DE60304881T2 - Zelllinien zur heterologen expression von genprodukten mit humanem glykosilierungsmuster - Google Patents

Zelllinien zur heterologen expression von genprodukten mit humanem glykosilierungsmuster Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ubiquitäre/universelle Verfahren zur Bildung von Zellen, die zu einer stabilen, mit hoher Ausbeute erfolgenden Expression eines rekombinanten Gens mit einem humanen Glycosylierungsmuster fähig sind, und zur Bildung von stabilen, universellen Vorläuferzellen, die zur Insertion von beliebigen Zielgenen verfügbar sind. Die Erfindung betrifft weiterhin die durch das Verfahren erhältlichen Zellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Produktion von rekombinanten Proteinen ist für verschiedene Anwendungen von zentraler Bedeutung. Strukturuntersuchungen von Proteinen (worauf das rationale Wirkstoffdesign und die Wirkstoffoptimierung basieren (Antivir. Chem. Chemother., 12 Suppl. 1, 43-49 (2001))), industrielle Anwendungen von Proteinen (Enzymen) und die klinische Verwendung von rekombinanten Proteinen haben die Notwendigkeit für deren effiziente Herstellung erhöht. Nach einem Gutachten der Pharmaceutical Research and Manufacturers of America vom Februar 2000 waren 122 biologische Materialien einschließlich 20 monoklonalen Antikörpern entweder in pharmazeutischen Prüfungen der Stufe III oder befanden sich in Erwartung der FDA-Zulassung (K. Garber, 2001, Nature Biotech. 19, 184-185).
  • In Abhängigkeit von der Anwendung sind die native Konformation und die korrekten posttranslationalen Modifikationen (wie die Glycosylierung) des rekombinanten Proteins von wesentlicher Bedeutung. Prokaryoten wie dem "Lieblings-"Organismus der Biotechnologie, Escherichia coli (E. coli) fehlt die Fähigkeit zur Einführung einer posttranslationalen Modifikation. Nur eukaryotische Zellen besitzen die Zellmaschinerie, die für cotranslationale und posttranslationale Modifikationen notwendig ist, wie sie oft erforderlich ist, um funktionell aktive Proteine zu erzeugen. Verschiedene eukaryotische Systeme zur Erzeugung einer Vielzahl von heterologen Proteinen existieren. Fungus-Expressionssysteme, die beispielsweise von den Gattungen Saccharomyces, Candida, Pichia, Hansenula, Aspergillus oder Kluyveromyces stammen, sind gut etabliert (Hollenberg und Gelissen (1997), Current Opinion in Biotechno-logy 8, 554-560). Um das Problem der Plasmidinstabilität, das manchmal bei Pilzen auftritt, zu umgehen, werden Sequenzen, die heterologe Proteine codieren, idealerweise über eine homologe Rekombination in das Fungus-Chromosom integriert. Weitere Probleme, die bei Fungus-Expressionssystemen auftreten, sind eine Überglycosylierung von heterologen Proteinen und ein falsches Falten wie eine falsche Oligomerisierung und eine unzureichende Einarbeitung von Liganden. Eine Expression von heterologen Proteinen in Insektenzellen – wobei die das heterologe Protein codierende DNA über eine Rekombination auch in das Chromosom integriert werden kann – vermeidet diese Probleme. Insektenzellen fehlt aber die Fähigkeit zur Erzeugung von Sialinsäure und Sialinglycanen. Terminale Sialinsäurereste spielen in vielen Glycoconjugaten diverse biologische Rollen. Pflanzen können auch zur Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet werden. Bei diesen heterologen Expressionssystemen erweisen sich aber Schwierigkeiten bei der Extraktion und der Reinigung als wahre Hemmnisse.
  • Das Expressionssystem von Säugern, kultivierte Zellen und die transgenen Tiere weisen keinen dieser Nachteile auf. Die posttranslatorischen Modifikationen variieren aber zwischen den Säuger-Spezies. Somit führt die Expression von humanen Proteinen in Nagerzellen (die z.B. in W. Sun et al., J. Immunol. 152, S. 695-704 (1994), P. Lang und R. Mocikat; Mol, Gen. Genet. 424, S. 528-538 (1994), WO 96/30498 und K. Fukuta et al., Arch. Biochem. Biophys. 378, S. 142-150 (2001) offenbart ist) zu einem humanen Protein mit einem Nager-Glycosylierungsmuster.
  • Rekombinante Proteine können in kultivierten Säugerzellen entweder vorrübergehend oder konstitutiv (stabil) erzeugt werden. Zur vorrübergehenden Expression einer Rekombinanten wird eine Vektor-DNA, die das rekombinante Protein codiert, in die Zelle eingeführt, und im Allgemeinen wird sie nicht in die Zell-DNA integriert. Expressionstiter des rekombinanten Proteins sind zu Beginn hoch. Weil die Vektor-DNA gewöhnlich nicht repliziert wird, wird die Vektor-DNA aber mit jeder Zellproliferation verdünnt, und somit nimmt der Expressionstiter ab. Nur selten rekombiniert die Vektor-DNA oder ein Teil der Vektor-DNA fehlerhaft mit der zellulären, genomischen DNA, wobei das das rekombinante Gen codierende Gen stabil in das Genom integriert wird. Wenn das das rekombinante Gen codierende Gen mit einem Selektionsmarker assoziiert ist, können die diese Kassette tragende Zellen identifiziert und als stabil transformierte Zellen isoliert werden. Stabile Transformanten haben den Vorteil, dass die heterologen Proteine kontinuierlich produziert werden. Der Expressionstiter wird hauptsächlich von der Stärke des Promotorkonstrukts, der Stelle der Integration in das Chromosom, die Kopienzahl und den Typ des betreffenden rekombinanten Proteins bestimmt. Viele starke Promotoren sind kommerziell verfügbar, wobei ihre Transkriptionsaktivität aber in Abhängigkeit von der zellulären Konzentration der relevanten Transkriptionsfaktoren und von der Chromatinstruktur an der Integrationsstelle variiert. Zum Beispiel kann eine Integration in die Gerüst- oder Matrix-Konfigurationsregionen (5/MAR-Elemente) von chromosomaler DNA die Aktivität von Promotoren und somit die Expression von heterologen Genen erhöhen und sie vor einer Inaktivierung durch das flankierende Chromatin schützen. Daher ist es hochgradig wünschenswert, einen Promotor zu wählen, der in einer speziellen Zelle hochgradig aktiv ist, und die Integration auf einen aktiven Teil des Chromosoms zu richten. Vorzugsweise ist ein einziges Integrationsereignis wünschenswert, weil heterologe Gene mit einer geringen Anzahl von Kopien gewöhnlich stabiler als mehrfach kopierende Gene sind.
  • Eine Integration an einem einzigen, vorgewählten, hochaktiven Locus kann über homologe Rekombination erreicht werden. Dieses Verfahren ist, obwohl es normalerweise auf embryonale Stammzellen von Mäusen angewandt wird, bei somatischen Zellen humanen Ursprungs extrem unwirksam und erfordert einen Screening-Aufwand in großem Maßstab. Darüber hinaus ist es, wenn erwünscht ist, die Expression eines gegebenen Zielgens komplett auszuschließen, auf die meisten humanen permanenten Zelllinien nicht anwendbar, weil diese Zelllinien gewöhnlich polyploid sind und ein Targeting von mehr als zwei identischen Loci kaum machbar ist. Eine ortsspezifische Rekombination unter Verwendung von Rekombinasen, z.B. Cr, flp, C13 und deren jeweilige Zielorte (RRS) sind eine brauchbare Alternative (Y. Q. Feng et al., Journal of Molecular Biology, Band 292(4), S. 779-785 (1999), T. Schlake et al., Biochemistry, Am. Chem. Soc., Band 244(1-2), S. 185-193 (Oktober 2000), M. Fussenegger et al., Trends in Biotechnology, Band 17(1), S. 35-42 (Januar 1999), A. C. Groth et al., Proceedings of the National Acacdemy of Sciences of USA, Band 97 (11), S. 5995-6000 (Mai 2000)). Bei diesem Ansatz kann ein Plasmid, das eine einzige RRS trägt, dazu verwendet werden, auf ein einzelnes RRS im Chromosom abzuzielen. Dieses Verfahren hat aber bestimmte Einschränkungen: es ist nämlich ziemlich ineffektiv, weil die Rückwärtsreaktion, die Exzision des Plasmids, eine intermolekulare Rekombination ist und mit einer viel höheren Geschwindigkeit als die Integration erfolgt. Zweitens wird das gesamte Plasmid einschließlich der bakteriellen Gene integriert. Zur Lösung des ersten Problems wurde eine Reaktion in eine Richtung beispielsweise mittels heterospezifischer Zielorte sowohl für flp als auch für cre etabliert. Diese RRS werden von der entsprechenden Rekombinase erkannt, wobei für eine erfolgreiche Rekombination aber identische Orte erforderlich sind und die Exzisionsreaktion ausgeschlossen ist (S. Karreman et al., Nucleic Acids Res., Band 24(9), S. 1616-1624 (1996, K. R. Trinh et al., J. of Immunol. Methods, Band 244, S. 185-193 (2000)). Das Zielsteuerungsplasmid muss aber immer noch in eine einzige, bevorzugte Position des Chromosoms integriert werden. Um solche seltenen Integrate zu finden, ist ein Sceening-Aufwand in großem Maßstab erforderlich. Diese Klone enthalten oft mehr als eine Kopie des Plasmids, sie können unvollständige Kopien und Bakteriensequenzen enthaften, die nicht von der Integration ausgeschlossen sind. Diese bakteriellen Sequenzen werden von der Säugerzelle erkannt, was oft zur Inaktivierung der Zielregion führt. Alternativ kann die Zielsteuerungs kassette über retrovirale Vektoren integriert werden (S. Karreman et al., Nucleic Acids Res., Band 24(9), S. 1616-1624 (1996)). Diese Vektoren zielen auf aktive Stellen innerhalb des Chromosoms, wobei nur Kassetten mit ganzer Länge integriert werden, und die Infektionsdosis kann so eingestellt werden, dass einzelne Integrationsstellen erzeugt werden. Von ITR flankierte Expressionseinheiten können aber auch einer Inaktivierung unterworfen sein. Darüber hinaus kann die Verwendung dieses Systems durch staatliche Genehmigungsstellen eingeschränkt sein, wodurch therapeutische Anwendungen des exprimierten Proteins ausgeschlossen sind. Schließlich offenbaren a. Karpas et al., PNAS 98(4), 1799-1804 (2001) eine humane Myelom-Zelllinie, die zur Bildung von Hybridomen geeignet ist, die Immunoglobuline mit hoher Ausbeute stabil exprimieren. Andererseits wird erwähnt, dass Myelome gewöhnlich für diesen Zweck nicht geeignet sind.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Mit Hinsicht auf das Obige besteht nach wie vor ein Bedarf an einem Verfahren, das die Transformation/Umwandlung einer Zelllinie mit einem beliebigen, ein Produkt von Interesse codierenden Gen unter Erhalt einer rekombinanten humanen, Glycoprotein mit hoher Ausbeute produzierenden Zelle ermöglicht, insbesondere an einem Verfahren ohne oder nur mit wenigen mühseligen Screening-Verfahren. Überraschenderweise ist gefunden worden, dass Zellen, die rekombinante Glycoproteine mit Merkmalen einer humanen, posttranslatationalen Modifikation in hoher Ausbeute exprimieren, erhältlich sind, durch
    erstens Identifizieren eines nichtessentiellen, in hohem Maße exprimierten Zellgens (hiernach kurz als "Ausgangsgen" bezeichnet) in einer humanen oder im Wesentlichen humanen Hybridzelle (hiernach kurz als "Ausgangszelle" bezeichnet);
    zweitens durch direktes Ersetzen des Ausgangsgens über eine homologe Rekombination durch eine erste funktionelle DNA-Sequenz (beispielsweise durch die Verwendung einer geeigneten Zielsteuerungskassette), die Rekombinase-Erkennungsstellen (RRS) für eine ortsspezifische Integration, und gegebenenfalls ein "Platzhalter-"Gen, umfassend verschiedene funktionelle Sequenzen, enthält, und Auswählen/Isolieren eines stabilen Klons dieser Vorläufer-Expressionszelle (funktionalisierte Zelle);
    drittens Einfuhr des interessierenden, das Zielgenprodukt (Protein) kodierenden Gens (von nun an als "Zielgen" bezeichnet), durch ortsspezfische Integration unter Verwendung einer Rekombinase, die die RRS erkennt, die in die erste Zielsteuerungskassette eingeführt wurden, und schließlich Auswählen/Isolieren einer stabilen Expressionszelle, die dazu fähig ist, große Mengen des rekombinanten Proteins zu erzeugen. Ein direkter Ersatz des Ausgangsgens durch eine funktionelle DNA-Sequenz, die eine für das Zielgenprodukt codierende DNA-Sequenz enthält, ist ebenfalls anwendbar.
  • Darüber hinaus ist gefunden worden, dass spezielle Säugerzellen wie Human-Myelom- und Hybridomzellen und Human-Hetero-Hybridomzellen (einschließlich Human-Maus-Hetero-Hybridomzellen wie H-CB-P1) geeignete Ausgangszellen für das obige Verfahren sind, die die Erzeugung von Proteinen mit einem im Wesentlichen humanen Glycosylierungsmuster ermöglichen.
  • Bei Verwendung der vorliegende Erfindung ist es möglich, ein beliebiges Gen, das ein interessierendes rekombinantes Protein codiert, in die oben aufgeführten speziellen Säugerzellen stabil einzuführen. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung wird das interessierende, das rekombinante Protein codierende Gen in den Locus eines hochgradig exprimierten Zellgens und vorzugsweise in einer engen Nähe zu einem hochaktiven, in einem aktiven Teil des Chromosoms befindlichen Zellpromotor integriert. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung können Vorläufer-Zelllinien verschiedenen Ursprungs erzeugt werden, die ein von RRS umgebenes Platzhaltergen tragen. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung kann das Platzhaltergen durch das interessierende Gen, das das rekombinante Protein codiert, durch eine ortspezifische Rekombination, die durch eine geeignete Rekombinase katalysiert wird, an den RRS ausgetauscht werden, wodurch die endgültige Hoch-Expressionszelle erhalten wird.
  • Schließlich wurde gefunden, dass das Human-Maus-Hetero-Hybridom ein sehr deutliches humanes Glycosylierungsmuster ergibt.
  • Insbesondere macht die vorliegende Erfindung Folgendes verfügbar:
    • (1) Ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die zur stabilen Expression eines Zielgenprodukts, das ein im Wesentlichen humanes Glycosylierungsmuster aufweist, in hoher Ausbeute befähigt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Auswählen einer immortalisierten humanen Zelle oder Human-Hybrid-Zelle (hiernach "Ausgangszelle"), die von B-Lymphocyten abgeleitet ist und zu einer stabilen Expression eines Ausgangs-Genprodukts, das für die Ausgangszelle nicht essentiell ist, in hoher Ausbeute befähigt ist; (b) Suchen nach dem Locus des Ausgangs-Genprodukts innerhalb des Genoms der Ausgangszelle; (c1) Ersetzen des Gens, das für das Ausgangs-Genprodukt codiert, durch eine erste funktionelle DNA-Sequenz, die eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungsstellen (RRS) enthält, wobei man eine funktionalisierte Vorläuferzelle erhält; und (d) Integrieren einer zweiten funktionellen DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz enthält, welche für das Zielgenprodukt codiert, in die in Schritt (c1) erhaltene funktionalisierte Vorläuferzelle durch Verwendung einer Rekombinase, die die in die erste funktionelle Sequenz eingebauten RRS erkennt; oder (c2) direktes Ersetzen des Gens, das für das Ig codiert, durch eine funktionelle DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz enthält, weiche für das Zielgenprodukt codiert;
    • (2) in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens von (1) oben ist die Ausgangszelle eine Human-Maus-Hetero-Hybridomzelle wie das Hetero-Hybridom H-CB-P1 (DSM ACC 2104), und die Integration der funktionellen DNA-Sequenz(en) wird an einem Ig-Locus (vorzugsweise an einem umgelagerten Ig-Locus der Zelle) bewirkt;
    • (3) eine Zelle, die zur Expression eines durch das Verfahren von (1) oder (2) oben erhältlichen Zielgenprodukts in hoher Ausbeute fähig ist;
    • (4) ein Verfahren zur Herstellung einer funktionalisierten Zelle, umfassend die Schritte (a) bis (c1) gemäß der Definition in (1) oder (2) oben;
    • (5) eine Vorläuferzelle, erhältlich durch das Verfahren von (4) oben; und
    • (6) ein Verfahren zur Expression eines Zielgenprodukts in hoher Ausbeute, das das Kultivieren einer in (3) oben definierten Zelle umfasst.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Übersicht über das Konzept, ein mehrstufiges Verfahren zur Bildung von Expressionszelllinien in hoher Ausbeute, umfassend die ortsspezifische Integration von Genen in einen IgH-Locus an frt-Stellen.
    Der IgH-Locus von H-CB-P1 ist im oberen Graphen der 1a und 1b veranschaulicht. Er enthält den variablen Genpromotor, gefolgt von einer Protein-Leader-Sequenz und speziellen Genen, V, D und J, die umgelagert und neben dem Enhancer Eμ, den codierenden Sequenzen MAR und Cμ positioniert sind. Zielsequenzen für die homologe Rekombination sind marmoriert dargestellt. Über eine homologe Rekombination zwischen den flankierenden Sequenzelementen "Vhprom" und "Cμ" von Vektor 1 (Ziel vektor) und die genomische DNA werden zuerst funktionalisierte Sequenzen, die sich zwischen den flankierenden Sequenzen befinden, in die genomische DNA eingeführt, und ein rekombinantes PBG03-Genom ist das Ergebnis. Die erste funktionalisierte Sequenz enthält frt-Stellen (frtFS, frtF3 und frt wt), einen künstlichen, starken Promotor, CES (1a) oder keinen zusätzlichen Promotor (1b) stromaufwärts vom ersten exprimierten Gen (hobFc). Darüber hinaus sind ein Blasticidin- oder Nygromycin-Resistenzgen und ein ATG-deletiertes Neomycin-Gen Teil der ersten funktionalisierten Sequenz. Das rekombinante Genom trägt die ersten funktionalisierten Sequenzen in die chromosomale DNA integriert.
    FLP-Rekombinase katalysiert die Rekombination an den Stellen frtFS und frtF3 oder frt wt und frtF3 des rekombinanten N-CB-P1-Genoms und des Vektors 2, das tatsächliche, interessierende Gen wird eingeführt und aus dem künstlichen bzw. dem endogenen VH-Promotor exprimiert (1a bzw. 1b). Teile der ersten funktionalisierten Sequenz, die sich zwischen den Stellen frt wt und frtF3 befinden, werden durch einen schwachen Promotor ersetzt, gefolgt von einem ATG, wonach die Rekombination im selben offenen Leseraster wie das ATG-deletierte Neomycin-Gen positioniert wird. Das resultierende Genom hat das hobFc-Gen und das Blasticidin- und das Hygromycin-Resistenzgen verloren und hat stattdessen das interessierende Gen (Zielgen) und ein funktionelles neo-Gen.
  • 2: Die endogene Kassette (CEShobFcblas) des Zielsteuerungsvektors.
    Dargestellt ist die detaillierte Struktur der endogenen Kassette, die einen CES-Promotor, ein hobFC-Fusionsgen, ein Blasticidin-Resistenzgen und ein Neomycin-Gen ohne Start-Codon (ATG). Ausführlicher enthält die endogene Sequenz eine modifizierte frt-Stelle (frtF5), gefolgt von einer Hybrid-Promotorstruktur, die die frühen CMV-Promotor-/Enhancer-Elemente sowie das erste Intron des Elongationsfaktor-α-Gens umfasst. Das nächste Element ist eine frt-Wildtyp-Stelle, gefolgt vom hobFC-Fusionsgen (hobFC) und dem SV40-Polyadenylierungssignal (SV40PA). Ein schwacher SV40-Promotor, der die Expression des Blasticidin-Resistenzgens steuert, folgt. Die letzten Elemente sind eine modifizierte frt-Stelle (frtF3), und daneben befindet sich das ATG-defizitäre neo-Gen. Die modifizierten frt-Stellen M3 und F5 ermöglichen eine Rekombination mit identischen Stellen, aber nicht mit Wildtyp-frt-Stellen bzw. F5- oder F3-Stellen. Die frtF3-Stelle ist stromaufwärts vom neo-Gen positioniert, wodurch sich ein angrenzendes offenes Leseraster bildet, dem das ATG fehlt.
  • 3.: Klonierungsstrategie für den intermediären Vektor pVCμ, der die flankierenden Regionen Vhprom und Cμ enthält.
    Die 2-kb-VH-Promotorsequenz wurde aus genomischer PBG03-Zellen-DNA amplifiziert, wobei der Vorwärts-Primer VHpromF (SEQ-ID Nr.: 1) und der Rückwärts-Primer VHpromR (SEQ-ID Nr.: 2) verwendet wurden. Das PCR-Produkt VHprom wurde in den PCR-Vektor 4BluntTOPO (Invitrogen) kloniert und der resultierende Vektor als pVH bezeichnet. Die 7,4-kb-Cμ-Region wurde aus genomischer H-CB-P1-DNA als zwei überlappende Fragmente, nämlich CμMitteR und CμMitteF, amplifiziert. Die Primer CμintV (SEQ-ID Nr.: 3) und CμMitteR (SEQ-ID Nr.: 5) ergaben das Produkt CμMitteR, und die Primer CμMitteF (SEQ-ID Nr.: 6) und der reverse Primer CμintR (SEQ-ID Nr.: 4) ergeben das Fragment CμMitteF. Beide Fragmente wurden in einen PCR-Vektor 4BluntTOPO (Invitrogen) kloniert, und die resultierenden Vektoren wurden als pCμMitteR und pCμMitteF bezeichnet. Die Cμ-Sequenz mit voller Länge wurde wiederhergestellt, indem beide Vektoren mit den Restriktionsenzymen SpeI und DraIII geöffnet wurden und das SpeI-DraIII-Fragment von pCμMitteR in das geöffnete pCμMitteF ligiert wurde. Der resultierende Vektor Cμ trägt die Cμ-Region mit voller Länge (Cμ-Intron). Die VH-Promotorsequenz und die Cμ-Sequenz wurden zu einem Vektor pVHCμ vereinigt, indem sowohl pVH als auch pCμ mit den Restriktionsenzymen SpeI und PmeI aufgeschlossen wurden und das isolierte Vhprom-PmeI-SpeI-Fragment in den mit Phosphatase behandelten, geöffneten Vektor pCμ eingeführt wurde.
  • 4: Klonierungsstrategie für die Zielsteuerungsvektoren pCESHhobFc und pVHCμHhobFc.
    Der Zielsteuerungsvektor pVHCμCESHhobFc, der den hochaktiven Promotor CES und das hobFC-Fusionsgen enthielt, wurde erzeugt, indem ein am Ende aufgefülltes, aus pCESHhobFC isoliertes SwaI-BstBI-Fragment in den pVHCμ-Vektor, der mit PmeI aufgeschlossen und dephosphoryliert worden war, ligiert wurde. Der Zielsteuerungsvektor pVHCμHhobFc, der das hobFC-Fusionsgen, aber keinen CES-Promotor aufwies, wurde hergestellt, indem ein am Ende aufgefülltes, aus pCESHhobFc isoliertes Bst1107-BstBI-Fragment in einen mit PmeI aufgeschlossenen und dephosphorylierten Vektor pVHCμ ligiert wurde.
  • 5: Klonierungsstrategie für Zielsteuerungsvektoren, die ein Blasticidin-Resistenzgen tragen, pVHCμCEShobFcblas und pVHCμhobFcblas.
    Als Donor für das Blasticidin-Gen wurde das Plasmid pCDNATRD verwendet. Zum Deletieren der Hygromycin-Gensequenzen sowie der FRT5- und der Neomycin-Sequenz aus dem Vektor pCESHhobFc wurde der Vektor mit EcoRI und SalI aufgeschlossen und dephosphoryliert. Ein EcoI-SalI-Fragment aus pCDNATRD, das die Blasticidinresistenz-Gensequenz enthielt, wurde in den zuvor geöffneten pCESHbohFC-Vektor ligiert, und das resultierende Plasmid wurde als pCEShobFcblasdeleted bezeichnet. Die FrtFS-Sequenz und die ATG-deletierte Neomycin-Sequenz wurden aus pCESHhobFc als SalI-SalI-Fragment isoliert und in die SalI-Stelle von pCEShobFcblasdeleted reinsertiert. Das resultierende Plasmid pCEShobFcblas wurde zusammen mit pVHCμCESHhobFc verwendet, um pVHCμCEShobFcblas zu erzeugen. Das die hobFc-Sequenz und das Blasticidin-Gen umfassende BamHI-SalI-Fragment wurde aus pCES-hobFcblas isoliert und in den mit BamHI und SalI geöffneten Vektor pVHCμCESHhobFc insertiert, wodurch pVHCμCEShobFcblas erhalten wurde. Der Vektor pVHCμhobFcblas wurde erzeugt, indem ein das hobFc-Gen und das Blasticidin-Gen enthaltendes BamHI-SalI-Fragment in den mit BamHI und SalI aufgeschlossenen Vektor pVHCμHhobFc ligiert wurde.
  • 6: Immunoanfärbung von H-CB-P1-Klonen
    Durch eine Transfektion von H-CB-P1-Zellen mit pVHCμCESHhobFcblas erhaltene H-CB-P1-Klone wurden mit einem mit Texas-Rot konjugierten Anti-Human-IgG, für Fγ-Fragmente spezifischen, aus Ziegen isolierten Antikörper oder einem AMCA-konjugierten, Anti-Human-IgM, Fc5μ-spezifischen, aus Ziegen isolierten Antikörper immunoangefärbt. Die linke Spalte zeigt zwei H-CB-P1-Klone, die mit dem Texas-Rot-konjugierten Antikörper angefärbt und mit einem UV-WG-Filter visualisiert sind. In der rechten Spalte sind dieselben Klone nach der Färbung mit dem AMCA-konjugierten anti-IgM-Antikörper und der Visualisierung unter einem UV-Filter-WU dargestellt. Während für den Klon im oberen Feld nur eine IgG-Färbung offensichtlich ist, ist für den Klon im unteren Feld die Färbung mit beiden Antikörpern vorhanden. Der erste Klon kann aus einer homologen Rekombination resultieren, während der andere Klon eine fehlerhafte Insertion der funktionellen Sequenzen enthält.
  • 7: Direkte Immunoanfärbung von H-CB-P1-Klonen und eine weitere Expansion von Klonen.
    Es wird demonstriert, dass H-CB-P1-Klone immunoangefärbt werden konnten, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu gefährden, und dass eine anschließende Expansion des angefärbten Klons möglich war. Ein H-CB-P1-Klon, der 10 Tage lang in einer Platte mit 96 Vertiefungen kultiviert worden war, wurde mit einem mit Texas-Rot konjugierten anti-IgG-Antikörper immunogefärbt. Ein Bild des Klons vor der Immunoanfärbung, das mit normaler Lichtmikroskopie visualisiert wurde, ist im oberen linken Feld veranschaulicht. Derselbe, mit dem an Texas-Rot konjugierten anti-IgG-Antikörper immunoangefärte Klon ist im oberen rechten Feld veranschaulicht. In den unteren Feldern sind Bilder der nachträglichen Trypsinbehandlung in Vertiefungen dargestellt. Wenn das Bild unter einem normalen Lichtmikroskop aufgenommen wurde, waren keine Zellen zu sehen, wie im unteren linken Feld zu sehen ist. Das rechte Feld zeigt dieselbe Vertiefung, die unter einem UV-Filter-WU untersucht wurde. Die Zellen sind von der Vertiefung vollständig entfernt, und der fluoreszierende Antikörper-Niederschlag verblieb in der Vertiefung und haftet nicht an der Zelloberfläche.
  • 8: Anti-IgM-Dot-Blot von Zellkultur-Überständen von einzelnen Klonen
    Überstände der folgenden Klone
    1: pVHCμhobFcblas-D6, 2: pVHCμhobFcblas-G8, 3: pCEShobFcblas-A3, 4: pVHCμCEShobFcblas-B4, 5: pVHCμCEShobFcblas-D3, 6: pVHCμCEShobFcblas-G8
    wurden auf eine Membran aufgetüpfelt und dem ECR-Anfärbeverfahren unterzogen. Weil die Ausgangszellen-Population homogen IgM erzeugte, resultieren Klone ohne nachweisbare IgM-Expression aus einer vom Zielsteuerungs-Vektor vermittelten Inaktivierung des IgM-H-Gens. Der Klon A3, der durch eine Transfektion von pCESHhobFcblas erzeugt wurde, dem homologe Flankierungssequenzen fehlen, war nicht dazu fähig, den IgM-Locus anzusteuern und exprimiert IgM.
  • 9: Anti-IgG-Dot-Blot von Zellkultur-Überständen einzelner Klone.
    Überstände der folgenden Klone
    1: pVHCμhobFcblas D6, 2: pVHCμhobFcblas D6 (1:2 verdünnt), 3: pVHCμhobFcblas-G8, 4: pVHCμhobFcblas-G8 (1:2 verdünnt), 5: pCEShobFcblas A3, 6: pVHCμCEShobFcblas B4, 7: pVHCμCEShobFcblas D3, 8: pVHCμCEShobFcblas D3 (1:2 verdünnt), 9: pVHCμCEShobFcblas D3 (1:10 verdünnt), 10: pVHCμCEShobFcblas G8, 11: hobFc-Standard, 500 ng/ml, 12: hobFc-Standard 50 ng/ml IgG
    wurden auf eine Membran aufgetüpfelt und unter Verwendung eines anti-IgG-Antikörpers dem ECR-Anfärbeverfahren unterzogen.
  • 10: Nachweis einer homologen Rekombination mittels PCR Um zu testen, ob ein homologes Rekombinationsereignis zwischen dem (Zielsteuerungs)Vektor und dem Ig-Locus von H-CB-P1-Zellen erfolgt war, wurde eine PCR-Strategie angewandt. Bei der Rekombination der endogenen Kassette des den CES-Promotor enthaltenden Vektors werden das hobFc-Gen und ein Resistenzgen (Hygromycin oder Blasticidin), gefolgt vom ATG-deletierten Neomycin-Gen, in die genomischen Promotor-Sequenzen des Gens V und dem Enhancer Eμ integriert. Der Vorwärts-Primer V5 (SEQ-ID Nr.: 7), der an die genomischen Promotor-Sequenzen des Gens V außerhalb des Fragments Vhprom bindet, wurde mit den Primern V6 oder V7 (SEQ-ID. Nr.: 8 bzw. 9) kombiniert, die innerhalb der ersten funktionellen Sequenz spezifisch binden. Das Auftreten von PCR-Produkten hängt strikt von der Colokalisierung beider Primer-Bindungssequenzen und somit von einer homologen Rekombination ab. Zur Bestätigung von positiven Ergebnissen wurde das mutmaßlich positive PCR-Produkt in einer geschachtelten PCR-Reaktion mit den Primern VHpromF und VHpromR (SEQ-ID Nr.: 1 und 2) verwendet.
    a: Primerposition, b: elektrophoretische Analyse von PCR-Produkten
    links: erste PCR, V5, V7
    Spur 1: 1-kb-Leiter (Invitrogen), Spur 2: Klon pVHCμhobFcblas H6, Spur 3: Klon pVHCμCEShobFcblas B10, Spur 4: Klon pVHCμhobFcblas D4, Spur 5: Klon pVHCμhobFcblas D8, Spur 6: Klon pVHCμhobFcblas E11, Spur 7: negative Kontrolle H-CB-P1
    rechts: geschachtelte PCR
    Spur 1: 1-kb-Leiter (Invitrogen), Spur 2: negative Kontrolle H-CB-P1, Spur 3: Klon pVHCμCEShobFcblas H6, Spur 4: Klon pVHCμhobFcblas D4, Spur 5: Klon pVHCμhobFcblas E11
  • 11: Expression von hobFc beim Fehlen eines Selektionsdrucks.
    Zellen wurden drei Monate lang beim Fehlen eines Selektionsdrucks kultiviert. Zur Bestimmung der Expression wurden Zellen mit einer Dichte von 105 Zellen/ml geimpft. Nach 24 h wurden die Zellkultur-Überstände geerntet und unter Verwendung eines anti-Human-Fc-Antikörpers einem Western Blot (Dot-Blot) unterzogen. Überstände wurden von links nach rechts auf den Filter aufgetragen: unverdünnt, 1:2-Verdünnung und 1:10-Verdünnung.
    Links: Klon pCEShobFcblas A3 (statistische Insertion), Mitte oben: pVHCμhobFcblas G8, Mitte unten: pVHCμhobFcblas G8, rechts: pVHCμCEShobFcblas D3.
    Die Expression ist stabil in Klonen, die aus einer homologen Insertion der funktionalisierten Sequenzen einschließlich des hobFc-Gens stammen.
  • 12: Erzeugung eines Zielzellenklons unter Verwendung von GFP als Modell-Zielgen.
    Der Klon pVHCμCEShobFcblas D3 (in PBG04 umbenannt) wurde mit Vektor 2, der eine zweite funktionelle Sequenz (frt wt, das offene Leseraster GFP und ein Polyadenylierungssignal, einen von ATG und frtFS gefolgten Minimalpromotor) umfasste, und das Plasmid pflp, das eine funktionelle Expressionseinheit für die flp-Rekominase umfasste (Hinweis: der Vektor ist zur Expression von GFP in einer natürlichen Zelle nicht fähig, weil ein funktioneller, die Expression antreibender Promotor fehlt) transfiziert. Nach einer zweiwöchigen Selektion mit G418 waren einzelne, stabile Klone nachweisbar, die GFP stark exprimieren. Die GFP-Expression sowie die G418-Resistenz hängen vom homologen Rekombinationsereignis ab.
  • 13: Identifizierung der Umlagerungen in den Heterohybridomen H-CB-P1.
    Die cDNA für die Gene der leichten und der schweren Kette von H-CB-P1 wurden sequenziert und mit Datenbank-Sequenzen verglichen. Genomische Gene, aus denen die Gene mit schwerer Kette bestehen, wurden durch eine Homologie mit nicht umgelagerten genomischen Sequenzen identifiziert. Auf der Grundlage der Identifikation von V1-2, D1, J6 und u wurde eine genomische Karte des umgelagerten Locus konstruiert. PCR-Primer wurden unter Verwendung dieser Informationen konstruiert, jeweilige Fragmente, die sich von 5' bis zum variablen V1-2-Promotor des Gens erstreckten und die D-, J- und μ-Intronsequenzen enthielten, das variable Gen ATG jedoch ausließen, wurden amplifiziert und zur Konstruktion des Zielsteuerungsvektors verwendet. Das variable Gen V3-19 der leichten Lambda-Kette wurde auch mittels einer Homologiesuche identifiziert. Dieser Zugang war nicht geeignet, um das konstante Gen zu identifizieren, weil der Locus zu 100 % identische Genkopien enthält. Eine PCR auf der Grundlage von Primern in den dazwischenliegenden Sequenzen zwischen den Genen der konstanten Region ermöglichte die Identifizierung von J2 und H2 als diejenigen Gene, die das umgelagerte Lambda-Gen von H-CB-P1 darstellen.
  • 14: Chromosomenanalyse von
    Beim GTG-Banding wurden auf dem linken Feld 68-94 Chromosomen gefunden. Die Mehrzahl wurde mittels spektraler Karyotyp-Analyse als Maus-Chromosomen identifiziert, mittleres und rechtes Feld. Humane Chromosomen innerhalb von H-CB-P1 wurden durch Hybridisierung mit speziell markierten Human-Chromosomenbanken identifiziert. Es wurden 8 intakte humane Chromosomen, 4, 5, 7, 10, 14, 17, 18, 22 und zusätzlich Chromosomenfragmente der Chromosomen 4, 8, 9, 10, 11, 14, 16 identifiziert. Eine Hybridisierung mit einer für den humanen Ig-H-Locus spezifischen Sonde ergab einen einzigen IgH-Locus auf dem intakten Chromsom 14.
  • 15: Schematische Veranschaulichung einer N-gekoppelten Oligosaccharidstruktur eines Säuger-Glycoproteins.
    Das Leptin-Fc-Molekül enthält zwei N-gekoppelte Oligosaccharide, eines an jeder Kette der Fc-Domäne.
  • 16: Aminophasen-HPLC von Leptin Fc.
    LeptinFc von PBG-04 wurde in einer Drehflaschenkultur erzeugt und mittels eines generischen Verfahrens gereinigt, das eine Affinitätschromatographie, Gelfiltration und Membranfiltration einschloss. Das Protein wurde mit Trypsin aufgeschlossen, und die resultierenden Peptide wurde mittels eines PNGase-F-Aufschlusses deglycosyliert. Die Glycane wurden mit 2-Aminobenzamid markiert und mittels HPLC an einer Phenomenex-Hypersil-APS-2-Säule getrennt. Die größten Zahlen stellen die Fraktionen dar, die bei der MALDI-TOF-MS-Analyse verwendet wurden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Transformation einer Säuger-Ausgangszelle, insbesondere einer humanen Zelle oder einer humanen Hybridzelle zu einer stabilen, mit hoher Ausbeute exprimierenden Zelle verfügbar. Um eine kontinuierliche rekombinante Expression zu erreichen, wird das das rekombinante Produkt codierende Gen in die genomische, zelluläre DNA integriert. Expressionsgrade werden in hohem Maße durch die Stelle der Integration des rekombinanten Gens in die zelluläre DNA bestimmt. Daher umfasst das hier vorgestellte Verfahren die Integration eines rekombinanten Gens in einen transkribierend hochaktiven Teil des Genoms einer Zelle. Das interessierende Gen, das für das rekombinante Protein codierend ist, kann sich entweder unter der Kontrolle eines sehr starken rekombinanten Promotors befinden, oder es kann unter die Kontrolle eines hochaktiven zellulären Promotors gestellt werden, indem es stromabwärts vom hochaktiven zellulären Promotor integriert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens (1) der Erfindung sezerniert die Ausgangszelle das Ausgangs-Genprodukt vorzugsweise in einer Menge von wenigstens 0,3 fmol/Zelle/d einer Polypeptidkette (was gleich 30 pg/Zelle/d für ein Protein von etwa 90 kd ist) und noch mehr bevorzugt in einer Menge von mehr als 1 fmol/Zelle/d (was gleich 100 pg/Zelle/d für ein Protein von etwa 90 kd ist). Alternativ wird in einem Fall, in dem die Ausgangszelle das Ausgangs-Genprodukt nicht sezerniert, ein Gen, das für ein hochgradig exprimiertes, vorzugsweise nichtessentielles intrazelluläres oder Membranprotein oder eine hochgradig exprimierte, nichtcodierende RNA codiert, ausgewählt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgangszelle eine primäre, immortalisierte oder fusionierte Zelle oder eine genetische Modifikation davon. Somit kann die Ausgangszelle aus primären Zellen, immortalisierten Zellen (z.B. von B-Lymphozyten stammenden immortalisierten Zellen) oder Tumorzellen oder genetischen Modifikationen davon, Zellhybriden, Zelllinien, die üblicherweise bei der Proteinherstellung verwendet werden, wie HEK293, PER.C6, humanen Zelllinien, die über eine genetische Immortalisierung oder Fusion mit immortalen Zelllinien aus primären Zellen erzeugt sind, ausgewählt sein, vorzugsweise ist sie eine humane Hybridom- oder Hetero-Hybridomzelle (z.B. Human-Maus, Human-Ratte oder dergleichen), und am meisten bevorzugt ist sie das Human-Maus-Hetero-Hybridom H-CB-P1 (DSM ACC 2104; zuvor als ZIM517 bezeichnet).
  • Wenn die Ausgangszelle eine humane Zelle oder ein humanes Hetero-Hybridom ist (beispielsweise gemäß der obigen Definition), ist es bevorzugt, dass die Hybridzelle oder das Hetero-Hybridom wenigstens ein humanes Chromosom umfasst und/oder zu einer posttranslationalen Modifikation fähig ist. Es ist besonders bevorzugt, dass das Ausgangs-Genprodukt ein humanes Gen ist.
  • Das Ausgangs-Genprodukt ist vorzugsweise aus sezernierten Proteinen wie Antikörpern, Cytokinen, Hormonen, Enzymen, Transportproteinen, Speicher proteinen und Strukturproteinen ausgewählt. Das Ausgangs-Genprodukt ist entweder als Hauptprodukt der gewählten Ausgangszelle bekannt. So ist eine stabile Expression von IgM für H-CB-P1 beobachtet oder in einem Screening-Verfahren ausgewählt worden. Das Screening kann auf einzelnen oder kombinierten Verfahren basieren, die eine Mikroarray-Expressionsanalyse, 2D-Protein-Gelelektrophorese, quantitative PCR, RNAse-Schutz, Northern Blot, ELISA und Western Blot umfassen. Die Leistungsfähigkeit und Empfindlichkeit dieser einzelnen Methoden ist den Fachleuten bekannt.
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Herstellung eines beliebigen rekombinanten Proteins. Bevorzugte Zielgenprodukte umfassen Enzyme, insbesondere Proteasen, Proteaseinhibitoren, Hormone, Cytokine, Rezeptoren oder lösliche Formen davon (z.B. Rezeptoren, denen Transmembran- oder intrazelluläre Domänen fehlen), Antikörper mit voller Länge oder Antikörperdomänen und Fusionsproteine, die Domänen dieser Proteinklassen kombinieren.
  • Bei einer ersten Option von Ausführungsform (1), die die Schritte (a), (b), (c1) und (d) umfasst, wird der Ersatz des Ausgangsgens durch eine einstufige Austauschstrategie bewirkt, wobei die Ausgangszelle mit einem Vektorkonstrukt in Kontakt gebracht wird, das die erste funktionelle Sequenz enthält, wobei die erste funktionelle Sequenz das für das Ausgangsgenprodukt codierende Gen inaktiviert und teilweise oder vollständig ersetzt. Alternativ wird der Austausch in einer zwei- oder mehrstufigen Strategie bewirkt, wobei das für das Ausgangsgenprodukt codierende Gen deletiert oder inaktiviert und anschließend mit einem die erste funktionelle Substanz enthaltenden Vektor in Kontakt gebracht wird, wobei die erste funktionelle Sequenz an der Stelle des deletierten/inaktivierten Ausgangsgenprodukts eingearbeitet wird.
  • Eine spezielle Einarbeitung der ersten funktionellen Sequenz an der Stelle der Ausgangsgene wird durch Sequenzen erleichtert, die die erste funktionelle Sequenz im Vektor, die zum Zielgen oder benachbarten Sequenzen homolog sind, flankieren. Diese flankierenden Sequenzen werden entweder aus Lambda-, Cosmid-, pac- oder bac-Bibliotheken der Ausgangszelle erhalten oder mittels PCR unter Verwendung von Ausgangzellen-DNA als Matrize erhalten. Der Prozentwert der Zellklone, die aus einer speziellen Einarbeitung der ersten funktionellen Sequenz an der Position des Zielgens resultieren, kann durch die Verwendung einer dualen Selektionsstrategie, bei der ein positiver Selektionsmarker als Teil der ersten funktionellen Sequenz enthalten ist und ein negativer Selektionsmarker durch eine homologe Flanke von der ersten funktionellen Sequenz getrennt ist, weiter erhöht werden. Ein homologer Austausch ermöglicht die Einarbeitung des positiven Selektionsmarkers beim Fehlen des negativen Selektionsmarkers. Beispiele für positive Selektionsmarker sind die Hygromycin-, Blasticidin-, Neomycin- oder Glutamin-Synthetase-Gene, und das HSV-tk- oder das Cytosin-Desaminase-Gen sind negative Selektionsmarker. Marker und Verfahren zur Anwendung davon sind den Fachleuten bekannt.
  • Zellklone, die aus einem homologen Austausch resultieren, sind durch das Vorhandensein von Elementen oder Genprodukten gekennzeichnet, die von der ersten funktionellen Sequenz und der Inaktivierung wenigstens eines Allels des Ausgangsgens exprimiert werden. Diese Zellklone stellen die funktionalisierte Vorläuferzelle dar.
  • Die erste funktionelle Sequenz umfasst ein oder mehrere RRS, die aus IoxP-, frt-, att L- und attR-Stellen von Lambdaphagen, Erkennungsstellen für Resolvasen oder die Phage-C31-Integrase ausgewählt sind. Es ist bevorzugt, dass die Erkennungsstellen eine unidirektionale Integration ergeben, die beispielsweise durch modifizierte loxP- und frt-Stellen sowie durch die (Wildtyp-)Erkennungsstellen von ΦC31-Integrase erreicht wird. Die erste funktionelle Sequenz kann weiterhin Sequenzen umfassen, die aus Markersequenzen, sezernierten Proteingenen, Promotoren, Enhancern, Spleißsignalen, Polyadenylierungssignalen und IKES-Elementen ausgewählt sind.
  • Zur Erzeugung einer produzierenden Zelle für das Zielgenprodukt wird die funktionalisierte Vorläuferzelle (wenn es sich nicht bereits um einen in Schritt (c2) der zweiten Option der Ausführungsform (1), siehe unten, handelt), z.B. der PBG03-Klon D3 (DSM ACC2577) anschließend mit einem zweiten Vektor in Kontakt gebracht, der die zweite funktionelle Sequenz enthält. Die zweite funktionelle Sequenz umfasst das Zielgen und RRS für die in der ersten funktionellen Sequenz vorhandenen Rekombinasen. Die zweite funktionelle Sequenz umfasst weiterhin funktionale Sequenzen, die aus Promotorsequenzen, Markersequenzen, Spleißdonor- und -akzeptorsequenzen und Rekombinase-Erkennungssequenzen, die sich von der RRS der ersten funktionellen Sequenz unterscheiden, ausgewählt sind.
  • Die Integration der zweiten funktionellen DNA-Sequenz wird durch Rekombinasen bewirkt, die die RRS mit oder ohne zusätzliche Proteine (z.B. Cr, Flp, ΦC31-Integrase und Resolvase) erkennen. Diese Rekombinase und diese zusätzlichen Proteine, für diese Proteine codierende mRNA oder virale oder nichtvinale Vektoren, die eine vorrübergehende Expression ermöglichen, werden zusammen mit, kurz vor oder nach Übertragung der zweiten funktionalen Sequenz übertragen.
  • Eine reine Klonpopulation, die die zweite funktionelle Sequenz an der Position des Ausgangsgens enthält, wird erreicht, indem ein rekonstituiertes, funktionales Selektionsmarkergen verwendet wird. Beispielsweise kann ein inaktives, ATG-deletiertes Selektionsmarkergen, das mit der ersten funktionellen Sequenz eingeführt wird, durch die Übertragung eines aktiven Promotors und eines In-Frame-ATG-Codons mit der zweiten funktionellen Sequenz rekonstituiert werden.
  • Bei einer zweiten Option von Ausführungsform (1) der Erfindung (umfassend die Schritte (a), (b) und (c2)) kann die Gencodierung für das Ausgangsgenprodukt direkt (d. h. ohne Bereitstellung der Vorläuferzelle) durch eine funktionelle DNA-Sequenz, die eine für das Zielgenprodukt codierende DNA-Sequenz enthält (hiernach kurz als "dritte DNA-Sequenz bezeichnet), ersetzt werden. Die dritte DNA-Sequenz kann durch eine ein- oder mehrstufige Strategie, die hier oben beschrieben ist, eingearbeitet werden. Die dritte DNA- Sequenz kann weiterhin wie die oben beschriebene erste und zweite DNA-Sequenz funktionelle Sequenzen (wie Promotoren und Marker) enthalten. Diese zweite Option von Ausführungsform (1) der Erfindung ist besonders bevorzugt, wenn nur ein Zielgenprodukt zu erzeugen ist, so dass die Erzeugung der Vorläuferzelle nicht erforderlich ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform (2) der Erfindung ist die Ausgangszelle vorzugsweise eine Human-Maus-Hetero-Hybridomzelle, ist die Hetero-Hybridomzelle vorzugsweise H-CB-P1 (DSM ACC2104). Die Integration der funktionellen DNA-Sequenz wird an einem Ig-Locus, vorzugsweise an einem der humanen, umgelagerten Ig-Loci (z.B. der schweren Kette oder der leichten Kette (λ oder κ)) der Hybridomzelle, durchgeführt. Der umgelagerte Immunoglobin-Locus ist die Genomsequenz, die das funktionelle Ig-Gen umgibt (schwere Kette, (λ oder κ), das während der Reifung des B-Lymphozyten, der zum Hybridom führt, aus der chromosomalen Konfiguration der Keimbahn modifiziert ist. Der IgH-Locus befindet sich am Chromosom 14q32.33. Bei H-CB-P1 wird dieser Locus vom umgelagerten und affinitätsgereiften VH1-2-Gen, das über ein D-Gen mit dem JH6-Gen verbunden ist, das über das μ-Intron mit den Cμ-Sequenzen verbunden ist ( DD 296 102 B3 ). Die Sequenz der umgelagerten VDJ-Sequenz des H-CB-P1-IgH-Locus ist in SEQ ID-Nr.: 12 aufgeführt. Es ist bevorzugt, dass die Zellen der Ausführungsformen (3) und (5) der Erfindung von H-CB-P1 (DSM ACC2104) stammen. Weiterhin ist es in Ausführungsform (3) der Erfindung bevorzugt, dass das Zielgenprodukt ein Antikörper ist. In einem solchen Fall ist die Zelle vorzugsweise PBG04 (DMS ACC2577). In den obigen Zellen, die insbesondere zur Expression von Antikörpern verwendet werden, ist es machbar, dass ihre leichten Ketten inaktiviert (unterbrochen) oder durch ein Gen ersetzt werden, das für dasselbe oder ein verschiedenes Zielgenprodukt codierend ist.
  • Darüber hinaus weisen die Zielgenprodukte, die durch die Expression einer von H-CB-P1 stammenden Zelllinie erhältlich sind, ein einzigartiges, im Wesentlichen humanes Glycosylierungsmuster auf.
  • Glycoproteine für die therapeutische Anwendung, insbesondere Antikörper, werden normalerweise in Säugerzellen hergestellt, weil posttranslationale Modifikationen wie N-gebundene Glycane nur in Säugern erzeugt werden, und sie haben eine wesentliche Auswirkung auf die pharmakologischen Merkmale dieser Proteine. Ein vollständig prozessiertes N-Glycan bildet mit Core-Fucose und terminalen Sialinsäuren eine biantennäre Struktur (15). Der Großteil der Proteine trägt unter physiologischen Bedingungen nur trunkierte Versionen der vollständigen Struktur. Der Grad, bis zu dem die Glycosyleriung bis zur Vervollständigung angetrieben wird, hängt vom Zelltyp sowie von den Kulturbedingungen ab.
  • Somit variiert der Sialinierungsgrad der Addition der terminalen Sialinsäure zum Glycan und erreicht für Antikörper in humanem Blut nur 30-40 %. Ein hoher Prozentsatz an sialinierten Proteinen erhöht aber die Halbwertszeit eines therapeutischen Proteins in Blut. Die von H-CB-P1 stammenden Zelllinien, wie PBG04, erzeugen im Vergleich zu CHO- und NS0-Zellen, die bei der Herstellung von Glycoproteinen weithin eingesetzt werden, hochgradig sialinierte Glycoproteine, wie aus Beispiel 5 hervorgeht. Bei therapeutischen Glycoproteinen ist es vorteilhaft, dass ein niedriger Gehalt an Glycanen vor der Zugabe von Galactose (G0-Strukturen) terminiert ist. So neigen G0-Glycoproteine zur Dimerisierung, und die Fähigkeit von Antikörpern zur Mediation einer komplementabhängigen Cytotoxizität vermindert sich. Die genetische Zusammensetzung von PBG04 ermöglicht eine komplettere Prozessierung mit einem niedrigeren Grad an G0-Strukturen (4,3 % bei Leptin-Fc in einem Drehflaschen-Verfahren).
  • Während die allgemeine biantennäre Struktur von allen Säugern gebildet wird, sind einige spezifische Strukturen (Bindungen zwischen individuellen Zuckern) entweder für Menschen spezifisch oder vollständig ausgeschlossen. Diese Strukturen beeinflussen auch biologische Merkmale. Daher ist es vorteilhaft, Zellen zur Herstellung von Glycoproteinen für therapeutische Anwendungen zu verwenden, die die notwendigen Enzyme ergeben, um humanspezifische Modifikationen zu erzeugen, und denen Enzyme fehlen, die in humanen Zellen nicht vorhanden sind und die für atypische Bindungen verantwortlich sind. Solche Zellen können vollständig human sein oder eine Untergruppe an humanen Chromosomen enthalten. Bei letzteren Zellen ist es wichtig, dass die humanspezifischen Glycosylierungsenzyme über die bei Menschen nicht vorhandenen dominieren.
  • Daher kann Neuraminsäure als N-Acetylneuraminsäure oder N-Glycolylneuraminsäure zugegeben werden, wobei letztere in Mauszellen die Hauptstruktur ist. N-Glycolylneuraminsäure fehlt bei der Glycanform von Affen der alten Welt und beim Menschen. Sie sind immunogen und können zur Bildung von Antikörpern gegen das therapeutische Protein führen.
  • Darüber hinaus enthalten Mauszellen ein zusätzliches Glycosylierungsenzym, die α-1,3-Galactosyltransferase. Es vermittelt die Übertragung von gal-Resten auf freiliegende gal-Reste des Glycans. Eine solche Bindung wird auch in Hefe gefunden, und als Schutz haben Menschen bereits existierende Antikörper gegen diese Struktur. Die Erkennung kann zur Bildung von immunen Komplexen und zu Nierenschäden als Folge einer Behandlung führen. Nur 1,3 % des von Leptin-Fc stammenden PBG04 enthält α-1,3-gal.
  • Ein kleiner Prozentwert von humanen Proteinen enthält ein zweiteilig spaltendes N-Acetylglycosamin. Es beeinflusst als solches nicht biologische Merkmale, aber der Enzymkomplex stört eine andere vermittelnde Core-Fucosylierung. Oft fehlt bei Proteinen mit zweiteilig spaltendem N-Acetylglycosamin die Core-Fucose, was zu einer effizienteren Bindung des Fcγ-Rezeptors und zu einer Verstärkung der antikörpervermittelten zellulären Cyctotoxizität (ADCC) führt. Daher sind Zellen entwickelt worden, die (1,4)-N-Acetylglucosaminyltransferase III exprimieren, um den Prozentsatz an nicht core-fucosylierten Proteinen zu erhöhen (U.S.-Patent 6,602,684).
  • Ein hoher Gehalt an Glycoproteinen ohne Core-Fucose kann auch in Mauszellen erreicht werden. Diese Proteine weisen aber die nachteiligen Merkmale auf, die für Mausproteine typisch sind. Eine spezielle Zelle eines Menschen und einer Maus mit einer Zelle mit der richtigen chromosomalen Zusammensetzung kann die vorteilhaften Merkmale von beiden vereinigen. Von H-CB-P1 stammende Zelllinien wie PBG04 sind solche Zelllinien.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
  • Die Zelllinie H-CB-P1 wurde am "Zentralinstitut für Molekularbiologie, Akademie der Wissenschaften der DDR", Robert-Rössle-Str. 10, Berlin Buch, DDR-1115, als ZIM-0517 am 16. März 1990 hinterlegt und am 12. Dezember 2000 zum DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 13, 38124 Braunschweig, Deutschland, überführt, und dort wurde die Hinterlegungsnummer DSM ACC2104 an sie vergeben. Der PBG03-Klon D3 (pVHCμCEShobFcblas) wurde in PBG04 umbenannt und am 18. September 2002 beim DMSZ als DSM ACC2577 hinterlegt.
  • Beispiele
  • Materialien und Verfahren
  • Materialien:
  • DNA-Klonierungstechniken
  • Isolierung von genomischer DNA: Zellen aus einem T25-cm2-Kolben wurden trypsiniert (siehe das Kapitel "Trypsinierung" unten), das resuspendierte Zellpellet wurde in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, und 200 μl PBS wurden zugegeben. Das Röhrchen wurde 5 min lang bei 13 200 U./min zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 2 ml von Lösung A resuspendiert. Nach der Übertragung der Suspension in ein Falcon-Röhrchen (15 ml) wurden 133 μl 10 %ige SDS und 333 μl Protease K zugegeben. Es folgten entweder eine 3-stündige Inkubation bei 55 °C oder eine über Nacht erfolgende Inkubation bei Raumtemperatur. Die Suspension wurde mit 607 μl 6 M NaCl vermischt und 15 s lang einer Wirbelbehandlung unterzogen, bevor sie zentrifugiert wurde (4300 U./min, 4 °C, 20 min). Der Überstand wurde in ein Falcon-Röhrchen (15 ml) übertragen und mit 2,5 ml 100 %igem Ethanol vermischt. An der Grenzfläche bildete sich ein fadenförmiges DNA-Präzipitat, das mit einer Pipettenspitze entfernt und in 1/2 TE-Puffer resuspendiert wurde. Man ließ die DNA sich bei 56 °C vollständig auflösen, bevor sie bei 4 °C aufbewahrt wurde.
  • PCR: Das PCR-Verfahren wurde zur Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen (präparative PCR) oder zum Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen (analytische PCR) verwendet.
  • Präparative PCR: Präparative PCR-Reaktionen (50 μl) wurden mit dem Expand High Fidelity PCR Kit (Roche) gemäß der Anleitung des Herstellers (20-30 ng Matrix, 5 μl eines 15 mM MgCl2-Puffers (10 ×), 5 μl dNTP-Mischung, 0,5 μl eines jeden Primers (30 nM), 0,5 μl Polymerase, und mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt) angesetzt. Die PCR-Produkte wurden mittels eines QIAquick PCR purification kit (QIAGEN) gereinigt.
  • Analytische PCR: Analytische PCR-Reaktionen (10 μl) wurden mit dem Taq-Polymerase kit (QIAGEN) gemäß der Anleitung des Herstellers (10 ng Matrix, 1 μl eines 10 × Puffers, 0,5 μl einer dNTP-Mischung, 0,1 μl eines jeden Primers (30 pM), 0,1 μl Taq-Polymerase und Auffüllen mit Wasser auf 10 μl) hergestellt.
  • Das PCR-Zyklusprogramm variierte für jedes Produkt gemäß der Annealing-Temperatur des Primers (siehe Tabelle 2) und der Länge der erwarteten PCR-Produkte (bestimmte Elongationszeit und -temperatur siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Die Länge des amplifizierten Fragments bestimmt die Elongationszeit
    Figure 00270001
    Tabelle 2: Anlagerungstemperaturen für Primer
    Figure 00270002
    • Fett: Restriktionsstellen
  • Amplifizierung, Isolierung und Quantifizierung von Plasmid-DNA: E. coli-Transformanten wurden in einer 1-ml-, 30-ml- bzw. 100-ml-Kultur gezogen, und Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Mini-, Midi- bzw. Maxi-Plasmidreinigungskits (QIAGEN) isoliert. Die Anleitungen des Herstellers wurden befolgt. Die DNA-Konzentration wurde mittels Spektroskopie bestimmt, wobei die Extinktion bei 260 und 280 nm gemessen wurde.
  • Aufschluss von Restriktionsenzymen: Plasmid-DNA wurde mit 1 Einheit des zweckmäßigen Restriktionsenzyms für 1 μg DNA aufgeschlossen, wobei der Puffer und die Temperatur verwendet wurden, die vom Hersteller vorgeschlagen sind (siehe Tabelle 3). Wenn für die Analyse die Verwendung von zwei oder mehr Restriktionsenzymen erforderlich war, wurden die Reaktionen möglichst mittels eines gleichzeitigen Aufschlusses durchgeführt. Andernfalls wurden aufeinanderfolgende einzelne Aufschlüsse mit einem dazwischenliegenden Säulen-Reinigungsschritt (QIAGEN) der Reaktionsmischung durchgeführt. Tabelle 3: Verwendete Restriktionsenzyme
    Figure 00290001
    • a. spezieller Puffer
  • Endreparatur einer DNA mit vorstehenden 5'-Termini Um 5'-Überstände wie die von EcoRI erzeugten mit einem glatten Ende zu versehen, wurde die aufgeschlossene DNA gemäß der Anleitung des Herstellers mit dem Klenow-Fragment (Roche) verdaut. Die das Ende auffüllende Reaktion wurde durch einen Wärmeinaktivierungsschritt (65 °C, 20 min) gestoppt, und die DNA wurde in Ethanol ausgefällt oder direkt einer Gelreinigung unterzogen.
  • Dephosphorylierung von Vektor-DNA: Um eine Selbstligation der linearisierten Vektor-DNA (siehe den Abschnitt "Ligation" unten) mit verträglichen Enden zu verhindern, wurde DNA mit alkalischer Phosphatase (AP) (Roche) gemäß der Anleitung des Herstellers dephosphoryliert. Die AP wurde durch Wärme inaktiviert (65 °C, 15 min) und das DNA-Gel (zur Elektrophorese siehe den Abschnitt "Agarose-Gelelektrophorese" unten) vor der Verwendung in einer Ligationsreaktion gereinigt.
  • TOPO-Klonierung: PCR-Amplifizierungsprodukte wurden in TOPO-Vektoren von Invitrogen kloniert. Gemäß der Anleitung des TOPO-Klonierungskits wurde das gereinigte PCR-Produkt (0,25-2 μl) mit der Salzlösung (0,5 μl) vermischt, Wasser wurde zugegeben, wodurch ein Volumen von 2,5 μl erreicht wurde, und dann wurde der TOPO-Vektor (0,5 μl) zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsröhrchen in Eis eingebracht, 2 μl der Reaktion zu "chemisch kompetentem Einmal-E. coli" gegeben und die Zellen 30 min lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden einem Hitzeschock (42 °C, 30 s) unterzogen, sofort wieder auf Eis übertragen, und 250 μl Raumtemperatur-SOC-Medium wurden zugegeben. Die Transformationsreaktion wurde 1 h lang bei 37 °C unter Schütteln (300 U./min) inkubiert, bevor die Mischung auf LB-Platten, die entweder Kanamycin oder Ampicillin enthielten, ausplattiert wurde. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.
  • Ligation: Alle Ligationsreaktionen wurden in 10-μl-Volumina mit 0,1-1 μg des dephosphorylierten Vektors und einem Insertüberschuss durchgeführt. Die Reaktion enthielt 2 μl T4-Ligationspuffer (Gibco BRL) und 1 μl T4-Ligase (Roche), und sie wurde 2 h lang bei 16 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Ligationsreaktion wurde in Bakterien transformiert.
  • Um den Grad an unerwünschten Nicht-Rekombinanten zu verringern, könnten Ligationen mit einem geeigneten Restriktionsenzym nachträglich aufgeschlossen werden, wenn im selbstligierten Vektor eine einzigartige Restriktionsstelle vorläge. Nach dem Aufschluss wurde die Ligationsreaktion mit Ethanol in Gegenwart von Acrylamid ausgefällt (Zentrifugation bei 4 °C, 14 000 U./min, 15 min), bevor die wieder aufgelöste DNA wiederum in einer Transformationsreaktion verwendet wurde.
  • Transformation von kompetenten Bakterien: Kompetente E. coli XL2 (bei –70 °C aufbewahrt) wurden auf Eis aufgetaut, entweder mit der Ligationsreaktion (ebenfalls auf Eis gehalten, siehe den Abschnitt "Ligation" oben) oder mit 1-100 ng Plasmid-DNA (Retransformation) vermischt und 20 min lang auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Transformationsreaktion einem Hitzeschock unterzogen (30-60 s, 42 °C), das Röhrchen wieder auf Eis überführt, und 205 μl SOC-Medium (frei von Antibiotika) wurden zugegeben und die Reaktion 45 min lang bei 37 °C durch Schütteln inkubiert (300 U./min). Die Transformationsreaktion wurde auf LB-Platten ausplattiert, die ein Antibiotikum (entweder Kanamycin (40-60 μg/ml) oder Ampicillin (50-100 μg/ml)) enthielten, und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Bakterienkulturen wurden gezählt, und die Effizienz der Transformationsreaktion wurde berechnet.
  • Agarose-Gelelektrophorese: DNA-Fragmente wurden als Funktion ihrer Länge auf 0,7-1,5 %igen Agarosegelen getrennt. Die Agarose wurde in 1×TAE-Puffer gelöst, und 2 μl Ethidiumbromid/100 ml Agarose wurden zugegeben. Wenn die Agarose sich aufgelöst hatte, wurde sie in eine Schale gegossen und absitzen gelassen. Die DNA-Probe wurde mit dem Beladungspuffer Orange G vermischt, ein Horizontalgel wurde damit beladen, und sie wurde bei 40-90 V mit 1×TAE aus Laufpuffer laufen gelassen. Die DNA/Ethidiumbromid-Komplexe wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht.
  • Gelreinigung von DNA-Fragmenten: Die DNA wurde auf einem Agarosegel (40- 80 V) getrennt, und (unter UV-Licht sichtbar gemachte) interessierende DNA-Banden wurden mit einem Skalpell herausgeschnitten. Mit einem QIAquick gel extraction kit (QIAGEN) wurde die DNA gemäß der Anleitungen des Herstellers aus dem Agaroseblock extrahiert.
  • Zellkultur
  • Trypsinierung: Anhaftende Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin geerntet. Zuerst wurde das Kulturmedium entfernt und die Einzelzellschicht mit Citratpuffer (auf 37 °C vorgewärmt) gewaschen. Eine kleine Trypsinmenge wurde direkt zur Einzelzellschicht gegeben und 3-5 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Trypsinierung wurde durch die Zugabe von PBG-1.0-Medium, das um 5 % FCS ergänzt war, gestoppt (siehe Tabelle 4). Die Zellsuspension wurde in ein Falcon-Röhrchen (50 ml) übertragen und 10 min lang zentrifugiert (800 U./min, 30 °C). Das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert, und die Zellen wurden zur Elektroporation oder zur Weiterverarbeitung verwendet.
  • Tabelle 4: Um 5 % FCS ergänzte Citrat-, Trypsin- und PBG-1,0-Volumina, die zur Trypsinierung der in verschiedenen Kolben gezogenen Zellen verwendet wurden
    Figure 00320001
  • Zählung von Zellen
  • Nachdem die Zellen trypsiniert worden waren, wurde sie in einer Neubauer-Kammer (Hämatocytometer) gezählt. Ein kleines Volumen der Zellsuspension wurde in die Kammer eingeführt und die Kammer unter einem Mikroskop positioniert. Nur Zellen innerhalb eines der vier Quadrate der Kammer wurden gezählt und die Anzahl der Zellen mit dem Faktor 104 multipliziert, wodurch die Anzahl der Zellen pro ml erhalten wurde. Um zwischen vitalen und toten Zellen zu differenzieren, wurden die Zellen vor der Zählung mit Trypanblau angefärbt. Tote Zellen erschienen blau, während vitale Zellen den Farbstoff nicht aufnahmen.
  • Transformation
  • Elektroporation von H-CB-P1-Zellen: In einer standardmäßigen Elektroporationsreaktion wurden 10 μg linearisierter Plasmid-DNA verwendet. Das Kulturmedium wurde entfernt, und die H-CB-P1-Einzelzellschicht wurde mit Citratpuffer gewaschen und trypsiniert (siehe den Abschnitt "Trypsinierung" oben). Der Zellpellet wurde in Opti-MEM (auf 37 °C vorgewärmt) resuspendiert, wodurch 3 × 106 Zellen/ml erhalten wurden. Ein Volumen von 700 μl der Zellsuspension wurde in eine Elektroporationsküvette (peqLab; EQUBIO 4 mm) übertragen, und die linearisierte DNA (10 μg) wurde zugegeben. Die Zellen wurden bei 250 V, 1500 μF einer Elektroporation unterzogen und unmittelbar danach in T75-Flaschen überführt, die vorgewärmtes PBG-1,0-Medium enthielten, das um 5 % FCS ergänzt war, und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
  • Selektion
  • Selektion von N-CB-P1-Zellen: Die elektroporierten N-CB-P1-Zellen wurden zwei Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Am 2. Tag wurde das Kulturmedium entfernt, und nicht anhaftende Zellen wurden durch Zentrifugation des Kulturmediums geerntet. 1 ml des Kulturmediums (Überstand) wurden für eine spätere Untersuchung der vorrübergehenden Expression eingefroren. Die trypsinierte Einzelzellschicht und die aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation geernteten Zellen wurden vereinigt und granuliert. Zellen wurden in PBG-1,0-Medium, das um 5 % FCS ergänzt war, resuspendiert, wodurch Verdünnungen mit 1 × 106, 1 × 105 und 1 × 104 Zellen/ml erhalten wurden. Jede Verdünnung wurde um 5 μg/ml oder 10 μg/ml Blasticidin oder um 200 μg/ml oder 400 μg/ml Hygromycin ergänzt, Das Selektionsmedium wurde am 4., 7. und 10. Tag gewechselt, und das Wachstum der H-CB-P1-Klone wurde mikroskopisch kontrolliert. Zwischen den Tagen 8 und 10 waren vitale Klone mit dem Auge sichtbar. Am 13. Tag wurden Klone durch Trypsinierung geerntet, die Zellpellets wurden in PBG-1,0-Medium suspendiert, so dass, wenn Platten mit 96 Vertiefungen mit Zellen beimpft wurden, eine Vertiefung entweder 5 Zellen oder 1 Zelle enthielt. Der Selektionsdruck (entweder 5 oder 10 μg/ml Blasticidin oder 200 oder 400 μg/ml Hygromycin) wurde ständig aufrechterhalten. Am 10. Tag wurden die Zellen immunoangefärbt, um zwischen positiven und negativen Zellklonen zu unterscheiden. Das Zellkulturmedium wurde entfernt und durch ein Standardmedium ersetzt, das um einen fluoreszenzmarkierten Antikörper (2 μg/ml), der das von den Zellen erzeugte rekombinante Protein erkannte, ergänzt. Die Antikörper-Suspension wurde 4 h lang auf der Einzelzellschicht belassen, bevor sie durch OptiMem 1 ersetzt wurde, das um 5 % FCS ergänzt war. Die Einzelzellschichten wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Wenn Texas-Rot-konjugierte Antikörper verwendet wurden, erfolgte die mikroskopische Untersuchung mit einem UV-Filter (WG), der für ein Spektrum von 470-480 nm durchlässig ist. Die angeregten, mit Texas Rot markierten Antikörper emittieren Licht im Spektrum von 590 nm. Ein für Spektren von 330-355 nm durchlässiger UV-Filter (WU) wurden zur Sichtbarmachung von an AMCA konjugierte Antikörper verwendet. Eine Emission von angeregtem AMCA erfolgte im blauen Spektrum (420 nm). Nur große und stark fluoreszierende Klone wurden berücksichtigt. Wenn in einer Vertiefung nur ein einziger Klon war, wurden die Zellen weiter ausgestrichen. Wenn mehr als nur ein Klon in der Vertiefung war, wurden die einzelnen Klone (Zellen) mit einer Mikrokapillare aufgenommen und zur weiteren Ausbreitung in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen übertragen (siehe den folgenden Abschnitt "Aufnahme mittels Mikrokapillaren").
  • Aufnahme mittels Mikrokapillaren: Bei der Mikrokapillaren-Aufnahmevorrichtung wurde eine Kapillare verwendet, die an einem beweglichen Arm angebracht war, der mit einem Joystick gesteuert wurde. Die Mikrokapillare und der Arm befanden sich innerhalb der Haube, während der Joystick von außen gesteuert wurde. Wenn ein interessierender Klon mittels der Immunoanfärbungstechnik (im Abschnitt "Selektion von H-CB-P1" oben beschrieben) identifiziert war, wurde die Mikrokapillare über dem Klon positioniert, in der Kapillare mit einer Vakuumpumpe ein Unterdruck erzeugt, und der interessierende Zellhaufen wurde in die Mikrokapillare gesogen. Der Arm wurde über eine frische Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen bewegt und die Zellen in die Vertiefung ausgestoßen.
  • Kryokonservierung: Für langzeitgelagerte Zellen wurden trypsinierte Zellen mit 1 × 106 bis 1 × 107 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (700 U./min, 10 min) granuliert, und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in kaltem, vorkonditioniertem Medium (900 μl) resuspendiert, eine Kryo-Ampulle wurde mit 180 μl DMSO und 720 μl FCS befüllt, und die 900 μl mit der Zellsuspension wurden in die DMSO/FCS-Lösung übertragen. Die Kryo-Ampulle wurde 24 h lang in einem speziellen Gefrierbehälter aufbewahrt, um die Zellen sanft einzufrieren. Für eine Langzeitlagerung wurden die Kryo-Ampullen in Tanks mit flüssigem Stickstoff (Lagerung bei –196 °C) übertragen.
  • Nachweis von Proteinprodukten
  • EC-Western-Blot (Verstärkte Chemilumineszenz): Zum Nachweis von hobFC-Antikörpern wurden 20 μl des Zellkultur-Überstandes mit 10 μl 5 %igem SDS vermischt und 2 min lang bei 97 °C inkubiert. Wenn erwartet wurde, dass das Zellkulturmedium IgM-Antikörper enthielt, wurde das Kulturmedium nicht behandelt. Eine Membran (Amersham-Pharmacia; Hybond-P) wurde zuerst in Methanol gespült (1 min), dreimal in Wasser gewaschen (1 min) und dann in Blot-Transferpuffer eingeweicht, bevor sie auf ein Stück 3-MM-Papier gelegt wurde, die ebenfalls mit Blot-Transferpuffer eingeweicht war. 5 μl des vorbehandelten (hobFC-Antikörper) oder 5 μl des unbehandelten (IgM-Antikörper) Kulturmediums wurde auf die Membran aufgetüpfelt und 1 min lang inkubiert. Die Membran wurde in Blockierungspuffer gelegt, eine halbe Stunde lang unter Schütteln inkubiert und dreimal je 5 min lang in T-PBS gewaschen. Die blockierte Membran wurde in eine Detektions-Antikörper-Lösung gelegt (für IgG 1:2000 und für IgM 1:5000) und 2 h lang inkubiert. Drei weitere Waschvorgänge mit einer Dauer von 2, 5 und 10 min in T-PBS-Puffer folgten. Die Membran wurde in einen Entwickler (Amersham-Pharmacia, ECL) eingebracht und 1 min lang inkubiert. Schließlich wurde die Flüssigkeit ablaufen gelassen, und sie wurde auf 3-MM-Papier gelegt und in Zellophan eingewickelt, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Lichtemission wurde in einem dunklen Raum beobachtet.
  • Beispiel 1: Herstellung eines für die IgM-Region von H-CB-P1-Zellen spezifischen Zielsteuerungsvektors
  • Das rekombinante Gen sollte in die Region der IgM-Sequenz insertiert werden, weil wohlbekannt ist, dass Antikörper hochgradig exprimierte und sezernierte Proteine sind. Daher waren für den fertigen Zielsteuerungsvektor Sequenzen erforderlich, die eine 100 %ige Homologie zu den geplanten genomischen IgM-Sequenzen aufweisen. Für den Basis-Zielsteuerungsvektor pVHCμ wurden die VH-Region von 2 kb und die Cμ-Intronregion mit einer Länge von 7,4 kb ausgewählt (siehe 3). Beide Regionen wurden als PCR-Fragmente isoliert, wobei Polymerasen mit einer Proofreading-Aktivität (ProofStart-Polymerase (Qiagen)) verwendet wurden, in einen PCR-4BluntTOPO-Vektor (Invitrogen) subkloniert und schließlich in einem Vektor mit der Bezeichnung pVHCμ kombiniert (siehe 3).
  • Herstellung der Plasmide pVHCμCESHhobFc und pVHCμHhobFc: Der Basis-Zielsteuerungsvektor pVHCμ hat noch keine endogene Kassette. Die endogene Kassette, die den CE-Promotor, das Platzhaltergen hobFc, drei FRT-Rekombinationsstellen sowie ein Hygromycin-Resistenzgen und ein ATG-deletiertes Neomycin-Gen enthielt, wurde als BstDI-SwaI-Fragment aus dem Vektor pCESHhobFc isoliert. Das Fragment wurde dann am Ende mit Klenow-Polymerase gefüllt und in den Grund-Zielsteuerungsvektor pVHCμ, der mit PmeI aufgeschlossen und dephosphoryliert worden war, verdaut. Der resultierende Zielsteuerungsvektor wurde als pVHCμCESHhobFc bezeichnet.
  • Ein zweiter Vektor, pVHCμHhobFc, dem der CES-Promotorkonstrukt fehlte, der aber ansonsten alle anderen Teile der endogenen Kassette enthielt, wurde auch konstruiert. Ein BstBI-Bstl107I-Fragment wurde aus pCESHhobC isoliert und am Ende aufgefüllt. Die Bstl107I-Restriktionsstelle in pCESHhobFC befindet sich unmittelbar stromaufwärts von der frt-wt-Stelle, gefolgt vom hobFc-Gen, und dem so isolierten Bstl107I-Bstb1-Fragment fehlt der Promotor. Das Fragment wurde in einen pVHCμ-Vektor ligiert, der zuvor mit PmeI aufgeschlossen worden war, und der resultierende Vektor war pVHCμHhobFc. Bei beiden Vektoren, pVHCμCSHhobFc und pVHCμHhobFc, war das aktive Resistenz-Markergen der endogenen Kassette das Hygromycin-Resistenzgen. Ein alternativer Satz von Vektoren, der ein Blasticidin-Gen statt des Hygromycin-Gens enthielt, wurde ebenfalls erzeugt.
  • Konstruktion von pVHCμCSHhobFcblas und pVHCμhobFcblas: Um Zielsteuerungsvektoren mit dem Blasticidin-Gen als Markergen in der endogenen Kassette zu erzeugen, wurde der Vektor pcDNATRD als Donor für das Blasticidin-Gen verwendet. Der erste Schritt umfasste den Austausch des Hygromycin-Gens durch das Blasticidin-Gen. Dazu wurde das Blasticidin-Gen als EcoRI-SalI-Fragment aus pcDNATRD isoliert. Der Vektor pcESHhobFc der endogenen Kassette wurde ebenfalls mit EcoRI-SalI geöffnet, und dadurch wurden das Hygromycin-Gen sowie ein Teil des ATG-deletierten Neomycin-Gens entfernt. Das das Blasticidin-Gen enthaltende Fragment wurde in das geöffnete pCESHhobFc ligiert, und der resultierende Vektor wurde als pCEShobFcblasdeleted bezeichnet.
  • Der zweite Schritt bestand in der Reinsertion des gleichzeitig entfernten, ATG-deletierten Neomycin-Gens. Dazu wurde ein das ATG-deletierte Neomycin-Gen umfassendes Fragment aus pCESHhobFc isoliert und in den geöffneten Vektor pCEShobFcblasdeleted insertiert. Der resultierende Vektor wurde als pCEShobFcblas bezeichnet. Dieser Vektor diente nun als Vektor für das Blasticidin-Gen für die Plasmide pVHCμCSHhobFc und pVHCμHhobFc. Ein BamHI-SalI-Fragment wurde aus pCESHhobFcblas isoliert und in einen mit BamHI-SalI geöffneten Vektor pVHCμCESHhobFc insertiert, wodurch pVHCμCEShobFcblas erhalten wurde. Zur Erzeugung des Kontrollvektors pVHCμhobFcblas, dem der CES-Promotor fehlt, wurde der Vektor pVHCμHhobFc auch mit BamHI-SalI aufgeschlossen, und wiederum wurde das BamHI-SalI-Fragment aus dem darin ligierten pCEShobFcblas isoliert.
  • Beispiel 2: Selektion von hobFc-Klonen
  • Elektroporation: H-CB-P1-Zellen wurden mit den Plasmiden pVHCμCshobFcblas, pVHCμhobFcblas, pVHCμHhobFc und pCShobFcblas elektroporiert. Um die Transfektionseffizienz zu bestimmen, wurden Zellen mit dem Plasmid pGFPN1VA transfiziert, und als Scheinkontrolle wurden Zellen mit einer Wasserprobe elektroporiert. Es wurde gefunden, dass die Transfektionseffizienz etwa 20 % betrug. Am 2. Tag nach der Elektroporation wurden in Abhängigkeit vom transfizierten Plasmid entweder Hygromycin oder Blasticidin zum Kulturmedium gegeben. Wenn die scheintransfizierten Zellen alle tot waren, wurden Zellen aus den anderen Transfektionsreaktionen geerntet, und eine Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit einer Dichte von entweder 1 Zelle oder 5 Zellen pro Vertiefung erneut beimpft. Zellen wurden weiter kultiviert, wobei Medium mit dem zweckmäßigen Antibiotikum ergänzt wurde.
  • Zur Optimierung der Selektionsbedingungen wurden T75-Kolben zwei Tage nach der Elektroporation mit 104, 105 oder 106 Zellen/20 ml beimpft. Das Medium wurde um entweder 5 oder 10 μg/m Blasticidin oder 200 oder 400 μg/ml Hygromycin ergänzt. Am 14. Tag wurde die Anzahl der Klone/cm2 bestimmt. Die höchste Klonzahl wurde in Kolben erhalten, die mit 1 × 106 Zellen beimpft worden waren, die mit den Plasmiden transfiziert waren, denen der CES-Promotor fehlte (pVHCμhobFcblas). Dreimal weniger Klone wurden erhalten, wenn Zellen mit Plasmiden beimpft worden waren, die den CES- Promotor trugen. Weiterhin wuchsen diese Klone weniger gut als diejenigen ohne den CES-Promotor.
  • Die Auswirkung, die Antibiotika auf die Selektion von proteinerzeugenden Klonen haben: Nach der Expansion der Klone in T75-Kolben wurden die Klone trypsiniert, und Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 5 Zellen/Vertiefung beimpft. Das Kulturmedium enthielt entweder 5 oder 10 μg/ml Blasticidin oder 200 oder 400 μg/ml Hygromycin. Am 10. Tag nach dem Impfen wurden Zellen mit Anti-IgG-Antikörpern, die mit Texas-Rot und mit AMCA-markierten Antikörpern gegen IgM konjugiert waren, angefärbt. Die Ergebnisse, die mit denjenigen Zellen erhalten wurden, die mit Blastcidin kultiviert waren, zeigten, dass bei der höheren Blasticidin-Konzentration weitaus weniger positive Klone erhalten wurden. Wenn 10 μg/ml Blasticidin verwendet wurden, wurden im Vergleich zu 5 μg/ml 100 % mehr hobFC-negative Klone beobachtet. Es wurden aber nur die ersten drei Reihen der Platte mit 96 Vertiefungen, die mit 10 μg/ml Blasticidin kultiviert waren, gezählt, und das Ergebnis für die gesamte Platte wurde extrapoliert, während bei der Platte mit 96 Vertiefungen, die mit 5 μg/ml Blasticidin kultiviert wurden, alle Reihen gezählt wurden.
  • Vorteil der Auswahl mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern: Durch Verwendung der Immunofluoreszenz-Färbetechnik kann eine große Anzahl von Klonen schnell gescreent werden. Die mit der direkten Immunotechnik erhaltenen Ergebnisse waren ein erstes Anzeichen für die richtige Integration der Zielsteuerungssequenz in die genomische DNA. Nichtexprimierende Klone wurden mit dieser Technik leicht nachgewiesen. Das Immunofluoreszenz-Färbeverfahren ist technisch leicht, es sind geringere Konzentrationen an Antikörpern erforderlich als bei der Methylcellulose-Färbetechnik, und die Proliferation von Zellen ist nicht verschlechtert. Zellen konnten ohne nennenswerte Beschädigungen vor der anschließenden Trypsinierung oder der mittels Mikrokapillaren erfolgenden Aufnahme zur Übertragung von Zellen in neue Kulturbehälter immunogefärbt werden.
  • Beispiel 3: Nachweis einer homologen Insertion in den IgM-Locus
  • Zum Entwerfen des Zielsteuerungsvektors wurde der Locus der schweren Kette des umgelagerten Immunoglobulins auf der Grundlage der cDNA-Sequenz des Antikörpers und den Informationen zur humanen Genomsequenz zusammengesetzt. Um zu gewährleisten, dass die Erzeugung von IgM durch den Zielsteuerungszugang unterbrochen wird, wurde die komplette Leadersequenz einschließlich des ATG, der V-, D-, und J-Gene aus dem Zielsteuerungsvektor weggelassen und durch ein einziges Homologisierungs-Rekombinationsereignis vom Genom deletiert. Somit enthielt der Zielsteuerungsvektor vom Ersatztyp isogene Sequenzen aus dem IgM-Locus, mit denen ein direktes Crossover ermöglicht wird, und das hobFc-Gen, die Blasticidin- und ATG-deletierten Neomycinresistenzgene. Weil nur ein umgelagerter aktiver IgM-Locus auf dem Chromosom 14 in der Ausgangs-Zelllinie H-CB-P1 vorhanden ist, beseitigt das homologe Rekombinationsereignis die IgM-Expression, die durch Fluoreszenz-Antikörper-Anfärbung und ein Immunoblotting des Überstands unter Verwendung eines anti-IgM-Antikörpers nachgewiesen wird, vollständig.
  • Western Blot (Dot-Blot) für IgM und IgG: Die Dot-Blot-Technik wurde verwendet, um die mit der direkten Immuno-Anfärbungstechnik erhaltenen Ergebnisse zu verifizieren. Der Überstand (das Medium) dieser Klone wurde auf das Vorhandensein von IgM und IgG untersucht. Wenn gefunden wurde, dass der Überstand IgM-negativ und IgG-positiv war, wurde geschlossen, dass ein homologes Rekombinationsereignis stattgefunden hatte.
  • PCR zum Nachweis von integrierten Zielsteuerungssequenzen: Um zu verifizieren, dass die Zielsteuerungskassette am IgM-Locus integriert wurde, wurden PCR-Reaktionen mit dem Vorwärts-Primer V5 (SEQ-ID Nr.: 7) und den Rückwärts-Primern V6 (SEQ-ID Nr.: 8) oder V7 (SEQ-ID Nr.: 9) durchgeführt, und genomische DNA wurde als Matrize aus Zellklonen isoliert. Der Primer V5 bindet an genomischen V-Gen-Promotorsequenzen außerhalb des im Zielsteuerungsvektor vorhandenen Fragments Vhprom, der Rückwärts- Primer V6 bindet innerhalb der CES-Promotorsequenzen (und wurde daher nur für Zellen verwendet, die mit Plasmids transfiziert waren, die den CES-Promotor trugen), und der Primer V7 bindet innerhalb des hobFc-Gens. Bei Verwendung der beschriebenen Primerkombinationen hängt das Auftreten von PCR-Produkten streng von der Colokalisierung beider Primer-Bindungssequenzen und somit von einer homologen Rekombination ab. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit dieses PCR-Assays wurden PCR-Produkte der ersten Runde als Matrizen in ineinandergeschachtelten PCR-Reaktionen mit den Primern VHpromF (SEQ-ID. Nr.: 1) und VHpromR (SEQ-ID Nr.: 2) verwendet. Endgültig ineinandergeschachtelte PCR-Produkte wurden einem Enzym-Restriktionsaufschluss mit HincII und DraI unterzogen, um zu bestätigen, dass die erhaltenen Sequenzen richtig waren. Weil sie alle diese Assays bestanden, waren die PGG03-Klone H6 (pVHCμhobFcblas), D4 (pVHCμhobFcblas), E11 (pVHCμhobFcblas, D3 (pVHCμCEShobFcblas) und G8 (pVHCμhobfcblas) richtig in die Zielsteuerungssequenz integriert. Der Klon D3 (pVHCμCEShobFcblas) wurde in PBG04 umbenannt und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) hinterlegt.
  • Beispiel 4: Rekombination zur Erzeugung eines Zielzellenklons
  • Der Klon pVHCμCEShobFcblas D3 (PBG04) wurde mit dem Vektor 2, der eine zweite funktionelle Sequenz (frtwt, GFP ORF und ein Polyadenylierungssignal, einem Minimalpromotor, gefolgt von ATG und frt5) umfasste, und dem Plasmid pflp, das eine funktionelle Expressionseinheit für flp-Rekombinase umfasste, unter Verwendung des Transfektionsreagenzes Effectene (Qiagen) transfiziert. Vektor 2 enthält keinen Promotor zum Antrieb der GFP-Expressionseinheit. Die funktionalisierte Zelle (PBG04) ist gegenüber einer Geneticin-Selektion aus 200 μg/ml empfindlich. Vektor 2 fehlt eine Neomycinresistenz-Gensequenz, die eine Resistenz gegenüber Geneticin verleihen könnte. Wie erwartet war 1-4 Tage nach der Transfektion keine grüne Fluoreszenz nachweisbar. Nach einer zweiwöchigen Selektion mit Geneticin waren einzelne stabile Klone nachweisbar, die GFP stark exprimierten. Die GFP-Expression hängt von einer Integration in direkter Nähe zu einem funktionellen Promotor ab. Die Geneticin-Resistenz hängt von der Rekonstitution des in der Zelllinie vorhandenen neo-Resistenzgens durch das ATG aus dem Vektor 2 ab. Wir schließen, dass in allen Fällen der Vektor 2 Sequenzen zwischen den Stellen frtw und frtFS ersetzt hat und den CES-Promotor und GFP sowie das ATG-deletierte Neomycin-Gen mit dem ATG funktionell verbunden hat.
  • Beispiel 5: Untersuchungen des Glycosylierungsmusters von Leptin Fc
  • Leptin-Fc aus PB604 wurde in einer Drehflaschenkultur erzeugt und durch ein allgemeines Verfahren gereinigt, das eine Affinitätschromatographie, Gelfiltration und Membranfiltration einschloss. Das Protein wurde mit Trypsin verdaut, und die resultierenden Peptide wurden durch einen PNGase-F-Aufschluss deglycoslyiert. Die Glycane wurden mit 2-Aminobenzamid markiert und mittels HPLC an einer Hypersil-APS-2-Säule von Phenomenex getrennt (16). Mit den sesialylierten, markierten Proben wurde MALDI-TOF-MS (BROKER BIFLEXTM) verwendet, wodurch die betreffenden, in Tabelle 5 aufgeführten Fraktionen weiter charakterisiert wurden.
  • Die einzelne N-Glycosylierungsstelle an Fc trägt komplexe Oligosaccharid-Strukturen, die zu 37 % silyliert sind, eine Rate, die der durchschnittlichen Sialyierung an Antikörpern in menschlichem Blut nahe kommt. Sialinsäuren wurden weiterhin durch eine Sialidase-Behandlung, DMB-Markierung und Trennung an einer Hypersil-ODS-Säule von Bischoff charakterisiert und mit dem Sialic Acid Reference Panel (Oxford GlycoSciences) verglichen. Normalerweise wurde N-Acetylneuraminsäure gefunden. Nur 2 % entsprachen N-Glycolylneuraminsäure, der dominierenden Form in Maus-Myelomzellen, für die gezeigt wurde, dass sie immunogen sind (A. Noguchi et al., J. Biochem, 17(1): S. 59-62 (1995)). α-1,3-Gal-Strukturen, die in menschlichen Zellen nicht erzeugt werden und von denen bekannt ist, dass sie die Toleranz gegenüber vorher existierenden Antikörpern erhöhen, wurden nur bei 1,3 % der Glycane gefunden. Die obigen Befunde sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
  • Tab 5: Identifizierte Oligosaccharide als Ergebnis einer MALDI-TOF-MS-Analyse von Fraktionen aus der Hypersil-APS-2-Säule von Phenomenex
    Figure 00430001
  • Tab. 6: Zusammenfassung spezieller Merkmale von N-gebundenen Oligosacchariden aus Proteinen, die aus menschlichem Blut Hamster-CHO, Maus-NS0-Zellen oder dem Heterohybridom PBG-04 isoliert sind
    Figure 00440001
  • Beispiel 6: Herstellung eines Zielsteuerungsvektors für den λ-Locus der leichten Kette von PBG04
  • Die Struktur des umgelagerten Locus der λ-Kette wurde durch eine Ausrichtung der bekannten cDNA des λ-Gens auf humane Genomsequenzen identifiziert. Das Gen besteht aus einem variablen Gen, wobei das J- und das H-Segment bereits miteinander verbunden sind. V3-19 wurde als das variable Gen identifiziert.
  • Dieser Weg war zur Identifizierung des konstanten Gens nicht geeignet, weil der Locus zu 100 % identische Genkopien enthält. Eine PCR auf der Grundlage von Primern in der bekannten Leadersequenz und in den einzigartigen dazwischenliegenden Sequenzen zwischen Genen mit konstanten Regionen. Die Primer V81, V83 (SEQ-ID. Nr.: 13 bzw. 14) ergaben ein PCR-Produkt mit einer richtigen Größe, das das erwartete Restriktionsmuster aufwies und daher die Identifizierung von J2 und H2 als diejenigen Gene, aus denen das umgelagerte λ-Gen von H-CB-P1 (SEQ-ID Nr.: 21) besteht, ermöglichte. Auf der Grundlage dieser Informationen wurde die Sequenz des umgelagerten Locus vorgeschlagen und ein Zielsteuerungsvektor konstruiert.
  • Eine 5'-Flanke stromaufwärts von der codierenden Sequenz des variablen Gens V3-19 wurde mit den Primern V89 bzw. V94 (SEQ-ID Nr.: 15 bzw. 18) erzeugt, wobei Provestart-Polymerase (Qiagen) verwendet wurde. Ein 4-kb-Fragment wurde in pPCR4blunttopo (Invitrogen) kloniert. Eine 3-Prime-Flanke wurde in zwei Stufen amplifiziert: überlappende PCR-Produkte wurden unter Verwendung der Primer V90, V91 bzw. V115, V116 (SEQ-ID Nr.: 16, 17, 19 bzw. 20) erzeugt und über eine einzigartige, in beiden Fragmenten vorhandene SphI-Stelle aufgereiht. Die flankierenden Sequenzen wurden in einen einzigen Vektor, PVLCL (SEQ-ID Nr.: 22) kloniert.
  • Um die Insertion von Genen zu ermöglichen, die von denjenigen im Locus der schweren Kette unabhängig sind, wurde ein analoges, aber heterospezifisches Ersatzsystem auf der Grundlage von frt konstruiert. Es enthält in 5'3'-Richtung eine frtF3-Stelle, den CMV-EF1α-Hybridpromotor, gefolgt vom Human-α(1)-Antitrypsin-Gen, dem Hygromycinresistenzmarker, einer wt-frt-Stelle und einem ATG-deletierten Histidinolresistenzmarker. Diese Elemente wurden in pVLCL kloniert, wodurch pVLCLaathyg erzeugt wurde.
  • Weil frt-wt- und F5-Stellen keine Rekombination ermöglichen, können spezielle Ersatzvektoren die Loci der schweren und der leichten Kette exklusiv anzielen, wodurch ein Promotor und ein Startcodon für den Neomycin- bzw. den Histidinolresistenzmarker erhalten werden. Zur Erhöhung der Selektivität enthalten die Ersatzvektoren Startcodons in verschiedenen offenen Leserastern in Bezug auf die frt-Stelle. Als Folge führt eine Einarbeitung des Vektors in die falsche frt-Stelle nicht zur Resistenz gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum.
  • Mittels Elektroporation wurde PVLCLaathyg in PBG-04 transfiziert. Ein T75-Kolben wurde mit Zellen beimpft, und die Zellen wurden 3 Wochen lang einer Selektion mit 200 μg/ml Hygromycin unterzogen. Die resultierenden Klone wurden durch Verdünnungsklonieren isoliert, und aus einem homologen Austausch resultierende Klone wurden unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Anti-Human-λ-Ketten-Antikörpers durch das Fehlen eines Immunofluoreszenz-Signals identifiziert. Die resultierenden Zellklone werden auf die Expression von α-1-Antitrypsin analysiert. Diese Klone sind zur Coexpression von zwei unabhängigen Transgenen, die mit hoher Konzentration zu exprimieren sind, geeignet. Vorzugsweise sind diese Gene die Gene mit der schweren und der leichten Kette eines Antikörpers. Mit einer einzigen Austauschreaktion unter Verwendung von flp-Rekombinase können Gene mit einer schweren und einer leichten Kette zu ihren jeweiligen Positionen geleitet werden.
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Claims (16)

  1. Ex-vivo-Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die zu einer stabilen Expression eines Zielgenprodukts, das ein im Wesentlichen humanes Glycosylierungsmuster aufweist, in hoher Ausbeute befähigt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Auswählen einer immortalisierten humanen Zelle oder Human-Hybrid-Zelle (Ausgangszelle), die von B-Lymphocyten abgeleitet ist und zu einer stabilen Expression eines Immunglobulins (Ig), das für die Ausgangszelle nicht essentiell ist, in hoher Ausbeute befähigt ist; (b) Suchen nach dem Locus des Ig-Gens innerhalb des Genoms der Ausgangszelle durch Screening; (c1) Ersetzen des Gens, das für das Ig codiert, durch eine erste funktionelle DNA-Sequenz, die eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungsstellen (RRS) enthält, wobei man eine funktionalisierte Vorläuferzelle erhält; und (d) Integrieren einer zweiten funktionellen DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz enthält, welche für das Zielgenprodukt codiert, in die in Schritt (c1) erhaltene funktionalisierte Vorläuferzelle durch Verwendung einer Rekombinase, die die in die erste funktionelle Sequenz eingebauten RRS-Stellen erkennt; oder (c2) direktes Ersetzen des Gens, das für das Ig codiert, durch eine funktionelle DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz enthält, welche für das Zielgenprodukt codiert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei: (i) die Ausgangszelle das Ig sezerniert, und zwar vorzugsweise in einer Menge von wenigstens 0,3 fmol einer Polypeptidkette pro Zelle pro Tag und besonders bevorzugt in einer Menge von mehr als 1 fmol/Zelle/Tag; und/oder (ii) wenn die Ausgangszelle eine Human-Hybrid-Zelle ist, das Ig-Gen ein humanes Gen ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Ausgangszelle eine humane Myelom- oder Hybridom- oder Human-Hetero-Hybridomzelle ist und es sich dabei am meisten bevorzugt um das Human-Maus-Hetero-Hybridom H-CB-P1 handelt, das als DSM ACC 2104 hinterlegt ist.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Integration der funktionellen DNA-Sequenz bzw. DNA-Sequenzen an einem umgelagerten Ig-Locus, vorzugsweise an einem umgelagerten Immunglobulin-H-Locus oder λ-Locus der Ausgangszelle, durchgeführt wird.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Locus des Ig-Gens: (i) bekannt ist oder durch ein Screening-Verfahren bestimmt wird, das eine Mikroarray-Expressionsanalyse, 2D-Protein-Gel-Elektrophorese, quantitative PCR, RPA (RNase protection assay), Northern Blot, ELISA, Western Blot und Kombinationen davon umfasst; und/oder (ii) so ausgewählt wird, dass man ein im Wesentlichen humanes Glycosylierungsmuster erhält.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Ersetzen des Ig-Gens durchgeführt wird: (i) durch eine einstufige Ersatzstrategie, wobei die Ausgangszelle mit einem Vektorkonstrukt in Kontakt gebracht wird, das die erste funktionelle Sequenz enthält, wobei die erste funktionelle Sequenz das für das Ig codierende Gen ersetzt; oder (ii) in einer zwei- oder mehrstufigen Strategie, wobei das für das Ig codierende Gen deletiert oder inaktiviert und die Ausgangszelle anschließend mit einem Vektorkonstrukt in Kontakt gebracht wird, das die erste funktionelle Sequenz enthält, wobei die erste funktionelle Sequenz an der Stelle des deletierten/inaktivierten Ig eingebaut wird.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 6, wobei die erste funktionelle DNA-Sequenz: (i) eine oder mehrere RRS-Stellen, die aus loxP-, frt-, attL- und attR-Stellen von lambdoiden Phagen ausgewählt sind, und Erkennungsstellen für Resolvasen oder Phagen-C31-Integrase, vorzugsweise RRS-Stellen, die zu einer unidirektionalen Integration befähigt sind, wie modifizierte loxP-Stellen und frt-Stellen, umfasst; und/oder (ii) weiterhin funktionelle Sequenzen umfasst, die aus Markersequenzen, Sekretionsproteinen, Promotoren, Enhancern, Spleißsignalen, Polyadenylierungssignalen und IRES-Elementen ausgewählt sind; und/oder (iii) im Vektor von Sequenzen flankiert ist, die zum Ziel-Gen oder benachbarten Sequenzen homolog sind.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei: (i) die Integration der zweiten funktionellen DNA-Sequenz durchgeführt wird, indem man zusammen mit, kurz vor oder nach der Einschleusung der zweiten funktionellen Sequenz eine Rekombinase einschleust, die die in der ersten funktionellen Sequenz vorhandenen RRS-Stellen erkennt; (ii) die Integrase aus Cre-, Flp-, ϕC31-Integrase und Resolvase ausgewählt ist; (iii) das Zielgenprodukt aus Enzymen, Hormonen, Cytokinen, Rezeptoren, Antikörpern, Antikörperdomänen und Fusionsproteinen, die das oben genannte Genprodukt umfassen, ausgewählt ist; (iv) die zweite funktionelle DNA-Sequenz weiterhin funktionelle Sequenzen umfasst, die aus Promotorsequenzen, Markersequenzen, Spleißdonor- und -akzeptorsequenzen sowie Rekombinase-Erkennungssequenzen, die von der RRS der ersten funktionellen Sequenz verschieden sind, ausgewählt sind.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das für das Ig codierende Gen direkt durch eine funktionelle DNA-Sequenz ersetzt wird, die eine DNA-Sequenz enthält, welche für das Zielgenprodukt codiert.
  10. Verfahren zur Herstellung einer funktionalisierten Zelle, das die Schritte (a) bis (c1) umfasst, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 6 definiert sind.
  11. Funktionalisierte Zelle, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 10 erhältlich ist.
  12. Zelle, die zu einer Expression eines Zielgenprodukts, das nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 erhältlich ist, in hoher Ausbeute befähigt ist.
  13. Zelle gemäß Anspruch 12, wobei das Zielgenprodukt ein Antikörper ist und es sich bei der Zelle vorzugsweise um PBG04 handelt, die als DSM ACC 2577 hinterlegt ist.
  14. Zelle gemäß Anspruch 11, 12 oder 13, die von H-CB-P1 abgeleitet ist, das als DSM ACC 2104 hinterlegt ist.
  15. Zelle gemäß Anspruch 13 oder 14, deren leichte Kette weiterhin inaktiviert oder durch ein Gen, das für dasselbe oder ein anderes Zielgenprodukt codiert, ersetzt ist.
  16. Verfahren zur Expression eines Zielgenprodukts in hoher Ausbeute, umfassend das Kultivieren einer Zelle, wie sie in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert ist.
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