DE68923048T2

DE68923048T2 - Alpha-Subeinheit des LFA-1-Leukocyt-Adhäsions-Rezeptors.

Info

Publication number: DE68923048T2
Application number: DE68923048T
Authority: DE
Inventors: Richard Larson; Timothy Alan Springer
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1988-08-23
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1995-11-16
Anticipated expiration: 2009-08-18
Also published as: HUT53673A; FI893916A7; IL91369A0; JPH02306999A; PT91503A; EP0362526B1; GR3017303T3; FI893916A0; KR900002796A; ATE123810T1; ES2075016T3; FI893916L; DE68923048D1; DK412589A; DK412589D0; AU634974B2; IL91369A; AU4014589A; EP0362526A2; EP0362526A3

Description

ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft den Leukozyten- Adhäsionsrezeptor LFA-1. Die Erfindung betrifft außerdem die Klonierung von DNA-Sequenzen, welche die alpha-Untereinheit dieses Moleküls kodieren.

BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK

Das Immunsystem hat die Aufgabe, Lebewesen vor fremden Eindringlingen, wie zum Beispiel Bakterien, Viren etc. zu schützen. Einen hervorragenden Überblick über dieses Abwehrsystem gibt Eisen, H.W. (In: Microbiology, 3. Aufl., Harper & Row, Philadelphia, PA (1980) S. 290-295 und 381-418). Die Fähigkeit des Immunsystems, ein Lebewesen vor fremden Eindringlingen zu schützen, hängt im großen und ganzen von der Anwesenheit und Funktion von Blutzellen, die als Leukozyten bekannt sind, ab. Die Fähigkeit der Leukozyten, solch einen Schutz zu gewähren, beruht darauf, daß diese Zellen an zelluläre und extrazelluläre Substrate binden.
Leukozyten zum Beispiel müssen in der Lage sein, an Endothelzellen zu binden, um so vom Kreislauf zu den bestehenden Entzündungsorten migrieren zu können. Des weiteren müssen sie an Antigen präsentierende Zellen binden, so daß eine normale Immunantwort stattfinden kann. Sie müssen auch in der Lage sein, an geeignete Zielzellen zu binden, so daß die Lysis von virusinfizierten (oder Tumor-) Zellen stattfinden kann. Des weiteren müssen Leukozyten in der Lage sein, an verschiedene, aktivierte Proteine zu binden (wie iC3b, die aktivierte Form der dritten Komplementkomponente), so daß sie effizient phagozytieren können und mikrobielle und zelluläre Trümmer beseitigen können. Deswegen ist die Leukozytenadhäsion eine Voraussetzung für das normale Funktionieren des Abwehrsystems des Wirtes. Die Inhibition dieses Abwehrsystems ist wünschenswert in Fällen, wie z.B. Transplantationen, weil der Wirt das transplantierte Gewebe als fremd "ansieht" und eine Immunantwort hinsichtlich dieses Gewebes initiiert.
Leukozytenadhäsion ist deshalb auch in die Abstoßung transplantierten Gewebes oder transplantierter Organe involviert. Deshalb kann ein Verständnis der Leukozytenadhäsion einen in die Lage versetzen, entweder die Fähigkeit eines Lebewesens zu verbessern, eine Infektion zu bekämpfen oder die Fähigkeit eines Lebewesens zu unterdrücken, ein transplantiertes Gewebe abzustoßen.
Leukozyten-Oberflächenmoleküle, welche in die Vermittlung der Leukozyten-Adhäsion involviert sind, wurden kürzlich durch den Gebrauch der Hybridom-Technik identifiziert. Kurz gesagt, es wurden monoklonale Antikörper, die gegen humane T-Zellen gerichtet sind (Davignon, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4535-4539 (1981)) und Milzzellen der Maus (Springer, T., et al., Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979)) identifiziert, die an Leukozytenoberflächen binden und welche die oben beschriebenen, Bindungs-Funktionen inhibieren (Springer, T., et al., Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985)). Die Moleküle, die durch diese Antikörper erkannt werden, umfassen ein Set von Leukozytenadhäsionsrezeptoren, die als "Lymphozytenfunktionsassoziierte Antigen-1 Familie" (oder die "LFA-1 Familie") von Adhäsionsrezeptormolekülen bekannt sind.
Die LFA-1 Familie von Adhäsionsrezeptormolekülen enthält drei eng verwandte Zelloberflächenglycoproteine. Diese Glycoproteine sind als Mediatoren der Zell-Zell-Interaktionen bei Entzündungen bekannt geworden. Die Glycoproteine sind als "LFA-1" (Lymphozyten-funktionsassoziiertes Antigen-1), "Mac-1" und "p150,95" bezeichnet worden. Während LFA-1 auf der Oberfläche der meisten Leukozyten gefunden wird (Springer, T.A., et al, Immunol. Rev. 68:111-135 (1982)), werden Mac-1 und p150,95 primär auf Makrophagen, Granulozyten oder anderen großen granulären Lymphozyten gefunden (Springer, T.A., et al., Immunol. Rev. 68:111-135 (1982); Keizer, G., et al, Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)).
Die LFA-1 Glycoproteinfamilie besteht aus Heterodimeren, wobei jedes eine alpha-Untereinheit enthält, die nicht kovalent mit einer beta-Untereinheit assoziiert ist. Es hat sich herausgestellt, daß die alpha-Untereinheiten dieser Familie untereinander verschieden sind und sie sind als Cd11a, Cd11b und Cd11c bezeichnet worden. Die glycosylierten alpha- Untereinheiten haben ungefähre Molekulargewichte von 180, 170 bzw. 150 kd. Im Gegensatz dazu hat sich herausgestellt, daß die beta-Untereinheit der LFA-1 Familie von Adhäsionsrezeptoren identisch ist und ein Molekulargewicht von 95 kd hat (Sanchez- Madrid, F., et al., J. Ex-er. Med. 158:1785-1803 (1983); Keizer, G.D., et al., Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985): Springer, T., Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985); Sanchez-Madrid, F., et al., J. Exper. Med. 158:586-602 (1983)).
Obwohl die alpha-Untereinheiten der Glycoproteine nicht die extensive Homologie aufweisen wie die beta-Untereinheiten, so hat doch eine genaue Analyse der alpha-Untereinheiten der Glycoproteine gezeigt, daß wesentliche Ähnlichkeiten unter ihnen existieren. Übersichtsartikel über die Ähnlichkeiten zwischen den alpha- und beta-Untereinheiten der Adhäsionsmoleküle der Glycoprotein-Familie werden bei Sanchez- Madrid, F., et al. J. Exper. Med. 158:586-602 (1983); J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983); Miller, L.J., et al., J. Immunol. 138:2381-2383 (1987)) beschrieben.
Springer et al. (Nature 314: 540-542 (1985) berichten über die Reinigung der LFA-1 alpha-Untereinheit von Mauslymphomzellen und erhielten eine 19 Aminosäurereste lange N-terminale Aminosäuresequenz durch Aminosäuresequenzierung. Larson et al. (J. Cell. Biochem. 1987, Suppl. O (11 part D), S. 272) geben eine kurze Zusammenfassung der Isolierung von humanem LFA-1 und der Versuche, den entsprechenden cDNA Klon zu isolieren. Diese Publikation enthält jedoch keine ausreichenden Informationen, um einem Fachmann die Lösung dieser Aufgaben zu ermöglichen.
Die Wichtigkeit der Rezeptoren der LFA-1 Familie wurde erstmalig in Studien erkannt, die die Fähigkeiten von monoklonalen Antikörpern auf zeigten (welche einerseits in der Lage waren, an spezifische alpha-Untereinheiten oder an die gemeinsame beta-Untereinheit zu binden), adhäsions-abhängige Leukozytenfunktionen zu inhibieren (Sanchez-Madrid, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7389-7493 (1982); Beller, D.I., et al., J. Exper. Med. 156: 1000-1009 (1982)).
Kürzlich wurde eine Gruppe von Patienten identifiziert, die nicht in der Lage sind, normale Mengen irgendeines Mitglieds der LFA-1 Adhäsionsproteinfamilie auf ihrer Leukozyten-Zelloberfläche zu exprimieren. Diese Krankheit wurde "Leukozyten-Adhäsions-Defekt" oder "LAD" genannt und ist sowohl charakterisiert durch chronische und wiederkehrende Infektionen als auch durch andere klinische Symptome (Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Leukozyten von LAD-Patienten zeigen in vitro Defekte, die Ähnlichkeit haben mit solchen, welche man antrifft, wenn Leukozyten von normalen Personen antagonisiert werden durch Antikörper, die spezifisch gegen Mitglieder der LFA-1-Familie gerichtet sind. Es hat sich gezeigt, daß LAD-Patienten nicht in der Lage sind, eine normale Immunantwort zu starten. Es hat sich gezeigt, daß dieser Mangel in der Unfähigkeit von Leukozyten von LAD-Patienten begründet war, an zelluläre oder extrazelluläre Substrate zu binden (Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Diese Studien haben gezeigt, daß es zu Entzündungen kommt, falls Leukozyten nicht in der Lage sind, in einer normalen Weise zu binden, bedingt durch den Mangel an funktionellen Adhäsionsmolekulen auf ihrer Zelloberfläche.
Zusammenfassend hängt die Fähigkeit der Leukozyten, die Gesundheit und Lebensfähigkeit von Lebewesen aufrechtzuerhalten, davon ab, ob sie in der Lage sind, an andere Zellen (z.B. Endothelzellen) und Proteine (z.B. iC3b) zu binden. Es hat sich gezeigt, daß diese Adhäsion Kontakte benötigt, an denen auf der Leukozytenoberfläche vorhandene spezifische Rezeptormoleküle beteiligt sind. Es hat sich gezeigt, daß diese Zelloberflächen-Rezeptorenmoleküle untereinander eng verwandt sind. Menschen, deren Leukozyten diese Zelloberflächen- Rezeptorenmoleküle nicht haben, zeigen chronische und wiederkehrende Infektionen und ebenso andere klinische Symptome.
Da Leukozytenadhäsion in dem Prozeß eine Rolle spielt, durch welchen Fremdgewebe identifiziert und abgestoßen wird, ist ein Verständnis dieses Prozesses für die Gebiete der Organtransplantation, Gewebespendung, Allergie und Onkologie von signifikanten Wert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Leukozytenzelloberflächen-Adhäsionsrezeptormoleküle und im besonderen die Klonierung und Expression der humanen alpha-Untereinheit des LFA-1-Rezeptormoleküls unter Verwendung rekombinanter DNA- Technologie. Die Erfindung betrifft die Adhäsionsmoleküle selbst, funktionelle Fragmente dieser Moleküle, Nukleinsäuren (d.h. DNA, und insbesondere cDNA), die in der Lage sind, diese Rezeptormoleküle zu kodieren, und Plasmide, welche solche Nukleinsäuresequenzen enthalten. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich zusätzlich auf Verfahren zur Produktion der Rezeptormoleküle mit rekombinanter DNA-Technologie. Im Detail betrifft die Erfindung die humane LFA-1 alpha- Untereinheit oder ein funktionelles Derivat hiervon, die im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminationen ist.
Die Erfindung betrifft außerdem die obengenannte LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat hiervon, das auch in der Lage ist, an Moleküle zu binden (wie ICAM-1 oder LFA-1 beta-Untereinheit), die auf der Oberfläche von Zellen vorhanden sind.
Die Erfindung schließt auch das obengenannte LFA-1 alpha- Untereinheit-Molekül ein, wobei dieses Molekül wenigstens ein Polypeptid enthält, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a. P-P-R-A-G-R.H;
b. I-I-T-D-G-E-A;
c. D-W-A-G-G-F-L;
d. S-Q-V-Q-T-I-H;
e. R-H-G-G-L-S-P;
f. M-S-C-T-D-F-S;
g. R-L-L-S-R-A-L;
h. G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E;
i. D-I-N-G-D-G-L-V-D-V;
j. V-K-D-L-E-G-D-G-L-A;
k. T-Y-L-S-G-L;
l. Y-I-I-G-I-G-K;
m. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; und
n. P-S-I-H-N-I-P.
Die Erfindung schließt auch ein rekombinantes DNA-Molekül ein, das in der Lage ist, entweder die humane LFA-1 alpha- Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon zu exprimieren.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Gewinnung von LFA-1 alpha-Untereinheiten in im wesentlichen reiner Form, wobei man:
(a) die LFA-1 alpha-Untereinheit aus den Membranen von Zellen, die LFA-1 alpha-Untereinheiten exprimieren, solubilisiert, um eine solubilisierte LFA-1 alpha-Untereinheit- Präparation zu bilden,
(b) die solubilisierte LFA-1 alpha-Untereinheit- Präparation in eine Affinitätsmatrix einbringt, wobei die Matrix immobilisierte Antikörper enthält, die in der Lage sind, die LFA-1 alpha-Untereinheit zu binden,
(c) es der LFA-1 alpha-Untereinheit ermöglicht, an den Antikörper der Affinitätsmatrix zu binden,
(d) aus dieser Matrix alle Verbindungen entfernt, die nicht in der Lage sind, an den Antikörper zu binden und
(e) die LFA-1 alpha-Untereinheit in praktisch reiner Form durch Elution der LFA-1 alpha-Untereinheit aus der Matrix gewinnt.
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungen, die von einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems (wie Typ der verzögerten Überempfindlichkeit; graft versus host Erkrankung, Gewebetransplantatabstoßung, Organtransplantatabstoßung, Autoimmunerkrankungen wie Lupus erythematosus, autoimmune Thyreoiditis, experimentell allergische Enzephalomyelitis (EAE), Multiple Sklerose, einige Formen von Diabetes, Reynaud's Syndrom, rheumatoide Arthritis, etc.) bei Säugern verursacht worden sind, wobei einem zu behandelnden Patienten eine zur Unterdrückung der Entzündung ausreichende Menge eines anti-inflammatorischen Mittels verabreicht wird; wobei das anti-inflammatorische Mittel ausgewählt wird aus folgender Gruppe: der LFA-1 alpha- Untereinheit und einem funktionellen Derivat der LFA-1 alpha- Untereinheit.
Zur Erfindung gehört auch die Coadministration eines Mittels ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: der LFA-1 beta-Untereinheit und einem funktionellen Derivat der LFA-1 beta-Untereinheit.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Unterdrückung von Metastasen einer hämatopoietischen Tumorzelle, jener Zelle, die ein funktionelles Mitglied der humanen LFA-1-Familie für Migration benötigt, wobei das Verfahren auch die für einen zu behandelnden Patienten benötigte Menge eines anti-inflammatorischen Mittels zur Unterdrückung von Metastasen bereitstellt, wobei das anti- inflammatorische Mittel aus der Gruppe bestehend aus LFA-1 alpha-Untereinheit und einem funktionellen Derivat der LFA-1 alpha-Untereinheit, ausgewählt wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Wachstumsunterdrückung von Tumorzellen, die humane LFA-1 alpha- Untereinheit exprimieren, welche die Verabreichung eines Toxins, ausreichend zur Suppression des Wachstums, an zu behandelnde Patienten umfaßt, wobei das Toxin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Toxin-derivatisierter LFA-1 alpha- Untereinheit, und einem Toxin-derivatisierten funktionellen Derivat eines Mitgliedes der LFA-1 alpha-Untereinheit.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von aus der Antwort des spezifischen Abwehrsystems resultierenden Entzündungen und deren Ort bei Säugern, die vermutlich die Entzündung haben, und das folgende Maßnahmen umfaßt:
(a) Dem Patienten wird ein Mittel verabreicht, das eine auffindbar markierte, humane LFA-1 alpha-Untereinheit enthält, die eine Zelle zu identifizieren vermag, welche ICAM-1, oder einen anderen natürlichen Liganden für LFA-1 exprimiert, und
(b) Nachweis der LFA-1 alpha-Untereinheit.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von aus der Antwort des spezifischen Abwehrsystems resultierenden Entzündungen und deren Ort bei Säugern, die vermutlich diese Entzündung haben, und das folgende Maßnahmen umfaßt:
(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Patienten mit einem Mittel, das eine auffindbar markierte, humane LFA-1 alpha- Untereinheit enthält, welche eine Zelle zu identifizieren vermag, die ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 exprimiert, und
(b) Nachweis der LFA-1 alpha-Untereinheit.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von aus der Antwort des spezifischen Abwehrsytems resultierenden Entzündungen und deren Ort bei Säugern, die vermutlich diese Entzündung haben, und das folgende Maßnahmen umfaßt
(a) Inkubation der Gewebeprobe des Patienten mit einem Mittel, das ein Nukleinsäuremolekül enthält, welches in der Lage ist, an ein Molekül zu binden, das ausgewählt wird unter einer DNA-Sequenz der humanen LFA-1 alpha-Untereinheit, und einer mRNA-Sequenz eines Gens für LFA-1 alpha-Untereinheit, wobei die Bindung eine Zelle zu identifizieren vermag, welche in der Lage ist, an ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 zu binden und
(b) Nachweis des Nukleinsäuremoleküls.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von aus der Antwort des spezifischen Abwehrsystems resultierenden Entzündungen und deren Ort bei Säugern, die vermutlich die Entzündung haben, und das folgende Maßnahmen umfaßt:
(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Patienten mit einem Mittel, welches eine auff indbar markierte LFA-1 alpha- Untereinheit enthält, die Zellen zu identifizieren vermag, welche ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 exprimieren, und
(b) Nachweis der LFA-1 alpha-Untereinheit.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von Tumorzellen und deren Ort, welche ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 exprimieren, und zwar bei einem Patienten, der vermutlich solche Zellen hat, und das die folgenden Maßnahmen umfaßt:
(a) Dem Patienten wird ein Mittel verabreicht, das einen auffindbar markierten Bindungsliganden enthält, der an ICAM-1 oder den anderen natürlichen Liganden von LFA-1 zu binden vermag, wobei die Liganden ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus LFA-1 alpha-Untereinheit und einem funktionellen Derivat davon, und
(b) Nachweis des Bindungsliganden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von Tumorzellen und deren Ort, welche ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 exprimieren, bei einem Patienten, der vermutlich solche Zellen hat, und das folgende Maßnahmen umfaßt:
(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Patienten in Anwesenheit eines Mittels, welches einen auffindbar markierten Bindungsliganden enthält, der an ICAM-1 oder den anderen natürlichen Liganden von LFA-1 zu binden vermag, wobei die Liganden ausgewählt werden aus LFA-1 alpha-Untereinheit und einem funktionellen Derivat davon, und
(b) Nachweis des Bindungsliganden, welcher an das in der Gewebeprobe vorhandene ICAM-1 gebunden ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Figur 1 zeigt ein Profil der Reverse-Phase HPLC- Auftrennung von tryptischen Peptiden der LFA-1 alpha- Untereinheit. Die Elution wurde durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm (unteres Profil) und 214 nm (oberes Profil) verfolgt. Die durch einen Punkt markierten Peptide wurden einer Proteinmikrosequenzierung unterworfen. Die Linie durch das Profil zeigt den Acetonitrilprozentsatz an.
Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte des cDNA-Klones der LFA-1 alpha-Untereinheit. Restriktionsorte sind Bal I (B1), Bam HI (B), Bg1 II (Bg), Cla I (C), Eco RI (R), Hinc II (H), Nru I (N), Pst I (P), Sca I (Sc) und Sma I (S). Pfeile weisen auf die Strategie der Sequenzierung hin.
Figur 3 zeigt die Nukleotid- und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der LFA-1 alpha-Untereinheit. Die Sequenzen der tryptischen Peptide und der Transmembranregion sind mit einer dicken bzw. einer schattierten Linie unterstrichen. Die vermuteten Orte der Serinphosphorylierung sind umkreist. Die Nukleotide in der nicht translatierten 3'-Region, welche unterstrichen sind, entsprechen einer Alul-Sequenz.
Figur 4 zeigt ein Alignment der Internal Repeats der LFA-1 alpha-Untereinheit. Die flankierende Konsensus-Sequenz ist oberhalb der verglichenen Repeats gezeigt, während die divalente Konsensus-Bindungsstelle und vorher beschriebene Bindungsstellen darunter gezeigt werden. Ein Stern weist darauf hin, daß mehr als ein Sauerstoffatom an der Kationenbindung beteiligt ist.
Figur 5 zeigt ein Alignment der humanen LFA-1 alpha- Untereinheit mit anderen Mitgliedern der Integrin-Supergenfamilie und den N-terminalen Anteil der murinen LFA-1 alpha- Untereinheit. Die Reste, die LFA-1 und wenigstens ein Integrin gemeinsam haben, sind eingerahmt. Das Gebiet der Leukozyteneinfügung ist sichtbar. Die Grenzen der homologen Repeats, welche die divalenten Kationbindungsstellen enthalten, sind mit Dreiecken markiert. Die Protease-Schnittstellen in den ECM-Rezeptor alpha-Untereinheiten sind durch Pfeile markiert. Die transmembrane Region ist unterstrichen.
Figur 6 zeigt ein Alignment und einen Vergleich der LFA-1 alpha-Untereinheit-L-Domäne mit den homologen Domänen des von Willebrand's Faktor (vWF), Faktor B und CMP.
Figur 7 zeigt eine schematische Darstellung der evolutionären Beziehung der Domänen, die homolog zur L-Domäne sind.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

I. Die Eigenschaften der Leukozytenadhäsionsproteine der LFA- 1-Familie

Die drei Leukozytenadhäsionsproteine Mac-1, p150,95 und LFA-1 unterscheiden sich in der Funktion und Expression auf Leukozytensubpopulationen. Mac-1 und p150,95 werden in Neutrophilen und Monozyten exprimiert (Springer, T.A., et al., In: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118); Pitman, London, S. 102-126 (1986)). Während der Differenzierung von Blutmonozyten zu Gewebsmakrophagen nimmt die Expression von p150,95 stark zu, während die Expression von Mac-1 abnimmt (Schwarting, R., et al., Blood 65:974-983 (1985, Hogg, N., et al., Eur. J. Immunol. 16:240-248 (1986)). p150,95 wird auch auf einigen Typen aktivierter T- und B-Lymphozyten exprimiert, wird aber nicht in diesen Zellen im Blut exprimiert (Kaligaris- Cappio, F., et al., Blood 66:1035-1042 (1985); Miller, L.J., et al., J. Immunol. 137:2891-2900 (1986); Keizer, G.D., et al., J. Immunol. 138:3130-3136 (1987)).
Mac-1 und p150,95 werden in einem intrazellulären vesikulären Kompartiment von zirkulierenden Neutrophilen Leukozyten und Monozyten exprimiert, das durch Entzündungsmediatoren auf die Zelloberfläche mobilisiert wird (Todd, R.F., et al., J. Clin. Invest. 74:1280-1290 (1984); Springer, T.A., et al., In: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, London, S. 102-126 (1986); Lanier, L.L., et al., Eur. J. Immunol. 15:713-718 (1985); Yancey; K.B., et al., J. Immunol. 135:465-470 (1985)). Diese Mobilisierung korreliert mit gesteigerter Adhäsion (Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med. 38:175-194 (1987)).
Monoklonale Antikörper gegen Mac-1 oder p150,95 inhibieren die Aggregation neutrophiler Leukozyten und unterbinden auch die Adhärenz an Endothelzellen, protein-bedeckte Oberflächen, Bakterien, parasitäre Protozoen und Pilze (Harlan, J.M., et al., Blood 66:167-178); Springer, T.A., et al., In: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, London, S. 102-126 (1986); Dana, N., et al., J. Immunol. 137:3259 (1986); Bullock, W.D., et al., J. Exper. Med. 165:195- 210 (1987); Mosser, D.M., et al., J. Immunol. 135:2785-2789 (1985)).
Mac-1 ist auch ein Rezeptor für die Komplementkomponente iC3b (Beller, D.I., et al., J. Exper. Med. 156:1000-1009 (1982)). Es konnte gezeigt werden, daß detergenslösliches Mac-1 und p150,95 an iC3b-Sepharose binden konnten (Micklem, K.J., et al., Biochem. J. 231:233-236 (1985)).
LFA-1 ist auf allen Leukozyten, außer auf einer Subpopulation von Makrophagen, vorhanden. Blockierungsstudien mit monoklonalen Antikörpern haben gezeigt, daß LFA-1 wichtig ist bei der durch T-Lymphozyten vermittelten Tötung, der T- Helfer-Lymphozytenantwort, der natürlichen Tötung und der Antikörper-abhängigen Tötungsreaktion (Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)). Die Adhäsion an die Zielzelle ist ein Schritt, der durch Antikörper blockiert wird, die gegen LFA-1 gerichtet sind. Funktionelle Studien weisen darauf hin, daß LFA-1 mit verschiedenen Liganden in Interaktion tritt, einer davon ist ICAM-1 (Rothlein, R., et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)).
Es hat sich gezeigt, daß einige cytotoxische T-Lymphozytenklone vergleichbare Mengen an p150,95 und LFA-1 exprimieren. Monoklonale Antikörper, die gegen LFA-1 und p150,95 alpha-Untereinheiten gerichtet sind, inhibieren die Zellvernichtung durch CTL-Klone in einem ähnlichen Ausmaß und sind in ihren inhibitorischen Effekten additiv (Keizer, G.D., et al., J. Immunol. 138:3130-3136 (1987)). Des weiteren hat sich gezeigt, daß Antikörper gegen p150,95 alpha-Untereinheiten die Bindung von Monozyten am Endothelium inhibieren (Keizer, G.D., et al., Eur. J. Immunol. 17:1317-1322 (1987)).

II. Klonierung der LFA-1 alpha-Untereinheit

Für die Klonierung des LFA-1 alpha-Untereinheitgens können beliebige Verfahren verwendet werden. Bei einem derartigen Verfahren wird eine Shuttle-Vector-Genbank von cDNA-Inserts (abgeleitet von einer LFA-1 alpha-Untereinheit exprimierenden Zelle) auf die Anwesenheit eines Inserts analysiert, welches das LFA-1 alpha-Untereinheitgen enthält. Eine derartige Analyse kann erfolgen, indem man Zellen mit dem Vektor transfiziert und dann auf LFA-1 alpha-Untereinheitexpression testet. Eine bevorzugte Methode für die Klonierung des LFA-1 alpha- Untereinheitgens hat die Bestimmung der Aminosäuresequenz des LFA-1 alpha-Untereinheitmoleküls oder tryptischer Peptide des Moleküls zur Folge. Zu diesem Zweck werden LFA-1 alpha- Untereinheitmoleküle vorzugsweise von Produktionszellen durch monoklonale Antikörperaffinitäts-Chromatographie gereinigt und durch präparative Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese ("SDS-PAGE") isoliert und dann elektroeluiert (Miller, L.J., et al., J. Immunol. 138:2381-2383 (1987). Diese Literaturstelle wird hiermit ausdrücklich einbezogen. Die alpha-Untereinheitmoleküle werden durch Bromcyan oder durch Proteasen wie Papain, Chymotrypsin oder Trypsin fragmentiert (Oike, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:9751-9758 (1982); Liu, C., et al., Int. J. Pest. Protein Res. 21:209-215 (1983)). Vorzugsweise wird die alpha-Untereinheit proteolytisch durch Trypsin verdaut. Die daraus resultierenden Peptide werden durch Reverse-Phase HPLC aufgetrennt und der Aminosäuresequenzierung zugeführt. Zu diesem Zweck wird das Protein vorzugsweise mittels eines automatischen Sequenators analysiert. Obwohl es möglich ist, die gesamte Aminosäuresequenz der LFA-1 alpha- Untereinheit zu bestimmen, werden vorzugsweise die Sequenzen fragmentierter Peptide des Moleküls bestimmt. Eine bevorzugte Quelle für die LFA-1 alpha-Untereinheit ist die SKW3-Zellinie.
Die Sequenz der Aminosäurereste eines Peptides wird hier entweder mit Hilfe ihrer üblicherweise verwendeten Dreibuchstaben-Nomenklatur oder ihrer Einbuchstaben-Nomenklatur angegeben. Eine Auflistung dieser Dreibuchstaben- und der Einbuchstabennomenklatur kann in Handbüchern, z.B. Biochemistry. Lehninger, A., Orth Publishers, New Vork, NY (1970) gefunden werden. Falls eine derartige Sequenz vertikal aufgelistet ist, soll der aminoterminale Rest am oberen Ende der Liste sein und der carboxyterminale Rest des Peptides soll am Ende der Liste stehen. In ähnlicher Weise soll, falls horizontal aufgelistet, der Aminoterminus am linken Ende und der Carboxyterminus am rechten Ende sein.
Die Aminosäurereste in den Peptiden können durch Bindestriche getrennt sein. Diese Bindestriche sollen allein die Präsentation einer derartigen Sequenz erleichtern. Lediglich beispielhaft zeigt die Aminosäuresequenz:
-Gly-Ala-Ser-Phe-
daß ein Ala-Rest an eine Carboxygruppe von Gly, und daß ein Ser-Rest an die Carboxygruppe von Ala und an die Aminogruppe von Phe gebunden ist. Die Darstellung zeigt weiterhin, daß die Aminosäuresequenz das Tetrapeptid Gly-Ala-Ser-Phe enthält. Die Darstellung soll nicht die Aminosäuresequenz auf dieses eine Tetrapeptid beschränken, sondern sie soll einschließen (1) das Tetrapeptid, welches ein oder mehrere Aminosäuren entweder an sein Amino- oder Carboxyende gebunden hat, (2) das Tetrapeptid, welches einen oder mehrere Aminosäurereste sowohl an sein amino- als auch carboxyterminales Ende gebunden hat, (3) das Tetrapeptid, welches keine zusätzlichen Aminosäurereste hat.
Sobald ein oder mehrere geeignete Peptidfragmente sequenziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen untersucht, welche diese Peptide kodieren können. Da der genetische Code degeneriert ist, können mehr als ein Codon für die Kodierung einer bestimmten Aminosäure verwendet werden (Watson, J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356-357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um Aminosäuresequenzen zu identifizieren, welche durch Oligonukleotide mit der geringsten Degeneration kodierbar sind. Dies wird vorzugsweise mit der Identifikation von Sequenzen durchgeführt, welche Aminosäurereste enthalten, die nur durch einen einzigen Codon kodiert werden.
Obwohl gelegentlich eine Aminosäuresequenz nur durch ein einziges Oligonukleotid kodiert werden kann, werden die Aminosäuresequenzen häufig durch irgendein Set von ähnlichen Oligonukleotiden kodiert. Wichtig ist, daß alle Mitglieder dieses Sets Oligonukleotide enthalten, die in der Lage sind, das Peptidfragment zu kodieren, und potentiell dieselbe Oligonukleotidsequenz wie jenes Gen enthalten, welches das Peptidfragment kodiert. Aber nur ein Mitglied dieses Sets enthält die Nukleotidsequenz, die identisch ist mit der Nukleotidsequenz des Gens. Da dieses Miglied innerhalb des Sets vorhanden ist und dazu auch noch in der Lage ist, mit DNA selbst in der Gegenwart von anderen Mitgliedern dieses Sets zu hybridisieren, kann man das ungereinigte Set der Oligonukleotide in der gleichen Weise anwenden, in welcher man ein einziges Oligonukleotid anwenden würde, um das Gen zu klonieren, welches das Peptid kodiert.
Ein geeignetes Oligonukleotid oder ein Set von Oligonukleotiden, die in der Lage sind, ein Fragment des LFA-1 alpha-Untereinheitgenes zu kodieren (oder ein zu solch einem Oligonukleotid oder einem Set der Oligonukleotide komplementäres) wird identifiziert (mit dem oben beschriebenen Verfahren), wird synthetisiert, und wird dann mit Hilfe allgemein bekannter Verfahren hybridisiert. Diese Hybridisierung erfolgt mit einer DNA oder stärker bevorzugt, einer Präparation von cDNA, die von humanen Zellen abstammt, und die dazu auch noch in der Lage ist, das LFA-1 alpha- Untereinheitgen zu exprimieren. Techniken der Nukleinsäurehybridisierung werden bei Maniatis, T., et al. beschrieben (In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982), und durch Haymes, B.D., et al. (In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)). Diese Literaturstelle wird hiermit ausdrücklich einbezogen. Die für DNA oder cDNA verwendete Quelle ist vorzugsweise mit LFA-1 alpha-Untereinheitsequenzen angereichert worden. Derartige Anreicherungen können am einfachsten mit cDNA erreicht werden, die durch Extraktion von RNA aus Zellen erhalten wird, die einen hohen Gehalt an LFA-1 alpha-Untereinheit produziert.
Techniken, wie die oben beschriebenen oder ähnliche haben die erfolgreiche Klonierung von Genen der humanen Aldehyd Dehydrogenase (Hsu, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3771-3775 (1985)), des Fibronectins (Suzuki S., et al., Eur. Mol. Biol. Organ, J. 4:2519-2524 (1985)), des humanen Östrogenrezeptorgens (Walter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7889-7893 (1985), des Gewebsplasminogenaktivators (Pennica, D., et al., Nature 301:214-221 (1983)) und der komplementän DNA humaner terminaler plazentaler alkalischer Phosphatase (Kam, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8715-8719 (1985)) ermöglicht.
Durch den genetischen Code (Watson, J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), können ein oder mehrere verschiedene Oligonukleotide identifiziert werden, wobei jedes davon in der Lage wäre, die tryptischen Peptide der LFA-1 alpha-Untereinheit zu kodieren. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Oligonukleotid die LFA-1 alpha-Untereinheit kodierende Sequenz tatsächlich darstellt, kann abgeschätzt werden, indem man abnormale Basenpaarungen und die Häufigkeit berücksichtigt, mit der ein bestimmtes Codon in Eukaryotenzellen tatsächlich benützt wird (um eine bestimmte Aminosäure zu kodieren). Derartige "Codon-Nutzungs-Regeln" sind bei Lathe, R., et al., J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985) beschrieben. Durch die Anwendung der "Codon-Nutzungs-Regeln" von Lathe, kann ein einziges Oligonukleotid oder ein Set von Oligonukleotiden identifiziert werden, das eine theoretisch "wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz enthält, die in der Lage ist, die Sequenzen der tryptischen Peptide der LFA-1 alpha-Untereinheit zu kodieren.
Das Oligonukleotid, oder das Set von Oligonukleotiden mit der theoretisch "wahrscheinlichsten" Sequenz, die Fragmente der LFA-1 alpha-Untereinheit zu kodieren vermag, wird für die Identifizierung der Sequenz eines komplementären Oligonukleotids oder eines Sets von Oligonukleotiden verwendet, das in der Lage ist, mit der "wahrscheinlichsten" Sequenz oder Set von Sequenzen zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid, das solch eine komplementäre Sequenz enthält, kann als Sonde zur Identifizierung und Isolierung des LFA-1 alpha- Untereinheitgenes eingesetzt werden (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Somit erlaubt die tatsächliche Identifizierung von LFA-1 alpha Untereinheit-Peptidsequenzen die Identifizierung einer theoretisch "wahrscheinlichsten" DNA-Sequenz oder eines Sets derartiger Sequenzen, die bzw. das ein derartiges Peptid kodieren kann. Durch Konstruktion eines Oligonukleotides, das zu dieser theoretischen Sequenz komplementär ist (oder durch Konstruktion eines Sets von Oligonukleotiden, die zu dem Set "wahrscheinlichster" Oligonukleotide komplementär sind), erhält man ein DNA-Molekül (oder ein Set von DNA-Molekülen), das als Sonde fungieren kann, um das Gen der LFA-1 alpha-Untereinheit zu identifizieren und zu isolieren.
Einzelstrang-Oligonukleotidmoleküle, die zu den "wahrscheinlichsten" Sequenzen tryptischer Peptide der LFA-1 alpha-Untereinheit komplementär sind, wurden mit Verfahren synthetisiert, die dem Fachmann allgemein bekannt sind (Belagaje, R., et al., J. Biol. Chem. 254:5765-5780 (1979); Maniatis, T., et al., In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, Nierlich, D.P., et al., Eds., Acad. Press, NY (1976); Wu, R., et al., Prof. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978); Khorana, R.G., Science 203:614-625 (1979)). Außerdem kann die DNA-Synthese durch automatische Syntheseapparaturen erreicht werden.
Es ist möglich, das Gen der LFA-1 alpha-Untereinheit eukaryotischer DNA-Präparationen zu klonieren, die dieses Gen enthalten. Um das Gen, welches das Protein der LFA-1 alpha- Untereinheit kodiert, zu identifizieren und zu klonieren, wird eine DNA oder vorzugsweise eine cDNA Bibliothek auf ihre Fähigkeit gescreent, mit den oben beschriebenen Oligonukleotidsonden zu hybridisieren. Brauchbare DNA- Präparationen (wie humane genomische DNA) werden enzymatisch gespalten, oder randomisiert geschnitten, und dann in rekombinante Vektoren eingebaut. Dann wird die Fähigkeit dieser rekombinanten Vektoren untersucht, mit den oben beschriebenen Oligonukleotidsonden zu hybridisieren. Verfahren für die Hybridisierung werden zum Beispiel bei Maniatis, T., (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)) oder in Haymes, B.T., et al., (Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985)) beschrieben. Für eine derartige Hybridisierung geeignete Vektoren werden dann analysiert, wobei die Länge und Eigenschaften der vorhandenen Sequenzen der LFA-1 alpha-Untereinheit bestimmt wird. Nach rein statistischen Gesichtspunkten könnte ein Gen, zum Beispiel eines, welches das Molekül der LFA-1 alpha-Untereinheit kodiert, unzweifelhaft identifiziert werden (durch Hybridisierungs-Screening). Das kann durch Verwendung einer Oligonukleotidsonde, die nur 18 Nukleotide enthält, erfolgen.
Ein nach der oben beschriebenen Methode kloniertes Gen der LFA-1 alpha-Untereinheit kann an einen Expressionsvektor operabel gekoppelt und in eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle eingeführt werden, um das Protein der LFA-1 alpha-Untereinheit zu produzieren. Techniken für derartige Verfahren werden bei Maniatis, T., et al., supra, beschrieben, und sind allgemein bekannt.

III. Die Expression der LFA-1 alpha-Untereinheit

Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil aus der Aufklärung der cDNA-Sequenz, welche die alpha-Untereinheit des LFA-1 Moleküls kodiert. Durch operable Verknüpfung dieser Sequenz (oder eines Fragments dieser Sequenz) mit einem funktionellen Promotor ist es möglich, die Expression der alpha- Untereinheit von LFA-1 in einer Zelle oder einem Organismus zu steuern.
Man nimmt an, daß ein Nukleinsäuremolekül, zum Beispiel die DNA, in der Lage ist, ein Polypeptid zu "exprimieren", wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die regulatorische Informationen für Transkription und Translation enthalten. Zusätzlich müssen derartige Sequenzen "operabel verknüpft" sein mit Nukleotidsequenzen" die Polypeptide kodieren. Eine operable Verknüpfung ist eine Verknüpfung, in der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, so untereinander verbunden sind, daß die Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der regulatorischen Region, die für die Genexpression notwendig sind, kann von Organismus zu Organismus variieren, wird aber generell eine Promotorregion einschließen, die, in Prokaryoten, sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription steuert) als auch die DNA-Sequenzen enthält, die, falls in RNA transkribiert, die Initia-tion der Proteinsynthese auslösen wird. Regulatorische Regionen in Eukaryotenzellen werden im allgemeinen eine Promo-torregion einschließen, die ausreicht, die Initiation von RNA-Synthesen zu steuern.
Zwei DNA-Sequenzen (zum Beispiel eine Promotorregion- Sequenz und eine LFA-1 alpha-Untereinheit-kodierende Sequenz) sind definitionsgemäß operabel verbunden, wenn die Verbindung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zur Einführung einer Frame-Shift-Mutation führt, (2) nicht die Fähigkeit der Promotorregionsequenz stört, die Transkription der kodierenden Sequenz der LFA-1 alpha-Untereinheit zu steuern oder (3) nicht die Fähigkeit der kodierenden Sequenz der LFA-1 alpha- Untereinheit stört, durch die Sequenz der Promotorregion transkribiert zu werden. Deshalb würde eine Promotorregion operabel an eine DNA-Sequenz gebunden sein, wenn der Promotor in der Lage wäre, die Transkription der DNA-Sequenz zu bewirken.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Expression der LFA-1 alpha-Untereinheit (oder eines funktionellen Derivats hiervon) in einer Prokaryoten- oder Eukaryotenzelle. Um die LFA-1 alpha- Untereinheit (oder ein funktionelles Derivat hiervon) in einer Prokaryotenzelle (wie z.B. E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, etc.) zu exprimieren, ist es notwendig, die kodierende Sequenz der LFA-1 alpha-Untereinheit operabel an einen funktionellen Prokaryoten-Promotor zu binden. Dieser Promotor kann entweder konstitutiv oder vorzugsweise regulierbar sein (d.h., induzierbar oder derepressiv). Beispiele für einen konstitutiven Promotor sind: int Promotor des Bakteriophagen λ, der bla Promotor des β-Lactamasegenes von p8R322, und CAT Promotor des Chloramphenicolacetyl- Transferasegenes von pPR325, etc. Beispiele für induzierbare prokaryotische Promotoren sind: Die rechten und linken Haupt- Promotoren des Baketeriophagen λ (PL und PR), die tro, recA, lacz, lacI, und gal Promotoren von E. coli, die α-Amylase(Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162:176-182 (1985) und die -28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman, M.Z., et al., Gene 32:11-20 (1984)), die Promotoren von Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, T.J., In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), und Streptomyces Promotoren (Ward, J.M., et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986)). Prokaryotische Promotoren sind bei Glick, B.R., beschrieben (J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. Biochimie 68:505-516 (1986)); und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)).
Geeignete Expression in Prokaryotenzellen erfordert die Anwesenheit einer Bindungsstelle für Ribosomen, die stromaufwärts von der Gen-kodierenden Sequenz liegt. Derartige Bindungsstellen für Ribosomen sind z.B. bei Gold, L., et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404 (1981)) beschrieben.
Wenn die Expression in Eukaryotenzellen gewünscht ist, zum Beispiel in Hefen, Pilzen, Säugetierzellen oder Pflanzenzellen, wird es notwendig sein, einen Promotor einzusetzen, der die Transkription in solch einer Eukaryotenwirtszelle zu steuern vermag. Bevorzugte Eukaryotenpromotoren schließen den Promotor des Maus-Metallothionein I-Gens ein (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); den TK Promotor des Herpesvirus (Mcknight. S., Cell 31:355-365 (1982)); den SV40 Promotor (Benoist, C., et al., Nature (London) 290:304-310 (1981)); den Hefe gal4 Genpromotor (Johnston, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver, P.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984)).
Es ist allgemein bekannt, daß die Translation einer eurkaryotischen mRNA an dem Codon initiiert wird, welches für das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grunde muß vorzugsweise dafür Sorge getragen werden, daß die Verbindung zwischen einem Eukaryotenpromotor und einer DNA-Sequenz, welche die LFA-1 alpha-Untereinheit (oder ein funktionelles Derivat hiervon) kodiert, auf keinen Fall irgendwelche dazwischenliegende Codons enthält, die Methionin (d.h. AUG) kodieren können. Die Anwesenheit derartiger Codons resultiert entweder in der Bildung eines Fusionsproteins (wenn das AUG Codon in demselben Leserahmen liegt wie die DNA-Sequenz, die LFA-1 kodiert) oder in einer Frame-Shift-Mutation (wenn das AUG Codon nicht in demselben Leserahmen ist wie die Sequenz, die LFA-1 kodiert).
Eine DNA-Sequenz, die das LFA-1 Protein kodiert (oder ein funktionelles Derivat hiervon), wird vorzugsweise in die Empfängerzelle durch irgendeine geeignete Maßnahme eingeführt, wie Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, etc. Voraussetzung aber hierfür ist eine operable Verbindung dieser DNA-Frequenz mit einem funktionellen Promotor.
Die Sequenz, welche die LFA-1 alpha-Untereinheit kodiert, kann zusammen mit einem operabel verbundenen Promotor als nicht-replizierendes DNA (oder RNA) Molekül in eine Wirtszelle eingeführt werden. Dieses kann entweder ein lineares Molekül oder vorzugsweise ein geschlossenes, kovalentzirkuläres Molekül sein. Da diese Moleküle keine autonome Replikation durchführen können, kann die Expression der Polypeptide der LFA-1 alpha- Untereinheit durch transiente Expression der eingeführten Sequenzen erfolgen. Als Alternative könnte die permanente Expression durch die Integration der eingeführten Sequenz in ein Wirtschromosom erfolgen.
Vorzugsweise wird die eingeführte Sequenz in ein Plasmid oder viralen Vektor inkorporiert, der im Empfängerwirt autonom replizieren kann. Eine große Vielzahl von Vektoren kann für diesen Zweck verwendet werden. Wichtige Faktoren für die Wahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors schließen ein: Die Einfachheit, mit der die den Vektor enthaltenden Empfängerzellen erkannt und von denjenigen Empfängerzellen abgetrennt werden können, welche den Vektor nicht enthalten; die Zahl der Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht wird; und ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Spezies austauschen zu können. Bevorzugte prokaryotische Vektoren schließen Plasmide ein, die in E. coli replizieren können (zum Beispiel pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, πVX). Diese Plasmide sind zum Beispiel bei Maniatis, T., et al. (In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)) beschrieben. Plasmide von Bacillus schließen pC194, pC221, pT127, etc. ein. Diese Plasmide sind bei Gryczan, T. beschrieben (In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), S. 307-329). Geeignete Plasmide von Streptomyces schließen pIJ101 (Kenda , K.J., et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987)), und Bakteriophagen von Streptomyces ∅ C31 ein (Chater, K.F., et al., In: Sixth International Symposium on Actinomyceteles Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), S. 45-54). Plasmide von Pseudomonas sind von John, J.F., et al. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)), und Izaki, K. (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978)) beschrieben worden.
Bevorzugte eukaryotische Plasmide schließen BPV, Vaccinia, SV40, 2 Mikron-Ring, etc. oder ihre Derivate ein. Diese Plasmide sind allgemein bekannt (Botstein, D., et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); Broach, J.R., In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445- 470 (1981); Broach, J.R., Cell 28:203-204 (1982); Bollon, D.P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis; T., In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Expression, Academic Press, NY, S. 563-608 (1980)).

IV. Verwendung der LFA-1 alpha-Untereinheit oder der Fragmente davon

Die vorliegende Erfindung stellt die Nukleinsäure- und die Proteinsequenzen der alpha-Untereinheit des LFA-1 Rezeptormoleküls bereit. Dies ermöglicht den Einsatz rekombinanter DNA-Technologie, um das Molekül der LFA-1 alpha- Untereinheit zu produzieren. Wie weiter unten diskutiert, betrifft eine erfindungsgemäße Ausführungsform die Verwendung der alpha-Untereinheit des LFA-1 Moleküls als anti- inflammatorisches Mittel. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die alpha-Untereinheit des LFA-1-Moleküls in Kombination mit ihrer beta-Untereinheit verwendet. Diese Kombination kann nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Zum Beispiel kann die beta-Untereinheit von LFA-1 unabhängig von der alpha- Untereinheit von LFA-1 produziert werden. Dann können die zwei Moleküle miteinander kombiniert werden. Vorzugsweise wird aber sowohl die alpha- als auch die beta-Untereinheit von LFA-1 in derselben Wirtszelle produziert, um ihre Selbstanordnung zu einem LFA-1 Heterodimer-Rezeptormolekül zu erleichtern. Die beta-Untereinheit von LFA-1 (die in LFA-1 und Mac-1 gemeinsam vorhanden ist), kann entweder durch chemische Synthese oder durch rekombinante DNA Techniken produziert werden (Kishimoto, T.K., et al., Cell 48:681-690 (1987)). Die Klonierung der beta- Untereinheit von LFA-1 ist weiterhin in der US-Patentanmeldung der Anmelderin mit der Anmelde-Nr. 019,440, welche am 26. Februar 1987 eingereicht wurde, beschrieben, die hiermit ausdrücklich einbezogen wird.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen der alpha-Untereinheit des LFA-1 Rezeptormoleküles. Dies erlaubt den Einsatz rekombinanter DNA-Technologie, um ein funktionelles Derivat der LFA-1 alpha-Untereinheit zu produzieren, welches als Antagonist der Zelladhäsion funktionieren kann. Hierin ist mit "Antagonist der Zelladhäsion" ein Molekül gemeint, welches in der Lage ist, den Prozeß der Zell-Zell- oder Zell-Substrat-Adhäsion zu inhibieren. Man kann feststellen, ob eine bestimmte Verbindung ein Antagonist ist, indem man einen Test zur Leukozytenaggregation an Endothelzel-len durchführt. Geeignete Tests für die Leukozytenaggregation sind zum Beispiel bei Rothlein, R. et al. (J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986)) beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird. Antagonisten der Leukozytenaggregation können als anti-inflammatorische Mittel verwendet werden.
Im vorliegenden Fall ist ein "funktionelles Derivat" der LFA-1 alpha-Untereinheit eine Verbindung, welche eine biologische Aktivität besitzt (entweder funktionell oder strukturell), die im wesentlichen gleichartig ist mit der biologischen Aktivität der alpha-Untereinheit von LFA-1. Beispiele für biologische Aktivitäten schließen die Fähigkeit der Bindung an ICAM-1 ein, ein anderer natürlicher Ligand des LFA-1 Moleküles, oder an die beta-Untereinheit der LFA-Familie von Glycoproteinen. Eine derartige Bindung würde adhäsionsbedingte Reaktionen inhibieren, z. B. die Bindung von Lymphozyten an Endothelzellen, antigenpräsentierende Zellen oder Zielzellen. Man sagt, daß ein Molekül "im wesentlichen gleichartig" mit einem anderen Molekül ist, wenn beide Moleküle im wesentlichen gleichartige Strukturen oder beide Moleküle gleichartige biologische Aktivität besitzen. Das "funktionelle Derivat" der alpha-Untereinheit von LFA-1 schließt sowohl "Fragmente" als auch "Varianten" der LFA-1 alpha-Untereinheit ein. Der Ausdruck "Fragment der alpha-Untereinheit von LFA-1" soll sich auf beliebige Polypeptid-Untergruppen dieses Moleküls beziehen. Der Ausdruck "Variante der alpha-Untereinheit von LFA-1" soll sich auf ein Molekül beziehen, das im wesentlichen die gleiche Struktur hat wie das gesamte Molekül, oder ein Fragment davon, vorausgesetzt die "Variante" besitzt wenigstens eine biologische Aktivität, die entweder gleichartig mit der Aktivität der alpha-Untereinheit von LFA-1 ist oder eine Aktivität von LFA-1 hemmt. Vorausgesetzt ein Molekül hat wenigstens eine biologische Aktivität, die entweder Ähnlichkeit mit LFA-1 hat oder diese Aktivität hemmt, so wird dieses als "Variante" der alpha-Untereinheit von LFA-1 im hier gebrauchten Sinn angesehen, selbst wenn eines der Moleküle eine oder mehrere Aminosäuren enthält, die nicht im anderen vorhanden sind, oder wenn die Sequenzen der Aminosäurereste in den beiden Molekülen nicht identisch sind. Beispielsweise würde eine Verbindung, der ein oder mehrere Aminosäurereste fehlen (oder diese enthält) die in der alpha-Untereinheit von LFA-1 vorhanden (oder nicht vorhanden) sind, als Variante der alpha- Untereinheit von LFA-1 angesehen werden, wenn diese Verbindung eine biologische Aktivität besäße, die mit der biologischen Aktivität der alpha-Untereinheit von LFA-1 vergleichbar wäre (oder diese inhibiert). Der Ausdruck "biologische Aktivität" soll sowohl "katalytische" als auch "strukturelle" Aktivität umfassen (d.h. die Fähigkeit, an ein anderes Molekül, wie ICAM- 1, einen anderen natürlichen Ligand des LFA-1 Moleküls, die beta-Untereinheit von LFA-1, oder Antikörper, die gegen die alpha-Untereinheit von LFA-1 gerichtet sind, zu binden) etc.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode zur Herstellung funktioneller Derivate der Untereinheit des LFA-1 Moleküls bereit. Um solche Derivate zu erhalten, ist es nur notwendig, eine DNA, RNA oder (vorzugsweise) die cDNA-Sequenz, welche die LFA-1 alpha-Untereinheit kodiert, zu mutieren. Die Mutation kann entweder randomisiert oder ortsspezifisch erfolgen. Außerdem kann die Mutation entweder spontan erfolgen oder durch chemische, radioaktive oder rekombinante Techniken induziert werden.
Die vorliegende Erfindung soll außerdem funktionelle Derivate, denen bestimmte Aminosäurereste fehlen oder die veränderte Aminosäurereste enthalten, umfassen, solange derartige Derivate die Fähigkeit haben, zelluläre Adhäsion zu verstärken oder zu hemmen.
Chemische Mutagene schließen Basenanaloga ein (zum Beispiel 5-Bromouracil oder 2-Aminopurin); desaminierende Mittel (zum Beispiel salpetrige Säure, Hydroxylamin, etc.); alkylierende Mittel (zum Beispiel Methylmethansulfonat, Nitrosoguanidin, etc.); oder intercalierende Substanzen (zum Beispiel Acridinorange, Ethidiumbromid, Psoralen, etc.). Stahleninduzierte Mutation kann durch Mittel, wie ultraviolettes Licht, Gammastrahlung, Röntgenstrahlung, etc., verursacht werden. Techniken für die Mutation von Nukleinsäuremolekülen sind bei Miller, J.H. (In. Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972)), und Shilhavy, T.J., et al. (In: Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)) zu finden.
Ortspezifische Mutagenese kann für die Erzeugung spezifischer Mutationen an gewünschten Stellen der Nukleinsäure, welche die LFA-1 alpha-Untereinheit kodiert, angewendet werden. Zu derartigen Verfahren gehört die Synthese von synthetischen Oligonukleotiden mit einer gewünschten und definierten DNA-Sequenz. Verfahren für die Synthese derartiger Oligonukleotide sind bei Itakura, K., et al. (Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)) beschrieben. Ein Nukleinsäuremolekül, welches das LFA-1 alpha-Untereinheit-Protein, oder ein funktionelles Derivat hiervon, kodiert, wird im allgemeinen auf einen Doppelstrangvektor, zum Beispiel M13, ∅X174, etc. subkloniert, dessen Einzelstränge voneinander getrennt werden können. Ein Einzelstrang dieses Vektors wird dann in Gegenwart von synthetischen Oligonukleotiden inkubiert. Da die DNA der Oligonukleotide kontrollierbar festgelegt ist, kann man ein Oligonukleotid herstellen, welches eine Basenpaarung mit irgendeinem Bereich der die LFA-1 alpha-Untereinheit kodierenden Nukleinsäure eingehen kann. Wenn erst einmal eine Basenpaarung zwischen dem Oligonukleotid und dem Einzelstrangplasmid stattgefunden hat, kann man das Oligonukleotid durch die DNA-Polymerase verlängern, um ein Doppelstrang-DNA-Molekül herzustellen, das dann mittels DNA- Ligase verbunden wird. Falls dieses Doppelstrang-DNA-Molekül in eine Zelle eingeführt wird, führt die semikonservative DNA- Replikation zur Erzeugung von Tochtermolekülen, in denen die DNA-Sequenz des Oligonukleotidfragments der LFA-1 alpha- Untereinheit kodierenden Sequenz eingefügt worden ist.
Die LFA-1 alpha-Untereinheit der vorliegenden Erfindung oder ihre funktionellen Derivate, können alternativ durch synthetische chemische Methoden unter Einsatz des bekannten Marriefield-Verfahrens oder anderer Techniken der Peptidsynthese hergestellt werden. Alternativ können derartige Moleküle auch durch chemische Synthese der Nukleinsäuremoleküle hergestellt werden (zum Beispiel unter Verwendung der Phosphodiester-Synthesetechnik), wobei die Expression zur Produktion ihrer Moleküle führt.
Falls die Einfügung einer Punktmutation und einer exogener DNA-Sequenz in eine spezifische Stelle der LFA-1 kodierenden Sequenz, oder eine Deletion von Nukleotiden, die üblicherweise in einer derartigen Sequenz vorhandenen sind, gewünscht wird, würde man ein Oligonukleotidfragment konstruieren, welches die Mutation oder die Sequenz enthält (oder nicht enthält) und dann das oben geschilderte Verfahren durchführen. Um eine derartige Mutation oder exogene DNA-Sequenz in eine bestimmte Region der die LFA-1 alpha-Untereinheit kodierenden Nukleinsäure einzubringen, ist es notwendig, die Mutation oder die exogene DNA-Sequenz mit flankierenden DNA-Sequenzen zu umgeben, die komplementär zu DNA-Sequenzen jener Region sind, deren Mutation gewünscht ist (Jenkins, F., et al., Bioessays 5:244-247 (1986); Doerfler, W., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:919-931 (1984); Kaina, B., Biol. Zentralbl. 99:513-531 (1980); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:488-492 (1985); Nisbet, I.T., et al., Gene Anal. Tech. 2:23-29 (1985); Hines, J.C., et al., Gene 11:207-218 (1980); Messing, J., et al., Nucl. Acid. Res. 9:309 (1981)).
Mutationen können auch durch die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie produziert werden. Zum Beispiel kann die Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, welches die LFA-1 alpha-Untereinheit kodiert, gescannt werden, um oligonukleotidpositionen zu identifizieren, welche durch Restriktions-Endonukleasen erkannt werden. Derartige Endonukleasen können dann verwendet werden, um spezifisch die Nukleinsäuresequenz an der erkannten Stelle zu schneiden. Durch die Verwendung einer Restriktions-Endonuklease, die zwei Positionen in der LFA-1 Sequenz erkennen (und dort auch schneiden) kann, ist es möglich, ein Fragment der LFA-1 alpha- Untereinheit kodierenden Sequenz herauszuschneiden. Anderseits ist es möglich, zwei unterschiedliche Endonukleasen für diesen Zweck einzusetzen. Man kann die LFA-1 alpha-Untereinheit kodierenden Sequenzen unter Bildung einer einzigen Sequenz (ohne das herausgeschnittene Fragment) wieder verbinden, indem man die geschnittenen Moleküle mit DNA-Ligase inkubiert. Falls keine geeignete Restriktions-Endonuklease für die Erkennungsorte der die alpha-Untereinheit von LFA-1 kodierenden Sequenzen vorhanden ist, können derartige Erkennungsorte in die Sequenzen durch ortspezifische Mutagenese nach oben beschriebenem Verfahren eingefügt werden.
Durch Schneiden der LFA-1 alpha-Untereinheit kodierenden Sequenz und anschließende "Verdauung" der freien Enden mit einer Exonuklease können Mutationen in alternativer Weise eingefügt werden. Durch eine derartige Behandlung kann man nicht nur Deletionen, sondern auch Frame-Shift- und andere Arten von Mutationen einfügen. Darüber hinaus kann diese Technik neue Stellen für Restriktions-Endonukleasen in die Sequenz einfügen, welche die LFA-1 alpha-Untereinheit kodieren. Verfahren für die Verwendung von Restriktions-Endonukleasen, DNA-Ligasen und Exonukleasen sind zum Beispiel bei Maniatis, T., et al. (In: Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)), beschrieben.
Rekombinante DNA-Techniken können auch zur Herstellung von Fusionsproteinen eingesetzt werden, die aus Protein der alpha- Untereinheit von LFA-1 (oder einem funktionellen Derivat davon) und einem neuartigen Polypeptid bestehen. Dieses neuartige Polypeptid beschränkt sich nicht auf irgendein bestimmtes Polypeptid. Es umfaßt entweder eine einzelne Aminosäure oder ein Set oder eine Permutation von Aminosäuren. Derartige Fusionsmoleküle können durch Ligation einer DNA-Sequenz, die das neue Polypeptid kodiert, mit einer DNA-Sequenz, die die LFA-1 alpha-Untereinheit (oder ein funktionelles Derivat hiervon) kodiert, ohne Einfügung einer Frame-Shift-Mutation erzeugt werden. Beispiele für bevorzugte Polypeptide, die mit dem Gen der LFA-1 alpha-Untereinheit (oder einem funktionellen Derivat hiervon) fusioniert werden können, schließen eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenzen (Gilbert, W., et al., U.S. Patent No. 4,411,994; Casadaban, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:4530-4533 (1979)), oder Polypeptide ein, die Stabilität, biologische Halbwertzeit oder Wirksamkeit der LFA-1 alpha-Untereinheit (oder eines funktionellen Derivates hiervon) erhöhen (oder vermindern). Einen ausgezeichneten Überblick über Verfahren zur Genfusionen gibt Silhavy, T.J., et al. (In: Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)).
Antikörper (speziell monoklonale Antikörper) können als Antwort auf eine Immunisierung mit Fragmenten der LFA-1 alpha- Untereinheit erzeugt werden. Derartige Antikörper können eingesetzt werden, um die Bindung einiger Leukozyten an Endothelzellen, antigenpräsentierende Zellen oder Zielzellen zu verhindern, und können so als anti-inflammatorische Mittel Verwendung finden.
Durch die obenbeschriebenen Methoden können Fragmente der LFA-1 alpha-Untereinheit hergestellt werden und daraufhin geprüft werden, ob sie Antagonisten der Zelladhäsion sind. Fragmente, die Antagonisten der Zelladhäsion sind, können als anti-inflammatorische Mittel in Übereinstimmung mit der hier beschriebenen Erfindung eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Festellung, daß die Leukozyten-Substrat-Adhäsion und die Leukozyten- Endothelzellen-Adhärenz aus Wechselwirkungen unter Beteiligung des LFA-1-Rezeptors resultiert. Da die zelluläre Adhäsion für die Migration der Leukozyten zu Entzündungsorten und/oder für verschiedene Effektorfunktionen, die zur Entzündung beitragen, notwendig ist, werden Mittel, die derartige zelluläre Adhäsionen verhindern, Entzündungen mildern oder verhindern. Das LFA- 1-Rezeptormolekül ist auf der Oberfläche der Leukozyten vorhanden. Die Adhäsion derartiger Zellen an Monolayers von Endothelzellen wird zum Teil durch LFA-1 vermittelt.
Die Interaktion von LFA-1-Molekülen mit ihren natürlichen Liganden (z.B. ICAM-1, etc.) ist von zentraler Bedeutung für zelluläre Adhäsion. Mit der Adhäsion können Lymphozyten ein Lebewesen kontinuierlich auf die Anwesenheit von Fremdantigenen hin überwachen. Obwohl diese Vorgänge normalerweise wünschenswert sind, sind sie auch der Grund für Organ-Transplantat-Abstoßung, Gewebe-Transplantat-Abstoßung und viele Autoimmunerkrankungen. Aus diesem Grunde sind alle erdenklichen Mittel für die Abschwächung oder Inhibition der zellulären Adhäsion für Empfänger von Organ-Transplantaten, Gewebe-Transplantaten oder für Autoimmunpatienten höchst wünschenswert.
Mittel, die diese Interaktionen antagonisieren, sind für Säuger als anti-inflammatorische Mittel sehr geeignet. Es ist bezeichnend, daß sich derartige Mittel von allgemein antiinflammatorischen Mitteln darin unterscheiden, daß sie selektiv die Adhäsion inhibieren und keine anderen Nebenwirkungen zeigen, z.B. Nephrotoxizität, die bei konventionellen Mitteln auftritt. Mittel, die an die alpha-Untereinheit von LFA-1, oder an ICAM-1, oder einen anderen natürlichen Liganden des LFA-1 Moleküls binden, können aus diesem Grunde zur Verhinderung von Organ- oder Gewebeabstoßung, Graft-Versus-Host Erkrankung (das ist eine Abstoßung von Wirtsgewebe, hervorgerufen durch die Spende von Knochenmark oder anderem Gewebe, das Lymphozyten enthält oder bildet) beitragen, oder die Autoimmunantworten durch Beeinflussung mit zellgebundenem LFA-1 ohne Gefahr von Nebenwirkungen modifizieren (z.B. Interaktion mit zellgebundenen Liganden, etc.).
Es ist wichtig, daß Mittel, die derartige Moleküle erkennen können, einem gestatten, Organtransplantationen selbst zwischen Individuen bei fehlender Übereinstimmung des HLA- Systems durchzuführen.
Mittel, die mit der Fähigkeit des LFA-1 Rezeptormoleküls zur Bindung an seinen natürlichen Liganden wechselwirken, können deshalb alle oben beschriebenen, LFA-1 abhängigen Funktionen unterbinden. Aus diesem Grunde können diese Mittel als anti-inflammatorische Mittel in Übereinstimmung mit der hier vorliegenden Erfindung dienen. Solche Mittel schließen die LFA-1 alpha-Untereinheit, LFA-1 (alpha- und beta Untereinheiten), und Antikörper, die an die LFA-1 alpha-Untereinheit binden können, oder Fragmente dieser Untereinheiten ein. Alle derartigen Mittel können in Übereinstimmung mit der hier vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die anti-inflammatorischen Mittel der vorliegenden Erfindung können Entzündungen behandeln, die auf Reaktion des spezifischen Abwehrsystems beruhen.
Der hier verwendete Ausdruck "spezifisches Abwehrsystem" soll auf diejenige zelluläre Komponente des Immunsystems zutreffen, die auf die Anwesenheit spezifischer Antigene reagiert. Derartige Zellen schließen Lymphozyten und Makrophagen ein. Man sagt, daß die Entzündung auf der Antwort des spezifischen Abwehrsystems beruht, wenn die Entzündung durch Reaktion des spezifischen Abwehrsystems hervorgerufen oder vermittelt wird, oder damit assoziiert ist. Beispiele für Entzündungen, die durch die Antwort des spezifischen Abwehrsystems hervorgerufen werden, schließen die Antwort auf Antigene ein, wie z.B. dasRubelia Virus,Autoimmunerkrankungen, Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ, die durch T-Zellen vermittelt werden (z.B. bei Patienten, mit "positivem " Mantaux-Test), Organ- oder Gewebeabstoßung, Graft-versus- Hhost Erkrankung (das ist eine Abstoßung von Wirtsgewebe, hervorgerufen durch die Spende von Knochenmark oder anderem Gewebe, das Lymphozyten enthält oder bildet), etc. Die Fähigkeit der LFA-1 alpha-Untereinheit und seiner funktionellen Derivate, derartige Entzündungsreaktionen zu antagonisieren, bildet die Basis für ihren therapeutischen Einsatz in der Behandlung chronischer, entzündlicher Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, z.B. Lupus Erythematosus, Autoimmunthyreoiditis, experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), multiple Sklerosis, einige Formen von Diabetes, Reynaud'sches Syndrom, rheumatoide Arthritis, etc.
Da LFA-1 auf den Zellen exprimiert wird, die an endotheliales Gewebe binden können, bietet die Verabreichung der LFA-1 alpha-Untereinheit oder LFA-1 (alpha- und beta- Untereinheiten) an Patienten einen Weg der Darstellung und Visualisierung endothelialen Gewebes. Darüber hinaus bietet dieses Verfahren diagnostische Informationen hinsichtlich der Quantität und Verteilung von Bindungsliganden des LFA-1- Rezeptormoleküls, die im visualisierten Gewebe vorhanden sind. Bei derartiger Verwendung sind die LFA-1 alpha-Untereinheiten (oder LFA-1 beta-Rezeptormoleküle) mit Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (z.B. Biotin, Avidin, etc.), Fluoreszenzmarkierungen, paramagnetischen Atomen, etc. auffindbar markiert. Verfahren für die Durchführung derartiger Markierungen sind dem Fachmann bekannt. Die Antikörper (oder Fragmente davon) können mit Radioisotopen, Enzymmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen, paramagnetischen Markierungen, Elektronendichte-Markierungen, Toxinmarkierungen, etc. auffindbar markiert sein. Bevorzugte Toxine für die Markierungen schließen das Diphtherietoxin, Ricin und Choleratoxine ein. Die Verabreichung eines derartig markierten Moleküls an ein Individuum identifiziert die Entzündungsorte. Derartige auffindbare Markierungen können auch für den check-up des Immunstatus eines Patienten eingesetzt werden. Die klinische Verwendung von Antikörpern in diagnostischen, bildgebenden Verfahren ist bei Grossman, H.B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E.C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)), und Khaw, B.A. et al., Science 209:295-297 (1980)) beschrieben.
Die Fähigkeit der Leukozyten, spontan zu den Entzündungsorten zu migrieren, hängt von LFA-1 ab (Keizer, G.D., et al., Eur. J. Immunol. 17:1317-1322 (1980)). Eine derartige Migration kann durch Gabe von LFA-1 alpha- Untereinheiten oder LFA-1 (alpha- und beta-Untereinheit) an Patienten verhindert werden. In ähnlicher Weise hat sich gezeigt, daß die Fähigkeit von Leukozyten, an Endothelzellen zu binden, von LFA-1 abhängt. Jedes der erfindungsgemäßen antiinflammatorischen Mittel kann für die Unterbindung derartiger Aktivitäten verwendeten werden.
ICAMS (z.B. ICAM-1) werden durch bestimmte humane Viren erkannt (besonders Rhinoviren des Haupttyps, die an ICAM-1 binden). Diese Viren binden an humane Zellen aufgrund dieser Erkennung, und führen dadurch zur viralen Infektion.Ein zentraler Schritt in der Etiologie viraler Erkrankung ist aus diesem Grund die Interaktion zwischen diesen zellulären Rezeptoren und dem Virus.
Mittel, welche die Fähigkeit eines Virus an ein ICAM- Molekül zu binden, unterdrücken, mit dem Virus in Konkurrenz treten, oder inhibieren, finden deshalb bei der Behandlung von viralen (und besonders rhinoviraler) Infektionen Anwendung.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft deshalb die Fähigkeit der alpha-Untereinheit von LFA-1 und seiner funktionellen Derivate, mit ICAM-1 in Wechselwirkung zu treten, um hierdurch entweder eine Bindung von Viren an Zellen und virale Infektionen zu verhindern oder die Schwere oder Dauer derartiger Infektionen zu vermindern oder abzuschwächen.
Für die vorliegende Erfindung sind funktionelle Derivate der alpha-Untereinheit von LFA-1, z.B. lösliche Formen der alpha-Untereinheit von LFA-1, Fragmente der alpha-Untereinheit von LFA-1, etc. von besonderem Interesse. Derartige Mittel werden vorzugsweise einem Empfängerpatienten als Heterodimer zur Verfügung gestellt, welches das Molekül in Assoziation mit einem Molekül der beta-Untereinheit der CD-18-Familie enthält. Das oben beschriebene Ziel der Behandlung viraler Infektionen kann mit einem einzelnen Mittel oder mit einer Kombination von mehr als einem Mittel erreicht werden.
Für den Zweck der Behandlung viraler Infektionen soll(en) das (die) oben beschriebene(n) Mittel der vorliegenden Erfindung Empfängerpatienten in einer Dosierung zur Verfügung gestellt werden (z.B. durch intranasale Applikation), die ausreicht, die Fähigkeit der Bindung des Virus an ICAM-Moleküle zu unterdrücken, damit zu konkurrieren, oder zu inhibieren. Eine derartige Dosierung wird allgemein (für jedes einzelne Mittel) im Bereich von 0,01 pg/kg Patientengewicht bis 1 mg/kg Patientengewicht liegen, obwohl größere oder kleinere Mengen auch verwendet werden können.
Für die Behandlung viraler Infektion kann die Gabe eines derartigen Mittels (derartiger Mittel) entweder "prophylaktisch" oder "therapeutisch" erfolgen. Prophylaktisch wird das Mittel (werden die Mittel) vor der Infektion (d.h. vor, während, oder kurz danach), aber vor dem Auftreten jeglicher Symptome einer viralen Infektion zugeführt werden. Die prophylaktische Verabreichung eines derartigen Mittels (derartiger Mittel) dient der Verhinderung oder Milderung jeglicher darauffolgender Infektionen. Für die therapeutische Anwendung soll das Mittel (sollen die Mittel) bei Beginn der Symptome der tatsächlichen viralen Infektion gegeben werden (oder kurz nach dem Beginn der Infektion), z.B. bei dem Auftreten viral induzierter nasaler Kongestion, etc. oder dem Nachweis von Viren in Körperflüssigkeiten, oder Nachweis von Antikörpern, die gegen das Virus gerichtet sind, im Serum des infizierten Patienten, etc. Die therapeutische Gabe des Mittels (der Mittel) dient der Milderung jeglicher vorliegender Infektion und verringert dadurch deren Ernsthaftigkeit oder Dauer.

V. Verabreichung der LFA-1 alpha-Untereinheit

Die therapeutischen Effekte der LFA-1 alpha-Untereinheit können durch die Verabreichung des LFA-1-Rezeptormoleküls (α- und β-Untereinheiten) an Patienten, durch Gabe des gesamten LFA-1 alpha-Untereinheit-Moleküles, oder irgendeines therapeutisch aktiven, funktionellen Derivates davon erreicht werden. Diese Moleküle können entweder synthetisch oder durch den Gebrauch der rekombinanten DNA-Technologie oder aus natürlichen Quellen erhalten werden. Fragmente des LFA-1- Rezeptors oder seiner alpha-Untereinheit können zusätzlich durch Proteolyse erhalten werden. Die therapeutischen Vorteile dieser Moleküle können durch funktionelle Derivate, die zusätzlich eingefügte Aminosäurereste aufweisen, um die Ankopplung an Carrier oder die Aktivität zu verbessern, vergrößert werden.
Die erfindungsgemäßen Moleküle sind "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen", wenn die Präparate im wesentlichen frei von Stoffen sind, mit denen diese Substanzen normalerweise und natürlich gefunden werden.
Bei der Gabe der erfindungsgemäßen therapeutischen Moleküle an Patienten wird die Dosierung des zugeführten Mittels verschieden sein und vom Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeinen medizinischen Status, Anamnese, etc. abhängen. Generell ist es wünschenswert, dem Empfänger eine Dosierung der LFA-1 alpha-Untereinheit (oder eines funktionellen Derivates davon) zur Verfügung zu stellen, die im Bereich von 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Die erfindungsgemäßen Moleküle können dem Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Die Gabe kann in Form einer kontinuierlichen Infusion oder durch einzelne oder multiple Bolusinjektionen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen anti-inflammatorischen Mittel sollen dem Empfänger in einer Menge zugeführt werden, die ausreicht, eine Entzündung zu unterdrücken. Eine Menge zur Unterdrückung der Entzündung ist ausreichend, wenn die Dosierung des Mittels, der Weg der Verabreichung etc. ausreicht, die Entzündung zu mildern oder zu verhindern. Die erfindungsgemäßen anti- inflammatorischen Mittel können entweder vor oder bei Beginn der Entzündung appliziert werden (um die erwartete Entzündung zu unterdrücken) oder nach Beginn der Entzündung gegeben werden.
Ein Mittel ist "pharmakologisch akzeptabel", wenn seine Verabreichung durch den Empfängerpatienten toleriert werden kann. Ein derartiges Mittel wird in "therapeutisch wirksamer Menge" gegeben, wenn die gegebene Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart zu nachweisbarer physiologischer Veränderung im Empfängerpatienten führt. Die erfindungsgemäßen Moleküle können nach bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch akzeptabler Mittel formuliert werden, wobei diese Substanzen oder ihre funktionellen Derivate in einer Beimischung mit einem pharmazeutisch gebräuchlichen Trägervehikel kombiniert werden. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung einschließlich anderer humaner Proteine, z.B. Humanserumalbumin, sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences (16 Aufl.,), Osol. A., ed., Mack, Easton, PA (1980) beschrieben. Um ein pharmazeutisch wirkungsvolles Mittel für eine wirksame Verabreichung herzustellen, werden derartige Mittel eine therapeutisch wirksame Menge der LFA-1 alpha-Untereinheit oder eines Fragmentes oder eines funktionellen Derivates davon, zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägervehikels, enthalten.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können verwendet werden, um die Dauer der Wirkung zu kontrollieren. Präparate mit kontrollierter Freisetzung können durch Verwendung von Polymeren erhalten werden, um die LFA-1 alpha-Untereinheit oder seine Fragmente oder funktionellen Derivate daran zu komplexieren oder zu absorbieren. Die kontrollierte Freisetzung kann durch die Auswahl geeigneter Makromoleküle (z.B. Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, oder Protaminsulfat) und die Wahl der Konzentration der Makromoleküle als auch durch Art der Inkorporation für die kontrollierte Freisetzung erreicht werden. Ein anderes mögliches Verfahren für die Kontrolle der Wirkdauer mit kontrolliert freisetzenden Präparationen besteht in der Einfügung von LFA-1 alpha-Untereinheit-Molekülen, ihrer Fragmente oder ihrer funktionellen Derivate in Partikel aus Polymermaterial, wie z.B. Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(milchsäure), oder Ethylenvinylacetat- Copolymere. Anstelle der Einfügung dieser Mittel in polymere Partikel ist es alternativ möglich, diese Moleküle in Mikrokapselpräparationen einzufügen, z.B. durch Coazervationstechniken oder durch Interface-Polymerisation mit, z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln und Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Medikament-Abgabe-Systeme einzufügen, wie z.B. in Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln in Makroemulsionen. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben.
Nach allgemeiner Beschreibung der Erfindung wird diese unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele noch leichter verstanden, die der Erklärung dienen und, sofern dies nicht angegeben ist, die vorliegende Erfindung nicht beschränken sollen.

BEISPIEL 1

Reinigung der LFA-1 alpha-Untereinheit

LFA-1 wird auf der Oberfläche von SKW3-Lymphozyten exprimiert. Das LFA-1 alpha-Untereinheit-Molekül wurde von SKW3-Zellen durch Affinitäts-Chromatographie mit monoklonalen Antikörpern nach der Methode von Miller, L.J., et al. (J. Immunol. 137:2891-2900 (1987), wobei auf diese Referenz ausdrücklich Bezug genommen wird) gereinigt. Der monoklonale Antikörper TS1/22, der gegen die alpha-Untereinheit von LFA-1 gerichtet ist, wurde gereinigt und durch Bromcyan an CL-48- Sepharose (Pharmacia) mit 2 mg MAB pro ml Packungsmaterial gekoppelt. SKW3-Zellen (42,2 g), die von der MIT Kultursammlung erhalten wurden, wurden in 300 ml Lysispuffer lysiert (Kurzinger, K. et al. J. Biol. Chem. 257:12412-12418 (1982). Das Lysat wurde dann 2 Stunden bei 16,000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann nacheinander über eine Vorsäule mit aktivierter und gequenchter CL-4B-Sepharose und einer TS1/22- Sepharosesäule geleitet. Die TS1/22-Säule wurde dann schrittweise gewaschen (Kurzinger, K. et al., J. Biol. Chem. 257:12412-12418 (1982), und die LFA-1 alpha-Untereinheit wurde mit 50 mM Triethylamin, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM Jodacetamid, 10 U/ml Aprotinin und 0,025% NaN&sub3; (pH 11,5) eluiert und der pH wurde sofort neutralisiert. Die Fraktionen mit LFA-1 alpha-Untereinheit wurden vereinigt, lyophylisiert und mit 5 Volumina Ethanol bei -20ºC über Nacht präzipitiert.
Gereinigtes Protein wurde reduziert und alkyliert (Law, S.K.A. et al., EMBO J. 6:915-919 (1987) und einer präparativen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zugeführt. Die Bande mit der LFA-1 alpha-Untereinheit wurde mit 1 M Kaliumchlorid visualisiert, ausgestanzt und elektroeluiert (Pellegrino, M.A. et al., Clin. Immunol. Immunopath. 3:324-333 (1975)). Die aufgereinigte alpha-Untereinheit wurde lyophilisiert und in 4 Volumina Ethanol bei -20ºC über Nacht präzipitiert. Das Pelletwurde resuspendiert und mit 1% Trypsin verdaut (Wong, W.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:7711-7715 (1985)). Die tryptischen Peptide wurden dann mit HPLC (Beckman) auf einer C4 Reverse-Phase-Säule (Vydac) isoliert. Die Peptide wurden mit einem Gradienten von 0 bis 60% Acetonitril in 1% Trifluoressigsäure eluiert. Verschiedene Peaks wurden isokratisch bei einer Acetonitrilkonzentration, die durch folgende Gleichung bestimmt war, rechromatographiert:
F = (0,9E) - 2
wobei F das Volumenprozent Acetonitril ist, bei dem unter isokratischen Bedingungen ein Peptid bei E-Prozent des linearen Gardienten eluierte (Lathe, R. et al. (J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)). Peaks wurden in 1,5 ml Polypropylenröhrchen gesammelt und auf ein Volumen von weniger als 50 ul konzentriert. Bei acht Peaks wurde eine Mikrosequenzierung durchgeführt. Die Sequenz eines Peptides, L64, wurde für die Synthese eines einzelnen Oligonukleotides nach Vorschlägen von Lathe, R. et al. (J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)) eingesetzt:
5' - GGGATGTTGTGGTCATGGATGGTGGGCTCAAT - 3'
LFA-1 wurde ursprünglich aus SKW3-Zell-Lysaten einer T- Lymphomzellinie durch Affinitäts-Chromatographie mit monoklonalen Antikörpern isoliert, die gegen die alpha- Untereinheit gerichtet waren. SDS-PAGE-Fraktionen ergaben die alpha- und beta-Untereinheiten. Die alpha-Untereinheit wurde weiterhin durch präparative SDS-PAGE gereinigt, die gereinigte alpha-Untereinheit mit Trypsin verdaut und die Peptide durch Reverse-Phase-HPLC isoliert. Die Peptidsequenz von neun Peaks wurde durch Mikrosequenzierung bestimmt (Figur 1). Die Peptidsequenz mit geringster Codon-Degeneration wurde verwendet, wobei eine einzige Oligonukleotidsequenz spezifiziert wurde, welche die am häufigsten vorkommenden Humancodons verwendet (Lathe, R. et al., J. Molec. Biol. 183:1- 12 (1985)). Die Sequenzen der tryptischen Peptide der LFA-1 alpha-Untereinheit sind in Tabelle I aufgelistet. TABELLE I SEQUENZEN DER TRYPTISCHEN PEPTIDE DER LFA-1 ALPHA-UNTEREINHEIT Reste Aminosäuresequenz
Klammern deuten auf Zweideutigkeit in der Sequenz. Die unterstrichenen Reste wurden für die Herstellung einer Oligonukleotidsonde verwendet.

BEISPIEL 2

cDNA-Klonierung

Rekombinante (5 x 10&sup5;) der λgt 10-Genbank, die selektioniert bezüglich cDNA-Inserts, die größer als 2 kb waren, und von PMA (Phorbol-Myristinsäure) induzierten HL-60- Zellen produziert wurden (Corbi, A. et al., EMBO J. 6:4023-4028 (1987)), wurden in einer Dichte von 50000 Rekombinanten pro 150 mm Platte ausplattiert. Die Genbank wurde amplifiziert (Woo, S.L.C., Met. Enzvmol. 68:389-395 (1979)) und Nitrocellulosefilter wurden nach den Richtlinien von Benton und Davis verarbeitet (Benton, W.D. et al., Science 196:180-182 (1977)). Die Filter wurden über Nacht bei 42ºC in 6 x SSC [0,6 M NaCl, 0,06 M Natriumcitrat], 0,05% Natriumphosphat und Natriumpyrophosphat, 0,5% SDS, 1% Denhardt's und 100 ug/ml einer DNA aus Lachsspermien prähybridisiert. Das Einzelsequenz-Oligonukleotid (oben gezeigte Sequenz) wurde mit γ-³²P-ATP durch Polynukleotidkinase markiert. Die Filter wurden über Nacht in dem Prähybridisierungspuffer bei 42ºC hybridisiert. Danach wurden sie sequentiell in 6 x SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat für 15 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden einem XAR-5-Film in Gegenwart einer Verstärkerplatte (preflashed) 6 bis 20 Stunden exponiert. Phagen, die ein Signal auf duplikaten Filtern gaben, wurden aus den Plaques gereinigt und die Größe ihrer cDNA-Inserts wurde durch Elektrophorese auf Agarosegelen bestimmt.
Die 32-mer Oligonukleotidsonde wurde eingesetzt, um zwanzig Klone aus einer Größen-selektierten λgt10 cDNA- Bank, die aus PMA-stimulierten Myeloidzellen erstellt wurde, zu isolieren (Corbi, A. et al., EMBO J. 6:4023-4028 (1987)). Es hatte sich früher schon gezeigt, daß diese Zellen die LFA-1 alpha-Untereinheit synthetisieren (Miller, L.J. et al., J. Immunol. 139:842-847 (1987)). Die Größe des Inserts wurde bestimmt und der längste Klon, λ5L5, wurde einer Restriktions- Kartierung unterzogen (Figur 2). Dieser Klon enthielt die Nukleotidsequenz, die der Oligonukleotidsonde entsprach (85% Übereinstimmung mit der "best-guess" Sonde). Die Nukleotidsequenz, welche die Oligonuklotidsonde einschloß und sich darüber hinaus erstreckte, kodierte auch das tryptische Peptid, das durch Mikrosequenzierung bestimmt wurde (16 von 16 Resten). Dieser Klon kodierte jedoch nicht das gesamte Protein, da nicht alle Sequenzen der tryptischen Peptide in dem offenen Leserahmen vorhanden waren. Das 5' 1,0 kb EcoRI Fragment von λ5L5 wurde für das Rescreening weiterer 5 x 10&sup5; Rekombinanten eingesetzt. Weitere 14 Klone wurden identifiziert und der Klon λ3R1 zeigte eine identische Restriktionskarte in der Überlappungsregion und enthielt zusätzlich ein 1,0 kb 5'- Fragment. Die Nukleotidsequenz dieses zusätzlichen Fragmentes wurde bestimmt (Figur 2).

BEISPIEL 3

Restriktionskartierung und Nukleotidsequenzierung Restriktionskarten der selektierten Klone wurden durch

doppelte und partielle Verdauung bestimmt (Maniatis, T., et al. (In: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Restriktionsfragmente wurden entweder in M13mp18 oder M13mp19 subkloniert (Messing, J. Met Enzymol. 101: 20-78 (1983) oder pGEM-3Z, 4Z oder 7Z (Promega). Deletionen der Fragmente in pGEM wurden durch Exonuklease III und S1 erreicht (Henikoff, S., Gene 28:351-359 (1984)). Die Sequenzierung wurde mit der Dideoxy-Terminationsmethode durchgeführt (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74:5463-5467 (1977)). Die kodierende Sequenz, die 5'- und 3'- nicht-translatierten Regionen wurden zu 100%, zu 83,1% bzw. zu 33,7% in beiden Richtungen bestimmt.
Die überlappenden cDNA-Klone enthalten 5139 Nukleotide (Figur 3). Es gibt einen offenen Leserahmen von 3510 Nukleotiden, eine untranslatierte 5'-Region mit 94 Nukleotiden, und eine untranslatierte 3'-Region mit 1535 Nukleotiden, die eine Polyadenylierungsstelle mit 15 Nukleotide vor dem Poly(A+)Schwanz enthält. Innerhalb der untranslatierten 3'- Region gibt es einen typischen Alul-Repeat mit zwei Tandemverwandten Sequenzen, wobei jede durch ein A-haltiges Segment abgeschlossen wird (Hardman, N., Biochem. J. 234:1-11 (1986)). Die Alu-Sequenz ist 304 Nukleotide lang und zu 78,8% identisch mit der gemeinsamen Sequenz der Alu-Familie.

BEISPIEL 4

Southern und Northern Blot

Der Southern-Blot wurde wie beschrieben durchgeführt (Corbi, A. et al. (J. Exper. Med. 167:1597-1607 (1988)). 20 ug/ml der gesamten zellulären RNA, die jeweils von SKW3, U937, IB4 und EJ-Zellen isoliert wurde, wurden auf einem 1,0%- igen Formaldehydgel elektrophoretisiert und auf Nitrocellulose transferiert (In: Current Protocols in Molecular Biolog., Green Publishing Associates und Wiley-Interscience, New York). Die Nylonmembran (Zetaprobe, Biorad) wurde prähybridisiert und mit 2 x SSC, 1 x Denhardt's-Lösung, 0,1% SDS und 10 ug/ml DNA aus Heringspermien hybridisiert. Eine 1,8 kb Eco RI-Sonde vom 5'- Ende des cDNA-Klones, λ3R1, wurde durch Nick-Translation markiert und als Sonde verwendet.
Die Northern-Blot-Analyse ergab eine Message von 5,5 kb in SKW3, U937 und IB4-Zellen, nicht aber in EJ-Zellen. Die Verteilungen der Zellen sind in guter Übereinstimmung mit der Größe der cDNA-Klone und der Expression von LFA-1 auf der Oberfläche der Zellen. In der Southern-Blot-Analyse hybridisierten zwei Fragmente, 10 und 8 kb, mit dem 1,2kb 5' EcoRI-BamHI-Fragment des Klones λ2L2 (Corbi, A. et al., J. Exper. Med. 167:1597-1607 (1988)). Ein Genomklon, der von einer Cosmid-Bank isoliert wurde, weist diese zwei Fragmente mit identischer Länge auf. Diese Fragmente grenzen aneinander an und zeigen, daß LFA-1 ein Single-Copy-Gen ist.

BEISPIEL 5

Computeranalyse

Für die Homologiesuche und Alignments von Sequenzen wurde anfangs das Mikrogenie-DNA-Programm (Beckman), FASTP (Wilbur und Sigmann) der Datenbanken NBRF und NEW (National Biomedical Research Foundation, Washington, DC), und FASTP, der Swiss- PROT-Datenbank (Bionet) verwendet. Diese Alignments wurden dann mit ALIGN (NBRF) (5585) und GENALIGN (Bionet) optimiert.
Die Hydrophobizität wurde mit dem Mikrogenie DNA-Programm und auch mit PEP-PLOT bestimmt (5792) (University of Wisconsin Genetics Computer Group). Die Analyse der Hydrophobizität der Aminosäuresequenz zeigte, daß die alpha-Untereinheit von LFA-1 ein typisches transmembranes Protein mit hydrophober Signalsequenz, extrazellulärer Domäne, einer einzelnen hydrophoben transmembranen Region und einem kurzen, cytoplasmatischen Schwanz darstellt. Der N-terminale Rest des humanen LFA-1 wurde aufgrund der Homologie mit dem N-terminalen Rest des murinen LFA-1 identifiziert (Figur 5). Humanes LFA-1 ist in den ersten 20 Aminosäuren zu 55 % mit murinem LFA-1 identisch. Ein klassisches Signalpeptid mit einer Konsensus- Sequenz (Ala-X-Ser/Pro) für die Peptidase-Spaltung steht der N- terminalen Sequenz voran. Im Leserahmen gibt es stromaufwärts drei putative Initiationsorte (ATG) für die Transkription. Der erste Initiationsort bei Nukleotidposition 89 wird im allgemeinen bevorzugt (Kozak, M. Nucl. Acid. Res. 12:857-872 (1984)) und ergibt eine Signalsequenz mit 25 Resten und einigen polaren Gruppen nahe der N-terminaien Reste, was typischerweise in Signalsequenzen gefunden wird (von Heijne, G.,J. Molec. Biol. 173:243-251 (1984)). Sämtliche 117 Aminosäuren, die durch Mikrosequenzierung der tryptischen Peptide bestimmt worden sind, wurden in dem translatierten, offenen Leserahmen gefunden und bestätigen die Authentizität der cDNA-Klone. Zusammenfassend beweisen diese Daten, daß die LFA-1 alpha- Untereinheit eine N-terminale Signalsequenz von 29 Aminosäuren, eine extrazelluläre Domäne von 1063 Resten, eine Transmembran- Domäne von 29 Aminosäuren und einen C-terminalen cytoplasmatischen Schwanz von 53 Aminosäuren aufweist.
Sieben Repeats mit 49-63 Aminosäuren liegen innerhalb der extrazellulären Domäne. Der Grad der internen Identität und der statistischen Signifikanz zwischen diesen Internal Repeats ist am höchsten zwischen den letzten drei: nämlich 24-33% mit p< 10&supmin;² bis < 10&supmin;&sup6;. Die zentrale Region der letzten drei Repeats besitzt Homologie mit verschiedenen Bindungsorten divalenter Kationen (Figur 4). Frühere Studien haben gezeigt, daß Mg²&spplus; allein oder bei niederer Konzentration zusammen mit Ca²&spplus; notwendig ist für die funktionelle Integrität des Proteins (Rothlein, R. et al., J. Exner. Med. 163:1132-1149 (1986)). Aufgrund der Homologie der drei Tandem Repeats mit den Bindungsstellen für divalente Kationen kann man annehmen, daß LFA-1 divalente Kationen bindet. Die Repeats I-IV weisen die Konsensus-Bindungsstelle für divalente Kationen nicht auf, besitzen jedoch konservierte flankierende Regionen. Diese strukturellen Ähnlichkeiten lassen vermuten, daß diese Repeats durch Duplikationen entstanden sind.
Das intakte Protein besitzt ein Molekulargewicht von 126193 Dalton. Zwölf N-gebundene, glycosylierte Stellen (Asn-X- Thr/Ser) sind in der extrazellulären Domäne vorhanden. Frühere Studien haben gezeigt, daß wenigstens fünf dieser Stellen glycosyliert sind und Oligosaccharidreste mit Molekuiargewicht von 5000-10000 Dalton tragen, was typisch für ein komplexes, N- gebundenes Kohlenhydrat ist (Dahms, N.M. et al., J. Immunol. 134:3978-3986 (1985)). Deshalb würde das Vorhandensein von 5-10 dieser Glycosylierungsstellen einem Molekulargewicht entsprechen, das auch durch SDS-PAGE bestimmt wurde.
Die Bestimmung des N-terminalen Restes des Maus-LFA-1 (Girma, J-P. et al., Blood 70:605-611 (1987)) und der Primärstruktur der gemeinsamen beta-Untereinheit von LFA-1/Mac- 1/p150,95 läßt vermuten, daß die LFA-1 alpha-Untereinheit ein Mitglied der Integrin-Superfamilie ist. Die LFA-1 alpha- Untereinheit zeigt eine auffallende Homologie (35% Identität) mit p150,95 und mit Mac-1-alpha-Untereinheiten, und in einem gewissen Ausmaß mit den alpha-Untereinheiten der ECM-Rezeptoren (25% Identität). Andererseits sind FNR, VNR und IIb untereinander zu 40% identisch. Zusätzlich enthalten die Leukozytenintegrine auch ein Insert von annäherd 200 Aminosäuren nahe der N-terminalen Region des Proteins, das nicht in den drei sequenzierten ECM-Rezeptoren vorhanden ist (Figur 5). Weiterhin fehlt die Region, in der ein Protease- Spaltungsort für VNR, FNR und gpIIb/IIIA vorhanden ist, in LFA-1, den p150,95 und den Mac-1-alpha-Untereinheiten. Dies korreliert mit dem Fehlen an proteolytischer Prozessierung der alpha-Untereinheiten der LFA-1-Familie. Im ganzen bestimmen diese strukturellen Eigenschaften zwei Unterfamilien der alpha- Untereinheit-Integrine, nämlich die Leukozytenintegrine und die ECM-Integrine.
Alle alpha-Untereinheiten der Integrinfamilie weisen, ähnlich wie LFA-1, Tandem Repeats auf, die putative Bindungsstellen für divalente Kationen enthalten (Corbi, A. et al., EMBO J, 6:4023-4028 (1987), Poncz, M. et al., J. Biol. Chem. 262:8476-8482 (1987), Suzuki, S. et al., Proc, Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 83:8614-8618 (1986), Argaves, W.S. et al., J. Cell Biol. 105:1183-1190 (1987), Ruoslahti, E. et al., Science 238:491-497 (1987)). Allerdings enthalten nur drei Repeats in LFA-1 und p150 putative Metall-Bindungsstellen, während alle vier Repeats in den ECM-Rezeptoren Metall- Bindungsstellen enthalten. Die putativen Bindungsstellen für divaiente Kationen in LFA-1 und den anderen Integrine sind verwandt, aber nicht identisch mit früher beschriebenen, Bindungsstellen divalenter Kationen in integralen Membranproteinen. Es gibt verschiedene Arten von Bindungsstellen für divalente Kationen. Die erste Gruppe der Bindungsstellen zeigt eine alternierende Struktur, nämlich D-X- D(N)-X-D(N). Diese Stellen findet man unter anderem in Troponin C, Parvalbumin (5256) und Galactosebindungsproteinen. Diese Bindungsstellen bilden eine EF-Loop-Struktur und haben 6-7 chelatbildenden Stellen. Die putativen Bindungsorte von LFA-1 und anderen Integrine zeigen auch eine D-X-D(N)-X-D(N)- Primärstruktur mit einer Anzahl konservierter G-Reste zwischen den chelatbildenden Resten. Allerdings ist der Rest in der -Z- Position durch einen hydrophoben Rest ersetzt. Des weiteren scheint die α-Helix vor und nach der Calciumbindungsstelle bei den Integrinstellen zu fehlen (Corbi, A. et al., EMBO J. 6:4023-4028 (1987)). Die Signifikanz dieser Änderungen ist unbekannt, kann aber teilweise für eine gewisse Präferenz dieser Stellen für Mg²&spplus; verantwortlich sein.
Die Suche in der NBRF und Swiss-Protein-Datenbank zeigt, daß diese für die LFA-1-Familie spezifische Domäne, die wir als "L"-Domäne bezeichnen, signifikante Homologie mit der A1-Domäne des humanen vWF, humanem Komplementfaktor B, und dem Matrixprotein von Hühnercollagen hat. Diese Ähnlichkeiten erstrecken sich über die gesamte Länge der L-Domäne. Da vWF drei repetitive A-Domänen (A1, A2, A3) (5790) hat, die Domäne in dem Komplementfaktor B analog zu einer ähnlichen Domäne in Komplementkomponente 2 (C2) (5789) ist, und CMP 2 Repeats (5778) hat, wurde die L-Domäne von LFA-1 mit all diesen Domänen unter Zuhilfenahme des ALIGN-Programmes verglichen. Mit Ausnahme von C2 waren all diese Aligments statistisch signifikant (Figur 6).
Diese Ähnlichkeiten implizieren eine mögliche funktionelle Domäne für LFA-1. Erstens bindet die A1-Domäne von vWF an Glycoprotein Ib und an Heparin (5646), während sowohl A1- als auch A3-Domänen in der Bindung an Collagen beteiligt sind. Zweitens liegt die homologe Domäne in Faktor B auf der C- terminalen Seite der Spaltungsstelle, an welcher der Faktor B in den Faktor Bb gespalten wird und auf der N-terminalen Seite der serinprotease-Stelle (Mole, J.E. et al., J. Biol. Chem. 259:3407-3412 (1984), Bently, D.R., Biochem. J. 239:339-345 (1986)). Deshalb ist diese Domäne in der Region lokalisiert, von der man annimmt, daß sie mit ihrem Liganden, C3b, in Wechselwirkung tritt. Die Struktur des Collagen-Matrixproteins ist teilweise bestimmt worden. Sie zeigt zwei Repeats, die durch eine Sequenz, ähnlich der des epidermalen Wachstumsfaktors, getrennt sind (Argaves, W.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:464-468 (1987)). CMP tritt mit Collagen (Argaves, W.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:464-468 (1987)) und Proteoglycan des Knorpels (Figur 7) (Paulsson, M. et al. Collagen Rel. Res. 4:219-229 (1984)) in Wechselwirkung.
LFA-1, Mac-1 und p150,95 sind kürzlich auf dem Chromosom 16p11 lokalisiert worden (Corbi, A. et al., J. Exper. Med. 167:1597-1607 (1988)). Die strukturelle Ähnlichkeit und die Verwandschaft der Gene, welche die alpha-Untereinheiten der Leukozytenintegrine kodieren, läßt vermuten, daß sich ein primordiales Gen duplizierte. Hieraus entstanden wenigstens zwei Zweige von alpha-Untereinheiten der Integrine, nämlich der Leukozytenintegrine und der ECM-Integrine. Eine Domäne mit 180 Aminosäuren wurde in das primordiale Gen der alpha-Untereinheit der Leukozytenintegrine eingefügt. Dann duplizierte das Gen und bildete LFA-1, Mac-1 und p150,95. Die Ähnlichkeit dieser Domänen mit den L-Domänen der LFA-1-Familie zeigt, daß diese L- Domäne eine funktionelle Domäne sein könnte. Des weiteren zeigen diese Homologien, daß eine primordiale Domäne in mehrere Proteine eingefügt wurde und dann verschiedene Erkennungsfunktionen in der Hämostase, der Komplementaktivierung und in der Immunantwort entfaltete.
Diese strukturellen Unterschiede zwischen den zwei Gruppen der Integrin-alpha-Untereinheiten korrelieren mit den Unterschieden in der Erkennungssteile der Funktions-Domänen, da Peptide, die RGD enthalten, die Bindung von FNR und gpIIb/IIIa an ihre entsprechenden Liganden blockieren (Ruoslahti, E. et al., Science 238:491-497 (1987)), während ein RGDS-Peptid nicht die Wechselwirkung zwischen LFA-1 und ICAM-1 unterbindet. ICAM- 1 selbst enthält keine RGD-Peptidsequenz und ist ein Mitglied der Superfamilie der Immunglobulingene im Gegensatz zu den Liganden der ECM-Integrine. Sowohl strukturelle als auch funktionelle Daten zeigen, daß die Integrine der Superfamilie in zwei Unterfamilien von alpha-Untereinheiten eingeteilt werden können. Diese strukturellen und funktionellen Eigenschaften der alpha-Untereinheiten, die mit β&sub2; assoziiert sind, sind jedoch vermutlich nicht einzigartig für ihre Unterfamilie, da einige andere Integrin-alpha-Untereinheiten strukturelle Eigenschaften ähnlich wie die LFA-1-Familie aufweisen, wie z.B. das Fehlen einer proteolytischen Spaltungsstelle (Charo, I.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83:8351-8355 (1986)).
Die Aufklärung der Struktur der alpha-Untereinheit von LFA-1 ergab eine neuartige evolutionäre Verwandtschaft zwischen den alpha-Untereinheiten der Integrine und verwies auf eine mögliche funktionelle Domäne und bewies, daß die LFA-1 alpha- Untereinheit zu der Superfamilie der Integrine gehört, aber eine zusätzliche Domäne besitzt. Diese L-Domäne und homologe Domänen bilden eine Familie von Protein "Domänen" mit funktioneller Bedeutung. Da die Erkennungsstelle von LFA-1 nicht RGD ist, könnte die L-Domäne in der LFA-1 alpha- Untereinheit und ebenso in den anderen Leukozytenintegrinen Mac-1 und p150,95 von funktioneller Bedeutung sein. Da jedoch LFA-1 in eine große Zahl von Leukozytenfunktionen involviert ist und vermutlich mehr als einen Liganden aufweist (Rothlein, R., et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986), ist es möglich, daß mehr als eine funktionelle Domäne in der LFA-1 alpha- Untereinheit vorhanden ist. Es ist auch von Interesse, die Wechselwirkungen des cytoplasmatischen Schwanz es mit dem Cytoskelett zu untersuchen und der Frage nachzugehen, welche Rolle diese Wechselwirkung beim Signalisieren spielt. Das Vorhandensein von cDNA-Klonen für die alpha- und beta- Untereinheiten erlaubt, diese Struktur-Funktion-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Claims

1. Humane LFA-1 alpha-Untereinheit, mit einer Aminosäuresequenz gemäß Abbildung 3 oder ein funktionelles Derivat davon, im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen.

2. Humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon nach Anspruch 1, worin dieses Molekül zusätzlich in der Lage ist, an ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 zu binden.

3. Humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon nach Anspruch 1, worin dieses Molekül in der Lage ist, mit einer LFA-1 beta-Untereinheit zu assoziieren, um ein LFA-1 Heterodimer zu bilden.

4. Humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon nach Anspruch 3, worin dieses LFA-1 Heterodimer in der Lage ist, an ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 zu binden.

5. Humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon nach Anspruch 1, worin dieses Molekül wenigstens ein Polypeptid enthält, welches aus folgender Gruppe ausgewählt wird:

a. P-P-R-A-G-R.H;

b. I-I-T-D-G-E-A;

c. D-W-A-G-G-F-L;

d. S-Q-V-Q-T-I-H;

e. R-H-G-G-L-S-P;

f. M-S-C-T-D-F-S;

g. R-L-L-S-R-A-L;

h. G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E;

i. D-I-N-G-D-G-L-V-D-V;

j. V-K-D-L-E-G-D-G-L-A;

k. T-Y-L-S-G-L;

l. Y-I-I-G-I-G-K;

m. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; and

n. P-S-I-H-N-I-P.

6. Funktionelles Derivat der humanen LFA-1 alpha-Untereinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin dieses funktionelle Derivat ein Fragment der LFA-1 alpha-Untereinheit ist.

7. Funktionelles Derivat der humanen LFA-1 alpha-Untereinheit nach Anspruch 1, worin dieses funktionelle Derivat ein chemisches Derivat der LFA-1 alpha-Untereinheit darstellt.

8. Rekombinantes DNA Molekül, welches für eine humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.

9. DNA Molekül nach Anspruch 8, worin diese humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder das funktionelle Derivat davon wenigstens ein Polypeptid enthält, welches aus folgender Gruppe ausgewählt wird:

a. P-P-R-A-G-R.H;

b. I-I-T-D-G-E-A;

c. D-W-A-G-G-F-L;

d. S-Q-V-Q-T-I-H;

e. R-H-G-G-L-S-P;

f. M-S-C-T-D-F-S;

g. R-L-L-S-R-A-L;

h. G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E;

i. D-I-N-G-D-G-L-V-D-V;

j. V-K-D-L-E-G-D-G-L-A;

k. T-Y-L-S-G-L;

l. Y-I-I-G-I-G-K;

m. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; and

n. P-S-I-H-N-I-P.

10. Humane LFA-1 alpha-Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Suppression von Entzündungen, der Suppression von Metastasen haematopoetischer Tumorzellen, die ein funktionelles Mitglied der LFA-1 Familie für Migration sein müssen, der Suppression des Wachstums von Tumorzellen, die LFA-1 alpha- Untereinheit exprimieren oder zur Behandlung einer viralen Infektion.

11. Verfahren zum Diagnostizieren einer Entzündung und ihres Ortes, die von der Antwort des spezifischen Abwehrsystems eines Säugers verursacht worden ist, der vermutlich diese Entzündung hat, das folgende Maßnahmen umfaßt

(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Individuums mit einem Mittel, das ein Nukleinsäuremolekül enthält, welches in der Lage ist, an eine DNA gemäß den Ansprüchen 8 oder 9 zu binden, wobei diese Bindung eine Zelle zu identifizieren vermag, die an ICAM-1 oder an einen anderen natürlichen Liganden von LFA-1 zu binden vermag, und

(b) Nachweis dieses Nukleinsäuremoleküls.

12. Verfahren zum Diagnostizieren einer Entzündung und ihres Ortes, die von der Antwort des spezifischen Abwehrsystems eines Säugers verursacht worden ist, der vermutlich diese Entzündung hat, das folgende Maßnahmen umfaßt:

(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Individuums mit einem Mittel, das eine auffindbar markierte humane LFA-1 alpha- Untereinheit oder ein funktionelles Derivat davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält, die bzw. das Zellen zu identifizieren vermag, die ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von humanem LFA-1 exprimieren können, und

(b) Nachweis dieser humanen LFA-1 alpha-Untereinheit.

13. Verfahren zum Nachweis und zur Lokalisation einer Tumorzelle, die ICAM-1 oder einen natürlichen Liganden von humanem LFA-1 expremiert, bei einem Patienten, der vermutlich eine derartige Zelle hat, das folgende Maßnahmen umfaßt:

(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Individuums mit einem Mittel, das einen auffindbar markierten Bindungs-Liganden enthält, der ICAM-1 oder einen anderen natürlichen Liganden von humanem LFA-1 binden kann, wobei dieser Bindungsligand die LFA- 1 alpha-Untereinheit oder ein funktionales Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 ist, und

(b) Nachweis dieses Bindungsliganden, der in der Gewebeprobe an ICAM-1 gebunden ist.

14. Verwendung der alpha-Untereinheit von humanem LFA-1 oder eines funktionellen Derivates davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung viraler Infektionen.