DE60208809T2 - Enzymsubstrate zum Nachweis der ß-D-Ribofuranosidase-Aktivität - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
- Diese Erfindung betrifft chromogene Enzymsubstrate.
- Indikator-Enzymsubstrate umfassen einen durch Enzym abspaltbaren Teil (z.B. ein Monosaccharyl) und einen Teil, der nach Abspaltung einen nachweisbaren Indikator bildet (z.B. eine chromogene oder fluorogene Gruppe). Eine große Zahl von Enzymsubstraten auf Glycosid-Basis ist bekannt und wird in großem Umfang in der Mikrobiologie, Molekularbiologie und auf anderen Gebieten verwendet. Glycoside von vielen verschiedenen Kohlenhydraten sind synthetisiert und für Nachweiszwecke verwendet worden. Die Enzyme, die durch diese Glycoside nachgewiesen werden, sind häufig Gruppen-spezifisch (d.h. zeigen relativ wenig Spezifität gegenüber einem Teil des Substrats, auf das sie einwirken), und deshalb kann eine große Vielfalt von Aglyconen (d.h. Indikator-Teilen) toleriert werden. So sind im Fall vom β-Galactosidase viele verschiedene β-Galactoside beim Nachweis derselben verwendet worden. Beispiele umfassen o-Nitrophenyl-, p-Nitrophenyl-, Indoxyl- (5-Brom-4-chlor-3-indolyl und 6-Chlor-3-indolyl), 4-Methylumbelliferyl-, 2-Naphthyl-, 6-Brom-2-naphthyl-, Cyclohexenoäsculetin- (CHE), Alizarin-, Naphthol-ASBI- und Phenyl-β-D-galactosid. Glycoside, die Glucuronsäure-, Glucose-, Galactose-, Mannose-, Fucose-, Arabinose-, N-Acetylglucosamin-, N-Acetylgalactosamin-, Sialinsäure-, Xylose- und Cellobiose-Kohlenhydrat-Einheiten enthalten, befinden sich unter denjenigen, auf die man am häufigsten in Enzymsubstrat-Anwendungen trifft. Viele von diesen, wie β-D-Glucuronide, α- und β-D-Galactopyranoside und α- und β-D-Glucopyranoside haben eine weit verbreitete Verwendung bei der Identifizierung und Zählung von Bakterien auf Gebieten wie der klinischen, Nahrungsmittel-, Veterinär-, Umwelt- und Wassermikrobiologie gefunden. Derzeit sind zahlreiche kommerzielle Medien und Testkits verfügbar, die Enzymsubstrate enthalten, welche die Anwesenheit von Bakterien, Hefe und anderen Mikroorganismen durch Erzeugung von gefärbten Kolonien oder Lösungen zeigen.
- Es sind einige Verbindungen bekannt, die eine Zuckereinheit enthalten, bei der es sich um Ribose handelt. Zum Beispiel werden Ribofuranoside von DOPA (2-Amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propansäure) und DOPA-Derivaten von Chavis et al. (1981), Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 16(3), 219-227 beschrieben. Die Verbindungen weisen eine potentielle Nützlichkeit als Antihochdruckmittel auf.
- Diese Erfindung stellt neue Verfahren zur Verwendung von β-D-Ribofuranosiden und neue β-D-Ribofuranosid-Indikator-Enzymsubstrate bereit. Bis heute weisen Substrate auf der Basis von β-D-Ribofuranosid wenig Anwendung als Substrate auf. Diese Erfindung stellt auch einige neue β-D-Ribofuranosid-Verbindungen bereit.
- Einige potentielle oder tatsächliche Substrate auf der Basis von β-D-Ribofuranosid (BDRF) sind bekannt. p-Nitrophenyl-BDRF wurde zuerst 1976 mitgeteilt (K. Honma et al., Chem. Pharm. Bull., 1976, 24, 394-399), aber über seine Verwendung als Enzymsubstrat wurde zu dieser Zeit nicht berichtet.
- 4-Methylumbelliferyl-β-D-ribofuranosid (4-MU-BDRF) ist seit 1995 im Handel von Glycosynth (Warrington, UK) erhältlich. Der aus 4-MU gebildete Indikator ist fluorimetrisch nachweisbar und nicht unter Verwendung von sichtbarem einfallendem Licht oder durch das Auge nachweisbar.
- In der WO 97/31008 beschreiben Schramm et al. die Synthese und Verwendung einiger BDRF- und BDRF-Phosphatsubstrate für den Nachweis von Parasiten in biologischen Proben. Dieses Verfahren beinhaltet den Nachweis von Nucleosidhydrolase- oder Nucleosidphosphorylase-Aktivität in der Probe. Die Substrate sind chromogen oder fluorogen. Ein Beispiel ist 4-MU-BDRF. Schramm et al. offenbaren auch p-Nitrophenyl-β-D-ribofuranosid. Dieses Substrat wurde nicht gegen Bakterien, Hefe oder deren Enzyme getestet. p-Nitrophenyl-β-D-ribofuranosid-5-phosphat wurde gegen eine N-Ribohydrolase aus E. coli, nämlich AMP-Nucleosidase, getestet, und es wurde gefunden, dass es inaktiv war.
- Zusätzlich ist keines der oben beschriebenen BDRF-Substrate ideal zur Verwendung in plattierten (festen) Medien geeignet, da sie stark diffundieren oder im Fall von 1-Naphthyl-BDRF eine Nachinkubations-Kupplungstechnik erfordern würden, um einen farbigen Niederschlag zu bilden. Um die Nützlichkeit von β-D-Ribofuranosid für die Identifikation von Mikroben auf festen Medien (z.B. Agar) zu etablieren, benötigten wir deshalb ein Substrat, das eine hoch lokalisierte Enzymaktivität zeigen würde.
- Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität auf einem festen Medium bereit, welches einschließt:
- a) In-Kontakt-Bringen auf einem festen Medium eines chromogenen β-D-Ribofuranosids, das eine β-D-Ribofuranosylgruppe und einen chromogenen Teil umfasst, wobei der chromogene Teil durch β-D-Ribofuranosidase von der β-D-Ribofuranosylgruppe abspaltbar ist, was ein chromogenes Produkt freisetzt und einen Indikator bildet, der das chromogene Produkt ist oder daraus gebildet wird und im Wesentlichen in dem festen Medium nicht diffundierfähig ist, mit einer Substanz, von der man vermutet, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktivität enthält,
- b) Detektieren, ob β-D-Ribofuranosidase-Aktivität anwesend ist, durch Bestimmen, ob der Indikator gebildet wird.
- β-D-Ribofuranosidase-Aktivität ist eine Enzymaktivität, die β-D-Ribofuranosylgruppen abspalten kann.
- Es ist ein Vorteil dieser Erfindung, dass sich der im Wesentlichen nichtdiffundierfähige Indikator bildet, direkt nachdem das chromogene β-D-Ribofuranosid mit der Substanz in Kontakt gebracht worden ist, von der vermutet wird, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktivität enthält, d.h. dass ein Nachinkubationsschritt nicht erforderlich ist. Der abgespaltene chromogene Teil, als chromogenes Produkt bezeichnet, kann den Indikator bilden. Alternativ kann es jedoch erforderlich sein, dass das chromogene Produkt mit einem Entwickler, einer weiteren Substanz, die benötigt wird, um die Bildung des farbigen, im Wesentlichen nicht-diffundierfähigen Indikators zu bilden, in Kontakt gebracht wird. Deshalb kann das oben beschriebene Verfahren auch das In-Kontakt-Bringen des chromogenen Produkts mit einem Entwickler beinhalten, der für die Bildung des Indikators erforderlich ist. Die Wirkung des Entwicklers ist bevorzugt rasch und gleichzeitig mit dem Prozess des Verfahrensschritts a) und erfordert nicht eine Änderung der Bedingungen.
- Es wird in Betracht gezogen, dass das Verfahren dieser Erfindung für Substanzen nützlich ist, von denen vermutet wird, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktiviät enthalten, welche aus einer Vielfalt von Quellen erhalten wurden. Es wird insbesondere in Betracht gezogen, dass das oben beschriebene Verfahren durchgeführt wird, wobei die Substanz, von der vermutet wird, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktivität enthält, eine Substanz mikrobiellen Urspungs, bevorzugt bakteriellen Ursprungs, umfasst. Bei einer solchen Vorgehensweise kann das oben beschriebene Verfahren einen vorgeschalteten Schritt des Züchtens von Mikroben auf dem festen Medium einschließen.
- Es wird im Allgemeinen erwartet, dass das chromogene β-D-Ribofuranosid in dem festen Medium in einem vorgeschalteten Schritt des Züchtens der Mikroben auf dem festen Medium und in Schritt a) vorliegt. In einer Ausführungsform, die einen Entwickler erfordert, um den abgespaltenen chromogenen Teil zur Bildung eines farbigen, im Wesentlichen nicht-diffundierfähigen Indikators zu kontaktieren, wird es im Allgemeinen erwartet, dass dieser ebenfalls in dem festen Medium vorliegt. Es ist möglich, dass das chromogene β-D-Ribofuranosid und jeglicher erforderliche Entwickler zu der Oberfläche des festen Mediums im Verfahren dieser Erfindung gegeben werden, aber bevorzugt sind sie in dem ganzen festen Medium verteilt.
- Die im Wesentlichen nicht-diffundierfähigen Indikatoren, die durch das Verfahren dieser Erfindung erzeugt werden, sind farbig. Als Ergebnis ist der Indikator mit dem Auge zu sehen, bevorzugt unter Verwendung von sichtbarem einfallendem Licht. Ein Fachmann versteht, dass dies ein Vorteil ist, da der Detektionsschritt b) rasch und leicht durchgeführt werden kann.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität bereit, welches umfasst
- a) In-Kontakt-Bringen eines chromogenen β-D-Ribofuranosids, das eine β-D-Ribofuranosylgruppe und einen chromogenen oder fluorogenen Teil umfasst, mit einer Probe, die eine Substanz bakteriellen Ursprungs umfasst, von der vermutet wird, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktivität enthält,
- b) Detektieren, ob β-D-Ribofuranosidase-Aktivität anwesend ist, durch Detektieren der Anwesenheit eines Indikators, der aus dem abgespaltenen chromogenen Produkt gebildet ist.
- In diesem Verfahren kann der chromogene Teil jede Gruppe umfassen, die (im sichtbaren Spektrum) für einen nachweisbaren Unterschied zwischen der gespaltenen und ungespaltenen Einheit sorgt. Es wird bevorzugt, dass dieses Verfahren auf einem festen Medium durchgeführt wird und der chromogene Indikator im Wesentlichen nicht-diffundierfähig ist. Es wird bevorzugt, dass das Produkt mit dem Auge nachgewiesen wird, aber andere spektroskopische Mittel, die sichtbares Licht detektieren, können verwendet werden.
- Bei beiden Aspekten dieser Erfindung wird es, wenn die β-D-Ribofuranosidase-Aktivität bakteriellen Ursprungs ist, bevorzugt, dass die Bakterien aus der Gattung Yersinia, der Gattung Shigella, der Gattung Vibrio und Corynebacterium diphtheriae und Arcanobacterium haemolyticum ausgewählt sind. Es ist wichtig, dass diese Bakterien erfolgreich nachgewiesen werden können, da Yersinia enterocolitica Diarrhöe verursachen kann und es derzeit keine kommerziellen Medien gibt, welche Enzymsubstrate enthalten, die sie nachweisen und von ähnlichen Spezies unterscheiden können. Shigella-Arten können Ruhr verursachen, Vibrio-Arten sind bei Nahrungsmittelvergiftung von Bedeutung und können Cholera verursachen und Corynebacterium diphtheriae verursacht Diphtherie.
- Nach der Enzymaktivität bildet der abgespaltene chromogene Teil direkt einen farbigen, z.B. nicht-diffundierfähigen Indikator. Der chromogene Teil dieser Verbindungen ist aus einem 1,2-Dihydroxybenzol, bevorzugt einem Brenzcatechin-Rest, einer Cyclohexenoäsculetin-Einheit oder einer anderen Äsculetin-Einheit oder einer Alizarin-Einheit, einer Indoxyl-Einheit oder einer p-Naphtholbenzein-Einheit und de ren Derivaten ausgewählt. Ein Brenzcatechin-Rest in der vorliegenden Beschreibung ist eine Einheit, die aus der Entfernung eines oder beider hydroxylischer Wasserstoffatome aus einem 1,2-Dihydroxybenzol oder einem substituierten Derivat desselben hervorgeht, das bevorzugt mit einer derivatisierenden Einheit substituiert ist, welche mit dem aromatischen Ring des Brenzcatechins über eine Bindung verknüpft ist, aber Verbindungen mit Ringen ausschließt, die an den 1,2-Dihydroxybenzol-Ring kondensiert sind, wie in einer Äsculetin- oder Alizarin-Verbindung. Wenn der chromogene Teil aus Brenzcatechin oder einem Brenzcatechin-Derivat gebildet ist, in dem eine derivatisierende Einheit mit dem Brenzcatechin-Ring über eine Bindung verknüpft ist, kann der chromogene Teil zum Beispiel aus einer Dihydroxybenzaldehyd-, Dihydroxybenzophenon-, Dihydroxyflavonoid-, Dihydroxyauron- oder Dihydroxychalcon-Struktur gebildet sein.
- Die Ribofuranoside werden durch eine Kondensationsreaktion zwischen der Ribofuranose in geeignet geschützter Form und der Vorstufe des chromogenen Teils, der eine freie Hydroxylgruppe aufweist, unter Erzeugung einer Glycosid-Verknüpfung hergestellt. Im Allgemeinen war bei der Kondensation der β-D-Ribofuranose und dem chromogenen Teil das Sauerstoff-Atom, das in der Verknüpfung beibehalten wird, ursprünglich ein Teil des Ausgangsmaterials, das den chromogenen Teil entstehen lässt.
- Wenn der chromogene Teil des chromogenen β-D-Ribofuranosids aus einem 1,2-Dihydroxybenzol, insbesondere einem Brenzcatechin oder Brenzcatechin-Derivat, gebildet wird, kann ein Metallion als Entwickler verwendet werden. Das Metallion wird durch den abgespaltenen chromogenen Teil chelatisiert, was einen farbigen, im Wesentlichen nicht-diffusionsfähigen Indikator erzeugt. Besonders bevorzugte chelatisierbare Metallion-Verbindungen sind Eisensalze, Aluminiumsalze und Bismutsalze.
- Das chromogene Enzymsubstrat kann durch die folgenden Formelndargestellt werden, worin Y und R Einheiten sind, welche die Enzymspaltung oder Bildung des Indikators nicht stören, und Z1, Z2, Z3 und Z4 jeweils für H oder eine β-D-Ribofuranosylgruppe stehen, mit der Maßgabe, dass Z1 und Z2 oder Z3 und Z4 nicht gleichzeitig H sind.
- Eine β-D-Ribofuranosylgruppe Z weist die folgende Struktur auf:worin VW die Verknüpfung mit dem phenolischen Sauerstoff oben in der allgemeinen Formel I oder II anzeigt.
- In einer Ausführungsform sind Y und R organische Einheiten, die weniger als 40 Atome, bevorzugt weniger als 30 Atome und bevorzugter weniger als 20 Atome enthalten.
- In den obigen Strukturen kann Y eine organische Einheit sein. Bevorzugt umfasst Y eine substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylgruppe, die 5 bis 18 Ringatome enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Y eine organische Einheit mit einer Kernstruktur V oder VI,wobei die Strukturen, wie gezeigt, an den Brenzcatechin-Ring geknüpft sind. Kernstruktur in dieser Beschreibung bedeutet das Gerüst von Y, und dieses kann weiter substituiert sein.
- Es wird bevorzugt, dass Y die Struktur VII oder VIII aufweist,worin (R5)n, (R6)n, (R7)n und (R8)n jeweils mehr als einen Nicht-Wasserstoff-Substituenten darstellen und =O einschließen können. R5, R6, R7 und R8 sind Substituenten, welche die Enzymwirkung oder Metallionen-Chelatisierung nicht stören. n ist bevorzugt 0, 1 oder 2.
- Die bevorzugten Ausführungsformen von Y werden durch die Strukturen IX und X dargestellt,worin (R9)n und (R11)n einen oder mehrere Substituenten darstellen und R10 und R12 jeweils Wasserstoff oder ein Substituent sind, welche alle die Enzymwirkung oder die Metallionen-Chelatisierung nicht stören.
- In Ausführungsformen, in denen (R6)n, (R8)n, (R9)n und (R11)n mehr als einen Substituenten darstellen, der =O einschließt, sind die Bindungen des Rings umgeordnet. R9 und R1 sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl-, C1-24-Alkyl-, C2-24-Alkenyl-, C1-6-Alkoxy-, Acyl-, einschließlich -CHO und COPhe, worin Phe Phenyl ist, =O, Halogen-, Nitro-, Aryl- und Acyloxygruppen. Alkyl- und Arylgruppen können mit Amino-, Hydroxyl-, Peptid-, Acyloxy-, Alkoxy-, -CONH2-, CONHR1- und NHCOR1-, worin R1 eine Alkyl- oder Arylgruppe ist, und Arylgruppen substituiert sein. R10 und R12 sind aus den gleichen Gruppen wie R9 und R11 und zusätzlich aus Wasserstoff ausgewählt. Bevorzugt sind R9, R10, R11 und R12 aus C1-4-Alkoxy ausgewählt.
- In den obigen Strukturen kann R für H, C1- bis C6-Alkyl-, -Alkoxy- und -Hydroxyalkyl-, Halogen-, Nitro-, Acyl-, Aryl- und Amidogruppen stehen, oder zwei benachbarte Gruppen R können unter Bildung eines kondensierten Ringsystems mit dem in den Formeln I und II gezeigten Ring verknüpft sein, wobei ein derartiger kondensierter Ring im Allgemeinen einen aromatischen Charakter aufweist und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome einschließt. Bevorzugt ist jede Gruppe R monofunktionell, d.h. ist nicht mit irgendeiner anderen Gruppe R verknüpft d.h. die Verbindung ist ein Brenzcatechin.
- Das chromogene β-D-Ribofuranosid ist bevorzugt aus Brenzcatechin-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, Quercetin-4'-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxychalcon-4-β-D-ribofuranosid, 4-Nitrobrenzcatechin-1-β-D-ribofuranosid, 3,3',4'-Trihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxyauron-4'-β-D-ribofuranosid und 3-Indolyl-β-D-ribofuranosiden mit einem oder mehreren Halogen- oder Nitro-Substituenten und/oder N-Niederalkyl-Substituenten ausgewählt.
- Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung stellt neue chromogene β-D-Ribofuranosid-Enzymsubstrate bereit, in denen die chromogene Einheit ein 1,2-Dihydroxybenzol-Rest ist. In dem Substrat wird eines oder werden beide der hydroxylischen Sauerstoffatome des Rests verwendet, um an eine β-D-Ribofuranosylgruppe zu binden. Diese neuen Verbindungen können durch die vorstehenden Formeln I und II dargestellt werden, mit der Maßgabe, dass Y nicht eine substituierte Alkylgruppe ist, wenn alle Gruppen R für H stehen. In einer bevorzugten Klasse von neuen Substraten sind die Verbindungen Brenzcatechine, in denen keine zwei Gruppen R kondensiert sind.
- Bevorzugte neue chromogene β-D-Ribofuranoside weisen die Strukturformel I oder II auf, wie oben beschrieben, in denen Y die Strukturformel V, VI, VII, VIII, IX oder X aufweisen kann.
- Bevorzugte neue chromogene β-D-Ribofuranoside weisen einen Brenzcatechin-Rest auf, der aus einem Brenzcatechin, Nitrobrenzcatechin, Dihydroxyflavonoid, wie Dihydroxyflavon, Dihydroxyisoflavon, Dihydroxyflavanon, Dihydroxyisoflavanon, Dihydroxyflavan, Trihydroxyflavan oder Dihydroxyisoflavan, Dihydroxyauron, Dihydroxychalcon, Dihydroxybenzaldehyd, Dihydroxybenzophenon oder Dihydroxybenzaldehydsemicarbazon oder Quercetin oder deren Derivaten gebildet ist. Quercetin wird auch als 3,5,7,3',4'-Pentahydroxyflavon bezeichnet.
- Besonders bevorzugte neue Verbindungen umfassen Brenzcatechin-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, Quercetin-4'-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxychalcon-4-β-D-ribofuranosid, 4-Nitrobrenzcatechin-1-β-D-ribofuranosid, 3,3',4'-Trihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxy-3-C1-6-alkoxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid und 3',4'-Dihydroxyauron-4'-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxybenzaldehydsemicarbazon-4-β-D-ribofuranosid und deren Derivate.
- Ein allgemeines Schema für die Synthese eines Substrats, das einen Brenzcatechin-Rest umfasst, beinhaltet, dass β-D-Ribofuranose mit geschützten Hydroxylgruppen mit Brenzcatechin oder einem Brenzcatechin-Derivat zusammengemischt wird, um das Brenzcatechin(derivativ)-β-D-ribofuranosid zu bilden. Gegebenenfalls können weiter derivatisierende Einheiten an den Brenzcatechin-Rest addiert werden. Das Produkt wird von Schutzgruppen befreit, und das chromogene Enzym-Substrat wird gereinigt. Indoxylribofuranoside können durch ein analoges Verfahren hergestellt werden. Ein spezielles Beispiel ist das nachstehende Beispiel 4.
- β-D-Ribofuranoside auf der Basis von 1,2-Dihydroxybenzol-Resten können als Hydrat oder in Form eines geeigneten Salzes erzeugt werden. Die Salzen könnten entweder von Metall- oder von organischen Ionen abgeleitet sein.
- Die Komponenten, die zur Durchführung der Verfahren dieser Erfindung erforderlich sind, können als Kit von Komponenten bereitgestellt werden. Ein derartiges Kit würde ein chromogenes β-D-Ribofuranosid einschließen, das eine β-D-Ribofuranosyl-Gruppe und einen chromogenen Teil umfasst, welcher, wenn er abgespalten wird, direkt einen farbigen, im Wesentlichen nicht-diffundierfähigen Indikator bildet. Alternativ würde ein derartiges Kit ein chromogenes β-D-Ribofuranosid einschließen, das, wenn es durch Bakterien oder eine Substanz bakteriellen Ursprungs gespalten wird, einen nachweisbaren Indikator erzeugt.
- Ein derartiges Kit von Komponenten könnte auch einen Entwickler umfassen. Der Fachmann wird anerkennen, dass es nützlich wäre, ein festes Medium zu er zeugen, welches das Wachstum von Mikroben unterstützen kann und die oben erwähnten Kit-Komponenten umfasst. Deshalb können die oben beschriebenen Kits auch Komponenten einschließen, die erforderlich sind, um das feste Medium zu erzeugen. Die Kit-Komponenten können getrennt oder in verschiedenen Kombinationen abgepackt sein, abhängig von den Anforderungen des durchzuführenden Analyseverfahrens.
- Es kann nützlich sein, dass die beim Nachweis der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität verwendeten Medien andere Komponenten enthalten, welche eine andere Enzymaktivität detektieren oder bezüglich spezifischer Mikroben selektieren. Deshalb können Kits dieser Erfindung auch derartige Verbindungen enthalten.
- Die Beschränkungen der Verwendung eines Substrats, das ein diftundiertähiges Endprodukt nach Hydrolyse auf einem festen Medium erzeugt, sind dem Fachmann bekannt. Der Erfinder hat die Nützlichkeit der nicht-diffundierfähigen Indikatoren dieser Erfindung demonstriert. Zum Beispiel wurde eine Kulturplatte präpariert, die festes Medium und das chromogene Enzymsubstrat 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid zusammen mit Eisen(III)-Ionen enthielt. Eine Kultur, die etwa gleiche Zahlen von Escherichia coli (β-D-Ribofuranosidase-positiv) und Actinobacter Iwoffii (β-D-Ribofuranosidase-negativ) enthielt, wurde auf dem Medium gezüchtet. E. coli erzeugte aufgrund der Hydrolyse von 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid intensiv schwarze Kolonien, und es gab wenig oder keine Diffusion des farbigen Indikators von diesen Kolonien weg. Die A. Iwoffii-Kolonien waren farblos. Es war möglich, die zwei Spezies zu unterscheiden, selbst wenn die Kolonien praktisch zusammenfielen.
- Beispiel 1
- Dieses Beispiele liefert Syntheseverfahren für mehrere chromogene β-D-Ribofuranoside.
- Beispiel 1.1 Synthese von 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid-Natriumsalz (DHF-Ribosid)
- Ein 50 ml-Rundkolben, der mit einem Stopfen und einem Magnetrührer ausgestattet ware, wurde mit 3',4'-Dihydroxyflavon (DHF) (Lancaster Synthesis Ltd, Lancashire, UK) (500 mg), β-D-Ribofuranosetetraacetat (640 mg), 3 Å-Molekularsieben (5,2 g) und Dichloromethan (20 ml) beschickt. Die Mischung wurde 15 min gerührt, dann wurde der Bortrifluorid-Diethyletherat-Katalysator (2,0 ml) in einer Portion dazugegeben. Das Rühren wurde weitere 20 min fortgesetzt, dann wurde die Reaktionsmischung in gesättigte Natriumbicarbonat-Lösung (150 ml) gegossen. Die organische Schicht wurde durch Zugabe von mehr Dichloromethan (30 ml) verdünnt und dann in einem Scheidetrichter von der gelben wässrigen Schicht abgetrennt. Die organische Schicht wurde dann elfmal mit einem gleichen Volumen an gesättigter organischer Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen, dann eine Stunde über Magnesiumsulfonat getrocknet. Nach Entfernung des Trocknungsmittels lieferte das Verdampfen des Dichloromethans das Glycosidtriacetat als dunklen Gummi (390 mg). Zu diesem Gummi (315 mg) wurde eine Natriummethanolat-Lösung gegeben, die durch Lösen von Natrium (50 mg) in Methanol (5 ml) hergestellt worden war. Nach Rühren für einige Minuten löste sich der Gummi, und die Lösung wurde 16 Stunden bei Umgebungstemperatur belassen. Die Lösung wurde dann durch Eindampfen auf ein Volumen von etwa 2 ml konzentriert, wonach die Zugabe von Diethylether (10 ml) verursachte, dass das Produkt ausfiel. Es wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und dann nach Waschen mit Diethylether (20 ml) in vier Portionen sofort in einen Exsikkator überführt und zwei Stunden unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das so erhaltene Produkt war ein gelbes Pulver. (201 mg).
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- Beispiel 1.2 Synthese von Brenzcatechin-β-D-ribofuranosid-Natriumsalz (2-Hydroxyphenyl-R-D-ribofuranosid-Natriumsalz)
- Ein 500 ml-Rundkolben, der mit einem Magnetrührer ausgerüstet war, wurde mit Brenzcatechin (33 g), 3 Å-Molekularsieben (20 g) und Dichloromethan (200 ml) beschickt. Die Lösung, die sich bildete, wurde 10 Minuten gerührt, dann wurde Bortrifluorid-Diethyletherat (10 ml) in einer Portion dazugegeben. Nach einer Stunde wurde die Reaktonsmischung filtriert, dann wurde sie in einem Scheidetrichter nacheinander mit gleichen Volumina an gesättigtem Natriumbicarbonat (fünfmal) und deionisiertem Wasser (zweimal) gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des Trocknungsmittels und Eindampfen lieferte ein hellgelbes Öl, das sich langsam verfestigte. Der Festkörper wurde in heißem denaturiertem Industriealkohol (IMS) (50 ml) gelöst und dann 16 Stunden bei 4 °C aufbewahrt, um die Vervollständigung der Kristallisation zu ermöglichen. Der weiße Festkörper wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und mit IMS (20 ml) in zwei Portionen gewaschen. Nach eintägiger Trocknung an Luft betrug die Ausbeute an geschütztem Ribosid 17,1 g. Das geschützte Ribosid (15 g) wurde in Methanol (150 ml) suspendiert, und eine Lösung, die aus Natrium (2 g) in Methanol (50 ml) hergestellt worden war, wurde dazugegeben. Anfänglich löste sich der Festkörper, aber dies wurde bald durch einen starken Niederschlag ersetzt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden beiseite gestellt. Der Festkörper wurde dann durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Methanol (5 ml) gewaschen. Der hygroskopische Festkörper wurde dann sofort in einen Exsikkator überführt und 6 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ausbeute an weißem Pulver betrug 4,3 g.
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- Beispiel 1.3 Synthese von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosidtriacetat
- In einen 3 I-Rundkolben, der mit einem Magnetrührer ausgestattet war, wurden 3,4-Dihydroxybenzaldehyd (50 g), β-D-Ribofuranosetetraacetat (47 g), 3 Å-Molekularsiebe (350 g) und Dichloromethan (1,4 l) gegeben. Nach fünfminütigem Rühren dieser Mischung wurde Bortrifluorid-Diethyletherat (75 ml) in einer Portion dazugegeben, und das Rühren wurde dann weitere 20 Minuten fortgesetzt, wonach die Molekularsiebe durch Filtration entfernt wurden. Das Filtrat wurde viermal mit einem gleichen Volumen an gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, 1 Stunde über Magnesiumsulfat getrocknet, dann zur Trockne eingedampft. Der rückständige hellgelbe Festkörper wurde in heißem IMS (70 ml) gelöst und 6 Stunden bei 4 °C aufbewahrt. Das Produkt wurde durch Filtration geerntet. Trocknen über Phosphorpentoxid unter Vakuum lieferte 12,4 g eines weißlichen Festkörpers.
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- Beispiel 1.4 Synthese von 3 4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid-Natriumsalz
- Zu einer Mischung von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosidtriacetat (aus Beispiel 1.3) (5,0 g) in Methanol (25 ml) wurde eine Lösung von Natrium (0,5 g) in Methanol (20 ml) gegeben. Das Triacetat löste sich und wurde durch einen dichten Niederschlag ersetzt. Nach 5 Stunden wurde dieser unter Vakuum abfiltriert und auf dem Filter mit Methanol (5 ml) und Diethylether (10 ml) gewaschen. Vierstündiges Trocknen unter Vakuum über Phosphorpentoxid ergab das Produkt als hellen cremefarbigen Festkörper (3,1 g).
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- Beispiel 1.5 Synthese von 3 4-Dihydroxybenzaldehydsemicarbazon-4-β-D-ribofuranosid
- Zu einer Lösung von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid-Natriumsalz (aus Beispiel 1.4) (0,5 g) in deionisiertem Wasser (5 ml) wurde eine Lösung von Semicarbazidhydrochlorid (1 g) und Kaliumacetat (1,5 g) in Wasser (5 ml) gegeben. Die Mischung wurde in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten erwärmt, dann abkühlen gelassen. Nach Konzentrieren der Lösung auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens durch Eindampfen kristallisierte das Produkt aus. Es wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und nach Waschen mit Wasser (2 ml) in einem Ex sikkator in Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das Produkt war ein weißer Festkörper (300 mg).
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- Beispiel 1.6 Synthese von 3,4-Dihydroxychalcon-4-β-D-ribofuranosid
- Zu einer Lösung von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid-Natriumsalz (aus Beispiel 1.4) (0,25 g) in IMS wurden Natriumhydroxid (0,1 g) in deionisiertem Wasser (3 ml) und Acetophenon (0,1 g) gegeben. Die Mischung wurde 9 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Reaktion bis zur Trockne eingedampft wurde. Das Produkt wurde als roter Festkörper erhalten.
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- Beispiel 1.7 Synthese von 3',4'-Dihydroxyauron-4'-β-D-ribofuranosid
- Zu einer Mischung von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosidtriacetat (aus Beispiel 1.3) (0,4 g) und 3-Cumaranon (0,17 g) in IMS (20 ml) wurde eine Lösung von mit Chlorwasserstoff-Gas gesättigtem IMS (0,05 ml) gegeben. Die Mischung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der resultierende Festkörper wurde in Methanol (2 ml) gelöst, und eine Lösung von Natrium (50 mg) in Methanol (0,5 ml) wurde dazugegeben, was eine blutrote Lösung ergab. Diese Lösung wurde zur Trockne eingedampft und zwischen deionisiertem Wasser (25 ml) und Dichlormethan (50 ml) verteilt. Die wässrige Schicht wurde mit zwei weiteren Dichlormethan-Waschportionen (50 ml) extrahiert, bevor sie zur Trockne eingedampft wurde. Das Produkt wurde als roter Festkörper erhalten.
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- Beispiel 2
- Dieses Beispiel liefert eine Bewertung des Ribofuranosids von 3',4'-Dihydroxyflavon (hergestellt in Beispiel 1.1) (DHF-Ribosid).
- Das Ribofuranosid-Derivat von Dihydroxyflavon wurde mit 194 verschiedenen Bakterienstämmen getestet. Die Wahl der Bakterien schloss einen großen Bereich ein, von denen viele wichtige Pathogene oder Kommensalen sind, die üblicherweise aus pathologischen Proben isoliert werden.
- Das chromogene β-D-Ribofuranosid-Substrat wurde in einer Substratkonzentration von 300 mg/l zu Columbia-Agar gegeben. Eisen(III)-ammoniumcitrat wurde zu 500 mg/l eingeschlossen. Alle Bestandteile wurden 20 Minuten bei 116 °C autoklaviert, um eine Sterilisation sicherzustellen. Agarplatten wurden dann in 90 mm-Petrischalen präpariert. Das Substrat verursachte eine Gelbfärbung des Agars.
- Bei jedem getesteten Stamm wurde eine Bakteriensuspension in sterilem deionisiertem Wasser bei einem Inokulum von etwa 1,5 × 108 Kolonien bildenden Einheiten pro ml hergestellt. Dies wurde unter Verwendung eines Densitometers erzielt. 1 μl jeder Bakteriensuspension wurde dann unter Verwendung eines Multipunkt-Inokulators auf jede Platte geimpft. Die Stämme wurden parallel auf Columbia-Agar geimpft, der Eisen(III)-ammoniumcitrat ohne Substrat enthielt (negative Kontrolle).
- Nach 18-stündiger Inkubation wurden die Stämme visuell bezüglich der Anwesenheit von Farbe überprüft. Alle Stämme, die eine schwarze Farbe auf Substrat enthaltenden Medien, aber nicht auf den negativen Kontrollplatten produzierten, wurden als das Substrat hydrolysierend bewertet.
- Von 120 getesteten Gram-negativen Bakterien hydrolysierten 68,3 % DHF-Ribosid. Diejenigen, die positiv waren, erzeugten ein klar sichtbares schwarzes Chelat von 3',4'-Dihydroxyflavon und Eisen(III)-ammoniumcitrat, das ohne Diffusion in den umgebenden Agar auf die Bakterienkolonien beschränkt verblieb. Der Nachweis von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität ermöglichte, dass Unterscheidungen zwischen nahe verwandten Gattungen oder Arten getroffen wurden. Die meisten der getesteten Enterobacteriaceae waren bezüglich der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität stark positiv. Eine Ausnahme war Yersinia enterocolitica, ein Pathogen, das eine Ursche von Enteritis ist. Dieses Substrat könnte eine nützliche Rolle zur Unterscheidung dieser Art von nahe verwandten Bakterien spielen. Die Tatsache, dass die Gattung Shigella gleichförmig bezüglich der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität positiv war, war ebenfalls bemerkenswert. Keine der Glycosidasen, die üblicherweise in der diagnostischen Mikrobiologie durchsucht werden, werden gleichförmig von Arten von Shigella produziert, und dies ist ein begrenzender Faktor beim Entwurf von Verfahren für deren Nachweis. Diese Erfindung kann eine Unterscheidung zwischen Shigella und nahe verwandten Arten, wie Proteus, ermöglichen.
- Ein weiterer Punkt von Interesse unter den Aktivitäten von Gram-negativen Bakterien betrifft die Vibrionaceae. Derzeitig erhältliche Kulturmedien für den Nachweis von Vibrio-Arten erlauben nicht die Unterscheidung von Aeromonas-Arten, die üblicherweise in der Umgebung gefunden werden und mit Vibrio sehr eng verwandt sind. Die meisten der hier getesteten Vibrio-Arten, einschließlich der zwei Hauptpathogene V. cholerae und V. parahaemolyticus, exprimieren β-D-Ribofuranosidase nicht. Dies steht im Gegensatz zu Aeromonas-Arten, die hoch aktiv sind. Diese Erfindung kann ein einfaches Mittel zur Unterscheidung zwischen diesen zwei nahe verwandten Arten bereitstellen.
- Unter den getesteten Gram-positiven Bakterien waren nur 30,8 % mit diesem Substrat aktiv. Alle Staphylokokken waren positiv, aber es gab keine Unterscheidung zwischen den verschiedenen Arten von getesteten Staphylokokken. Streptokokken waren nahezu universell negativ, während Enterokokken ('fäkale Streptokokken') in ihrer Aktivität variabel waren. Der Hauptpunkt des Interesses war, dass Corynebacterium diphtheriae und Arcanobacterium haemolyticum mit diesem Substrat aktiv waren. Beide diese Arten werden im Hals von infizierten Menschen gefunden, und Halskulturen werden deshalb durchgeführt, um diese Pathogene zu isolieren und zu identifizieren. Die aerobe kommensale Flora des Halses wird von Streptokokken dominiert, und DHF-Ribosid dieser Erfindung kann ein Mittel zur Unterscheidung dieser zwei Pathogene von der normalen kommensalen Flora des Halses bereitstellen.
- TABELLE 1: Hydrolyse von 3',4'-Dihydroxyflavon-β-ribofuranosid durch Gram-negative Bakterien
- TABELLE 1 Fortsetzung: Hydrolyse von 3',4'-Dihydroxyflavon-β-ribofuranosid durch Gram-negative Bakterien
- TABELLE 1 Fortsetzung: Hydrolyse von 3',4'-Dihydroxyflavon-β-ribofuranosid durch Gram-negative Bakterien
- Abkürzungen:
-
-
- NCTC
- National Collection of Type Cultures (UK)
- ATCC
- American Type Culture Collection
- Schlüssel
-
-
- +
- positive Reaktion mit dem Substrat
- ++
- starke positive Reaktion mit dem Substrat
- –
- keine nachweisbare Reaktion
- TABELLE 2: Hydrolyse von 3',4'-Dihydroxyflavon-β-ribofuranosid durch Gram-positive Organismen
- TABELLE 2 Fortsetzung: Hydrolyse von 3',4'-Dihydroxyflavon-β-ribofuranosid durch Gram-positive Organismen
- Schlüssel
-
-
- +
- positive Reaktion mit dem Substrat
- ++
- starke positive Reaktion mit dem Substrat
- –
- keine nachweisbare Reaktion
- Beispiel 3
- Weitere Substrate für den Nachweis der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität wurden getestet.
- Es wurden die gleichen Bewertungsverfahren verwendet, wie sie oben in Beispiel 2 beschrieben wurden.
- i) 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-ribofuranosid (hergestellt in Beispiel 1.4) Dunkelbraune Kolonien, die β-D-Ribofuranosidase-Aktivität anzeigten, waren bei S. sonnei und K. pneumoniae sichtbar. Eine schwächere Reaktion und demgemäß hellere Kolonien wurden bei E. coli und E. aerogenes gesehen. Um alle positiven Kolonien war eine kleine Diffusionszone sichtbar. Die β-D-Ribofuranosidase-negativen Stämme zeigten keine Anzeichen von Aktivität und bildeten cremefarbene Kolonien.
- ii) 3',4'-Dihydroxyauron-4'-β-ribofuranosid (hergestellt in Beispiel 1.7) Wie in den vorangehenden Tests wurde eine Auswahl von β-D-Ribofuranosidase-positiven und -negativen Stämmen auf Agarplatten geimpft und inkubiert. Positive Stämme erzeugten hellbraune Kolonien, was nur eine schwache Reaktion anzeigte.
- iii) 3,4-Dihydroxybenzaldehydsemicarbazon-4-β-ribofuranosid (hergestellt in Beispiel 1.5)
- Wie in den vorangehenden Tests wurde eine Auswahl von β-D-Ribofuranosidase-positiven und -negativen Stämmen auf Agarplatten geimpft und inkubiert. Nach Inkubation wuchsen alle β-D-Ribofuranosidase-positiven Organismen als diffuse braune Kolonien und nicht-β-D-Ribofuranosidase-erzeugende Organismen wuchsen als cremefarbene Kolonien.
- Die Ergebnisse dieser Tests sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt.
- TABELLE 3 Bewertung von chromogenen Ribosid-Substraten bezüglich Bakterienwachstums und Kolonienaussehen
- Schlüssel:
- Beispiel 4
- Synthese von 5-Bromchlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (X-β-D-ribofuranosid)
- Die Reaktion wurde in einem 500 ml-Zweihalskolben durchgeführt, der mit einem Magnetrührer ausgestattet war.
- Zu einer Mischung von 2,3,5-Tri-O-acetyl-α/β-D-ribofuranosyltrichloracetimid [I. Chiu-Machado et al., (1995), J. Carbohydrate. Chem. 14, 551 ff.] (145,0 g) und 3 Å-Molekularsieben (2,0 g) in trockenem Dichlormethan (300 ml) wurde trockenes 1-Acetyl-5-brom-4-chlorindoxyl (X-OH) (82,9 g) gegeben, und die ganze Mischung wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt. TMS-Triflat (8 ml) wurde dann mittels einer Spritze in einer Portion dazugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren gelassen. Die Mischung wurde dann in Dichlormethan (3 l) gegossen und mit 1 M Natriumhydroxid (4 × 2 l) gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, durch Celite filtriert und im Vakuum auf ein geringes Volumen (etwa 1 l) konzentriert. Die organische Schicht wurde dann weiter mit 1 M Natriumhydroxid (6 × 1 l) und deionisiertem Wasser (1 l) gewaschen. Nach dem Trocknen (Magnesiumsulfat) wurde sie durch Celite filtriert und im Vakuum konzentriert, was das rohe geschützte Produkt als dunkelbraunen Festkörper lieferte (87,4 g).
- Der dunkelbraune Festkörper wurde mittels DSC überprüft, und es wurde gefunden, dass er zwei Hauptprodukte mit Rf-Werten von etwa 0,37 (das geschützte β-Ribofuranosid) und 0,43 enthielt. [Kieselgelplatten, 60/80 Petrolether, Ethylacetat 1:1 Vol./Vol., UV bei 254 nm]. Flashchromatographie des Rohprodukts auf Kieselgel C60 (600 g) unter Verwendung von 60/80 Petrolether/Ethylacetat/Triethylamin 1:1:0,05 Vol./Vol./Vol. als Elutionslösungsmittel ergab das geschützte Produkt als braunes Öl (55 g). Das Öl war hauptsächlich eine Mischung des X-β-D-Ribofuranosidtetraacetats und der Verunreinigung mit Rf von 0,43. Dieses Öl wurde in warmem Methanol aufgenommen, und nach Belassen bei Umgebungstemperatur bildete sich ein Niederschlag. Nach 16 Stunden wurde der cremefarbene Festkörper, der nahezu vollständig aus Material mit einem Rf-Wert von 0,43 bestand, durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde bei 40 °C in Vakuum konzentriert, was X-β-D-Ribofuranosidtetraacetat als braunes Öl (33,6 g) lieferte.
- X-β-D-Ribofuranosidtetraacetat (30 g) wurde in Methanol (200 ml) gelöst, und 5 ml einer Natriummethanolat-Lösung (hergestellt aus 1 g Natrium in 20 ml Methanol) wurden dazugetropft, bis die Lösung pH 10 erreichte. Die Lösung wurde 90 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann im Vakuum zu einem braunen teerartigen Öl konzentriert. Das Öl wurde in Aceton (500 ml) digeriert. Ein grauer Festkörper fiel aus, und dieser wurde durch Vakuumfiltration entfernt. Der Festkörper wurde verworfen, und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem braunen Öl (19,3 g) konzentriert. Das Öl wurde mit Methanol (80 ml) digeriert, und das Produkt fiel als hellblauer Festkörper aus, der durch Filtration gewonnen wurde (2,57 g). Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und mit Methanol (30 ml) digeriert, wodurch man eine zweite Fraktion eines hellen cremefarbenen Festkörpers erhielt, der ebenfalls durch Filtration gewonnen wurde (4,04 g). Beide Fraktionen wurden vereinigt und mit kaltem Aceton (etwa 20 ml) gewaschen, gefolgt von Filtration, um die Titelverbindung als weißen Festkörper (etwa 2,5 g) zu gewinnen.
- Beispiel 5
- Vergleich der Eigenschaften von Substraten für β-D-Ribofuranosidase
- Die folgenden Medien wurden erzeugt, um die Nützlichkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Medium A (Komponenten pro Liter)
Columbia-Agar (Oxoid) 40 g 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 200 mg Columbia-Agar (Oxoid) 40 g 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid 300 mg 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 200 mg Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg Columbia-Agar (Oxoid) 40 g 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid 80 mg 3,4-Cyclohexenoäsculetin-β-D-galactopyranosid 300 mg Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 30 mg Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg Columbia-Agar (Oxoid) 40 g 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid 80 mg 3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon-4'-β-D-galactopyranosid 300 mg Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 30 mg Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg Columbia-Agar (Oxoid) 40 g 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid 80 mg Columbia-Agar (Oxoid) 40 g 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid 300 mg Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg - Alle Komponenten wurden in 1 Liter deionisiertes Wasser gegen und 10 Minuten bei 116 °C autoklaviert. Kulturplatten wurden aus geschmolzenem Agar bei 50 °C präpariert und getrocknet. Verschiedene Kontrollstämme mit bekannten enzymatischen Eigenschaften wurden bei einer Suspension von etwa 108 cfu/ml unter Verwendung eines Densitometers präpariert. 10 μl dieser Suspension wurden auf jede der verschiedenen Arten von Medien geimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
- Das Kulturaussehen der verschiedenen getesteten Stämme ist in Tabelle 4 gezeigt.
-
- Beispiel 6
- 3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid
- Das in der Überschrift gezeigte Substrat wurde aus 3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon (F.A.A. van Acker et al., J. Med. Chem., 43, 3752-3760, (2000)) durch ein zu Beispiel 1.1 analoges Verfahren synthetisiert.
- Das Substrat wurde unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens von Beispiel 2 bewertet, aber unter Verwendung eines Bereichs von verschiedenen Metallsalzen und unter Verwendung nur einer Kultur von E. coli. Die in der nachstehenden Tabelle 5 gezeigten Metallsalze wurden bei einer Konzentration von 500 mg/l verwendet. Tabelle 5 Tabelle 5: Bewertung von 3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid mit Metallsalzen, die Chelate bilden
Metall Farbe der Kolonien Zn Kein Wachstum Co Kein Wachstum Mn Hellorange Sn Gelb Ba Gelb Al Gelb Sr Gelb Bi Rostig orange Fe B rau n Kein Metall Diffus gelb - Als das Aluminiumsalz-haltige Medium mit einer gemischten Kultur von E. coli und Yersinia enterocolitica verwendet wurde, waren die E. coli-Kolonien leuchtend gelb und ragten sehr klar heraus. Es gab im Wesentlichen keine Diffusion in die Y. enterocolitica-Kolonien (negativ für dieses Substrat, daher farblos), selbst wenn die Kolonien beinahe zusammenfielen.
Claims (39)
- Verfahren zum Detektieren von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität auf einem festen Medium, welches umfasst a) In-Kontakt-Bringen auf einem festen Medium eines chromogenen β-D-Ribofuranosids, das eine β-D-Ribofuranosylgruppe und einen chromogenen Teil umfasst, wobei der chromogene Teil durch β-D-Ribofuranosidase von der β-D-Ribofuranosylgruppe abspaltbar ist, was ein chromogenes Produkt freisetzt und einen Indikator bildet, der das chromogene Produkt ist oder daraus gebildet wird und im Wesentlichen in dem festen Medium nicht diffundierfähig ist, mit einer Substanz, von der man vermutet, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktivität enthält, b) Detektieren, ob β-D-Ribofuranosidase-Aktivität anwesend ist, durch Bestimmen, ob der Indikator gebildet wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Substanz, von der vermutet wird, dass sie β-D-Ribofuranidase-Aktivität enthält, eine Substanz mikrobiellen Ursprungs umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 2, welches einen einleitenden Schritt des Züchtens von Mikroben auf dem festen Medium einschließt.
- Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, in dem die Substanz, von der vermutet wird, dass sie Enzymaktivität enthält, eine Substanz bakteriellen Ursprungs umfasst.
- Verfahren zum Detektieren von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität, welches umfasst a) In-Kontakt-Bringen eines chromogenen β-D-Ribofuranosids, das eine β-D-Ribofuranosylgruppe und einen chromogenen Teil umfasst, mit einer Probe, die eine Substanz bakteriellen Ursprungs umfasst, von der vermutet wird, dass sie β-D-Ribofuranosidase-Aktivität enthält, und b) Detektieren, ob β-D-Ribofuranosidase-Aktivität vorhanden ist, durch Detektieren der Anwesenheit eines Indikators, der aus dem abgespaltenen chromogenen Teil gebildet ist.
- Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, in dem die bakterielle Aktivitätsquelle ausgewählt ist aus der Gattung Yersinia, der Gattung Shigella, der Gattung Vibrio, Corynebacterium diphtheriae und Arcanobacterium haemolyticum.
- Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Verfahren auf einem festen Medium durchgeführt wird und der Indikator im Wesentlichen nicht diffundierfähig ist.
- Verfahren nach Anspruch 7, welches einen einleitenden Schritt des Züchtens der Bakterien auf dem festen Medium einschließt.
- Verfahren nach Anspruch 1, in dem das chromogene β-D-Ribofuranosid in dem festen Medium während des einleitenden Züchtungsschrittes anwesend ist.
- Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, welches auch das In-Kontakt-Bringen des chromogenen Produkts mit einem Entwickler zur Bildung des Indikators beinhaltet.
- Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 8, welches auch das In-Kontakt-Bringen des chromogenen Produkts mit einem Entwickler zur Bildung des Indikators beinhaltet, wobei der Entwickler in dem festen Medium in dem einleitenden Züchtungsschritt anwesend ist.
- Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem der im Wesentlichen nicht diffundierfähige Indikator unter Verwendung von sichtbarem einfallendem Licht sichtbar ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Substrat ein O-verknüpftes Ribofuranosyl-Derivat einer Hydroxyl-Verbindung ist, die aus 1,2-Dihydroxybenzol-Derivaten, Indoxylen und p-Naphtholbenzein und deren Derivaten ausgewählt ist.
- Verfahren nach Anspruch 13, in dem das Substrat ein O-β-D-Ribofuranosyl-1,2-dihydroxybenzol-Derivat ist.
- Verfahren nach Anspruch 14, in dem das chromogene β-D-Ribofuranosi durch eine der folgenden Formeln dargestellt wirdin denen Y und R Wasserstoff oder organische Gruppen sind, welche die Enzymspaltung oder Bildung des Indikators nicht stören, und jedes von Z1, Z2, Z3 und Z4 für H oder eine β-D-Ribofuranosyl-Einheit stehen kann, mit der Maßgabe, dass Z1 und Z2 oder Z3 und Z4 nicht gleichzeitig H sind.
- Verfahren nach Anspruch 15, in dem Y und R organische Einheiten sind, die weniger als 40 Atome, bevorzugt weniger als 30 Atome und bevorzugter weniger als 20 Atome enthalten.
- Verfahren nach Anspruch 15, in dem jedes R aus H, C1 bis C6-Alkyl-, -Alkoxy- und -Hydroxyalkyl-, Halogen-, Nitro-, Acyl-, Aryl- und Amidogruppen ausgewählt ist oder zwei benachbarte Gruppen R unter Bildung eines kondensierten Ringsystems mit dem in den Formeln I und II gezeigten Ring verknüpft sein können, wobei ein derartiger kondensierter Ring gegebenenfalls einen aromatischen Charakter aufweist und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome einschließt.
- Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, in dem der chromogene Teil eine Brenzkatechin-Einheit ist.
- Verfahren nach Anspruch 18, in dem der chromogene Teil eine Dihydroxybenzaldehyd-, Dihydroxybenzophenon-, Dihydroxyflavonoid-, Dihydroxyauron- oder Dihydroxychalcon-Struktur umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 17, in dem jedes R aus H, C1- bis C6-Alkyl-, -Alkoxy-, und -Hydroxyalkyl-, Halogen-, Nitro-, Acyl-, Aryl- und Amidogruppen ausgewählt ist, wobei die Gruppen R nicht miteinander verknüpft sind.
- Verfahren nach Anspruch 20, in dem Y eine substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylgruppe umfasst, die 5 bis 18 Ringatome enthält.
- Verfahren nach Anspruch 21, in dem Y die Struktur von IX oder Xaufweist, worin (R9)n und (R11)n einen oder mehrere Substituenten darstellen und R10 und R12 für H oder Substituenten stehen, welche alle die Enzymeinwirkung oder Metallionen-Chelatisierung nicht stören.
- Verfahren nach Anspruch 22, in dem jedes von R9 und R11 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl-, C1-24-Alkyl-, C2-24-Alkenyl-, C1-6-Alkoxy-, Acyl-, einschließlich -CHO- und COPhe-, worin Phe Phenyl ist, =O, Halogen-, Nitro-, Aryl- und Acyloxygruppen und n für 0, 1 oder 2 steht.
- Verfahren nach Anspruch 23, in dem R9 und R11 für C1-4-Alkoxy stehen.
- Verfahren nach Anspruch 22, in dem R10 und R12 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl-, C1-24-Alkyl-, C2-24-Alkenyl-, C1-6-Alkoxy-, Acyl-, einschließlich -CHO- und COPhe-, worin Phe Phenyl ist, =O, Halogen-, Nitro-, Aryl- und Acyloxygruppen.
- Verfahren nach Anspruch 13, in dem das chromogene β-D-Ribofuranosid aus Brenzkatechin-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, Quercetin-4'-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxychalcon-4-β-D-ribofuranosid, 4-Nitrobrenzkatechin-1-β-D-ribofuranosid, 3,3',4'-Trihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxy-3-C1-6-alkoxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid und 3',4'-Dihydroxy auron-4'-β-D-ribofuranosid, 3-Methoxy-3',4'-dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid ausgewählt ist.
- Verfahren nach Anspruch 10, in dem, wenn der chromogene Teil des chromogenen β-D-Ribofuranosids wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 26 definiert ist, der Entwickler ein Metallion, vorzugsweise Eisen, Aluminium oder Bismut, ist.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid, dargestellt durch eine der folgenden Formelnin denen Y und R Wasserstoff oder organische Gruppen sind und jedes von Z1, Z2, Z3 und Z4 für H oder eine β-D-Ribofuranosyl-Einheit stehen kann, mit der Maßgabe, dass Z1 und Z2 oder Z3 und Z4 nicht gleichzeitig H sind und Y nicht eine substituierte Alkylgruppe ist, wenn alle Gruppen R für H stehen.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid nach Anspruch 28, in dem Y und R organische Einheiten sind, die weniger als 40 Atome, bevorzugt weniger als 30 Atome und bevorzugter weniger als 20 Atome enthalten.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid nach Anspruch 29, in dem jedes R aus H, C1- bis C6-Alkyl-, -Alkoxy- und -Hydroxyalkyl-, Halogen-, Nitro-, Acyl-, Aryl- und Amidogruppen ausgewählt ist oder zwei benachbarte Gruppen R unter Bildung eines kondensierten Ringsystems mit dem in den Formeln I und II gezeigten Ring verknüpft sein können, wobei ein derartiger kondensierter Ring gegebenenfalls einen aromatischen Charakter aufweist und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome einschließt.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid nach irgendeinem der Ansprüche 28 bis 30, in dem jedes R für H oder eine monofunktionelle Gruppe steht.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid nach Anspruch 31, in dem Y eine substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylgruppe umfasst, die 5 bis 18 Ringatome enthält.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid nach Anspruch 32, in dem Y die Struktur IX oder Xaufweist, jedes von R9 und R10 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl-, C1-24-Alkyl-, C2-24-Alkenyl-, C1-6-Alkoxy-, Acyl-, einschließlich -CHO- und COPhe-, worin Phe Phenyl ist, =O, Halogen-, Nitro-, Aryl- und Acyloxygruppen, R10 und R12 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl-, C1-24-Alkyl-, C2-24-Alkenyl-, C1-6-Alkoxy-, Acyl-, einschließlich -CHO- und COPhe-, worin Phe Phenyl ist, =O, Halogen-, Nitro-, Aryl- und Acyloxygruppen und n für 0, 1 oder 2 steht.
- Verbindung nach Anspruch 31, umfassend: i) einen chromogenen Teil, der einen Brenzkatechinrest umfasst, der aus Brenzkatechin, Nitrobrenzkatechin, Dihydroxyflavonoid, wie Dihydroxyflavon, Dihydroxyisoflavon, Dihydroxyflavanon, Dihydroxyisoflavanonen, Dihydroxyflavan, Trihydroxyflavan oder Dihydroxyisoflavan, Dihydroxyauron, Dihydroxychalcon, Dihydroxybenz aldehyd, Dihydroxybenzophenon, Dihydroxybenzaldehydsemicarbazon oder Quercetin gebildet ist; ii) eine durch ein Enzym abspaltbare Gruppe, die β-D-Ribofuranosyl ist, das durch eine Ether-Verknüpfung an das Sauerstoffatom geknüpft ist, das von einer Hydroxylgruppe des Brenzkatechinrestes abstammt.
- Chromogenes β-D-Ribofuranosid nach Anspruch 34, in dem das chromogene β-D-Ribofuranosid aus Brenzkatechin-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, Quercetin-4'-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxybenzaldehyd-4-β-D-ribofuranosid, 3,4-Dihydroxychalcon-4-β-D-ribofuranosid, 4-Nitrobrenzkatechin-1-β-D-ribofuranosid, 3,3',4'-Trihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid, 3',4'-Dihydroxy-3-C1-6-alkoxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid und 3',4'-Dihydroxyauron-4'-β-D-ribofuranosid und 3,4-Dihydroxybenzaldehydsemicarbazon-4-β-D-ribofuranosid ausgewählt ist.
- Testsatz von Komponenten zur Verwendung bei der Detektion von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität auf festem Medium, welches das Wachstum von Mikroben unterstützen kann, umfassend ein chromogenes β-D-Ribofuranosid, welches eine β-D-Ribofuranosylgruppe und einen chromogenen Teil umfasst, wobei der chromogene Teil durch β-D-Ribofuranosidase von der β-D-Ribofuranosylgruppe abspaltbar ist, was das chromogene Produkt freisetzt, welches einen Indikator bildet, der das chromogene Produkt ist oder daraus gebildet wird und im Wesentlichen in dem festen Medium nicht diffundierfähig ist, und Komponenten, welche das feste Medium bilden können.
- Testsatz nach Anspruch 36, der auch einen Entwickler umfasst.
- Testsatz nach Anspruch 37, in dem der chromogene Teil des chromogenen β-D-Ribofuranosids wie in irgendeinem der Ansprüche 28 bis 32 beansprucht ist und der Entwickler ein Metallion, bevorzugt ein Eisensalz oder ein Aluminiumsalz oder ein Bismutsalz, ist.
- Testsatz nach irgendeinem der Ansprüche 36 bis 38, in dem das chromogene β-D-Ribofuranosid, feste Wachstumsmedium-Komponenten und irgendein Entwickler in Mischung vorliegen.
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