JPH04505009A - クローニングｌｆａ―１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クローニングＬＦＡ−１ 関連出願の相互参照 本出願は１９８７年２月２６日付米国特許出願第０７／８１９゜４４０号の部分 継続出願である。

発明の背景 本研究は国の資金援助のもとになされたものであり、従って国は本発明に関しあ る種の権利を有する。特に、本研究はＮ、１．Ｈ，交付資金ＣＡ３１７９８号お よびＡ［１５８７７により支持されている。

本発明は細胞接着に関する。

細胞接着は細胞の移動や局在化をもたらし、体を完全な状態に維持するための重 大な機能である。細胞外基質成分用リセプター、例えばフィブロネクチン、ラミ ニンおよびビトロネクチンは形態形成および傷の癒合に際して細胞接着を媒介す る。免疫システムにおいて規則的な網状組織はリンパ球と抗原存在側細胞間の親 密な細胞−細胞相互作用、および細胞介在細胞溶解反応は、作用因子細胞とウィ ルス感染または転換ターゲット細胞との直接接触を含む。白血球内皮球相互作用 は炎症部位への白血球の移動およびリンパ球再循環において重要である。これら の細胞接着反応は一部の構造的に関連する糖蛋白質、ＬＦ　Ａ　−１，Ｍａｃ　 −１およびｐ１５０，９５１：Ｊ：り部分的に媒介されている。上記の糖蛋白質 は全て共通のβ−サブユニット（以下、ヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニットと云 う）を有している。

スプＩＪ　７ガーら、３１４　ネイチャー　５４０．１９８５；スフ’リンガ− ら［リンパ球作用に関連するＬＦＡ−１，ＣＤ２およびＬＦＡ−３分子：免疫シ ステムの細胞接着リセプター」アン・レブ・イムツール・Ｖｏｌ、　５　、　１ ９８７の両文献を本明細書の一部としてここに引用する。

発明の概要 本発明の一般的特徴は　ａ）細胞接着に関連するヒト糖蛋白質の実質上純粋な組 換体β−サブユニット、ｂ）このβ−サ°ブユニットの生物学的に活性なフラク シヨン、Ｃ）このβ−サブユニットの類似体または　。）このβ−サブユニット の臨接配列頻度が少なくとも１０％であるβ−サブユニットの７ラグメントにあ る。本発明はまたβ−サブユニットに対するコード化ｃＤＮＡ配列およびそれに 対するコード化ＤＮＡ配列を有するベクターに特徴を有する。組換体サブユニッ トはβ−サブユニーツトをコード化する組換体ＤＮＡのポリペプチド生成物、即 ち染色体内への局在化を自然には生じないＤＮＡから発現するポリペプチドを意 味する。天然サブユニットは自然に発生し局在化したＤＮＡからインビボで自然 に生成したサブユニットを意味する。類縁体は、−まＩ；は二種以上のアミノ酸 により通常のポリペプチドと区別されるが、通常のポリペプチドの生物学的活性 を実質上有しているポリペプチドを意味する。

本発明はまた、組換体β−サブユニット、生物学的に活性なフラクシｊン、類縁 体、ヒト糖蛋白質のβ−サブユニットの臨接配列頻度を少なくとも１０％、好ま しくは少なくとも８０％を有するフラグメントに対し引きおこされた全てのモノ クローナル抗体（Ｍ　Ａ　ｂ）に特徴がある。

ＬＦＡ−１β−サブユニットまたはそのフラグメントをコード化するｃＤＮＡｊ Ｅ列は、それをコード化する遺伝子を自然に生ずる全てのものから誘導してもよ く、あるいは、化学的に合成してもよい。得られた蛋白質のアミノ酸配列を変化 させないかあるいは蛋白質の生物学的な活性を顕著に変えないこの配列における 変体もまた本発明に含まれる。

好ましくはヒト糖！白質はＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１またはｐ１５０゜９５である 。

以下に詳述するごとく本発明は、様々なヒトの病気の状態を診断および治療する ことを可能にする。

本発明の別の特徴および利点は、好ましい態様に関する以下の記載およびクレー ムから明らかであろう。

好ましい態様の記載 まず図面について簡単に説明する。

第１図はＬＦ　Ａ　−１％Ｍａｃ　−１およびｐ１５０，９５のβ−サブユニッ トのＤＮＡ暗号配列である。潜在的なＮ−グリコジル化部位は三角形で示しであ る。

第２＠は第１ｆ！ＩのｃＤＮＡから予期されるアミノ酸配列とＬＦＡ−１のβ− サブユニットの酵素分解から誘導されたアミノ酸配列との比較である。アミノ酸 の不明瞭な決定を（）で囲っである。アミノ酸のコードは以下の通りである： Ａｓｎ、　Ｎ　−アスパラギン Ａｓｐ、　Ｄ　−アスパラギン酸 Ｃｙｓ、　Ｃ−システィン Ｇｉｎ、　Ｑ　−グルタミン Ｇｌｕ、　Ｅ　−グルタミン酸 Ｇｌｙ、　Ｇ　−グリシン Ｈｉｓ、　Ｈ−ヒスチジン Ｉ　ｌｅ、　Ｉ　−インロイシン Ｌｅｕ、　Ｌ　−ロイシン Ｌｙｓ、　Ｋ　−リジン Ｍｅｔ、　Ｍ　−メチオニン（出発） Ｐｈｅ、　Ｆ　−フェニルアラニン Ｐｒｏ、　Ｐ　−プロリン Ｓｅｒ、　Ｓ　−ゼリン Ｔｈｒ、　Ｔ　−スレオニン Ｔｒｐ、　Ｗ　−トリプトファン Ｔｙｒ、　Ｙ　−トリプシン 上述の関連する糖蛋白質の全てのβ−サブユニットは一般に標準的な方法により 単離され、その少なくとも一部であるアミノ酸配列も標準的方法で測定される。

この分析からこのアミノ酸配列に相当する合成オリゴヌクレオチドプローブが合 成され、β−サブユニットをコード化するＮＤＡ配列含むゲノムまたはｃＤＮＡ ライブラリー用プローブとして用いられる。この方法の実施例を以下に記載する 。当業者はこの方法がＬＡＦ−１β−サブユニットコード化遺伝子の数あるクロ ーニング達成手段のうちの一例を現わしているにすぎないことを理解するべきで ある。

β−サブユニットの精製 ｐ１５０．９５、Ｍａｃ−１およびＬＡＦ−１のσ−サブーＬ二ｙトに対して反 対向きのＭＡｂ’ｓを用いて、三種の異なったソースからそれぞれの類縁蛋白質 を精製した。

ｐ１５０．９５蛋白質はヘアリー・セル・リュウケミア・スプリーンから精製し 、（ミラーら、１９８６，１３７　ジエイ・イムツール　２８９１　：これを本 明細書の一部とする）；Ｍａｃ−１はうつ血性ヒト白血球から（ミラーら、同上 ）：およびＬＡＦ−１は、ＴＳＩ／２２モノクローナル抗体を用いる５ＫＷ３　 Ｔセルラインから精製した（サンケラツーマドリッドら、ｌ　９８３．Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ。

１５８　：　５８にれを本明細書の一部とする）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの調製はラムリーの方法（フン力ピラーら、１９８３　、 　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ＋ｍ、　９上：２２７）を用いて行なツタ。０゜１ｍＭ 　Ｎａトリグリコレートを上部チャンバーに加え、ゲル中の遊離ラジカルのレベ ルを減少させた。ゲルをＩＭＫＣＩ中で数分間浸漬することによりバンドを可視 化し、次いで切開した。β−サブユニットをフン力ビラーら（同上）により記載 された装置および方法を用いて電気溶出させた。精製蛋白質を２％ＳＤＳの存在 下、２ｍＭＤＴＴで稀釈し、暗所で５１１ＩＭ沃化酢酸を用いてアルキル化した （場合により蛋白質を稀釈し、ゲルの調製前にアルキル化した）。

アミノ酸配列 上記試料を４容量倍のエタノールを用い一２０℃で１６時間かけて沈澱させた。

蛋白質ペレットを０．１ｍＭ　ＣａＣ１ｚと０．１％両性剤３−１４（カルビオ ケム、サンジエゴ、ＣＡ）を含む０．１Ｍ　ＮＨ４ＣＯ３３０〜５０μＱに再溶 解した。次いでサンプルを１％Ｗ／Ｖトリプシンで３７℃、６時間分解した。イ ンキュベーション中、２時間目と４時間目に、追加トリプシン（１にｖ／ｗ）を 加えた。

トリプシン処理ペプタイドを０．４　Ｘ　１５ｃｍＣＪカラム（バイダック、ヘ スペリフヒ、ＣＡ）を備えた逆相ＨＰＬＣ（ベックマン・インスツルメント）に より分離し、０から６０％の直線濃度勾配を有するアセトニトリルで２時間溶出 した。水性および有機溶媒の両方に０．１％のＴＦＡを含有させた。ピークを２ １４および２８０ｎｍで　−モニターＬ、１．５−ポリプロピレン・チューブ中 に集めた。フラ″゛クシ瑠ンを高速真空装置（スピード−バク・アパラタス）上 で３０μａ以下に濃縮し、選出ペプタイドを気相ミクロシクエネータ−（アプラ イド・バイオシステム、フォスター・シティ−、ＣＡ）を用いて配列分析にかけ た。

実施例　ｐ１５０．９５のβ−サブユニットｐ１５０．９５をａ−サブユニット （ＭＷ約１５０．０００．　ミラーら、同上）に特異的なモノクローナル抗体を 用いヘアリー・セル・リューケミアにかかったヒトの患者の牌臓から類縁体を精 製した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥと銀着色による精製蛋白質の分析から、少量の不純蛋白質を含 む特徴的なσおよびβ−サブユニットを確認した。β＝サブユニット　ハンドは 、上述のごとく、調製５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから削り取って電気溶出した。

β〜サブユニットのＮ−末端はグロックされているので配列しなかった。内部ア ミノ酸配列情報は、β−サブユニットをトリプシンで消化することにより得た。

このトリプシン処理ペプチドヲ逆相ＨＰＬＣで分離し、６０％アセトニトリル勾 配で溶出した。２１４および２８０ｎｍの吸収により分析されるピークを集め、 気相ミクロシクエネーターにかけた。

これらの７ラグメントの二種類のペプチド配列は：Ｐ−６１ペプチド配列： ＬａｕＴｙｒＧ　ＩｕＡｓｎＡｓｎ　［ＩｅＧ　ＩｎＰｒｏ　Ｉ　ＩｅＰｈｅＡ 　ＩａＶａｌ　ＴｈｒＳｅｒＰ−２０ペプチド配列：　ＴｈｒＡｓｐＴｈｒＧ　 ｌｙＴ　ｙｒ　Ｉ　１ａＧ　１ｙＬ　ｙｓ。

二つの方法がオリゴヌクレオチドプローブを構成するために採用された。ヒト・ フードン利用頻度にもとづきペプチドＰ−６１から特有の配列３９ｍｅｒを設計 した（Ｌａｔｈｅ、　１９８５　、　ｆ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ。

上８３：１）。この配列は二 ３’−ＧＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＴＣＧＧＧＴＡＧＡＡＡＣＧＡ ＣＡＣＴＧＧ−５゜ 混合配列プローブの二組を、それぞれ可能な配列を表わすように構成した。ペプ チドＰ−６１から、９６−倍リダンダンシーを有する２Ｑｍｅｒが誘導され、β −サブユニットの異なったペプチド・７ラグメントであるＰ−２０からの配列に もとづいて１９２−倍リダンダンシーを有する１７ｒｎｅｒが構成された。これ らの配列を以下に示す。

２Ｑｍｅｒの混合配列： １７ｎ＋ｅｒ混合配列： この３９ｍａｒおよび混合配列２Ｑａ＋ｅｒを用いて、ＰＭＡ−賦活Ｕ９３７細 胞からのポリへ十選択ＲＮＡのノーサン・プロットをプローブした。Ｕ９３７細 １！ＪＹリムホブラストイド細胞、ＨｅＬａ１ｌＢ１１！ｌおよびＣＯ３細胞（ スプリンガーら、１９８４、Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、上６０：１９０１．健 康なドナーからのＥＢＶ変換セルライン）を３７℃、Ｃｏ、５％含有加湿大気中 で１０〜１５％の牛の胎児血清含有ＲＰＭＩ　１６４０中で生育ｑせた。Ｕ９３ ７細胞を、収穫前３日間２　ｎｇ／　ｍＱ　Ｐ　Ｍ　Ａで活性化した。この細胞 を４Ｍグアニジニウムインチオシアネート溶液中に溶解し、５．７Ｍ　ＣｓＣ＋ 勾配中でＲＮＡを単離した。ポリＡ＋＋５ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロース カラム（マニアナイスら、モノキュラー・クローニング：ラボラトリ−・マニュ アル、コールド番スプリング・ハーバ−φラボラトリー・ニューヨーク、１９８ ２）またはオリゴ（ｄＴ）−親和紙（アマ−ジャム）で選出した。このＲＮＡを ホルムアルデヒド含有１％アガロース・ゲル（マニアチスら；同上）上で変性し 、大きさをそろえ、２ＯＸＳＳＣ中でナイロン膜（バイオラッド）に移した。人 の細胞からの２８３および１８５リボゾーマルＲＮＡまたはエッシェリッヒア・ コリからの２３５および１６ｓのｒＤＮＡを含むレーンの標準分子量を測定した 。

フィルターをニック翻訳グローブＤＮＡを５ｘＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、 ｌＯ％デキストランサルフェート％ＩＸデンハルト、０．５％ＳＤＳおよび１０ ０　ｐｇ／ｍＱ変性サーモンす子ＤＮＡ中で４２℃、１８時間ハイブリダイズし 、０．２ＸＳＳＣ中および０．１％ＳＤＳ中で厳密に洗浄した（６５℃）。プロ ーグは両方共、約３ｋｂのバンドを同定した。３９＋ｅｒはより強い信号を与え 、ｃＤＮＡライブラリーの第１スクリーニング用に選ばれた。

ヒト扁桃ｃＤＮＡライブラリー（エル・クリックスタインの贈呈）を２ｋｂ以上 挿入するために寸法選択し、λｇｔｌｌ（ウオングら、１９８５、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８２ニア　７１１）中で構成し た。４Ｘ１０’組換体の厚ライブラリーを一旦増幅し、７５００ブラック／１０ ０ｍａ＋プレートの密度で２００，０００組換体を覆った。このブラックをウー （１９７９，Ｍａｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、６８：３８９）によす記載された二重ニト ロセルロースフィルター上にイン・サイチュ増幅した。

オリゴヌクレオチドのプローブにポリヌクレオチド・キナーゼを用いて、”Ｐ− ＡＴＰでラベルした。このフィルターを６ＸＳＣＣ。

ｌ×デンハルツ、０．５％ＳＤＳ、０．０５％リン酸塩、バッファーおよび１０ ０μｇ／■ａのサーモン精液ＤＮＡ中、４２℃で少なくとも２時間、ブリハイブ リダイズした。３９閣ｓｒとのハイブリダイゼーシヨンは、２０μｇ／ｍＱ　ｔ ＲＮＡを含むプリハイプリダイセージ１ン溶液中で４２℃で１晩行なった。フィ ルターを６ｘｓｓｃ、ｏ。

１％ＳＤＳおよび０．０５％リン酸塩バッファーを用い、５３〜５５℃で洗浄し た。湿ったフィルターをプラスチック製ラップで覆い補強スクリーンを有するフ ィルムｊｍｌ）した。複写フィルター上に陽性の信号を与えた７アージが精製さ れたブラックであり、より高い洗浄温度（６０℃）において３９ｍａｒと共にお よび、２０ｍｅｒおよび１７　＋ｓｓｒ混合配列プローブと共に再スクリーンし た。１５個の陽性クローンを採取した。８個のクローンが相互に反応し、２Ｑｍ ｅｒ混合配列グローブと独立１７ｍａｒ混合配列プローブの陽性信号を与えた。

これらのクローンをさらに分析するために選択した。

ｃＤＮＡクローンの同一性を確認するための、３９ＩＩＩｅｒに対しハイブリダ イズされた２６３ｂｐ　Ｐｓｔｌ／ＥｃｏＲＩ＠定フラグメントをＭ１３ベクタ ー中にサブクローンし、以下のごときサンガー・ジデオキシ鎖ターミネーシ璽ン 法により配列した。ＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列は、３９■ｓｒプロー ブが誘導されるペプチド配列に対し、１３または１４位において同一であり、こ れは、オリゴヌクリオチドのデザイン中には含まれていないあるアミノ酸を含ん でいる。さらに、予想されるアミノ酸配列はこのペプチドが、典塵的な７ラグメ ントに対して期待されているようにまずリジン、次いでアルギニンが配列される ことを示している。一つの不適当な組合せは正常な多形性によるかも知れない。

特有の配列オリゴヌクレオチドはｃＤＮＡ配列に対し、８７％一致するが一つの アミノ酸は不適合であった。

ｃＤＮＡクローンを一種および二種の制限酵素を用いて消化し、末端ラベル化、 制限酵素で部分消化してその制限酵素地図を得た。

（マニアチスら、同上）。共存し得る制＠７ラグメントをＭ１３クローニングベ クター中に直接サブクローンした。他の２ラグメントをまずフレナラ、Ｔ４ポリ メラーゼ、またはムング・ビーン・ヌクレアーゼ（マニアティら、同上）で平滑 末端化し、Ｍ１３ポリリンカーのＨｉｎｃｎまたはΣｍａＩ部位中に連結した。

両ストランドのヌクレオチド配列を”５−ｄＡＴＰを用いるサンガーらのジデオ キシ鎖ターミ不−シタン法により決定した（　１９７７　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ、　Ａｃａｄ。

！３ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ−７４：５４６３）。

最長クローン中のβ−サブユニット遺伝子、１８．１．１（２，８ｋｂは長さ） の推定アミノ酸配列と完全なヌクレオチド配列をＦｉｇ、ｌに示す。第１のＡＴ Ｇは７３位ｌこあり、ＡＴＧをとり囲む配列は初期コードンに対して合意された 規則（Ｋｏｚａｋ　１９８４　。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、ｌ　２：８５７）に一致している。この推定 上の初期コードンに続いて２３０４ｂｐのオープン・リーディング・フレームを 示してあり、これは７６９アミノ酸（ａａ）のポリペプチドをコード化し得る。

停止コードンＡＴＣに続いて３９４ｂｐの３′非翻訳領域が示されている。ポリ Ａの尾部は見出せなかったが、合意されたポリアデニル化信号（ＡＡＴＡＡＡ） は３′端部から９ｂｐに位置している。

ｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列を、Ｍａｃ　−１，ＬＦＡ　−１８よびｐ ｉ　５０．９５（Ｆｉｇ、２）のβ−サブユニットからのペプチド配列データと 対比した。上述のＰ６１とＰ−２０ペプチド配列に加えて、ｐ１５０．９５のβ −サブユニットから他の１つのペプチドを配列した。トリプシン処理ペプチドを 調製し、精製Ｍａｃ−１およびＬＦＡ−１のβ−サブユニットから分析した。各 ペプチド配列は推定アミノ酸配列（１”ｉｇｓ、ｌおよび２）の範囲内にあった 。即ち、ｃＤＮＡはヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニットをコード化すると結論づ けることができる。

ｃＤＮＡクローンは、ぼｆ３．０ｋｂの単−ｍＲＮＡスピーシズに対しハイブリ ダイズし、これは３９ｍａｒオリゴヌクレオチドにより同定されるのと同一のメ ツセージである。このメツセージは、ＰＭＡ活性化Ｕ９３７細胞（ＬＦＡ−１” 　、Ｍａｃ−１−、ｐｌ　５０．９５°）、ＪＹリムフｔ”ブラストイド細胞（ ＬＦＡ−１”　、Ｍａｃ−１−、ｐｉ５０．９５−）、および正常なドナーから のＥＢＶ−形質転換細胞（ＬＦＡ−１”、Ｍａｃ−１−、ｐ１５０．９５−）中 に存在するが、ＨｅＬａ細胞（ＬＦＡ−１−、Ｍａｃ−１−、ｐ１５０．９５− ）中には存在しない。クローン１８．１．１はポリ八尾部を欠いているがＲＮＡ メツセージの推定サイズに近接している。

推定ポリペプチド内に二層の膜を橋かけできるに十分な長さと疎水性の２つの領 域がある。第１の領域はおそらくメチオニンで始まり、２２個のアミノ酸を有し 、シグナル配列の特性を有する。この推定シグナル配列に続いて変性グルタミン が位置し、その残基はしばしばＮ−末端部位で環化している。これは、もしシグ ナル配列が処理中に開裂すると、β−サブユニットのＮ−末端部位のプロッヶー ジと一致する。

用途 ヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニットをコード化するｃＤＮＡは組換体β−サブユ ニットを多量に生産するために使用できる。例えばβ−サブユニット・コード化 ｃＤＮＡは、λｇｔｌｌクローンから削り取って標準的手段により発現ベクター （プラスミド、コスミド、ファージまたは他のタイプ）中に導入し、Ｅ、ｃｏｌ ｉ中のβ−サブユニットを発現することができる。代りに、クローンを他のベク ター、例えば哺乳類、昆虫、またはイースト発現ベクター中に導入し、哺乳類ま たはイースト細胞中に組換体β−サブユニットを生産するために使用してもよい 。

上記方法により生産されるサブユニットは、容易Ｉこ精製でさ、サブユニットに 対するモノクローナル抗体を高めるためのイムノゲンとして使用することもでき る。これらの抗体はラベルして、白血球細胞中およびそれらの表面ＬＦＡ−１ま たは関連蛋白質上に有する、多すぎるかあるいは少なすぎる細胞に関連した病気 を有する患者の血清または他の体液中のＬＦＡ−１％Ｍａｃ−１またはｐ１５０ ．９５のレベルをモニターするための標準イムノアッセイに用いることもできる 。

例えば、エイズ等の免疫抑制に特徴づけられる病気は抗感染細胞の異常な低下を 併うことが予測されてあり、この様な病気は、これらの蛋白質のモニターリング ・レベルにより監視することができる。

また、他の病気、例えば、自己免疫疾患、同種移植片拒絶症および移植片宿主病 はその様なＪＩＩＩ胞の異常に高いレベルｌ：特徴があると思われ、これは、こ れらの蛋白質のモニタリング・レベルにより監視できる。

これらはまた白血球の接着欠陥、ＬＦＡ−１，Ｍａｃ−Ｌおよびｐ１５０，９５ 糖蛋白質の本質的な欠除の診断に使用することもできる。β−サブユニットに対 する抗体もまた従来の免疫親和性精製法により、ＬＦＡ−１またはそれに関連す る蛋白質を精製するために使用することができる。

精製蛋白質、特にＬＦ　Ａ　−１，Ｍａｃ　−１および／またはｐ１５０゜９５ は、天然のものか組換によるかにかかわらず治療に使用することができる。蛋白 質は治療を必要とする際、有効量（例えば体重１ｋｇ当り２０〜５００μｇ）患 者に投与する、これは、生理学的に許容し得るキャリア、例えば食塩水と混合し て用いてもよい。これらの蛋白質の治療への利用は病気の状態、例えば自己免疫 疾患、同種移植片拒絶反応および移植対宿主病等がＬＦＡ−１および関連する蛋 白質の、ターゲット抗原が存在する細胞、内皮細胞および他種の細胞に対する結 合および認識によって媒介される異常に高いレベルの細胞対ｍ砲の接触を含むと 云う事実にもとづいている。ＬＦＡ−１または関連する蛋白質またはそれらの７ ラグメントの投与は、細胞結合蛋白質用リセプターと競合し、細胞対細胞の結合 を阻止し、所望の免疫抑制をもたらすであろう。これらの蛋白質が特に有用であ る疾病は自己免疫性リウマチ様関節炎である。

好ましい投与は、体重１ｋｇ当り、約２０〜５００μｇの静脈注射または、リウ マチ様関節炎にかかった患者の炎症関節への直接投与である。代りに経口投与ま たは局部投与を、錠剤、カプセルまたは溶液を供給し、あるいは必要とされるロ ーションを投与することによって採用してもよい。投与量および方法を患者の年 令や体重および治療すべき病気によって変えてもよい。

治療し得る自己免疫疾病は全身性エスリマトーデス、若年性ｆｌｌＲ病、多発性 硬化症、アレルギー症、湿疹、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病および 同種移植片拒絶反応（例えば腎臓または心臓移植の拒絶反応）等が含まれる。Ｌ ＦＡ−１％Ｍａｃ−１８よびｐｉ５０．９５は、通常内皮および他の細胞に結合 することにより、インサイチュで通常作用する。即ち、投与される遊離蛋白質ま たはペプチドは、炎症部位に対する白血球免疫応答および移動を阻止することが できるであろう。

β−サブユニットｃＤＮＡクローンは白血球接着欠陥（ＬＡＤ）の出産前糖尿病 に使用できる。ＬＡＤ疾患はＬＦＡ−１％Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５の細 胞表面発現において欠けており、これは、少すくトモ部分的にはβ−サブユニッ トにおける初期遺伝子損傷によっている。重病のＬＡＤ疾病患者は再発性細菌感 染にかかり易く、滅多に大人まで生き残れない。この欠陥は特有の制限酵素フラ グメントの多重性と関連しているので妊娠の早期に検出できる。ヒトＤＮＡのＰ ｓｔｌダイジェスシ望ンおよびβ−サブユニットｃＤＮＡの１゜８ｋｂ　Ｅｃｏ ＲＩフラグメント（Ｆｉｇ、２参照）との／１イブリデーシ層ンは、制限酵素７ ラグメントの多重性（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）をきめる。従ってこの病気の診断はこのＥ ｃｏＲＩフラグメントの全部または一部を用いる標準法によって実施される。胎 児および胎児の両親のゲノムＤＮＡ５はこのプローブでスクリーンし、それらの ＲＦＬＰｓ分析を行った。この方法で胎児が病気を有する可能性が予測できる。

ＩＣＡＭｓ（例えばＩＣＡＭ−１）がある種の人のウィルス（特にメジャーをの 鼻炎ウィルス（ＩＣＡＭ−１に結合している）により確認されている。この確認 により、これらのウィルスは人の細胞に結合しており、これによりウィルス感染 を媒介する。即ち、ウィルス性疾病の病因である主要なステップはこれらの細胞 リセプターとウィルス間の相互作用にある。

ＩＣＡＭ分子と結合するウィルスの活性を抑制し、競合しあるいは阻止する薬剤 は、ウィルス（特に鼻炎ウィルス）感染の治療に使用できる。

本発明の特徴の一つは、ヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニットの活性、およびＩＣ ＡＭ−１と相互作用し、およびそれによって、相互に細胞−ウィルス付着および ウィルス感染を防止し、あるいはこの感染のつらさや長期化を減少しあるいは短 くするためのその機能誘導体に関する。

本発明にとって特に興味深いのはヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニット、例えば溶 解化されたヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニット、ヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニ ットの７ラグメント等の機能誘導体である。

このような薬剤は好ましくは一部のＣＤ−１８フアミリー（例えばＬＦ’Ａ−１ ，ｐｉ　５０．９５またはＭＡＣ−１のごとき）のσ−サブユニットの分子と関 連した分子を含むヘテロダイマーとして受容者である患者に供給する。ウィルス 感染を治療する上述の目的は、単一薬剤または二種以上の薬剤の併用により達成 してもよい。

ウィルス感染治療の目的にとって、本発明の上述の薬剤は受容者である患者に対 し、ウィルスがＩＣＡＭ分子に結合する能力を抑制し、競合し阻止するに十分な 投与量で供給（例えば鼻内に）されるべきである。この様な投与量は一般に患者 の体重１ｋｇ当り０．０１ｐｇから１１１９であるがこれより少量あるいは多量 に使用してもよい。

ウィルス感染治療の目的には薬剤の投与は「予防」または「治療」いずれでもよ い。予防のために投与するときは、薬剤は感染に先立つて（感染前または直後） 、ウィルス感染の徴候が表われる前に供給する。薬剤の予防投与はその後の感染 を防止または減少させるのに役立つ。治療用に用いるときは薬剤は実際のウィル ス感染の微＃（例えばウィルス性の鼻の充血等、あるいは体液中のウィルスの検 出、または感染患者の血清中のウィルスに対する抗体の検出等）があったとき（ あるいはそのすぐ後）である。

薬剤の治療用投与は全ての実際の感染症の減少に役立ち、そのつらさや期間を減 少させる。

他の態様は以下の請求の範囲に含まれる。

セ　ン　ｓ”　史　の　さ　起 −トＷｌ さ 、ｔ、−Ｎ　Φ　φ ８　諾　′　？　０　′″：′ Ｍ　？　？　？　’ｆ’ ｒ％−■ ξ　＄　３８２　口　８ ぽ） Ｆ工ＧＵ只Ｅ２ ｐＩ５０，９５βサブユニツト ？ｗＬａｃ−１βサブユニット 推定配列　ＫＳＡＶＧＥＬＳＥＤＳＳＮＬＦＡ−１βサブユニツト Ｌ５６ａ配列　ＥＣＱＩ’ＰＦＡＦＲ 推定配列　ＫＥＣＱＰＰＥ’ＡＦＲ Ｌ−６５配列　Ｖ　］”、　Ｌ　Ｄ　）ｌ　Ｎ　Ａ　Ｌ　Ｉ’推定配列　ＲＶＥ ’ＬＤＨＮＡＬＰ 国際調査報告

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニットまたは、それらの機能誘導体を含む組成 物の有効量を治療の必要な患者に投与することを特徴とするウイルス感染症の治 療法。
2. ２．ヒトＬＦＡ−１のβ−サブユニットをＣＤ−１８ファミリーのメンバーのα −鎖と連合して投与される請求項１記載の方法。
3. ３．ウイルス感染症が鼻のウイルス感染症である請求項１記載の方法。
4. ４．ウイルス感染症が鼻の感染症である請求項１に記載の方法。