DE69120318T2

DE69120318T2 - Esterase von Serratia und Verfahren zur Herstellung

Info

Publication number: DE69120318T2
Application number: DE69120318T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Akatsuka; Hiroaki Matsumae; Takeji Shibatani
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1990-03-13
Filing date: 1991-03-06
Publication date: 1996-12-12
Anticipated expiration: 2011-03-07
Also published as: IE75884B1; AU7269591A; SG43356A1; CA2037634C; EP0446771B1; IL97454A0; HK1000128A1; US5208156A; KR910016917A; CA2037634A1; AU643758B2; ATE139563T1; IE910751A1; EP0446771A3; DK0446771T3; JPH04228070A; KR0139525B1; DE69120318D1; EP0446771A2; JPH0779690B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Esterase sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
In jüngster Zeit sind Versuche unternommen worden, Esterase in organischen Synthesereaktionen (z.B. Hydrolysereaktion) einzusetzen. Beispielsweise wird Esterase aus Schweineleber häufig zu diesem Zweck eingesetzt. Diese Esterase hat für eine industrielle Anwendung den Nachteil, daß sie teuer ist. Andererseits sind Esterasen bekannt, die aus Mikroorganismen gewonnen werden, wie etwa aus Arthrobacter globiformis IFO 12985 (ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 181788/1989) (Molekulargewicht 43.000), Bacillus stearothermophilus (Archiv. Biochem. Biophys 160, 504-513 (1974) (Molekulargewicht 47.000), Geotrichum candidum (Agric. Biol. Chem. 37(6), 1457-1464 (1973)) (Molekulargewicht 53.000-55.000), Pseudomonas aeruginosa (J. Biochem. 86, 643-656 (1979)) (Molekulargewicht 55.000), Pseudomonas fluorescens (J. Biochem. 95, 1047-1054 (1984)) (Molekulargewicht 48.000). Bei diesen Esterasen gibt es jedoch die Schwierigkeit, daß sie wegen ihrer engen Substratspezifitäten nicht auf breiter Front eingesetzt werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neuartige Esterase bereitzustellen, die aus einem Mikroorganismus gewonnen wird und die in organischen Synthesereaktionen auf so breiter Basis wie die Schweineleber-Esterase eingesetzt werden kann.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung dieser Esterase.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Niederalkyl (2R, 35)-3- (4- Niederalkyloxyphenyl)glycidats unter Verwendung dieser Esterase bereit zustellen.
Als Ergebnis verschiedener Untersuchungen haben wir nunmehr eine geeignete Esterase gefunden, die aus einem Mikroorganismus der Gruppe Serratia gewonnen wird.
Die Esterase nach der vorliegenden Erfindung ist eine neuartige Esterase mit folgenden physiko-chemischen Eigenschaften und enzymatischen Charakteristika:

(1) Aktivität

Die Esterase hydrolysiert eine Esterbindung eines organischen Carboxylats.

(2) Substrat-Spezifität

Sie wirkt auf Alkylester organischer Carbonsäuren, Triglyceride oder Thiolester. Beispielsweise hat die Esterase nach der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, niedere oder höhere Alkylester oder organische Carbonsäuren (z.B. eine niedere Fettsäure, eine höhere Fettsäure, eine niederalkoxysubstituierte Phenylglycidsäure und ähnliches) zu hydrolysieren. Darüber hinaus hat diese Esterase die starke Fähigkeit, aus Glycerin und wasserlöslichen niederen Fettsäuren oder wasserunlöslichen höheren Fettsäuren bestehende Triglyceride zu hydrolysieren. Ferner ist sie ebenso in der Lage, Thiolester wie etwa Dimercaprol- Tributyrat und ähnliches zu hydrolysieren. Sie ist allerdings nicht in der Lage, Casein zu hydrolysieren.

(3) pH-Optimum

Sie zeigt ein pH-Optimum von etwa 7.5-9.0, wenn Olivenöl als Substrat verwendet wird.

(4) pH-Stabilität

Sie behält mehr als 95 % ihrer Aktivität, wenn sie bei pH 5-9 bei 30 ºC 60 Minuten lang aufbewahrt wird.

(5) Temperatur-Optimum

Sie zeigt ein Temperatur-Optimum von etwa 40-50 ºC, wenn die enzymatische Reaktion in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8.0) mit Olivenöl als Substrat abläuft.

(6) Temperatur-Stabilität

Sie behält 100 % ihrer Aktivität, wenn sie bei einer Temperatur von nicht höher als 50 ºC in 100 mM Tris-HCl- Puffer (pH 8.0) 30 Minuten lang aufbewahrt wird.

(7) Untersuchung der Enzymaktivität

(a) Aktivität für Olivenöl

Die Enzymreaktion wird bei pH 8,0 und 37ºC 20 Minuten lang geführt, wobei Olivenöl als Substrat eingesetzt wird. Die Aktivität der Esterase, die zur Produktion von einem µMol Fettsäure pro Minute führt, wird als eine Einheit definiert (vgl. Beispiel 1).

(b) Aktivität für Triglyzeride oder Fettsäure-Ester

Die Enzymreaktion wird bei pH 8,0 und 37ºC 10 Minuten lang durchgeführt, wobei Triglyzeride oder Fettsäure-Ester als Substrat eingesetzt werden. Die Esterase-Aktivität, die zur Produktion von einem µMol Fettsäure pro Minute führt, wird als eine Einheit definiert (vgl. Beispiel 3).

(c) Aktivität für Thiolester

Die Enzymreaktion wird bei pH 8,5 und 30ºC 10 Minuten lang mit Dimercaproltributylat als Substrat durchgeführt. Nach der Reaktion wird dem Reaktionsgemisch 5,5'-Dithiobis(2- Nitrobenzoesäure) als farbbildendes Reagenz zugefügt. Die Menge der freigesetzten 5-Mercapto-2-Nitrobenzoesäure wird spektrophotometrisch gemessen. Die Esterase-Aktivität, die zur Bildung von einem µMol 5-Mercapto-2-Nitrobenzoesäure führt, wird als eine Einheit definiert (vgl. Beispiel 4).

(8) Molkulargewicht

62.000 ± 2.000 (SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese)

(9) Isoelektrischer Punkt

4,6 ± 0,1

(10) Einfluß von Metallionen

In Anwesenheit von 1 mM Kalzium-Ionen wird die Esterase aktiviert. Andererseits wird die Aktivität in Gegenwart von 1 mM Zinkionen, Kupferionen, Manganionen zu 40-90 % und in Anwesenheit von irum Kobaltionen, Nickelionen, Eisen-Il- Ionen, Eisen-Ill-lonen und Ethylendiamintetraessigsäure vollständig gehemmt.
Die obengenannte Esterase nach der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich offensichtlich von den bekannten Esterasen dadurch, daß sie ein Molekulargewicht von 62.000±2.000 (bestimmt mit SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese) und einen isoelektrischen Punkt bei 4,6±0,1 hat.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die obengenannte Esterase dadurch hergestellt werden, daß man den Mikroorganismus Serratia marcescens Sr41 (Fern-BP No. 487) in einem Medium kultiviert, daß die Esterase in dem Mikroorganismus oder außerhalb davon akkumuliert und diese Esterase daraus gewonnen wird.
Als Medium kann jedes Medium verwendet werden, in dem die Esterase bildenden Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung wachsen und sich vermehren können. Beispiele für die Kohlenstoffquelle schließen Zucker wie etwa Glukose, Saccharose, Melasse und ähnliches, organische Säuren wie etwa Fumarsäure, Zitronensäure und ähnliches, Alkohole wie etwa Glycerin und ähnliches, Aminosäuren wie etwa Alanin, Glutamin, Asparagin und ähnliches, usw. ein. Anorganische Ammoniumsalze wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und ähnliches, Harnstoff, Pepton, Getreideeinweichwasser, Hefeextrakt, Kaseinhydrolysat und ähnliches, können als Stickstoffquelle verwendet werden. Vorzugsweise werden 1-15 Gew.-% der Kohlenstoffquelle und 0.1-2.0 Gew.-% der Stickstoffquelle eingesetzt. Wenn nötig, können anorganische Salze wie etwa Phosphate, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Kalziumsalze und ähnliches oder Metallionen wie etwa Eisenionen, Manganionen, Kupferionen, Zinkionen und ähnliches dem Medium zugegeben werden. Wird ein synthetisches Medium verwendet, können dem Medium erforderlichenfalls Vitamine wie etwa Biotin, Thiamin und ähnliches oder wachstumsfördernde Substanzen wie etwa Carnitin zugesetzt werden. Darüberhinaus können dem Medium nötigenfalls Startsubstanzen wie etwa Pflanzenöle oder Tenside zugegeben werden. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 5-8 eingestellt.
Nach dem Überimpfen des Mikroorganismus auf das Medium können die Kulturen auf herkömmliche Art gezüchtet werden. Beispielsweise können zu diesem Zweck Verfahren wie etwa Schüttelkultur, Kultur mit Belüftungskreisel, stationäre Kultur oder Durchflußkultur eingesetzt werden.
Die Kultivierungsbedingungen können in Abhängigkeit von der Art des Mediums und des Kultivierungsverfahrens und ähnlichem variieren. Jede Bedingung, bei der der Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung wachsen, sich vermehren und Esterase bilden kann, ist für den vorliegenden Zweck geeignet. Allerdings wird normalerweise bevorzugt, die Kultivierung bei einem pH-Wert von etwa 5-8 anzufangen und diese dann bei Zimmertemperatur oder unter Erwärmung ablaufen zu lassen, beispeisweise 1 oder 2 Tage lang bei einer Temperatur zwischen 20 und 40 ºC.
Die in den kultivierten Mikroorganismen oder außerhalb davon akkumulierte Esterase kann auf herkömmliche Weise gewonnen und gereinigt werden. Beispielsweise kann die in der Kulturbrühe akkumulierte Esterase mit Hilfe einer Kombination bekannter Methoden wie etwa dem Aussalzen mit anorganischen Salzen (z.B. Ammoniumsulfat, einem Alkalimetallsulfat oder einem Alkalimetallhalogenid), differentieller Fällung mit hydrophilen organischen Lösungsmitteln (z.B. einem Alkohol oder Aceton), Säulenchromatographie mit Ionen-Austauscherharz oder hydrophobem Harz, Gelfiltration und Eiweißfällung mit Nukleinsäure, Tannin oder ähnlichem gewonnen werden. Die derart gewonnene Esterase kann mittels einer Kombination bekannter Reinigungsverfahren wie etwa isoelektrische Fällung, Dialyse, Elektrodialyse, Elektrophorese und ähnlichem weiter gereinigt werden. Die Reinigung wird z.B., in folgenden Schritten durchgeführt:
(1) Entfernen von mikrobiellen Zellen aus der Kulturbrühe durch Zentrifugation,
(2) Behandlung des Überstandes mit einer zu 45% gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung,
(3) nach Dialyse resultierendes Präzipitat einer Chromatographie auf einem Anionenaustauscherharz (DEAE- TOYOPEARL 650 M, MonoQ) unterziehen,
(4) nach Dialyse aktive Fraktionen auf ein hydrophobes Harz (Butyl-TOYOPEARL 6505 zur Chromatographie geben und
(5) nach Dialyse und Aufkonzentrierung aktive Fraktionen einer Gelfiltration (Superose 6) unterziehen.
Die derart gereinigte Esterase ist ein Polypeptid, das in einer SDS-Polyacrylymidgel-Elektrophorese eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 62.000±2.000 zeigt.
Wie vorhin erwähnt hat die Esterase nach der vorliegenden Erfindung die starke Fähigkeit, einen weiten Bereich von Substraten zu hydrolysieren, wie etwa Alkylester organischer Carbonsäuren, Triglyceride oder Thiol-Ester. Deshalb kann diese Esterase in organischen Synthesereaktionen auf so breiter Basis wie Schweineleber- Esterase eingesetzt werden. Sie kann beispielsweise zur Herstellung eines optisch aktiven Isomers aus einem Razemat eingesetzt werden, oder zur Herstellung einer chiralen Verbindung aus einer prochiralen. Insbesondere wird die Esterase nach der vorliegenden Erfindung dadurch charakterisiert, daß sie eine starke Fähigkeit zur Hydrolyse eines (niederen) Alkyl(nieder)alkyloxyphenylglycidats besitzt. Wenn sie zum Beispiel zur Hydrolyse eines razemischen Niederalkyl-trans-3-(4-niederalkoxyphenyl)glycidats verwendet wird, so kann ein Niederalkyl (2R, 3S)-3-(4-niederalkyloxyphenyl)glycidat mit guter Ausbeute gewonnen werden. Das auf diese Weise erhaltene Niederalkyl (2R, 3S)-3-(4- Niederalkoxyphenyl)glycidat ist als synthetisches Zwischenprodukt für Pharmazeutica wie etwa Diltiazemhydrochlorid brauchbar.
In den folgenden Beispielen bedeutet, wenn nicht anders beschrieben, "8" Gew./Vol.-%.

Beispiele

Beispiel 1

Ein Medium (pH 7.0, 20 Liter) mit Dextrin (1%), Ammoniumsulfat (0.2%), meast-S (2%), Kaliumdihydrogenphosphat (0.1%), Magnesiumsulfat (0.05%), Kalziumchlorid (0.01%), Eisensulfat (0.001%), Tween 80 (0.5 v/v-%) und ein Polyalkylenglycol-Derivat als Tensid (Handelsname KARARIN 102, hergestellt von Sanyo Chemical Industries, Ltd. 0,1 v/v-%) wurde in einem 30-Liter Topf- Fermenter eingefüllt und durch Autoklavieren sterilisiert.
Eine Brühe (200 ml) von Serratia marcescens Sr41, die man durch Umkehrschütteln bei 30 ºC für 20 Stunden im gleichen Medium wie oben erhalten hat, wurde in das sterilisierte Medium eingeimpft. Die Kultivierung erfolgte durch Belüftung und Rühren (200 U/Min., 0,5 vvm) bei 30 ºC während 18 Stunden. Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert, und der Überstand (4,5 Liter) wurde mit 45 % gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung ausgesalzt. Das Präzipitat wurde durch Filtration über Celite gewonnen und mit Wasser eluiert. Das Eluat wurde dialysiert und lyophilisiert. Es ergaben sich 4,1 g Esterase (18.600 U/g) als ungereinigtes Enzym in Pulverform

Test der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität wurde nach folgender Methode ermittelt.
Eine Mischung aus 225 ml 2%-igen Polyvinylalkohol (Poval 117, hergestellt von Kurare Co., Ltd.) und 75 ml Olivenöl wurde durch Rühren bei 14500 U/min. bei 5-10 ºC während 10 Minuten emulgiert. 5,0 ml dieser derart hergestellten Olivenöl-Emulsion und 4,0 ml 0,25 M Tris-HCl-Puffer (pH 8.0, 2.5 mM Kalziumchlorid enthaltend) wurden 10 Minuten lang bei 37 ºC vorinkubiert. Ein ml einer Enzymlösung wurde zur Einleitung der enzymatischen Reaktion dazugegeben Nach einer 20 minütigen Inkubation der Mischung bei 37 ºC wurden 20 ml einer Aceton-Ethanol-(1:1)-Mischung zur Reaktionslösung hinzugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Die Mischung wurde mit 0.05 N Natriumhydroxid unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator titriert. Eine Vergleichslösung wurde auf die gleiche Weise wie oben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Aceton- Ethanol-(1:1)-Mischung zur Substrat-Lösung vor Zugabe der Enzym-Lösung zugegeben wird. Die Vergleichslösung wurde in gleicher Weise titriert wie oben. Die Enzymmenge, die ein µMol Fettsäure pro Minute freisetzt, wurde als eine Einheit (U) definiert.

Beispiel 2

10 Liter des in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gewonnenen Überstandes wurden mit 45 % gesättigter Ammoniumsulfat- Lösung ausgesalzt. Das Präzipitat (Esterase) wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst. Die Lösung wurde dialysiert und über eine Säule mit einem Anionen- Austauscherharz (DEAE-TOYOPEARL 650 M, Toyo Soda Co., Ltd.), voräquilibriert mit dem gleichen Puffer, geleitet. Die Säule wurde mit 20 mm Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) gewaschen. Die Enzym-Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1.0 M Natriumchlorid-Lösung, 20 mm Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) enthaltend. Esterase wurde mit etwa 0.27 M Natriumchlorid-Lösung, enthaltend 20 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7.5) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) dialysiert und über eine Säule eines starken Anionen- Austauscherharzes (MonoQ, hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology) geleitet, die mit dem gleichen Puffer voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 20 mm Tris- HCl-Puffer (pH 7.5) gewaschen. Die Enzym-Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0.6 M Natriumchlorid-Lösungen, enthaltend 20 mm Tris-HCl-Puffer (pH 7.5). Die Esterase wurde mit etwa 0.35 M Natriumchlorid-Lösung, enthaltend 20 mm Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 5 % gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung mit 20 mm Tris- HCl-Puffer (pH 7,5) dialysiert und über eine Säule mit einem hydrophoben Harz (Butyl-TOYOPEARL 6505, hergestellt von Toyo Soda Co., Ltd.), die mit dem gleichen Puffer voräquilibiriert worden war, geleitet. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer (pH 7,5) gewaschen. Die Enzym-Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 5 bis 0 % gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5). Die aktiven Fraktionen wurden wiederum gesammelt und gegen 0,15 M Natriumchlorid-Lösung mit 20 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,5) dialysiert und aufkonzentriert. Der Rest wurde einer Gel-Filtration mit einem Molekularsieb-Harz (Superose 6, hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology), voräquilibriert mit dem gleichen Puffer, zugeführt. Daraus ergaben sich 56,8 mg gereinigter Esterase.
Die gereinigte Esterase zeigte mit Gel-Filtration ein Molekulargewicht von etwa 590.000 und von etwa 62.000 mit SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Die spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten der Esterasen aus jedem der obigen Reinigungsschritte sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt (die Enzymaktivität wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ermittelt und die Proteinmenge wurde mit der Methode von Lowry bestimmt.
Die derart gewonnene Esterase zeigte mit Casein als Substrat keine Proteaseaktivität. Tabelle 1 Reinigungsschritt Gesamtprotein (mg) Gesamtaktivität (U) Spezifische Aktivität (U/mg Protein) Ausbeute (%) Kulturüberüberstand 45% Ammoniumsulfat DEAE-TOYO-PEARL 650M MonoQ Butyl-TOYO-PEARL 650S Superose 6

Beispiel 3

Die Substratspezifität bezüglich verschiedener Arten von Triglyceriden und Fettsäure-Estern wurde im Hinblick auf die Esterase aus Beispiel 2 untersucht.

Test der Hydrolyse-Aktivität bei Triglyceriden und Fettsäureestern

In 100-ml-Flaschen wurden 0,2 g eines jeden Substrats, 4 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und ein ml einer 6 mM Kalziumchlorid-Lösung eingefüllt. Nach einer zehnminütigen Vorinkubation wurde zum Starten der Enzymreaktion 1 ml Enzymlösung zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37 ºC unter Rühren bei 80 U/min. 10 Minuten lang inkubiert. 20 ml einer Aceton-Ethanol-Mischung (1:1) wurden der Reaktionsmischung zum Stoppen der enzymatischen Reaktion zugegeben. Die Mischung wurde mit 0.05 N Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator titriert. Eine Vergleichslösung wurde in gleicher Weise wie oben hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Aceton-Ethanol- Gemisch (1:1) der Substratlösung vor Zugabe der Enzymlösung zugesetzt wurde. Diese Vergleichslösung wurde in gleicher Weise wie oben titriert. Die Enzymmenge, die ein µMol Fettsäure pro Minute freisetzen kann, wurde als eine Einheit definiert.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 2 und 3 aufgeführt. Die Enzymaktivität ist als relative Aktivität (%) dargestellt [Methyl n-caprylat (Tabelle 2), Tricaprylin (Tabelle 3) = 100]. Tabelle 2 Substrat Relative Aktivität (%) Methylacetat Methyl-n-butyrat Methyl-n-valerat Methyl-n-caproat Methyl-n-caprylat Methyl-n-caprat Methyllaurat Methylmyristat Methylpalmitat Methyllinolenat Methyllinolat Methyloleat 1): 204 U/mg Protein Tabelle 3 Substrat Relative Aktivität (%) Triacetin Tributylin Tricaproin Tricaprylin Tricaprin Trilaurin Trimyristin Tripalmitin Tristearin 2): 1169 U/mg Protein

Beispiel 4

Die Substratspezifität bezüglich Dimercaproltributyrat wurde mit der gereinigten Esterase aus Beispiel 2 untersucht.
Die Esterase wurde einer Substratlösung eines Lipase Kit S (Substrat: Dimercaproltributyrat, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) zugegeben. Nach der Hydrolyse wurde 5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) als farbgebendes Mittel dem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Enzymaktivität wurde aus der Messung der Menge an freigesetzter 5- Mercapto-2-nitrobenzoesäure bei 412 nm bestimmt.
Die Esterase zeigte eine Enzymaktivität von 1,7*10&sup5; U/mg Protein.

Beispiel 5

1,5 mg der gereinigten Esterase aus Beispiel 2 wurde 75 ml einer wässrigen 1 mM Kalziumchlorid-Lösung zugegeben. 75 ml einer Toluol-Lösung enthaltend 1 M razemisches Methyltrans- 3-(4-methoxyphenyl)glycidat wurden dazu gegeben. Das Gemisch wurde auf pH 8,0 eingestellt und bei 30 ºC 4 Stunden lang gerührt. Nach dem Ablauf der Reaktion wurde das Verhältnis des (+)-Isomeren [(25, 3R)-Isomer] und des (-)-Isomeren [(2R, 35)-Isomer] von Methyltrans-3-(4- methoxyphenyl)glycidat in der Toluolschicht mittels HPLC bestimmt (Säule: Chiralcel OJ, hergestellt von Daicel Chemical Industries, Ltd., mobile Phase: n-Hexan Isopropylalkohol = 9:1).
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Verhältnis optisch aktiver Isomere (%) Optische Ausbeute von (-)-Transisomer (%) (+) -Transisomer (-) -Transisomer

Beispiel 6

Das pH-Optimum und die pH-Stabilität wurden anhand der gereinigten Esterase aus Beispiel 2 untersucht.
Die Bestimmung des pH-Optimum erfolgte durch Messung der Enzymaktivität wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Enzymreaktion bei unterschiedlichen pH Werten durchgeführt wurde. Die jeweilige Aktivität wurde als relative Aktivität (%) angegeben (Aktivität bei pH 8 = 100).
Die pH-Stabilität wurde untersucht, indem die Enzymlösung auf definierte pH-Werte eingestellt wurde, eine Stunde lang bei 30 ºC inkubiert und dann die Enzymaktivität wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt wurde. Die Enzymaktivität wurde als relative Aktivität (%) der Restaktivität dargestellt (unmittelbar vor der Inkubation gemessene Aktivität = 100), und die Einstellung des pH-Wertes erfolgte unter Verwendung eines Mcllvaine-Puffers (pH 3,0 - 7,0), 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0 - 9,0) und 100 mM Glycin-Puffer (pH 9,0 - 11,0).

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 5 und 6 dargestellt. Aus diesen Tabellen geht klar hervor, daß das pH-Optimum der Esterase bei etwa 7,5 - 9,0 liegt, und daß die Esterase bei einem pH-Wert von etwa 5 - 9 stabil ist. Tabelle 5 (Relative Aktivitäten bei den einzelnen pH-Werten) pH Relative Aktivität (%) Tabelle 6 (pH-Stabilität) pH Restaktivität (%)

Beispiel 7

Die optimale Temperatur und die Wärme-Stabilität wurden für die gereinigte Esterase aus Beispiel 2 untersucht.
Die Bestimmung der optimalen Temperatur erfolgte durch Messung der Enzymaktivität in der Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Enzymreaktion bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt wird. Die Enzymaktivität wurde als relative Aktivität (%) angegeben (Aktivität bei 45 ºC = 100).
Die Untersuchung der Wärmestabilität erfolgte durch Inkubation des Enzyms in 100 mM Tris-HCl-Puffer während 30 Minuten bei einer definierten Temperatur und Ermittlung der Enzymaktivität in der Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Enzymaktivität wurde als relative Aktivität (%) der Restaktivität angegeben (unmittelbar vor der Inkubation gemessene Aktivität = 100).

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 7 und 8 gezeigt. Aus diesen Tabellen geht klar hervor, daß die optimale Temperatur bei etwa 40 bis 50 ºC liegt und daß die Esterase bei einer Temperatur nicht höher als 50 ºC stabil ist. Tabelle 7 Temperatur (ºC) Relative Aktivität (%) Tabelle 8 Temperatur (ºC) Restktivität (%)

Beispiel 8

Der isoelektrische Punkt der gereinigten Esterase nach Beispiel 2 wurde mittels Elektrophorese unter folgenden Bedingungen ermittelt:
Träger: Ampholine (pH 3 - 10)
Dichtegradient von 0 bis 50 % Sucrose
Spannung: bei 400 V für 26 Stunden vom Anfang an und dann 14 Stunden lang bei 800 V
Temperatur: 2 ºC
Verwendet wurde eine 110-ml-Säule.
Daraus ergab sich ein isolelektrischer Punkt von 4,6+0,1.

Beispiel 9

Die gereinigte Esterase aus Beispiel 2 (Protein: 95 µg) wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde bis zum Eintrocknen verdampft. Der Rest wurde einem Aminosäuren-Sequenzierer zugeführt. Für die Aminosäurensequenz vom N-Terminus bis zur Nummer 12 hat die Untersuchung zu folgendem Ergebnis geführt:
N-Terminus-(X)-Ile²-Phe-Ser-Tyr&sup5;-Lys-Asp-Leu-Asp-Glu¹&sup0;-Asn- Ala, wobei X eine bisher noch nicht identifizierte Animosäure ist.

Beispiel 10

Der Einfluß von Metallionen oder bekannten Enzym- Inhibitoren auf die gereinigte Esterase aus dem Beispiel 2 wurde folgendermaßen untersucht:
1 mM eines jeden Metallions oder 1 mM eines jeden Inhibitors wurden der Enzymlösung zugefügt. Die Enzymaktivität wurde in der Weise wie in Beispiel 1 beschrieben ermittelt.
Die Aktivität wurde als relative Aktivität (%) angegeben (Aktivität ohne Zugabe von Metallionen oder Inhibitor = 100).

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 9 und 10 dargestellt. Tabelle 9 (Einfluß von Metallionen) Metallion (1mM) Relative Aktivität (%) ohne Zugabe Tabelle 10 (Einfluß von Inhibitoren) Inhibitor (1mM) Relative Aktivität (%) ohne Zugabe Ethylendiamintetraessigsäure p-Chloromercuribenzoat Natriumdodecylsulfat Phenylmethylsulfonylfluorid

Beispiel 11

12 Liter des Überstandes aus der Kulturbrühe nach Beispiel 1 wurden mit einer Ultrafiltrationsmembran (SIP-3013, Asahi Chemical Indurstries Co., Ltd.) aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde mit 35 % gesättigter, 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,5) enthaltender Ammoniumsulfat-Lösung ausgesalzt. Das Präzipitat (Esterase) wurde in 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst. Die Lösung wurde dialysiert und auf eine Anionenaustauscher-Säule (DEAE-TOYOPEARL 650M, hergestellt von Toyo Soda Co., Ltd.) gegeben, die mit dem gleichen Puffer voräquilibriert war. Die Säule wurde mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gewaschen. Die Enzym-Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,8 M Natriumchlorid-Lösung, die 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) enthielt. Die Esterase wurde mit etwa 0,3 M, 10 inn Tris- HCl-Puffer (pH 7,5) enthaltender Natriumchlorid-Lösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 0,15 M, 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) enthaltender Natriumchlorid-Lösung dialysiert. Die Lösung (101 ml) wurde auf 8 ml durch Ultrafiltration (Diaflo Ultrafilter PM-10, hergestellt von Amicon Co., Ltd.) konzentriert. Mit dem Konzentrat wurde eine Gelfiltration mit einem Molekularsieb-Harz (Sephacryl S-300 HR, hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology), das mit dem gleichen Puffer voräquilibriert war, durchgeführt . Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, gegen 2 % gesättigte, 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,5) enthaltende Ammoniumsulfat-Lösung dialysiert und auf eine Säule mit einem hydrophoben Harz (PHENYITOYOPEARL 650M, hergestellt von Toyo Soda Co., Ltd.) gegeben, die mit dem gleichen Puffer voräquilibriert war.
Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Enzymelution erfolgte mittels Stufengradienten von 2 % bis 0 % gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung, die 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,5) enthielt. Von der gereinigten Esterase ergaben sich 133 mg.
Physikochemische Eigenschaften und charakteristische Eigenschaften des Enzyms sind identisch mit denjenigen in Beispiel 2.
Die spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten der in jeder der obengenannten Reinigungsstufen erhaltenen Esterase sind in der folgenden Tabelle 11 dargestellt (die Enzymaktivität wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ermittelt und die Proteinmenge wurde nach der Lowry-Methode bestimmt). Die so erhaltene Esterase zeigte mit Casein als Substrat keine Proteaseaktivität.
Alle obigen Reinigungsschritte wurden unterhalb 5 ºC ausgeführt. Tabelle 11 Reinigungsschritt Gesamt-Volumen (ml) Gesamtprotein (mg) Gesamt-Aktivität (U) Spezifische Aktivität (U/mg Protein) Ausbeute (%) Kulturüberüberstand Konzentrieren mit UF-Membran 35% Ammoniumsulfat DEAE-TOYO-PEARL 650M Sephacryl S-300 HR Phenyl-TOYO-PEARL 650M

Beispiel 12

Die Aminosäurenzusammensetzung der gereinigten Esterase nach Beispiel 11 wurde mit einem Aminosäure-Sequenzierer unter folgenden Bedingungen analysiert.
Jede Enzymlösung wurde in 6 M Salzsäure (2,0 mg/ml) in Glasröhrchen unter Vakuum eingeschlossen und dann 20, 40 oder 70 Stunden lang bei 110 ºC hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde bis zum Eintrocknen bei Unterdruck eingedampft, in 0,02 N Salzsäure gelöst und mit einem Aminosäuren-Sequenzierer (Hitachi Modell L-8500) analysiert. Cystein und Cystin wurden nach Oxidation der Probe mit Perameisensäure nach der Methode von Moore1) als Cysteinsäure bestimmt. Die Bestimmung von Tryptophan erfolgte nach der Methode von Simpson et al. 2).

Quellen:

1) Moore, 5. (1963) J. Bio. Chem. 238, 235-237.
2) Simpson, R. J., Neuberger, M. R., und Lin, T.-Y. (1976) J. Biol. Chem. 251, 1936-1940. Tabelle 12 Aminosäure Residuen / Molekül a) a) : Bezogen auf ein Molekulargewicht von 62.000. b): Summe aus Säure und Amid c) : Die Serin- und Threonin-Werte wurden unter Annahme eines Zerfallsgesetzes erster Ordnung durch Extrapolation auf den Zeitpunkt Null gewonnen.

Beispiel 13

Die gereinigte Esterase nach Beispiel 11 wurde gegen Wasser dialysiert, und der Kalziumgehalt wurde mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt (Hitachi Modell Z- 9000).
Für den Kalziumgehalt der gereinigten Esterase ergab sich ein Mol pro molekularer Masse des Enzyms von 62.000.

Beispiel 14

Die Substratspezifität für Dimercaproltributyrat der gereinigten Esterase gemäß Beispiel 11 wurde in der im Beispiel 4 beschriebenen Weise untersucht.
Die Esterase zeigte eine Enzymaktivität von 5,2*10&sup5; U/mg Protein.

Claims

1. Esterase, die aus Serratia marcescens Sr41 (FERM BP 487) gewonnen werden kann und die folgende physikochemische Eigenschaften und enzymatische Charakteristika aufweist:

(1) Aktivität: die Esterase hydrolysiert eine Esterbindung organischer Carboxylate,

(2) Substratspezifität: sie wirkt auf Alkylester organischer Carbonsäuren, Triglyceride oder Thiolester,

(3) pH-Optimum: das pH-Optimum ist 7,5-9,0, wenn die Hydrolyse mit Olivenöl als Substrat durchgeführt wird,

(4) pH-Stabilität: sie ist stabil bei pH 5,0-9,0, wenn sie für 1 Stunde bei 30 ºC aufbewahrt wird,

(5) optimale Temperatur: die optimale Temperatur beträgt 40-50 ºC, wenn die Hydrolyse mit Olivenöl als Substrat durchgeführt wird,

(6) Wärmestabilität: Bei Aufbewahrung für 30 Minuten bei pH 8,0 ist sie bei einer Temperatur, die nicht höher als 50 ºC liegt, stabil,

(7) Molekulargewicht: 62.000 ± 2.000 (SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese)

(8) Isoelektrischer Punkt: 4,6 ± 0,1,

(9) Einfluß von Metallionen: Sie wird in Gegenwart von 1 mM Kalziumionen aktiviert und wird in Gegenwart von 1 mM Kobaltionen, Nickelionen, Eisenionen oder Ethylendiamintetraessigsäure inhibiert.

2. Verfahren zur Herstellung einer neuartigen Esterase, das folgende Schritte aufweist:

(a) Kultivieren von Serratia marcescens Sr41 (FERM BP- 487) und

(b) Gewinnen der Esterase aus der Kulturbrühe.

3. Verfahren zur Herstellung eines Niederalkyl(2R,35)-3- (4-Niederalkoxyphenyl) glycidats, das folgende Schritte aufweist:

(a) Behandeln eines razemischen Niederalkyl-trans-3-(4- niederalkoxyphenyl)glycidats mit der Esterase nach Anspruch 1 zur stereoselektiven Hydrolyse seines 25, 3R- Isomers, und

(b) Gewinnen des unumgesetzten 2R, 35-Isomers aus dem Reaktionsgemisch.