidanaloga der huTFh Bindungsstelle angesehen.
Somit sind die Polypeptide p24-35 und p159-169, huTFh Polypeptidbindungsstellenanaloga der vorliegenden Erfindung. Es ist auch festzustellen, dass die mit p24-35 erhaltenen Ergebnisse, wenn in Hinblick auf ähnliche Ergebnisse, die mit Polypeptid p25-49 erhalten wurden, betrachtet, zeigen, dass eine huTFh-Faktor VII/VIIa Bindungsstelle durch die Aminosäuresequenz ausgebildet werden kann, die den beiden Polypeptide gemeinsam ist, d. h., Reste 30 – 35, wie in 1 gezeigt (-VNQVYT-).
18. Kinetiken der Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper
Um die Zeit zu bestimmen, in welcher Anti-huTF-Antikörper in der Lage waren, eine huTF-initiierte Koagulation zu inhibieren, wurde der Zeitverlauf der Inhibierung unter Verwendung des in Beispiel 10 beschriebenen Inhibierungsassays gemessen.
Ungefähr 1 ng MAPS-isolierter TF8-5G9 monoklonale Antikörper, der wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurde, wurde in 100 μl HBS/BS mit ungefähr 1 ng wieder Lipidversetztem huTF, das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurde, vermischt. Die verschiedenen so gebildeten Mischungen wurden bei 37 °C für verschiedene Zeiten von ungefähr 1 bis ungefähr 60 Minuten aufbewahrt, um es dem Anti-huTF Antikörpermolekül zu ermöglichen, immunologisch an das huTF zu binden und ein Immunreaktionsprodukt auszubilden. Bei den in 13 spezifizierten Zeiten wurde jede Mischung anschließend auf huTF prokoagulatorische Aktivität wie in Beispiel 2 beschrieben untersucht und die Prozentinhibierung wurde dann wie in Beispiel 10 beschrieben ausgedrückt.
13 zeigt die Ergebnisse einer solchen kinetischen Messung, die zeigt, dass Inhibierungen der huTF-initiierten Koagulation von mehr als 65% in weniger als 10 Minuten bei der in diesem Assay verwendeten Konzentration des Antikörpers und des aufgereinigten huTF vorkommen. Es wird angenommen, dass schnellere und vollständigere Inhibierungen aus höheren Konzentrationen des Anti-huTF-Antikörpers resultieren würden.
19. Dosis-Reaktion auf die Inhibierung von huTF-initiierten Koagulation durch Anti-huTF-Antikörper
Die Fähigkeit der Anti-huTF-Antikörper der vorliegenden Erfindung, eine huTF-initiierte Koagulation über einen Bereich von Antikörperdosierungen zu inhibieren, wurde durch die in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren mit den folgenden Modifikationen untersucht. Ein ng wieder Lipidversetztes huTF, das in Beispiel 4 hergestellt wurde, wurde mit 0,1 ml HBS/BSA mit verschiedenen Mengen des TF8-5G9 monoklonalen Antikörpers, der wie in Beispiel 7 beschrieben isoliert worden war, vermischt. Die so hergestellten Mischungen wurden aufbewahrt, um Immunreaktionsprodukte auszubilden und wurden anschließend auf huTF prokoagulatorische Aktivität wie in Beispiel 10 beschrieben untersucht.
Ergebnisse eines solchen Dosis-Reaktionsassays werden in 14 gezeigt und zeigen, dass Inhibierungen halbmaximal bei ungefähr 1 bis 5 ng Anti-huTF pro ml für die Konzentration des in dieser Studie verwendeten huTFs ist.
Eine ähnliche Dosis-Reaktion wurde unter Verwendung lysierter menschlicher Zellen als Quelle des huTFs durchgeführt.
Die menschliche Fibroblastenzelllinie GM1381 (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) wurde in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco Laboratories, Grand Island, NY), supplementiert mit 2 mM Glutamin, 5% fetalen Kälberserum und Antibiotika, bei 37°C und unter 7% (v/v) Kohlendioxid in der Luft kultiviert. Die GM1381-Zellen wurden wachsen gelassen und geerntet und ein Pellet von 30 × 10⁶ Zellen wurde durch Zentrifugation hergestellt und bei minus 70 °C eingefroren. Dieses gefrorene Pellet wurde schnell durch die Zugabe von 9 ml 15 mN Beta-oktylglucopyranosid (Sigma) in HN- Puffer (25 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0) aufgetaut und bei 37 °C für 10 Minuten aufbewahrt, um die Zellen zu lysieren, wonach 18 ml HN hinzugefügt wurden, um Zelllysat auszubilden.
Der wie in Beispiel 7 beschrieben isolierte monoklonale Antikörper TF8-5G9 wurde mit 0,01 % BSA (Sigma, RIA-Qualität) auf verschiedene Dosierungen verdünnt, die in 15 aufgeführt sind. 25 μl von jeder Antikörperverdünnung wurden mit 225 μl des oben hergestellten Zelllysats vermischt und bei 37°C für 60 Minuten aufbewahrt, um es dem Antikörper zu erlauben, mit jeglichem huTF, das in dem Zelllysat vorhanden ist, zu immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt auszubilden. Danach wurden 50 μl einer 25 mM CaCl₂-Lösung mit 50 μl der Lösung, die das Immunreaktionsprodukt enthält, vermischt, gefolgt durch 50 μl von Zitrat-versetztem menschlichen Plasma, um die Koagulation zu initiieren. Die so hergestellten Mischungen wurden bei 37°C aufbewahrt und die Zeit zwischen der Zugabe des Plasmas und der Ausbildung eines Gerinnsels wurde gemessen. Die wirksame huTF-Konzentration und Prozentinhibierung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben berechnet.
Ergebnisse aus einem Dosis-Reaktions-Inhibierungsassay unter Verwendung von menschliche GM1381 Zelllysaten als Quelle von huTF werden in 15 gezeigt. Diese Ergebnisse deuten an, dass TF8-5G9 Anti-huTF Antikörper eine halbmaximale Inhibierung dieser Zelllysatquelle von huTF bei ungefähr 8 – 10 ng Antikörper pro ml produzieren.
20. Kreuzreaktivität von MoAbs mit nicht menschlichem Gewebefaktor
Gewebefaktor wurde entweder aus Gehirngeweben (Ratte, Kaninchen, Rind, Hund, Schaf, Schwein und Affe) oder Gewebekulturzellen [afrikanische grüne Affennieren (COS)Zellen] isoliert. Gewebe oder Zellen wurden aufgetaut, von Membranen befreit, zerstampft, in einem ml kaltem Aceton pro g Gewebe homogenisiert und unter Vakuum durch ein Whatman #1 Papier filtriert. Die Feststoffe wurden in Azeton resuspendiert und 5 weitere Male filtriert, dann über Nacht luftgetrocknet und bei Minus 30°C aufbewahrt. Die Acetonpulver, welche 16 – 19% des Ausgangsnassgewichts umfassten, wurden mit einem Mörser und Stößel pulverisiert, bei 5% (W/V) in TBS, enthaltend 5 mmol/L EDTA, resuspendiert und für eine Stunde bei Flaumtemperatur vermischt. Die Feststoffe wurden durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 30 Minuten bei 20°C gesammelt und TF-enthaltende Membranen wurden durch Zentrifugation des Überstandes bei 100.000 × g für 1 Stunde gesammelt. Das Pellet wurde in TBS resuspendiert und bei Minus 80°C gelagert.
Die Antikörperinhibierung von tierischem TF (grobe Gewebeextrakte, die TF-Aktivität enthalten) wurde wie folgt bestimmt. Gleiche Volumen von TF (1 mg/ml) und Hybridomzellüberstand (1/10 mit TBS/BSA verdünnt) wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Verbleibende TF-Aktivität wurde durch das Hinzufügen von 100 μl der Inkubationsmischung zu 50 μl menschlichem Faktor VII-defizitärem Plasma und 50 μl 50 mM CaCl₂ gemessen. Nach einer Minute bei 37°C wurden 50 μl einer 1/10 Verdünnung eines homologen Speziesserums als Quelle von Faktor VII hinzugefügt und die Zeit zur Gerinnungsausbildung wurde als Doppelwert bestimmt.
18 der 24 MoAbs inhibierten die prokoagulatorische Aktivität von Paviangehirn TF oder afrikanischen grünen Affennierenzellextrakten (Tabelle 8). Jedoch zeigte keiner der MoAbs eine Kreuzreaktivität mit Ratten-, Kaninchen-, Rinder-, Hund-, Schafs- oder Schwein- TF, d. h., keines inhibierte die Fähigkeit dieser TF-Preparationen, die Rekalzifizierungszeit von menschlichem Faktor VII-defizitärem Plasma in der Gegenwart einer Quelle von homologem Faktor VII zu beschleunigen. Keiner der Antikörper inhibierte die prokoagulatorische Aktivität von Kaninchen TF, das mit normalem menschlichen Plasma untersucht wurde. Tabelle 8

¹ Es wurden, es sei denn, dies wird anderweitig zum Ausdruck gebracht, alle Ergebnisse unter Verwendung von Hybridomzellkulturüberständen bei einer 1:10 Verdünnung erhalten. Radioimmunoassayergebnisse, ausgedrückt in Zählungen (Count) pro Minute (CPM), unter Verwendung von ¹²⁵I-TF, das unter Verwendung von Laktoperoxidase markiert wurde.
² Westernblots wurden unter Verwendung von reduziertem (R) oder nicht reduziertem (NR) TF durchgeführt.
³ Inhibierung der Koagulation von menschlichem Plasma, die durch aufgereinigtes menschliches Gehirn TF induziert wird.
⁴ Inhibierung der spezifischen ¹²⁵I-Faktor VII/VIIa Bindung an J82-Zellen. In einigen Fällen (*) inhibierten die Kulturüberstände bei einer 1:10 Verdünnung die Faktor VII/VIIa Bindung nicht deutlich und die Daten werden für aufgereinigte IgG bei 10 μg/ml dargestellt.
⁵ Inhibierung der Koagulation von menschlichem Plasma, die durch groben Paviangehirnextrakt (B) oder lysierte COS-Zellen (M) induziert wird. Ein Buchstabe würde für eine Spezies eingegeben, wenn der MoAb die pro-koagulatorische Aktivität um 60% oder mehr inhibierte.

Die Inhibierung der prokoagulatorischen Aktivität, die durch eine Reihe von menschlichen Zellen und Geweben ausgedrückt wird, wurden in größerem Detail unter Verwendung des MoAbs TF8-5G9 untersucht. TF8-5G9 neutralisierte die Funktion von aufgereinigtem wieder Lipidversetztem menschlichem TF um mehr als 90% bei einer IgG Konzentration ≥ 1 μg/ml (16). Es wurde auch die Fähigkeit dieses MoAb, die prokoagulatorische Aktivität von menschlichen Zelllysaten und groben Gewebeextrakten zur inhibieren, gezeigt (Tabelle 9). TF8-5G9 bei einer IgG-Konzentration von 10 μg/ml inhibierte quantitativ ≥ 80% der prokoagulatorischen Aktivität von groben Gehirn – und plazentalen Acetonpulvern und von lysierten menschlichen Fibroblasten, Blasenkarzinomzellen und Endotoxin-stimulierten peripheren Blut – mononuklearen Zellen. Tabelle 9 Inhibierung der prokoagulatorischen Aktivität von verschiedenen Zellen und Geweben durch den monoklonalen Antikörper TF8-5G9
21. Faktor VII-Bindungsstudien
Da die Bindung des Faktors VII/VIIa an TF für den Zusammenbau des funktionellen TF VII/VIIa prokoagulatorischen Komplex notwendig ist, wurde die Fähigkeit der MoAbs, die in Tabelle 8 gezeigt werden, die TF-Aktivität mittels der Blockierung der Bindung des Faktors VII/VIIa an TF zu neutralisieren, untersucht.
Die durch den menschlichen Gewebefaktor vermittelte Bindung von Faktor VII an die Oberfläche von J52 Blasenkarzinomzellen ist gut charakterisiert. Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692 (1987). Entsprechend wurden die Wirkungen der MoAbs auf den Zusammenbau des Zelloberflächen huTF : VII/VIIa-Komplexes durch das Vorinkubieren von J82-Zellen mit Antikörper und anschließender Quantifizierung der spezifischen Bindung von ¹²⁵I-Faktor VII/VIIa untersucht.
J82-Zellen wurden bis zur Konfluenz in 12-Welt Kulturplatten wie durch Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692 (1987) beschrieben kultiviert, mit Puffer A gewaschen (137 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mmol L-Glukose, 5 mM Natriumazid, 10 mM HEPES, pH 7,45) gewaschen und für 2 Stunden bei 37°C mit 0,7 ml Puffer A, enthaltend aufgereinigtes MoAb IgG oder eine 1/10 Verdünnung eines Hybridomzellkulturüberstandes, inkubiert. Kalziumchlorid und ¹²⁵I-Faktor VVI/VVIa wurden jeweils zu Endkonzentrationen von 5 mM und 1 nM hinzugefügt und mit Zellen für einen zusätzlichen Zeitraum von 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zelleinzelschichten wurden dann 5 × mit kaltem Puffer B gewaschen (140 mM NaCl, 0,5% BSA, 5 mM Tris-HCL, pH 7,45), in 1 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS, 10 mM EDTA lysiert und das Lysat in einem Gammazähler gezählt. Die spezifische Bindung wurde durch das Subtrahieren nicht spezifisch gebundener Radioaktivität (¹²⁵I-Faktor VII/VIIa, der mit Zellen in der Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des nicht markierten Faktors VII/VIIa assoziiert ist) bestimmt. Die Prozentinhibierung der spezifischen Bindung wurde für J82-Zellen bestimmt, die mit MoAbs relativ zu Kontrollzellen behandelt wurden, die mit 9 Teilen Puffer A und einem Teil Kulturmedium behandelt wurden.
Wenn Faktor VII/VIIa an TF gebunden ist, wird er normalerweise nicht internalisiert, aber um die Möglichkeit einer TF-Internalisierung, die durch Antikörperbindung induziert wird, auszuschließen, wurden J82-Zellen metabolisch mit 5 mM Natriumazid vergiftet. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, egal ob die Zellen mit Azid behandelt oder nicht mit Azid wurden.
Die Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle 8 oben gezeigt. Alle 23 MoAbs, die TF-Aktivität inhibierten, blockierten auch die Faktor VII/VIIa-Bindung. Wie erwartet blockierte der MoAb, der die TF-Aktivität nicht inhibierte, TF9/10H10, nicht die Faktor VII-Bindung.
22. Inhibierung des Faktors Xa Bildung durch J82-Zellen
Die Geschwindigkeiten der Faktor Xa-Bildung durch den huTF:VII/VIIa-Komplex auf J82-Zellen wurden in Doppelbestimmungen unter Verwendung des Multiwellkulturplattenassays, der durch Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692 (1987) beschrieben wird, mit den folgenden Modifikationen quantifiziert. Die Zellen wurden Platten mit 12 Vertiefungen kultiviert und für 2 Stunden bei 37°C mit variierenden Konzentrationen der aufgereinigten IgG-Fraktion der MoAbs vor dem Beginn des Assays, wie oben für die Faktor VII/VIIa-Bindung an J82-beschrieben, kultiviert. Es wurde eine Einzelkonzentration von Faktor VII/VIIa (1 mM) in diesem Assays verwendet. Bei Intervallen von 5, 10 und 15 Minuten nach der Zugabe des Faktors X auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml wurden 50 μl Überstand abgenommen und zu 550 μl 50 mM Tris-HCL, 225 mM NaCl, 50 mM EDTA (pH 8,2) hinzugefügt. Nach der Zugabe des chromogenen Faktor Xa-Substrats (50 μl 3,4 mM S-2222 Helena Labs, Beaumont, TX), wurde die Faktor Xa-Aktivität durch Messung der Geschwindigkeit der Erhöhung in der Absorbtion bei 405 nm in einem Beckmann DU-30 Spektrophotometer mit kinetischem Analysemodul quantifiziert. Die Hintergrundhydrolyse von S-2222 durch den Überstand der J82-Zellen, die in Abwesenheit des Faktors VII/VIIa inkubiert worden waren, wurde von jeder Bestimmung abgezogen. Die Prozentinhibierung durch Antikörperbehandlung wurde relativ zu Zellen berechnet, die nicht mit Antikörper vorinkubiert worden waren.
Die Inhibitionskurven zur Behandlung von J82-Zellen mit den MoAbs TF9-2C4 und TF9-5B7 zeigen, dass die Geschwindigkeit der Faktor Xa-Bildung durch Antikörperkonzentrationen inhibiert wurden, die ähnlich denen der inhibierten Faktor VII-Bindung (17) sind. Der nicht-inhibierende (nicht-neutralisierende) MoAb TF9-10H10 hatte wenig oder keinerlei Wirkung auf die prokoagulatorische Aktivität, Faktor VII/VIIa-Bindung oder die Geschwindigkeit der Faktor Xa-Generierung bei IgG-Konzentrationen bis zu 10 μg/ml, noch tat dieses der Kontroll MoAb Pab100 (nicht gezeigt).
23. Die Inhibierung der Faktor X-Aktivierung auf J82-Zellen durch kompetive Bindung von huTF Polypeptiden an VII/VIIa
Wie auf dem Gebiet wohlbekannt ist, ist die zelluläre Aktivierung der Koagulationsproteasekaskaden mit einer heterogenen Gruppe von Erkrankungen assoziiert, die als schwindsüchtige thrombohemorrhagische Erkrankungen bezeichnet werden. Die Koagulationsproteasekaskade wird am häufigsten auf Zelloberflächen durch die hochafine Bindung von Faktor VII/VIIa an seinen Membranrezeptor und den essentiellen Kofaktor, Gewebefaktor (TF), eingeleitet. Der bimolekulare prokoagulatorische Komplex von TF und Faktor VII/VIIa [TF:VII/VIIa] aktiviert die Faktoren X und IX durch eingeschränkte Proteolyse, was letztendlich zur Thrombinausbildung und Fibrinablagerung führt. Zusätzlich zu der Rolle von TF in der Homeostase wird die Einleitung der Koagulationsproteasekaskade durch TF auch in der streuenden intravaskulären Koagulation und der Thrombogenese impliziert. Niemetz et al., Blood, 42:47 (1973) und Bevilacqua et al., J. Exp. Med., 160:618 (1984). TF ist ein wichtiges Effektormolekül, das auf der Oberfläche von Monozyten und endothelialen Zellen als Reaktion auf entzündliche Mediatoren und in zellulären Immunaktionen exprimiert wird.
Es wurde die Fähigkeit der hutF Polypeptide der vorliegenden Erfindung, an Faktor VII/VIIa zu binden und dadurch die Ausbildung eines TF:VII/VIIa Komplexes zu inhibieren, der in der Lage ist Faktor X zu aktivieren, untersucht.
50 Mikroliter (μl) einer Lösung, enthaltend 100 μM huTF Polypeptidanalogon in in TBS, wurde zu jeder Vertiefung einer 96-Well Flachbodenpolystyrolassayplatte hinzugefügt. Dann wurden zu jeder Vertiefung 25 μl einer Lösung hinzugefügt, die Faktor VII/VIIa enthält, der wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert wurde, bei einer Konzentration von 1 nm in TBS, des weiteren mit 25 μl 20 mM Kalziumchlorid in TBS vermischt und die resultierende Mischung wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten aufbewahrt.
Menschlichen Blasenzellkarzinom J82 – Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) HTB 1,; Rockville, MD) erhalten und wie durch Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692 – 11698 (1987) beschrieben kultiviert, dessen Verfahren hierin durch referenzieren aufgenommen wird.
5 × 10⁴ J82-Zellen werden in 50 μl TBS suspendiert und zu jeder Probe der Polystyrolassayplatte nach der oben genannten Aufbewahrungszeit hinzugefügt. Direkt danach wurden 25 μl des Faktors X, wie durch Fair et al., J. Biol. Chem., 262: 11692 – 11698 (1987) beschrieben isoliert, bei der Konzentration von 100 nM in TBS und 50 μl Xa des chromogenen Substrats S-2222 (1 mg/ml in TBS) vermischt und die resultierende Mischung wurde für 2 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt, um eine das chromogene Reaktionsprodukt enthaltende Lösung auszubilden.

Die Menge des gebildeten chromogenen Produkts wurde durch die Messung der Menge der optischen Lichte (O.D.) bei 405 Nanometern (nm) unter Verwendung eines V-max 96 well-Spektrophotometer (Molecular Devices, Mountain View, California) quantifiziert. Es wurden auch Kontrollen mit PBS an Stelle der Peptide oder ohne hinzugefügten Faktor VII laufen gelassen, um das Maximum und das Minimum der möglichen O.D.-Werte zu etablieren. Die Ergebnisse dieser gemessenen Inhibitionen werden in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Inhibierung der X-Aktivierung auf J82-Zellen unter Verwendung von huTF-Polypeptiden

HuTFh-Polypeptide	Optische Dichte
PBS	0,960 ± 0,083
Kein Faktor VII/VIIa	0,005 ± 0,001
p1-18	1,007 ± 0,087
p1-30	1,098 ± 0,028
p11-28	0,687 ± 0,071
p24-35	0,477 ± 0,017
p26-49	0,437 ± 0,020
p40-71	0,814 ± 0,053
p72-104	0,781 ± 0,047
p94-123	0,818 ± 0,055
p121-155	0,889 ± 0,067
p144-159	0,507 ± 0,053
p146-167	0,004 ± 0,001
p157-169	0,389 ± 0,035
p161-190	0,600 ± 0,023
p190-209	0,625 ± 0,031
p204-226	0,715 ± 0,042
p244-263	0,619 ± 0,047

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die huTFh-Polypeptide p24-35, p26-49, p144-159, p146-167 und p157-169 den Faktor VII/VIIa binden und seine Fähigkeit inhibieren, einen TF:VII/VIIa-Komplex auszubilden, der Faktor X aktivieren kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Polypeptidanalogon der huTFh Bindungsstelle der vorliegenden Erfindung zur Inhibierung der Koagulation verwendet werden kann.
24. in Vivo Inhibierung der Koagulation durch Anti-huTFh-MoAbs
Die durch gram-negative Bakterien bedingte Sepsis involviert oft einen Schockzustand, der letztendlich zum Tode führen kann. Störungen des hemostatischen Systems sind eng mit der Entwicklung des Schockzustands verbunden. Tayer et al., J. Clin. Invest., 79: 918 – 825 (1987) zeigten, das exogen hinzugefügtes aktiviertes Protein C, ein natürlich vorkommendes antikoagulatorische Enzym, die koagulatorische Reaktion und die lethalen Wirkungen von LD₁₀₀-Konzentrationen von E. coli in Pavianen verhindert.
Die Fähigkeit eines antikoagulatorischen MoAb der vorliegenden Erfindung, die Koagulation in vivo zu inhibieren, wurde unter Verwendung des Pavianmodells für septischen Schock, wie es durch Tayler et al., supra, beschrieben wird, untersucht. Paviane, die 7 – 8 kg wiegen, wurden über Nacht vor der Studie fasten gelassen und an dem Morgen des Experiments mit Ketamin (14 mg/kg, intramuskulär) immobilisiert. Natriumpentobarbital wurde dann in die zephalische Vene durch einen perkutanen Katheter verabreicht, um einen leichten Spiegel chirugischer Anästhesie aufrecht zu halten (2 mg/kg ungefähr alle 45 Minuten). Eine femorale Vene wurde aseptisch freigelegt und ein Hinterglied zur Blutentnahme kanalüsiert. Der perkutane Katheter wurde verwendet, um die E. coli und andere Mittel, einschließlich MoAb TF9-5B7, zu infundieren, von denen in Beispiel 20 gezeigt wurde, dass sie mit Pavian-TF kreuzreagieren. Nach einem Equilibrierungszeitraum von 30 Minuten wurden die Tiere über einen Zeitraum von 10 Minuten mit entweder 500 μg/kg oder 150 μg/kg MoAb-TF9-5B7 (wie in Beispiel 7 isolierte MAPS und dann gegen sterile normale Salzlösung auf eine Konzentration von 0,58 μg/ml dialysiert) oder 500 μg/kg eines irrelevanten MoAb infundiert.
Nach der MoAb-Verabreichung und einem Equilibierungszeitraum von 30 Minuten erhielt jedes Tier eine LD₁₀₀-Dosis an E. coli ( ungefähr 10¹⁰ Organismen, eine Menge, die den Tod bedingt durch septischen Schock ungefähr 8 – 16 Stunden nach der Infusion bewirkt). Die E. coli wurden durch Infusion über ein ungefähr zweistündigen Zeitraum verabreicht. Die Resultate dieser Studie werden in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 In vivo Unterbrechung der Lethalität eines septischen Schocks in Pavianen
Wie aus Tabelle 11 zu sehen ist, überleben Paviane, die MoAb TF9-5B7 erhalten, die Herausforderung einer LD₁₀₀-Dosis E. coli. Sowohl die 150 μg/kg wie auch 500 μg/kg-Dosierungen MoAb schützten. Zusätzlich waren die deutliche Blutdrucksenkung, Koagulationskaskadenaktivierung und der Abbau von Fibrin, der mit einer Koagulopathie assoziiert ist, deutlich in den Tieren attenuiert, die MoAb TF9-5B7 erhalten.
25. Charakterisierung der leichten Kette des 58 kDa huTF-Heterodimers als Hämoglobin Alpha-Kette
Immunaffinitätsisolierte huTF wurden des Weiteren durch Westernblot-Analyse charakterisiert, um die Komponenten des 58 kDa huTF-Heterodimers zu identifizieren, nämlich die 47 kDa und 12,5 kDa-Proteine, die in Beispiel 4 beschrieben werden.
Eine Westernblot-Analyse, die wie in Beispiel 6c beschrieben durchgeführt wurde, wurde unter Verwendung von immunaffinitätsisoliertem huTF, das wie in Beispiel 9 beschrieben, hergestellt wurde, aufgereinigtem menschlichen Hämoglobin oder Molekulargewichtsstandards, die wie die elektophoretisierten Proben behandelt wurden, durchgeführt. Wo angezeigt, wurde 50 mM Dithiolthreitol in den Probenpuffer für eine Reduktion der Disulfidbindungen hinzugefügt. Die Western-blots wurden wie angezeigt unter Verwendung von nicht-immunem Kaninchen IgG, Kaninchen anti-huTF IgG, hergestellt unter Verwendung von Verfahren, die wohlbekannt sind, oder Kaninchen anti-menschliches Hämoglobin IgG, das von Dako erhalten wurde (Santa Barbara, California), immunreagiert. Die ersten zwei IgG-Zubereitungen wurden waren wie in Beispiel 7 beschrieben MAPS-II- isoliert.
Ergebnisse aus der oben genannten Westernblot-Analyse werden in 18 gezeigt. Anti-huTF-IgG immunreagierte nur mit der 47 kDa-Bande von reduziertem huTF und nicht mit der 12,5 kDa-Bande (Abschnitt A, Bahn 3), wohingegen das gleiche IgG sowohl mit den 58 kDa- und 47 kDa-Formen von nicht reduziertem huTF immunreagierte (Abschnitt A, Bahn 4). Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Identifizierung von huTF als die 47 kDa-Komponente des 58 kDa-Heterodimers. Anti-Hämoglobin IgG immunreagierte auf Westernblots nur mit der 58 kDa-Bande in der nicht reduzierten huTF-Probe und nicht mit dem 47 kDa-Monomer (Abschnitt B, Bahn 4). Jedoch reagierte das Anti-Hämoglobin IgG mit der 12,5 kDa-Bande in der reduzierten huTF-Probe (Abschnitt B, Bahn 3) und immunreagierte mit dem 12,5 kDa aufgereinigten menschlichen Hämoglobinprotein (Abschnitt B, Bahn 2). Es gab keine Reaktivität mit nicht immunem Kaninchen IgG.
Die oben gezeigten Ergebnisse unterstützen den Schluss, dass die 58 kDa-Form von nicht-reduziertem huTF aus einem 47 kDa huTF-Protein besteht, das an Hämoglobin disulfidgebunden ist.
Somit wird nun angenommen, dass die 12,5 kDa leichte Kettenkomponente des 58 kDa Heterodimers, das in Beispiel 4 beschrieben wird, die Alphakette von Hämoglobin ist, und dass dessen Assoziierung mit dem 47 kDa huTF-Protein ein Artefakt des huTF-Isolierungsverfahrens ist.
Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse der Beispiele 1 - 25 Es wurde eine Bibliothek von 24 MoAbs gegen menschliches Gehirn TF, erhalten aus zwei verschiedenen Zellfusionen, beschrieben. Die Immunspezifität von jedem MoAbs wurde durch Dotblot, Westernblot und Radioimmunoassay charakterisiert. Die meisten MoAbs reagierten mit menschlichem TF unter allen drei Bedingungen und sowohl mit nativem wie auch denaturiertem TF. Einer der MoAbs, TF8-5G9, wurde erfolgreich zur routinemäßigen Aufreinigung des TF-Proteins verwendet. Es adsorbiert quantitativ TF-Aktivität aus Gewebeextrakten und führt konsistent zu aufgereinigtem menschlichen TF in Milligrammmengen.
Alle bis auf einen der MoAbs neutralisierten die funktionelle Aktivität von aufgereinigtem menschlichem Gehirn TF stark. Obwohl sich verschiedene MoAbs als mit TF aus Pavian und Affe kreuzreagierend herausgestellt haben, inhibierte keiner der Antikörper die Koagulation von Faktor VII-defizientem menschlichen Plasma, das durch Ratten-, Kaninchen-, Rinder-, Hunde-, Schafs- oder Schweinethromboplastin in der Gegenwart von homologem Faktor VII eingeleitet wurde. Des Weiteren wurde die Einleitung der Koagulation von normalem menschlichen Plasma durch Kaninchengehirnthromboplastin nicht durch einen dieser MoAbs inhibiert, was den Schluss unterstützt, dass die Inhibierung der menschlichen TF prokoagulatorischen Aktivität nicht durch die Wechselwirkung der Antikörper mit löslichem Plasmakoagulationsproteinen, einschließlich Faktor VII/VIIa, bedingt war.
Die einfachste Basis für die Inhibierung der TF prokoagulatorischen Aktivität durch Anti-TF-Antikörper ist das Blockieren der Faktor VII/VIIa-Bindung. Wie erwartet, beseitigten alle 23 antikoagulatorischen (neutralisierenden) MoAbs die spezifische Bindung von Faktor VII/VIIa an J82-Zellen, was mit der primären Rezeptorfunktion von TF konsistent ist. Dieses wurde des Weiteren in der Dosistitrierung ausgewählter aufgereinigter MoAbs bestätigt, bei denen die halbmaximale Inhibierung der Faktor VII-Bindung und halbmaximale Inhibierung der Geschwindigkeit der Faktor Xa-Bildung bei ähnlichen IgG-Konzentrationen vorkam.
Es wurde vor kurzem ein MoAb gegen menschliches TF durch Carson et al., Blood, 70:490 (1987), als die TF-Aktivität inhibierend beschrieben, angeblich durch Wechselwirkung mit der Faktor VII/VIIa-Bindung, obwohl dieses nicht direkt untersucht wurde. Dass 23 von 24 der derzeit bekannten MoAbs die TF-Aktivität stark neutralisieren, ist bemerkenswert. Die Erfahrung in dem Labor der Anmelden mit MoAbs gegen eine Reihe menschlicher Koagulationsproteine war es, dass nur ein kleiner Anteil die funktionelle Aktivität neutralisiert. Es ist unwahrscheinlich, dass die Hybridomazellen, bedingt durch die Unterschiede in ihren Reaktivitäten, einschließlich Kreuzreaktivitäten mit Primaten TF, alle gleiche Schwesterklone sind. Zusätzlich zeigen weiterführende Epitopkartierungsstudien, dass mindestens drei unterschiedliche nicht kompetitierende Antikörperbindungsstellen durch diese Reihe MoAbs erkannt werden. Daher ist der große Anteil neutralisierender MoAbs gegen TF wahrscheinlich nicht die Konsequenz einiger weniger immundominanter Epitope, die auch in dessen Funktion partizipieren; tatsächlich wird von der TF-Aminosäuresequenz durch das Verfahren von Hopp et al., Mol. Immunol., 20:483 (1983) vorausgesagt, dass sie mehrere Antigene Determinanten enthält.
Die kleine Größe von TF kann teilweise erklären, warum so viele Anti-TF MoAbs die Faktor VII/VIIa-Bindung blockierten. Von der cDNA-Klonierung wird für TF vorausgesagt, dass es eine 25 kDa extrazelluläre Domäne ohne Glykosilierung aufweist. Daher können Antikörper- und Faktor VII/VIIa-Moleküle eine sterische Hinderung in der Bindung an die deutlich kleinere extrazelluläre Domäne von TF aufzeigen. Die Hypothese der sterischen Hinderung ist konsistent mit der Beobachtung, dass Concanavalin A TF-Aktivität inhibiert [Pitlick, J. Clin. Invest., 55:175 (1975)], da die Kohlenhydratgruppen von TF wahrscheinlich nicht für die Funktion benötigt werden. [Nakamura, Throm. Hemost., 58:135 (1987)].
Es war von einiger Bedeutung, dass die Faktor VII-abhängige prokoagulatorische Aktivität, die durch verschiedene Zellen und Gewebe zum Ausdruck kommt, für mehr als eine molekulare Spezies von TF-ähnlichen Proteinen mit ähnlicher Funktion verantwortlich sein könnte. Jedoch inhibierte der MoAb TF8-5G9 quantitativ die prokoagulatorische Aktivität von groben Gehirn- und plazentalen Extrakten und von lysierten Fibroblasten, Blasenkarzinomzellen und peripheren blutmononuklearen Zellen. Während sie nicht erschöpfend sind, unterstützen diese Ergebnisse doch den Schluss, dass zelluläre prokoagulatorische Aktivitäten derzeit auf TF zurückzuführen sind, die Antigen-verwandt, wenn nicht sogar identisch sind. Dieses ist mit der Entdeckung konsequent, dass es wahrscheinlich ein einzelnes Gen für TF gibt.
Vor kurzem wurde gezeigt, dass die lethalen Wirkungen von septischem Schock in Pavianen durch Infusion mit aktiviertem Protein C, einem antikoagulatorischen Protein, welches an Zwischenschritten der Koagulationsproteasekaskade wirkt, verhindert werden kann. Die vorliegenden Studien zeigen, dass MoAbs, welche die TF-Aktivität inhibieren, hochspezifische in-vivo antikoagulatorische Agenzien sind, da sie durch Blockierung der Iniziierung der Koagulationsproteasekaskade den Verbrauch von Plasmakoagulationsfaktoren, der normalerweise mit der pathologischen Aktivierung der intravaskulären Koagulation assoziiert ist, inhibieren.
Von der 58 kDa-Form von huTF, wie sie in Beispiel 4 beschrieben wird, wurde hier gezeigt, dass sie ein Disulfid-gebundenes Heterodimer des 47 kDa TF-Proteins und eines ungefähr 12,5 kDa Polypeptids ist, das nun immunochemisch und durch teilweises Aminosäuresequenzieren als Alphakette des Hämoglobins identifiziert wurde. Vorherige Spekulation, dass die 58 kDa-Bande vielleicht eine natürlich vorkommende heterodimere Form von zellulärem TF darstellen könnte, ist wahrscheinlich inkorrekt, da es wahrscheinlich ist, dass das 58 kDa Heterodimer während der Isolierung gebildet wird.
Die Alphakette von Hämoglobin hat ein einziges Cystein und von TF wird aus der cDNA vorausgesagt, dass es ein einzelnes Cystein in seiner zytoplasmatischen Domäne aufweist. TF hat auch vier Cysteine in seiner extrazellulären Domäne, aber mindestens zwei müssen in eine Zwischenkettendisulfidbindung involviert sein, da die TF-Funktion nach Reduktion verloren wird. Das einzelne Cystein in der zytoplasmatischen Domäne von TF bleibt wahrscheinlich, wie Cysteine in den meisten zytoslichen Proteinen, in dem reduzierten Stadium erhalten. Dieses (oder weniger wahrscheinlich, ein anderes Cystein von TF) kann leicht für eine gemischte Disulfidbindung nach Zellyse zugänglich sein, und es wird vorgeschlagen, dass die Oxidation während des Isolierungsverfahrens in der Ausbildung einer Disulfidbindung zwischen den Cysteinrest der zytoplasmatischen Domäne von TF und Hämoglobin resultiert. Die Beobachtung, dass die Heterodimerbildung scheinbar zeitabhängig ist, unterstützt diesen Schluss dahingehend, dass die Minimierung der Zeit zwischen der Detergenzextraktion von TF aus Gehirnacetonpulver und der Bindung der Immunaffinitätsmatrix die Menge des erhaltenen heterodimeren TFs reduziert. Das angenommene 96 kDa TF-Dimer kann auch durch einen ähnlichen Mechanismus während der Isolierung ausgebildet werden.
Eine Anti-Hämoglobin Antikörpersäule band spezifisch das 58 kDa-Heterodimer, aber entfernte nicht quantitativ alle höher molekulargewichtige Spezies, die in Immunaffinitäts-aufgereinigten TF-Zubereitungen zu sehen sind. Spurenmengen anderer kleinerer Banden mit Molekulargewichten oberhalb von 47 kDa wurden dahingehend beobachtet, dass sie mit Anti-TF Antikörpern reagieren. Diese selteneren Spezies, einschließlich einem Teil der 58 kDa-Bande, können gemischte Disulfide darstellen, die zwischen TF und anderen nicht identifizierten Proteinen gebildet werden.
Die vorgenannte Beschreibung einschließlich der speziellen Ausführungsform und Beispiele ist als illustrativ für die vorliegende Erfindung zu sehen und sollte nicht als einschränkend angenommen werden. Viele andere Variationen und Modifikationen können ohne ein sich Entfernen von dem eigentlichen Gedanken und Umfang der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden.

Claims

Ein Polypeptidanalogon einer menschlichen Gewebefaktorbindungsstelle, das nicht mehr als ungefähr 50 Aminosäurereste umfasst und eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die mit einer Sequenz korrespondiert, die durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
dargestellt wird.
Das Polypeptid von Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Formel: H-VNQVYTVQIST-OH aufweist.
Das Polypeptid von Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Formel: H-LYYTYWKSSSSGKKT-ON aufweist.
Ein Polypeptidanalogon einer menschlichen Gewebefaktorbindungsstelle, das eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
aufweist.
Ein Polypeptidanalogon einer menschlichen Gewebefaktorbindungsstelle, das eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
aufweist.
Eine Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörpermoleküle, die: a) mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors immunreagieren; b) mit einem Polypeptid immunreagieren, das durch eine Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe bestehend aus:
ausgewählt ist, und c) die nicht wesentlich mit einem Polypeptid immunreagieren, das durch die in 1 von Position 204 bis 226 gezeigte Formel dargestellt wird.
Die Zusammensetzung von Anspruch 6, worin die Antikörper mit einem Marker verbunden sind.
Die Antikörperzusammensetzung von Anspruch 6, worin die Antikörpermoleküle in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel vorhanden sind.
Eine Hybridomzelle, die als TF8-5G9 (ATCC HB 9382) bezeichnet wird, die Antikörpermoleküle produziert, die mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors und einem Polypeptid, das durch die in 1 von Rest 26 bis Rest 49 gezeigte Formel dargestellt wird, immunreagieren.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörpermoleküle, die durch die Hybridomzelle von Anspruch 9 produziert werden.
Eine Hybridomzelle, die als TF9-10H10 (ATCC HB 9383) bezeichnet wird, die Antikörpermoleküle produziert, die mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors und einem Polypeptid, das durch die in 1 von Rest 26 bis Rest 49 gezeigte Formel dargestellt wird, immunreagieren.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörpermoleküle, die durch die Hybridomzelle von Anspruch 11 produziert werden.
Eine Hybridomzelle, die als Tf9-6B4 (ATCC HB 9381) bezeichnet wird, die Antikörpermoleküle produziert, die mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors und einem Polypeptid, das durch die in 1 von Rest 146 bis Rest 167 gezeigte Fonnel dargestellt wird, immunreagieren.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörpermoleküle, die durch die Hybridomzelle von Anspruch 13 produziert werden.
Ein Verfahren zur Untersuchung auf das Vorhandensein des schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend die Schritte des: a) Vermischens einer Körperprobe mit Antikörpern, die mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors immunreagieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit mindestens dem Rest 1 bis Rest 209 von 1 korrespondiert, um eine Immunreaktionsmischung auszubilden; b) die Aufbewahrung der Mischung für einen Zeitraum, der für besagte Antikörper ausreichend ist, um mit jeglichem in der Probe vorhandenen menschlichen Gewebefaktor zu immunreagieren und ein Immunreaktionsprodukt auszubilden; und c) das Nachweisen des Vorhandenseins eines Immunreaktionsproduktes, das in Schritt b ausgebildet wurde.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel und eine Menge an Antikörpermolekülen, die durch die Hybridomzelle TF9-10H10 (ATCC HB 9383) produziert werden, die an ein in vivo anzeigende Mittel gebunden sind, die dahingehend wirksam sind, dass sie mit einem in einem Thrombus vorhandenen menschlichen Gewebefaktor zur Verwendung in dem Nachweis eines Thrombus in vivo immunreagieren.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, die Antikörpermoleküle enthält, die durch eine Hybridomzelle produziert werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TF9-5B7, TF8-5G9 und TF9-6B4 (ATCC HB 9658, HB 9382 und HB 9381), zur Verwendung in der Neutralisation der Fähigkeit des menschlichen Gewebe-Faktors, den Koagulationsfaktor VII/VIIa in vivo zu binden.
Eine Polypeptidzusammensetzung, umfassend ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, enthaltend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei besagtes Polypeptid in besagter Zusammensetzung in einer Menge vorhanden ist, die wirksam ist, um mit dem Faktor VII/VIIa zu reagieren, zur Verwendung in der Hemmung der Bindung des menschlichen Gewebefaktors an den Koagulationsfaktor VII/VIIa in vivo.
Ein diagnostisches System in Kitform zur Untersuchung auf das Vorhandensein des schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors in einer Probe umfassend: a) eine Verpackung, die eine Antikörperzusammensetzung gemäß Anspruch 6 enthält.
Das diagnostische System von Anspruch 19, worin besagte Antikörperzusammensetzung monoklonale Antikörpermoleküle umfasst, die durch eine Hybridomzelle produziert werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Hybridomzellen bestehend aus: a) TF8-5G9 (ATCC HB 9382), b) TF9-6B4 (ATCC HB 9381), c) TF9-10H10 (ATCC HB 9383), und d) TF9-5B7 (ATCC HB 9658).
Ein Verfahren zur Isolierung des Blutkoagulationsfaktors VII/VIIa aus einer Probe, umfassend die Schritte des: a) Vermischens der Probe mit einem festen Träger, der ein Polypeptidanalogon von Anspruch 1, 4 oder 5 umfasst, das an eine feste Matrix befestigt ist, wobei die Mischung eine Bindungsreaktionsmischung ausbildet; b) die Aufbewahrung besagter Bindungsreaktionsmischung für einen Zeitraum, der ausreichend für besagten Koagulationsfaktor zur Bindung an besagtes Polypeptid ist und einen festen Phasenkomplex und einen Überstand ausbildet; c) das Abtrennen des Überstands vom Komplex, und d) die Rückgewinnung des Koagulationsfaktors aus dem abgetrennten Komplex von Schritt c.
Eine Zusammensetzung, umfassend eine wässrige Lösung eines biologisch aktiven schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors, die im Wesentlichen frei von dem leichten Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors ist, wobei besagtes schweres Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu Rest 1 bis Rest 209 von 1 korrespondiert und in einer Konzentration von 0,1 pg bis 100 ng/ml vorhanden ist.
Die Zusammensetzung von Anspruch 22, worin das biologisch aktive schwere Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors in einem Phospholipid dispergiert ist.
Die Zusammensetzung von Anspruch 22, worin die Lösung ein nicht ionisches Detergenz enthält.
Die Zusammensetzung von Anspruch 22, worin das Protein löslich ist und eine Aminosäuresequenz, die durch 1 von Position 1 bis Position 219 dargestellt wird, aufweist.
Ein diagnostisches System in Kitform zur Untersuchung der Koagulationskompetenz in einer Flüssigkeitsprobe des vaskulären Systems umfassend: a) eine Verpackung, enthaltend eine Zusammensetzung einer wässrigen Lösung von biologisch aktivem schweren Kettenprotein des menschlichem Gewebefaktors, die im Wesentlichen frei von dem leichten Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors ist, wobei besagtes schweres Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens mit dem Rest 1 bis Rest 209 von 1 korrespondiert, und wobei dieses schwere Kettenprotein in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um mindestens eine Untersuchung durchzuführen.
Das diagnostische System von Anspruch 26, worin besagtes schweres Kettenprotein in einem Phospholipid dispergiert ist.
Das diagnostisches System von Anspruch 26, worin besagtes Protein löslich ist und eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch 1 von Position 1 bis Position 219 dargestellt wird.
Ein Verfahren zur Herstellung eines reifen schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors, umfassend die Schritte des: a) Initiierens einer Kultur von Säugetierzellen in einem Nährmedium, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das einen Expressionsvektor umfasst, der zu besagten Zellen kompatibel ist, der operativ mit einem ersten DNA-Segment verbunden ist, das ein strukturelles Gen definiert, das für ein schweres Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit mindestens dem Rest 1 bis Rest 209 von 1 korrespondiert, und einem zweiten DNA-Segment, das zu dem 5'-Terminus von dem ersten Segment benachbart liegt und für eine Aminosäureleadersequenz kodiert, die mit dem Protein verbunden ist; wobei die ersten und die zweiten DNA-Segmente zusammen ein zusammengesetztes strukturelles Gen definieren, das eine Vorläuferform des besagten Proteins kodiert; b) die Aufbewahrung der Kultur für einen Zeitraum, der ausreicht, damit die Zellen ein Protein aus dem rekombinanten DNA-Molekül exprimieren und das reife Protein ausbilden; und c) die Rückgewinnung des reifen Proteins aus der Kultur.
Das Verfahren gemäß Anspruch 29, worin das zusammengesetzte strukturelle Gen eine Nukleotidbasensequenz aufweist, die durch 2 von Base 34 bis 786 dargestellt wird.
Eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus dem reifen schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors besteht, das durch das Verfahren von Anspruch 30 hergestellt wird.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, enthaltend Antikörpermoleküle, die durch die Hybridomzelle TF8-5G9 (ATCC HB 9382) produziert werden, zur Verwendung in der Neutralisation der Fähigkeit des menschlichen Gewebefaktors die Koagulation in vivo zu initiieren.
Eine Hybridomzelle, die als TF9-5B7 (ATCC HB 9658) bezeichnet wird, die Antikörpermoleküle produziert, die mit dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors und einem Polypeptid, das durch die in 1 von Rest 26 bis Rest 49 gezeigte Formel dargestellt wird, immunreagieren.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörpermoleküle, die durch die Hybridomzelle von Anspruch 33 produziert werden.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, umfassend ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, die Antikörpermoleküle enthält, die durch die Hybridomzelle TF9-5B7 (ATCC HB 9658) produziert werden, zur Verwendung in der Neutralisation der Fähigkeit des menschlichen Gewebefaktors, die Koagulation in vivo zu initiieren.
Eine antikoagulatorische monoklonale Antikörperzusammensetzung, die Antikörpermoleküle enthält, die mit a) dem schweren Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors (huTFh, mit einer in 1 von Rest 1 bis Rest 209 gezeigten Aminosäuresequenz) immunreagieren, und dadurch die Fähigkeit des Proteins hemmen, an den Faktor VII/VIIa zu binden, und b) mit einem huTFh : VII/VIIa-Komplex immunreagieren (huTFh, mit einer in 1 von Rest 1 bis Rest 209 gezeigten Aminosäuresequenz), und dadurch die Fähigkeit des Komplexes hemmen, den Faktor X zu aktivieren, zur Verwendung in der Hemmung der Koagulation in vivo.
Die Verwendung eines Antikörpers in der Herstellung eines Medikaments zur Neutralisation der Fähigkeit des menschlichen Gewebefaktors, an Faktor VII/VIIa in vivo zu binden oder zur Hemmung der Koagulation in vivo, wobei der Antikörper durch eine Hybridomzelle, ausgewählt aus TF9-5B7, TF8-5G9 oder TF9-6B4 (ATCC HB 9658, HB 9382 oder HB 9381), produziert wird.
Ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Proteins, das in der Lage ist, den Faktor VII/VIIa zu binden, wobei dieses Verfahren umfasst: a) das Initiieren einer Kultur von Wirtszellen in einem Nährmedium, die mit einem DNA-Molekül transformiert sind, das eine Sequenz umfasst, die für ein schweres Kettenprotein des menschlichen Gewebefaktors kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens Rest 1 bis Rest 209 von 1 korrespondiert, b) die Aufbewahrung besagter Kultur für einen Zeitraum, der für die transformierten Zellen ausreicht, um das Protein zu exprimieren, und c) die Durchführung einer Gelfiltration, Gelchromatografie, Ultrafiltration, Elektrophorese, Ionenaustausch, Affinitätschromatographie oder immunologischer Verfahren mit dem Teil dieser Kultur, der das Protein enthält, zur Isolierung des Proteins.
Ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Proteins, das in der Lage ist, den Faktor VII/VIIa zu binden, wobei besagtes Verfahren umfasst; a) das Initiieren einer Kultur von Wirtszellen in einem Nährmedium, die mit einem DNA-Molekül transformiert sind, das eine Sequenz umfasst, die für mindestens 90% des schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu dem Rest 1 bis Rest 263 von 1 korrespondiert. b) die Aufbewahrung der Kultur für einen Zeitraum, der für die transformierten Zellen ausreicht, um das Protein zu exprimieren, und c) die Durchführung einer Gelfiltration, Gelchromatografie, Ultrafiltration, Elektrophorese, Ionenaustausch, Affinitätschromatographie oder immunologischer Verfahren mit dem Teil dieser Kultur, der das Protein enthält, zur Isolierung des Proteins.
Ein menschliches Gewebefaktorprotein, bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 209, 1 bis 214 oder 1 bis 244 von 1.
Eindiagnostisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Koagulationskompetenz in einer Probe, umfassend die Schritte der: 1) Durchführung eines Koagulationsassays zur Bestimmung der Gerinnungszeit unter Verwendung einer vorgegebenen Menge eines menschlichen Gewebefaktors (huTF)-Proteins, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens Rest 1 bis Rest 209 von 1 korrespondiert, wobei das Protein in der Lage ist, die Koagulation in zitriertem Plasma in der Gegenwart von Calciumchlorid zu initiieren; 2) Herstellung einer Standardkurve der gemäß dem Assay in Schritt (1) erhaltenen Gerinnungszeiten unter Verwendung eines Bereichs von Mengen des huTF-Protein; 3) Durchführung eines Koagulationsassays gemäß Schritt (1), außer der Verwendung einer Probe, von der angenommen wird, dass sie huTF an der Stelle der vorgegebenen Menge des huTF-Proteins enthält; und 4) Bestimmung der Koagulationskompetenz der Probe durch das Vergleichen der Gerinnungszeit der Probe mit der Standardkurve.
Ein diagnostisches Assayverfahren gemäß Anspruch 42, worin das huTF-Protein, das in Schritt (1) verwendet wird, ein huTF-Protein gemäß Anspruch 40 ist.
Ein DNA-Segment, das nicht mehr als 1133 Nukleotidbasenpaare umfasst, einschließlich einer Sequenz, die für eine lösliche Vorstufe des schweren Kettenproteins des menschlichen Gewebefaktors kodiert, der eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch 1 von Rest –32 bis Rest 219 dargestellt wird.
Das DNA-Segment von Anspruch 43, welches eine Nukleotidbasensequenz umfasst, die durch 2 von Base 34 bis Base 786 dargestellt wird.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend den Vektor gKSV-10, der operativ mit einem DNA-Segment gemäß Anspruch 44 verbunden ist.