JPH093090A - 新規化合物ａ−７６２０２ｍ及びその製法 - Google Patents

新規化合物ａ−７６２０２ｍ及びその製法

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JPH093090A
JPH093090A JP15418995A JP15418995A JPH093090A JP H093090 A JPH093090 A JP H093090A JP 15418995 A JP15418995 A JP 15418995A JP 15418995 A JP15418995 A JP 15418995A JP H093090 A JPH093090 A JP H093090A
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spectrum
rhodococcus
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JP15418995A
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Inventor
Akira Takatsuki
昭 高月
Mutsuo Nakajima
睦男 中島
Osamu Ando
治 安東
Yasuyuki Takamatsu
安行 高松
Takeshi Kinoshita
武 木下
Hideyuki Haruyama
英幸 春山
Hisao Okazaki
尚夫 岡崎
Ryuzo Enokida
竜三 榎田
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Sankyo Co Ltd
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Sankyo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】下記式（Ｉ） で示される化合物。 【効果】化合物（Ｉ）は顕著な小胞体α−グルコシダー
ゼ阻害活性を有しており、抗ＡＩＤＳ薬、抗腫瘍薬等と
して有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の目的】
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明は、小胞体α−グルコシダ
ーゼ阻害活性を有する新規化合物Ａ−７６２０２Ｍ、そ
の製造法及びその用途に関する。
【０００３】
【従来の技術】α−グルコシダーゼは、生体内に広く分
布する酵素である。
【０００４】このうち小胞体に存在するα−グルコシダ
ーゼ、すなわちα−グルコシダーゼＩ，ＩＩは、分泌糖
蛋白質、細胞表層糖蛋白質、及びウイルス表層糖蛋白質
上のＮ結合型糖鎖の成熟過程においてプロセシングに関
わる酵素である。具体的には、未成熟のＮ結合型糖鎖の
末端部分に存在する３分子のグルコースを切り出す活性
を有している。その後、更に別の酵素が働き糖鎖が成熟
する。ＨＩＶをはじめとするウィルス感染細胞において
本酵素を阻害した場合、生成するウィルス粒子の表層糖
蛋白質の糖鎖は未成熟な状態にとどまり、生成ウィルス
の感染性が抑制される結果となる。実際に、小胞体α−
グルコシダーゼ阻害物質として知られる、１−デオキシ
ノジリマイシン、カスタノスペルミン及びその誘導体
は、in vitroにおいてＨＩＶの伝翻、増殖を阻害するこ
とが報告されている（H.Shimizu etal., AIDS,4巻、975
〜 979頁(1990 年); B.D.Walker et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、84巻、8120〜8124頁(1987 年)
等）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは微生物代
謝産物中より小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性を有す
る物質を検索した結果、土壌より分離したロドコッカス
属に属するＳＡＮＫ６１６９４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
７５１）の培養液中に、小胞体α−グルコシダーゼ阻害
活性を有する新規化合物Ａ−７６２０２Ｍが生産される
ことを見出して本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）下記式
（Ｉ）で表わされる新規化合物Ａ−７６２０２Ｍ、：
【０００７】
【化２】
【０００８】（２）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属に属するＡ−７６２０２Ｍ生産菌を培養し、そ
の培養物よりＡ−７６２０２Ｍを採取することを特徴と
するＡ−７６２０２Ｍの製造法、（３）ロドコッカス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するＡ−７６２０２
Ｍ生産菌がロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株である（２）に
記載の製造法、（４）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株に関
する。
【０００９】本発明のＡ−７６２０２Ｍは下記の物理化
学的性状を有する。 １）性質；白色粉末。 ２）溶解性；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、水に
可溶。アセトンに難溶。 ３）分子式；Ｃ25Ｈ26Ｏ13（高分解能マススペクトルに
より測定） ４）分子量； ５３４（ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにより
測定） ５）紫外線吸収スペクトル；λmax ｎｍ ０．０１Ｎ塩酸水溶液中で測定した紫外線吸収スペクト
ルは、２５７ｎｍに吸収極大を示し、２５７ｎｍにおけ
る吸光係数（Ｅ1% 1cm ）は６２８である。 ６）赤外線吸収スペクトル；νmax cm-1 ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは次の
通りである。 ３３６４、２９３５、１６２６、１６１０、１５７４、
１５１５、１２８５、１２１１、１０８１、１０３２、
９６９ ７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ｐｐｍ) ＤＭＳＯ−ｄ６溶液中（ＤＭＳＯ内部基準: ２．４９ｐ
ｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨ
ｚ）は、次の通りである。 3.41(1H, dd, J=5.5, 11.9Hz)、 3.54(1H, dd, J=5.9, 11.2Hz)、 3.55(1H, dd, J=3.1, 11.9Hz)、 3.63(1H, dd, J=4.3, 7.0Hz)、 3.67(1H, dd, J=3.7, 11.2Hz)、 3.74(1H, ddd, J=3.1, 5.5, 7.0Hz)、 3.79(1H, dd, J=2.0, 4.3Hz)、 3.84(1H, dd, J=3.9, 6.2Hz)、 4.10(1H, ddd, 3.7, 5.9, 6.2Hz)、 4.27(1H, dd, J=1.6, 3.9Hz)、 4.75(1H, d, J=2.0Hz)、 5.60(1H, d, J=1.6Hz)、 6.81(2H, d, J=8.7Hz)、 7.20(1H, d, J=8.9Hz)、 7.39(2H, d, J=8.7Hz)、 7.49(1H, d, J=8.9Hz)、 8.36(1H, s) ８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ｐｐｍ) ＤＭＳＯ−ｄ６溶液中（ＤＭＳＯ内部基準: ３９．５ｐ
ｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨ
ｚ）は、次の通りである。 61.22、 66.81、 76.99(2C)、 81.17、 81.78、 83.62、 83.82、 107.24、 107.94、 114.08、 114.59、 114.86(2C)、 119.71、 122.48、 123.06、 130.01(2C)、 137.20、 146.31、 147.56、 152.96、 157.08、 175.20 ９）高速液体クロマトグラフィー 分離カラム；Senshu pak PEGASIL ODS（φ４．６×１５
０ｍｍ，センシュー科学（株）製） 移動相； １６％アセトニトリル水 流速； １．５ｍｌ／分 検出波長； ２１０ｎｍまたは２５９ｎｍ 温度； ２５℃ 保持時間； ６．０分 本発明の前記一般式（Ｉ）を有する化合物Ａ−７６２０
２Ｍは、常法にしたがって塩にすることができる。その
ような塩としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリ
ウムのようなアルカリ金属塩；カルシウム、バリウムの
ようなアルカリ土類金属塩；マグネシウム塩；アルミニ
ウム塩；等の無機塩またはアンモニア、メチルアミン、
ジメチルアミン、ジシクロヘキシルアミンのようなアミ
ン塩；リジン、アルギニンのような塩基性アミノ酸塩；
等の有機塩基塩などをあげることができる。好適には薬
理上許容しうる塩である。
【００１０】なお、本発明の前記一般式（Ｉ）を有する
化合物Ａ−７６２０２Ｍは、種々の異性体を有する。前
記一般式（Ｉ）を有する化合物Ａ−７６２０２Ｍにおい
ては、これらの異性体およびこれらの異性体の混合物が
すべて単一の式で示されている。従って、本発明におい
てはこれらの異性体およびこれらの異性体の混合物をも
すべて含むものである。
【００１１】本発明の前記一般式を有する化合物Ａ−７
６２０２Ｍの製造法において用いられるロドコッカス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ) 属に属する菌株としては、
例えばロドコッカス エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｓｐ．) ＳＡＮＫ ６１６９４株（以下、単にＳＡ
ＮＫ ６１６９４株と記載する。）を挙げることができ
る。ＳＡＮＫ ６１６９４株は茨城県つくば市筑波山東
腹の土壌から土壌希釈法によって分離された。ＳＡＮＫ
６１６９４株の菌学的性状は、次の通りである。
【００１２】Ｉ）ＳＡＮＫ ６１６９４株の菌学的性状 １．形態学的性状 ＳＡＮＫ ６１６９４株は、菌株同定用寒天培地上２８
℃、７ないし１４日間の培養において普通もしくは貧弱
に生育する。コロニーはラフ型を示す。基生菌糸はジグ
ザグ状に伸長し分岐する。基生菌糸は茶味白ないし薄黄
味橙色を示す。気菌糸は着生しない。ＳＡＮＫ ６１６
９４株はイースト・デキストロース液で２８℃、２日間
の培養において菌糸の分断が観察され、断片はおよそ
０．６〜０．８×０．８〜３．５μm であり、表面は平
滑である。胞子のう、菌核、車軸分岐等の特殊器官は認
められない。
【００１３】２．各種培養基上の諸性質 各種培養基上で２８℃、１４日間培養後の性状は表１に
示した通りである。色調の表示はマンセル方式による日
本色彩研究所版「標準色表」のカラーチップ・ナンバー
をあらわす。
【００１４】
【表１】 ─────────────────────────────────── 培地の種類 項目*1 ＳＡＮＫ ６１６９４株の性状 ─────────────────────────────────── シュークロース・ Ｇ： 良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1)*2 硝酸塩寒天 Ｒ： 茶味白（2.5Y 9/1） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── グルコース・ Ｇ： 余り良くない、平坦、茶味白（10YR 9/1） アスパラギン寒天 Ｒ： 茶味白（10YR 9/1） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── グリセリン・ Ｇ： 良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1） アスパラギン寒天 Ｒ： 茶味白（2.5Y 9/1） （ＩＳＰ ５） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── 澱粉・無機塩寒天 Ｇ： 良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1） （ＩＳＰ４） Ｒ： 茶味白（2.5Y 9/1） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── チロシン寒天 Ｇ： 良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1） （ＩＳＰ ７） Ｒ： 茶味白（2.5Y 9/1） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── 栄養寒天 Ｇ： 余り良くない、平坦、茶味白（10YR 9/1） （ＤＩＦＣＯ） Ｒ： 薄黄味橙（2.5Y 9/2） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── イーストエキス・ Ｇ： 良好、平坦、薄黄味橙（10YR 8/3） 麦芽エキス寒天 Ｒ： 薄黄（2.5Y 9/4） （ＩＳＰ ２） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── オートミール寒天 Ｇ： 余り良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1） （ＩＳＰ ３） Ｒ： 薄黄味橙（2.5Y 9/2） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── 水寒天 Ｇ： 良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1） Ｒ： 茶味白（2.5Y 9/1） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── ポテトエキス・ Ｇ： 余り良くない、平坦、茶味白（2.5Y 9/1） 人参エキス寒天 Ｒ： 茶味白（2.5Y 9/1） ＳＰ： 産生せず ─────────────────────────────────── ＊１ Ｇ：生育，Ｒ：裏面，ＳＰ：可溶性色素 ＊２ 性状の欄の（ ）内はマンセル方式による色調表示。
【００１５】３．生理学的性質 ２８℃で培養後、２ないし２１日間に観察したＳＡＮＫ
６１６９４株の生理学的性質は表２に示した通りであ
る。
【００１６】
【表２】 ─────────────────────────────────── 澱粉の水解 陰性 ゼラチンの液化 陰性 硝酸塩の還元 疑陽性 ミルクの凝固 陰性 ミルクのペプトン化 陰性 メラニン様色素生産性 (培地1)* 陰性 (培地2)* 陰性 (培地3)* 陰性 基質分解性 カゼイン 陰性 チロシン 陰性 キサンチン 陰性 アデニン 陰性 ヒポキサンチン 陰性 テストステロン 陰性 ウレア 陰性 酸産生 アドニトール 陰性 アラビノース 陰性 セロビオース 陰性 ドルシトール 陰性 エリスリトール 陰性 ガラクトース 陰性 グルコース 陽性 グリセリン 陽性 イノシトール 陰性 ラクトース 陰性 マルトース 陰性 マンノース 陰性 メリビオース 陰性 ラフィノース 陰性 ラムノース 陰性 トレハロース 陰性 ペニシリン耐性 感受性 ライソザイム耐性 耐性 有機酸利用性 ベンゾエート 陰性 シトレート 陰性 ラクテート 陰性 オキザレート 陰性 サクシネート 陽性 50℃生残 陰性 生育温度範囲 ( 培地4)* ７〜３４℃ 生育適正温度 ( 培地4)* １４〜２９℃ 食塩耐性 ５％ ─────────────────────────────────── *:培地１；トリプトン・イーストエキス・ブロス（ＩＳＰ １） 培地２；ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ ６） 培地３；チロシン寒天（ＩＳＰ ７） 培地４；イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ ２） また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ ９）
を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮ
Ｋ ６１６９４株の炭素源の資化性は表３に示す通りで
ある。
【００１７】
【表３】 ─────────────────────────────────── D-グルコース ＋ シュークロース − D-フルクトース ＋＋ イノシトール − L-アラビノース − ラフィノース − L-ラムノース − D-マンニトール − D-キシロース − 対照 − ─────────────────────────────────── ＋＋：強く利用する， ＋：利用する， −：利用しない ４．菌体成分について ＳＡＮＫ ６１６９４株の細胞壁は、ビー・ベッカーら
の方法（B. Becker etal.、アプライド マイクロバイ
オロジー（Applied Microbiology）、12巻、421 〜423
頁(1964 年) ）に従い検討した結果、メソ−ジアミノピ
メリン酸が検出された。また、ＳＡＮＫ ６１６９４株
の全細胞壁中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方
法（M. P. Lechevalier 、ジャーナル オブ ラボラト
リー アンド クリニカル メディスン（Journal of L
aboratory & Clinical Medicine）、71巻、834 頁(1968
年) ）に従い検討した結果、アラビノースとガラクト
ースが検出され、ミコール酸の存在も確認された。
【００１８】細胞壁ペプチドグリカン中のムラミン酸の
アシル基型はグリコリル型であった。また、主要メナキ
ノン成分としてＭＫ−８（Ｈ２）が検出された。ＤＮＡ
のＧＣ含量は６９．５％であった。
【００１９】ＩＳＰ〔ジ・インターナショナル・ストレ
プトマイセス・プロジェクト（TheInternational Strep
tomyces Project）〕基準、バージーズ・マニュアル・
オブ・システマテック・バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）第４巻、ワックス
マン（S.A.Waksman ）著、ジ・アクチノミセテス（The
Actinomycetes ）第２巻および放線菌に関する最近の文
献によって同定を行い、本菌株が放線菌の中でもロドコ
ッカス属に属すると判断した。そこで、本菌株をロドコ
ッカス エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｓｃｃｕｓ ｓｐ．)
ＳＡＮＫ ６１６９４株と命名した。なお、本菌株は１
９９４年７月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４
７５１を付された。
【００２０】一般に、放線菌は自然界において、または
人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学
薬品処理等）により変異を起こし易い。本発明のＳＡＮ
Ｋ６１６９４株はそのすべての変異株を包含する。ま
た、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、
組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも
包含される。即ち、Ａ−７６２０２Ｍを生産するＳＡＮ
Ｋ ６１６９４株およびその変異株およびそれらと明確
に区別されない菌株はすべてＳＡＮＫ ６１６９４株に
包含されるものである。
【００２１】ＩＩ） ＳＡＮＫ ６１６９４株の培養 Ａ−７６２０２Ｍを得るため、これらの微生物の培養
は、他の醗酵生成物を生産するために用いられるような
培地中で行う。このような培地中には、微生物が同化で
きる炭素源、窒素源及び栄養無機塩を含有する。一般
に、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトー
ス、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキ
ストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、
ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、
クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いる
事ができる。一般には、培地量の１〜１０重量％で変量
する。
【００２２】窒素源としては、一般に蛋白質およびその
加水分解物を含有する物質あるいは無機塩を醗酵工程に
用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花
生粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、魚粉、コーンスチ
ープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イースト
エキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単一また
は併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で用い
る。
【００２３】培地中にとり入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得
ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も含む。
【００２４】液体培養に際しては、シリコン油、植物
油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。ＳＡＮ
Ｋ ６１６９４株を培養し、Ａ−７６２０２Ｍを生産す
る培地のpHは５．０〜８．０である。
【００２５】本菌株は７℃ないし３４℃の範囲で生育
し、特に１４℃ないし２９℃の範囲で良好である。更に
Ａ−７６２０２Ｍの生産には２２℃ないし２８℃が好適
である。Ａ−７６２０２Ｍは、好気的に培養して得られ
る。通常用いられる好気的培養法としては、例えば固体
培養法、振盪培養法、通気撹拌培養法等をあげることが
できる。
【００２６】小規模な培養においては、２８℃で数日間
振盪培養を行うのが良好である。培養は、三角フラスコ
中で、一段階または複数段階の種培養液の発育工程によ
り開始する。種培養フラスコは定温インキュベーター中
で数日間、または充分に成長するまで振盪培養する。成
長した種培養液は、その一部または全部を次段階の種培
地または生産培地に接種するのに使用される。接種した
生産培地を含むフラスコを一定温度で数日間振盪培養
し、培養終了後、フラスコの含有物を遠心分離またはろ
過により分別する。
【００２７】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作製することができ
る。栄養培地を１２５℃まで加熱して滅菌し、冷却後こ
の滅菌培地に、あらかじめ成長させた種培養液を接種す
る。培養は２８℃で通気撹拌して行う。この方法は多量
の化合物を得るのに適している。
【００２８】培養の経過に伴って生産されるＡ−７６２
０２Ｍの量の経時変化を知るには、例えば培養液をろ過
して得たろ液を酸性で酢酸エチルを用いて抽出し、濃
縮、乾固した油状物中のＡ−７６２０２Ｍの量を小胞体
α−グルコシダーゼ阻害試験、または高速液体クロマト
グラフィーに付して測定する。通常は９６時間から１６
８時間の培養でＡ−７６２０２Ｍの生産量は最高値に達
する。
【００２９】ＩＩＩ） Ａ−７６２０２Ｍの抽出精製 培養終了後、培養液中の液体部分に存在するＡ−７６２
０２Ｍは、菌体、その他の固形部分を、珪藻土をろ過助
剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、その
ろ液または上清中に存在するＡ−７６２０２Ｍを、その
物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られ
る。例えば、ろ液または上清中に存在するＡ−７６２０
２Ｍをイオン交換樹脂、例えばアンバーライトＩＲＣ−
５０、ＣＧ−５０（ローム・アンド・ハース社製）、ダ
ウエックス５０ＷＸ４、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ（ダウ
ケミカル社製）の層を通過させて不純物を吸着させて取
り除くか、またはＡ−７６２０２Ｍを吸着させた後、ア
ンモニア水または塩酸を用いて溶出させることにより得
られる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭または吸
着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４
（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨ
Ｐ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（三
菱化成（株）社製）等が使用される。Ａ−７６２０２Ｍ
を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物
を吸着させて取り除くか、またはＡ−７６２０２Ｍを吸
着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶
剤との混合溶剤を用いて溶出させることにより得られ
る。また、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロ
ライド等の有機溶剤により抽出することによっても得ら
れる。
【００３０】このようにして得られたＡ−７６２０２Ｍ
は、更にシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた
吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業
（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシ
ア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよ
び順相、逆相カラム、イオン交換カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【００３１】本発明のＡ−７６２０２Ｍの精製における
所在は次に挙げる方法によって測定することができる。
【００３２】１）小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験 ラット肝臓ミクロソーム画分のトリトンＸ−１００可溶
化処理液を酵素液とし、トリチウム標識グルコースを含
む水疱性口内炎ウイルス糖蛋白質を基質として各被検試
料存在下でα−グルコシダーゼ反応を進行させる。トリ
クロロ酢酸水溶液を添加して反応を停止させ、蛋白質を
不溶化して、ポアサイズ０．６５μｍのメンブランフィ
ルターでろ過したろ液中の遊離グルコースの放射活性を
液体シンチレーションカウンターを用いて計測する。阻
害剤を含まない反応液の放射活性と比較して、被検試料
の酵素活性の阻害率を算出する。
【００３３】２）高速液体クロマトグラフィーを用いる
方法 分離カラム： Senshu pak PEGASIL ODS(φ４．６×１
５０ｍｍ, センシュー科学（株）製） 移動相： １６％アセトニトリル水 流速： １．５ｍｌ／分 検出波長： ２１０ｎｍ 温度： ２５℃ 保持時間： ６．０分
【００３４】
【作用】本発明のＡ−７６２０２Ｍは、文献未載の新規
化合物であり、小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性を有
する。従って、本化合物は抗ＡＩＤＳ薬、抗腫瘍薬とし
ての用途に有用である。
【００３５】その投与形態としては、例えば錠剤、カプ
セル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与、また注
射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、坐薬等による
非経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤
は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢
剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、コーティング剤等既知の
医薬製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤
を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、
年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、
通常は成人に対して１日１ｍｇから１０００ｍｇを一回
または数回にわけて投与することが好ましい。
【００３６】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれに限定されない。
【００３７】実施例 １． （Ａ）培養 ロドコッカス エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．) ＳＡＮＫ ６１６９４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７
５１）を培地組成−１で示される培地７００ｍｌを含む
２リットル容量の三角フラスコ２本に、スラントより１
白金耳接種し、２１０ｒｐｍ回転振盪培養機で、２８℃
で１４４時間培養し種培養液とした。
【００３８】 培地組成−１ グルコース ５ ％ ファーマメディア ０．６ ％ 大豆粉 ０．７５％ (NH4)2SO4 ０．５ ％ CaCO3 ０．５ ％ KH2PO4 ０．１ ％ CB-442（消泡剤） ０．０１％ ─────────────────────────── 滅菌前 pH ７．０ 培地組成−１で示される培地３０リットルを６０リット
ル容量のタンクに入れ、１２１℃で４５分間加熱滅菌し
た。これを２８℃に冷却した後、６００ｍｌの種培養液
を接種した。次いで回転数を１６５ｒｐｍ、 通気量を３
０リットル／分、２８℃で、 ４８時間攪拌培養し、２次
種培養液とした。
【００３９】培地組成−２で示される培地３００リット
ルを６００リットルタンクに入れ、１２１℃、４５分間
加熱滅菌した。これを２８℃に冷却した後、２次種培養
液９リットルを接種した。次いで回転数を８３−９０ｒ
ｐｍ 、通気量３００リットル／分、２８℃で、 ２８３時
間攪拌培養した。 培地組成−2 グルコース ５．０ ％ ポリペプトン ０．５ ％ イ−ストエキス(DIFCO社製） ０．５ ％ 大豆粉 ８．０ ％ KH2PO4 ０．１ ％ CaCO3 ０．５ ％ 大豆油 １．０ ％ Tween 80 （界面活性剤） ０．１ ％ CB-442（消泡剤） ０．０１％ ─────────────────────────── 滅菌前 ｐＨ ７．２ （Ｂ）単離 得られた培養液３００リットルにろ過助剤として１５ｋ
ｇのセライト５４５(ジョンズ マンビル プロダクト
コーポレーション製）を加えてろ過し、その洗浄液と
併せてろ液３７５リットルを得た。このろ液を水酸化ナ
トリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、４０リットルの
ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに供与してＡ
−７６２０２Ｍを吸着させた。カラムを脱イオン水２０
５リットル、１０％アセトン水１９５リットルで洗浄
後、５０％アセトン水で溶出を行った。溶出液について
後述の小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験法により分析
を行うと、Ａ−７６２０２Ｍが溶出液２６リットルから
５４リットルまでの分画に存在することが確認された。
この分画を濃縮して２０リットルとした。この濃縮液に
塩酸を加えてｐＨを３．０に調整し、２０リットルの酢
酸エチルで３回抽出し酢酸エチル抽出液６０リットルを
得た。酢酸エチル抽出液６０リットルに水５リットルを
添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１０．０に調
整して抽出し、Ａー７６２０２Ｍを水層に転溶してＡ−
７６２０２Ｍを含む水溶液６リットルを得た。水溶液６
リットルのｐＨを７．０に調整した後、１リットルに濃
縮し、２．５リットルのダイヤイオンＨＰ−２０を充填
したカラムに供与してＡ−７６２０２Ｍを吸着させた。
カラムを脱イオン水１０リットル、１０％アセトン水１
０リットルで洗浄後、５０％アセトン水で溶出を行っ
た。溶出液について後述の小胞体α−グルコシダーゼ阻
害試験法により分析を行うと、Ａ−７６２０２Ｍが溶出
液１．５リットルから４．９リットルまでの分画に存在
することが確認された。この分画を濃縮して４５ｍｌと
した。この濃縮液４５ｍｌを、あらかじめ５％アセトニ
トリル−水で平衡化した５００ｍｌのコスモシール１４
０Ｃ18−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）を充填した
カラムに吸着させた。５％アセトニトリル水３．５リッ
トル、１０％アセトニトリル水２リットル，１５％アセ
トニトリル水３．５リットルで順次溶出し、溶出液を５
００ｍｌずつ、１８フラクションに分画した。溶出液に
ついて後述の小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験法によ
り分析を行って、Ａ−７６２０２Ｍの存在が確認された
フラクション３〜１５を集めて減圧下で濃縮し４０ｍｌ
とした。この濃縮液４０ｍｌを、再度、５００ｍｌのコ
スモシール１４０Ｃ18−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）
製）を充填したカラムに供与して精製した。溶出液につ
いて後述の小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験法により
分析を行って、Ａ−７６２０２Ｍの存在が確認されたフ
ラクションを集めて減圧下で濃縮し、凍結乾燥するとＡ
−７６２０２Ｍを含む褐色粉末６ｇが得られた。
【００４０】次いで、この褐色粉末を緩衝液Ａ（０．４
％トリエチルアミン水に濃リン酸水溶液を加えてｐＨを
３．２に調整した緩衝液） ２００ｍｌに溶解した。こ
れを、４５０ｍｌのコスモシール１４０Ｃ18−ＯＰＮを
充填し、５％アセトニトリル緩衝液Ａ溶液で平衡化した
カラムに供与して吸着させた。続いて、このカラムを順
次５％アセトニトリル緩衝液Ａ溶液５００ｍｌ、１０％
アセトニトリル緩衝液Ａ溶液１．３５リットルで洗浄し
た後、１５％アセトニトリル緩衝液Ａ溶液で溶出し、溶
出液を２０ｍｌずつ分画した。溶出液について後述の小
胞体α−グルコシダーゼ阻害試験法により分析を行っ
て、Ａ−７６２０２Ｍの存在が確認されたフラクション
３７〜４４を集めて減圧下で濃縮した。これを、６０ｍ
ｌのダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに供与し
てＡ−７６２０２Ｍを吸着させた。このカラムを脱イオ
ン水２００ｍｌで洗浄した後、２００ｍｌの５０％アセ
トン水で溶出した。この溶出液を濃縮し、凍結乾燥する
とＡ−７６２０２Ｍを含む黄色粉末３４２ｍｇが得られ
た。
【００４１】次に、この粉末のうち１３０ｍｇを取り、
１６％アセトニトリル緩衝液Ａ溶液３ｍｌに溶解し、試
料溶液とした。試料溶液の０．５ｍｌを、あらかじめ１
６％アセトニトリル緩衝液Ａ溶液で平衡化したＨＰＬＣ
カラム（センシューパックＯＤＳ−Ｈ−５２５１）に注
入した。１６％アセトニトリル酸緩衝液Ａ溶液を移動相
として流速１０ｍｌ／分で溶出し、検出波長２５９ｎｍ
でモニタ−して、保持時間２６〜２８分の溶出液を集め
た。残りの試料溶液２．５ｍｌについても同様に操作し
た。計６回のＨＰＬＣを用いた分取により得た溶出液を
濃縮し、５０ｍｌのダイヤイオンＨＰ−２０を充填した
カラムに供与して吸着させ、２００ｍｌの蒸留水で洗浄
後、５０％アセトン水１００ｍｌで溶出した。溶出液に
ついて後述の小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験法によ
り分析を行って、Ａ−７６２０２Ｍの存在が確認された
フラクションを集めて濃縮した後、凍結乾燥すると白色
粉末３３．２ｍｇが得られた。
【００４２】この白色粉末の一部を取り高速液体クロマ
トグラフィ−で分析したところ下記の結果が得られた。 １） 高速液体クロマトグラフィー 分離カラム; Senshu pak PEGASIL ODS（４．６φ×１
５０ｍｍ, センシュー科学（株）製） 移動相； １６％アセトニトリル水 流速； １．５ｍｌ／分 検出波長；２５９ｎｍ 温度； ２５℃ 保持時間； ６．０分
【００４３】
【発明の効果】
試験例． 小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験法 トリチウム標識グルコースを含む糖鎖を有するウイルス
蛋白質を基質とし、遊離した標識グルコースの放射活性
を測定することで酵素活性を求めた。
【００４４】ウィスター系ラットの肝臓１５ｇを細切
し、０．２５Ｍシュークロース、０．５ｍＭジチオスレ
イトールを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）６
０ｍｌ中で、テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナ
イズした。これを１，８００×ｇ，１０分の遠心分離に
供して上清を得た。この上清を、１５，０００×ｇ, ３
０分の遠心分離に供して上清を得た。
【００４５】この上清を１２０，０００×ｇ, ６０分の
遠心分離に供して沈渣を得た。この沈渣に１０％ グリ
セロール、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、 ０．５μＭジチオスレ
イトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）６０ｍｌを加えてホモゲナイズし、再度１２
０，０００×ｇ, ６０分の遠心分離に供した。得られた
沈渣に１０％ グリセロール、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．
５μＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）６０ｍｌを加えてホモゲナイズ
したものを肝臓ミクロソーム画分とした。
【００４６】この肝臓ミクロソーム画分を、２％トリト
ンＸ−１００存在下で、テフロンホモゲナイザーを用い
てホモゲナイズした。プロテインアッセイ（バイオラッ
ド社、商品名）により牛血清アルブミンを標準試料とし
て換算し、蛋白質濃度３．４ｍｇ／ｍｌになるように２
０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む１００ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で希釈したものを酵素液
とした。
【００４７】カングらの方法（M. S. Kang et al., Ana
lytical Biochemistry, 184 巻, 109 〜112 頁 (1989
年) ）に従ってトリチウム化グルコースで水疱性口内炎
ウイルスをラベルした。すなわち、水疱性口内炎ウイル
スを感染させたＢＨＫ細胞を、培養面積１５０ｃｍ2 の
培養ボトル１８個に接種して２４時間培養した。これら
１８個の培養ボトルから回収した培養上清を１００，０
００×ｇ、２時間の遠心分離に供し、ウイルスを含む沈
渣を得た。これを蒸留水に溶解後、トリクロロ酢酸で沈
殿させた。この沈殿を０．５％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、５ｍＭジチオスレイトール存在下で、ｐＨ７に調整
した溶液７ｍｌを基質液とした。
【００４８】以下、希釈等の操作には、２０ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸を含んだ１００ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．８）を使用した。９６穴マイクロタイタ
ープレートの各ウェルに、被検試料溶液５μｌ、酵素液
１０μｌ、基質液の５倍希釈液１０μｌと上記緩衝液７
５μｌを加え、総計１００μｌとして、反応を開始し
た。３７℃で６０分静置して反応を進行させた後、１０
ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン水溶液と５０％トリクロロ
酢酸水溶液をそれぞれ２５μｌずつ分注し、α−グルコ
シダーゼ反応を停止した。４℃で６０分静置した後、マ
ルチスクリーンアッセイシステム（ミリポア社、商品
名）を用いて、ポアサイズ０．６５μｍのメンブレンフ
ィルターでろ過した。ろ液１００μｌ中に含まれる放射
活性を液体シンチレーションカウンターを用いて計測し
た。阻害剤を含まない反応液の放射活性と比較し、被検
試料の酵素活性の阻害率を算出した。こうして得られた
被検試料の酵素活性の阻害率に基づいて小胞体α−グル
コシダーゼを５０％阻害する濃度を求めた。Ａ−７６２
０２Ｍが小胞体α−グルコシダーゼを５０％阻害する濃
度は８．２μｇ／ｍｌであった。
【００４９】以上のように本発明のＡ−７６２０２Ｍは
顕著な小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性を有している
ことから、抗ＡＩＤＳ剤、抗腫瘍剤等として有用であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 19/60 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 高松 安行 福島県いわき市泉町下川字大剱389−４ 三共株式会社内 (72)発明者 木下 武 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 春山 英幸 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 岡崎 尚夫 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 榎田 竜三 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記式（Ｉ）で表わされる新規化合物Ａ−
    ７６２０２Ｍ。： 【化１】
  2. 【請求項２】下記の物性値を有する新規化合物Ａ−７６
    ２０２Ｍ。 １）性質；白色粉末 ２）溶解性；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、水に
    可溶。アセトンに難溶。 ３）分子式；Ｃ25Ｈ26Ｏ13（高分解能マススペクトルに
    より測定） ４）分子量； ５３４（ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにより
    測定） ５）紫外線吸収スペクトル；λmax ｎｍ ０．０１Ｎ塩酸水溶液中で測定した紫外線吸収スペクト
    ルは、２５７ｎｍに吸収極大を示し、２５７ｎｍにおけ
    る吸光係数（Ｅ1% 1cm ）は６２８である。 ６）赤外線吸収スペクトル；νmax cm-1 ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは次の
    通りである。 ３３６４、２９３５、１６２６、１６１０、１５７４、
    １５１５、１２８５、１２１１、１０８１、１０３２、
    ９６９ ７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ｐｐｍ) ＤＭＳＯ−ｄ６溶液中（ＤＭＳＯ内部基準: ２．４９ｐ
    ｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨ
    ｚ）は、次の通りである。 3.41(1H, dd, J=5.5, 11.9Hz)、 3.54(1H, dd, J=5.9, 11.2Hz)、 3.55(1H, dd, J=3.1, 11.9Hz)、 3.63(1H, dd, J=4.3, 7.0Hz)、 3.67(1H, dd, J=3.7, 11.2Hz)、 3.74(1H, ddd, J=3.1, 5.5, 7.0Hz)、 3.79(1H, dd, J=2.0, 4.3Hz)、 3.84(1H, dd, J=3.9, 6.2Hz)、 4.10(1H, ddd, 3.7, 5.9, 6.2Hz)、 4.27(1H, dd, J=1.6, 3.9Hz)、 4.75(1H, d, J=2.0Hz)、 5.60(1H, d, J=1.6Hz)、 6.81(2H, d, J=8.7Hz)、 7.20(1H, d, J=8.9Hz)、 7.39(2H, d, J=8.7Hz)、 7.49(1H, d, J=8.9Hz)、 8.36(1H, s) ８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ｐｐｍ) ＤＭＳＯ−ｄ６溶液中（ＤＭＳＯ内部基準: ３９．５ｐ
    ｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨ
    ｚ）は、次の通りである。 61.22、 66.81、 76.99(2C)、 81.17、 81.78、 83.62、 83.82、 107.24、 107.94、 114.08、 114.59、 114.86(2C)、 119.71、 122.48、 123.06、 130.01(2C)、 137.20、 146.31、 147.56、 152.96、 157.08、 175.20 ９）高速液体クロマトグラフィー 分離カラム；Senshu pak PEGASIL ODS（φ４．６×１５
    ０ｍｍ，センシュー科学（株）製） 移動相； １６％アセトニトリル水 流速； １．５ｍｌ／分 検出波長； ２１０ｎｍまたは２５９ｎｍ 温度； ２５℃ 保持時間； ６．０分
  3. 【請求項３】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）
    属に属するＡ−７６２０２Ｍ生産菌を培養し、その培養
    物よりＡ−７６２０２Ｍを採取することを特徴とするＡ
    −７６２０２Ｍの製造法。
  4. 【請求項４】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）
    属に属するＡ−７６２０２Ｍ生産菌がロドコッカス・エ
    スピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ６
    １６９４株である、請求項３に記載の製造法。
  5. 【請求項５】ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏ
    ｃｃｕｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株。
  6. 【請求項６】前記一般式（Ｉ）を有するＡ−７６２０２
    Ｍを有効成分として含有するα−グルコシダーゼ阻害
    剤。
  7. 【請求項７】前記一般式（Ｉ）を有するＡ−７６２０２
    Ｍを有効成分として含有する抗ＡＩＤＳ剤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056334A1 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 The Trustees Of Boston College Use of imino sugars for anti-tumor therapy
WO2003035896A3 (en) * 2001-10-24 2004-04-22 Michael Burton Chromogenic enzyme substrates and method for detecting beta-d-ribofuranosidase activity

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