JPH04228070A - 新規エステラーゼ及びその製法 - Google Patents

新規エステラーゼ及びその製法

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JPH04228070A
JPH04228070A JP3125598A JP12559891A JPH04228070A JP H04228070 A JPH04228070 A JP H04228070A JP 3125598 A JP3125598 A JP 3125598A JP 12559891 A JP12559891 A JP 12559891A JP H04228070 A JPH04228070 A JP H04228070A
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柴谷　武爾
Hiroaki Matsumae
裕明 松前
Hiroyuki Akatsuka
浩之 赤塚
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規エステラーゼ及び
その製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、有機合成反応、例えば加水分解反
応にエステラーゼ等の酵素を利用する試みが盛んに行わ
れている。しかし、かかる目的に多く使用される豚肝臓
由来のエステラーゼは高価であり、また多量に消費する
工業的用途には適さない。一方、微生物由来のエステラ
ーゼとしては、例えば，Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　　
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　　ＩＦ０　　１２９５８（特
開平１−１８１７８８）（分子量：４３，０００）、　
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉ１ｕｓ（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．１６０、５０４−５１３（１９７４））（分子量
：４７，０００）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　　Ｃａｎｄ
ｉｄｕｍ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７（６
）、１４５７−１４６４（１９７３））（分子量：５３
，０００−５５，０００）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６、
６４３−６５６（１９７９））（分子量：５５，０００
）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５、１０４７−１０５４（
１９８４））（分子量：４８，０００）等に由来するも
のが知られているが、これらの酵素は各々基質特異性を
有し、繁用性に欠けるという難点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、豚肝臓エス
テラーゼと同様に、有機合成反応に広く適用しうる繁用
性のある微生物起源の新規エステラーゼ及びその製法を
提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は次の理化学的性
状をもつ新規エステラーゼに関する。
【０００５】（１）作用有機カルボン酸エステルのエス
テル結合を加水分解する。
【０００６】（２）基質特異性有機カルボン酸のアルキ
ルエステル、トリグリセライド及びチオールエステルに
作用する。例えば、本発明のエステラーゼは低級脂肪酸
、高級脂肪酸、低級アルコキシ基置換フェニルグリシッ
ド酸等各種有機カルボン酸の低級アルキルエステル及び
高級アルキルエステルのいずれに対しても優れた加水分
解能を示し、またトリグリセライド、例えば水溶性の低
級脂肪酸トリグリセライド、水不溶性の高級脂肪酸トリ
グリセライドに対しても高い加水分解能を示す。また、
例えば三酪酸ジメルカプロール、ブチリルＣｏＡ、パル
ミトイルＣｏＡ等の各種チオールエステルの加水分解能
をも併せ有する。なお、カゼインに対しては加水分解能
を有しない。
【０００７】（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性オリーブ油
を基質とした時の加水分解の至適ｐＨは、７．５−９．
０であり、３０℃、１時間保存後の残存活性は、ｐＨ５
−９では９５％以上である。
【０００８】（４）至適温度及び熱安定性オリーブ油を
基質とした時の加水分解の至適温度は、１００ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中で４０−５０℃である。同緩
衝液中で、３０分間各温度で処理した後の残存活性は、
５０℃以下で１００％である。
【０００９】（５）力価測定法 （ａ）オリーブ油に対する力価測定法：オリーブ油を基
質とし、ｐＨ８．０、３７℃で２０分間酵素反応させ、
１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位
とする（実施例１参照）。 （ｂ）トリグリセライド、脂肪酸エステルに対する力価
測定法：トリグリセライド又は脂肪酸エステルを基質と
し、ｐＨ８．０、３７℃で１０分間酵素反応させ、１分
間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とす
る（実施例３参照）。 （ｃ）チオールエステルに対する力価測定法：三酪酸ジ
メルカプロールを基質とし、ｐＨ８．５、３０℃で１０
分間酵素反応させ、反応終了後、発色剤である５，５’
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させ、遊離
する５−チオ−２−ニトロ安息香酸の量を分光光度計で
測定する。活性は１分間に１μｍｏｌの５−チオ−２−
ニトロ安息香酸を遊離する酵素量を１単位とする（実施
例４参照）。
【００１０】（６）分子量６２，０００±２，０００（
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
【００１
１】（７）等電点４．６±０．１
【００１２】（８）金
属イオン等による影響１ｍＭのカルシウムイオン存在下
で活性化されると共に、１ｍＭの亜鉛イオン、銅イオン
、マンガンイオン存在下で４０〜９０％阻害され、１ｍ
Ｍのコバルトイオン、ニッケルイオン、二価及び三価の
鉄イオン、ＥＤＴＡ存在下では完全に活性は阻害される
。上記の如き性状を有する本発明のエステラーゼは、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて分子量が６２
，０００±２，０００を示し、かつ等電点が４．６±０
．１である点で、従来公知のエステラーゼとは明らかに
異なっている。
【００１３】本発明によれば、上記性状を有する新規エ
ステラーゼは、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属す
る微生物を培養し、培養菌体内外に本酵素を蓄積せしめ
、これを分離・採取して製造することができる。かかる
新規エステラーゼ産生菌としては、セラチア属に属し、
上記性状をもつ酵素を産生する能力を持つ菌であればい
かなるものも使用でき、具体的には、例えばセラチア・
マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃ
ｅｎｓ）Ｓｒ４１（微工研条寄第４８７号）、その変異
株、変種等があげられる。また、本発明は、上記セラチ
ア属微生物に限定されるものではなく、これら菌株を用
いて得られる遺伝子組換え微生物を含め、上記性状の酵
素を産生する菌をも用いることができる。
【００１４】培地としては、本エステラーゼ産生微生物
が生育・増殖しうるものであれば、いずれの培地をも用
いることができる。例えば、炭素源としてはブドウ糖、
庶糖、糖密の如き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機
酸またはグリセロールの如きアルコール類、アラニン、
グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸を、窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無
機アンモニウム塩または尿素、或はペプトン、コーン・
スティープ・リカー、酵母エキス、カゼイン加水分解物
などを好適に用いることができる。炭素源は、通常、培
地に対し、１−１５重量％、窒素源は０．１−２．０重
量％の範囲で用いるのが好ましい。また培地には必要に
応じて、燐酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩等の無機塩、鉄、マンガン、銅、亜鉛等の金属イ
オンを適当量添加してもよい。合成培地を用いる場合に
は、必要に応じて、例えば、ビオチンやチアミン等のビ
タミン類或はカルニチン等の生育促進物質を添加しても
よい。さらに、必要に応じて、植物油、界面活性剤等の
酵素誘導物質、消泡剤を添加してもよい。これらの培地
は、ｐＨ５−８に調整して用いるのが好ましい。
【００１５】培養は上記培地に微生物を接種後、常法に
よって実施することができ、例えば振とう培養、通気撹
拌培養、静置培養、連続培養などのいずれの方法によっ
ても行うことができる。培養条件は、培地の種類、培養
法により適宜選択すれば良く、本菌株が増殖し、エステ
ラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。通常
は培養開始のｐＨを５〜８に調整し、室温〜加温下、例
えば２０〜４０℃で培養することが望ましい。培養日数
は通常１〜２日が適当である。
【００１６】以上のようにして培養菌体内外に産生され
たエステラーゼは公知の方法により分離、採取し、また
精製することができる。例えば、培地中に含まれるエス
テラーゼは無機塩類（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸
アルカリ金属、ハロゲン化アルカリ金属等）による塩析
法、親水性有機溶媒（例えば、アルコール類、アセトン
等）による分画沈澱、イオン交換樹脂及び多種カラムク
ロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲル濾過法、蛋白沈
澱剤（例えば、核酸、タンニン等）を利用する方法又は
これらを適宜組合せて分離、採取することができる。ま
たかくして得たエステラーゼは等電点沈澱法、透析法、
電気透析法、電気泳動法等によりさらに精製することが
できる。例えば、菌体を除いた培養液を３５〜４５％飽
和硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱を透析後、陰イ
オン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、Ｍｏｎ
ｏＱ等）にて吸脱着する。その活性画分を透析後、疎水
性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ又はＢｕｔｙｌ−トヨパール６５
０Ｓ等）にて吸脱着する。さらに活性画分を透析・濃縮
後、ゲル濾過法（セファロース６、セファクリルＳ−３
００ＨＲ等）を用いることによって、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し、分子量６
２，０００±２，０００のポリペプチドである精製エス
テラーゼが得られる。なお、以下の実施例において、％
は、特に記載したものを除き、全てｗ／ｖ％を示す。
【００１７】
【実施例】実施例１ デキストリン１％、硫酸アンモニウム０．２％、ミース
トＳ２％、燐酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシウム
０．０５％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄０
．００１％、Ｔｗｅｅｎ８０　　０．５％ｖ／ｖ及びポ
リアルキレングリコール誘導体系界面活性剤（カラリン
１０２、三洋化成工業社製）０．１％ｖ／ｖよりなる液
体培地２０１（ｐＨ７．０）を３０１容ジャーファーメ
ンターに入れ滅菌後、あらかじめ同培地で、３０℃、２
０時間往復振とう培養したセラチア・マルセッセンスＳ
ｒ４１（微工研条寄第４８７号）の前培養液２００ｍｌ
を接種し、３０℃で２００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで攪拌
、通気を行い、１８時間培養した。この培養液を遠心分
離し、得られた上清液４．５リットルを４５％飽和硫酸
アンモニウムで塩析した。生じた沈澱をセライト濾過し
て集め、水で溶出し、透析後、凍結乾燥して１８，６０
０単位／ｇの活性を持つエステラーゼ４．１ｇを粗酵素
粉末として得た。なお、酵素活性は下記方法により測定
した。
【００１８】（活性測定法）２％ポリビニルアルコール
（ポバール１１７、クラレ社製）２２５ｍｌと局方品オ
リーブ油７５ｍｌの混液を５−１０℃にて１０分間、１
４，５００ｒｐｍで乳化し、得られたオリーブ油乳化液
５．０ｍｌと０．２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０
）４．０ｍｌ（２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む）を３
７℃で１０分間、予熱しておく。これに１ｍｌの酵素液
を加え、３７℃で２０分間反応させた後、アセトン−エ
タノール混液２０ｍｌを加えて反応を停止し、フェノー
ルフタレインを指示薬として０．０５Ｎ　　Ｎａ０Ｈ溶
液で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタノ
ールを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以上
の方法で１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量
を１単位とした。
【００１９】実施例２ 実施例１に準じて得た培養上清液１０，０００ｍｌを４
５％飽和硫酸アンモニウムで塩析した。沈殿物として得
たエステラーゼを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解し、透析して脱塩後、同一緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、
東洋曹達工業（株）製）に加えた。２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に非吸着分を除いた後、０
−１．０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶出を行
った。その結果、エステラーゼが０．２７Ｍ塩化ナトリ
ウム付近に溶出した。活性画分を集め、２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析後、同一緩衝液で平衡
化した強陰イオン交換樹脂（ＭｏｎｏＱ、ファルマシア
社製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分を除いた
後、０−０．６Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶
出した。その結果、エステラーゼが０．３５Ｍ塩化ナト
リウム付近に溶出した。活性画分を集め、５％飽和硫酸
アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
．５）にて透析後、同一緩衝液で平衡化した疎水性樹脂
（Ｂｕｔｙｌ−トヨパール６５０Ｓ，東洋曹達工業（株
）製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分を除いた
後、５−０％飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて
溶出を行った。活性画分を集め、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
透析、濃縮後、同一緩衝液にて平衡化した分子篩樹脂（
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　　６、ファルマシア社製）にてゲル
濾過を行った。かくして、精製エステラーゼ蛋白５６．
８ｍｇを得た。
【００２０】この精製エステラーゼは、ゲル濾過法にて
分子量約５９０，０００を示し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法にて分子量約６２，０００を示した。 また、上記各精製過程における比活性及び回収率は、下
記第１表の通りである（酵素活性は実施例１記載の方法
で測定し、蛋白量はローリー法で測定）。なお、上記精
製エステラーゼは、カゼインを基質とした場合には、プ
ロテアーゼ活性が認められなかった。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例３ 実施例２で得た精製エステラーゼを用い、下記活性測定
法により、各種トリグリセライド及び脂肪酸エステルに
対する基質特異性を調べた。（トリグリセライド、脂肪
酸エステルの加水分解活性測定法）１００ｍｌ三角フラ
スコ中に０．２ｇの各基質と０．２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４ｍｌと６ｍＭ塩化カルシウム溶液１ｍ
ｌを添加し、３７℃　　１０分間予熱しておく。これに
１ｍｌの酵素溶液を加えて１分間に８０回振とうしなが
ら３７℃で１０分間反応させた後、アセトン−エタノー
ル混液２０ｍｌを加えて反応を停止し、フェノールフタ
レインを指示薬として、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶
液で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタノ
ールを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以上
の方法で１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量
を１単位とした。 （結果）結果は下記第２〜３表の通りである。なお、表
２中の酵素活性は、ｎ−カプリル酸メチルを１００とし
たときの相対値（％）で、表３中の酵素活性は、トリカ
プリリンを１００としたときの相対値（％）で表した。
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】実施例４ 実施例２で得た精製エステラーゼの三酪酸ジメルカプロ
ールに対する基質特異性を調べた。即ち、本エステラー
ゼをリパーゼ定量用試薬であるリパーゼキットＳ［基質
：三酪酸ジメルカプロール、大日本製薬（株）製］の基
質溶液に加え、加水分解終了後、発色剤である５，５’
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させ、遊離
した５−チオ−２−ニトロ安息香酸を４１２ｎｍの吸光
度で測定した。その結果、本エステラーゼの活性は１．
７Ｘ１０５単位／ｍｇ蛋白であった。
【００２６】実施例５ 実施例２で得た精製エステラーゼ蛋白１．５ｍｇを１ｍ
Ｍ塩化カルシウム水溶液７５ｍｌに添加した。この溶液
に１Ｍの濃度でラセミ型トランス−３−（４−メトキシ
フェニル）グリシッド酸メチルエステルを溶解したトル
エン溶液７５ｍｌを加え、ｐＨを８．０にコントロール
して３０℃で４時間攪拌した。反応後、トルエン層中の
トランス−３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸
メチルエステルの（＋）体［（２Ｓ，３Ｒ）体］と（−
）体［（２Ｒ，３Ｓ）体］との比を高速液体クロマトグ
ラフイー（カラム：キラルセル０Ｊ，ダイセル化学工業
社製、移動相：ｎ−ヘキサン：イソプロピルアルコール
＝９：１）で測定した。その結果は第４表の通りである
。
【００２７】
【表４】
【００２８】実施例６ 実施例２で得た精製エステラーゼの至適ｐＨ値及びｐＨ
安定性を調べた。即ち、酵素の至適ｐＨについては、酵
素反応時のｐＨを変える以外は、実施例１記載の方法に
従ってエステラーゼ活性を測定し、ｐＨ８の活性値を１
００とした時の相対活性（％）で表した。一方、酵素の
ｐＨ安定性は、酵素液を、各ｐＨの緩衝液中で３０℃、
１時間インキュベーションした後、実施例１記載の方法
によりエステラーゼ活性を測定し、０時間の活性値を１
００とした時の活性残存率（％）で表した。なお、ｐＨ
調整には、マックルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝
液（ｐＨ３．０−７．０）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０−９．０）、１００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ９．０−１１．０）を用いた。（結果）結果は下
記第５〜６表の通りであり、至適ｐＨは７．５−９．０
であり、ｐＨ５−９で安定であった。
【００２９】
【表５】
【００３０】
【表６】
【００３１】実施例７ 実施例２で得た精製エステラーゼの至適温度及び熱安定
性を調べた。即ち、至適温度については、酵素反応時の
温度を変える以外は実施例１記載の測定法によってエス
テラーゼ活性を測定し、４５℃の活性値を１００とした
ときの相対活性（％）で表した。一方、酵素の熱安定性
は、酵素を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
中、各温度で３０分間インキュベーションした後、実施
例１記載の測定法によってエステラーゼ活性を測定し、
０時間の活性値を１００とした時の活性残存率（％）で
表した。 （結果）結果は下記第７〜８表の通りであり、至適温度
は４０−５０℃であり、５０℃以下で安定であった。
【００３２】
【表７】
【００３３】
【表８】
【００３４】実施例８ 実施例２で得た精製エステラーゼについて、ｐＨ３〜１
０のアンホライン（ＬＫＢ製）を用い、０〜５０％ショ
糖密度勾配の条件下で、等電点電気泳動（通電条件：初
期２６時間を４００Ｖの定電圧、その後の１４時間を８
００Ｖの定電圧、温度２℃、１１０ｍｌ容カラムを使用
）を４０時間行った。その結果、本エステラーゼの等電
点は４．６±０．１であった。
【００３５】実施例９ 実施例２で得た精製エステラーゼ（蛋白量９５μｇ相当
）を蒸留水に対して透析後、乾固し、気相アミノ酸シー
クエンサー４７７Ａ（アプライド・バイオシステム社製
）にかけ、本エステラーゼのＮ末端から１２番目までの
アミノ酸配列を決定した。決定されたＮ末アミノ酸配列
は以下の通りである。 （但し、Ｘは未決定のアミノ酸を表す。）
【００３６】
実施例１０ 金属イオン及び酵素阻害剤として公知である各種試薬の
実施例２で得た精製エステラーゼに対する影響を調べた
。即ち、酵素溶液中に各金属イオン及び阻害剤を１ｍＭ
添加し、実施例１記載の測定法によりエステラーゼ活性
を測定し、金属イオン及び阻害剤無添加の場合の活性値
を１００とした時の相対活性（％）で表した。 （結果）結果は下記第９〜１０表の通りである。
【００３７】
【表９】
【００３８】
【表１０】
【００３９】実施例１１ 実施例１に準じて得た培養上精液１２リットルを限外ろ
過膜（ＳＩＰ−３０１３、旭化成工業社製）を用いて濃
縮した。濃縮液を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を含む３５％飽和硫酸アンモニウムで塩析した。沈
澱物として得たエステラーゼを１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）に溶解し、透析して脱塩後、同一緩衝
液で平衡化した陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍ、東洋曹達工業社製）に加えた。１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に非吸着分を除い
た後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む
０−０．８Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配法にて溶出を
行った。その結果、エステラーゼが０．３Ｍ塩化ナトリ
ウム付近に溶出した。活性画分を集め、１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液に対して透析した。透析液１０１ｍｌは、限外
ろ過膜（ダイアフローメンブレンＰＭ−１０、アミコン
社製）にて８ｍｌに濃縮し、同一緩衝液で充分に平衡化
した分子篩樹脂（セファクリルＳ−３００ＨＲ、ファル
マシア社製）でゲルろ過を行なった。活性画分を集め、
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む２％飽
和硫酸アンモニウムで透析後、同一緩衝液で平衡化した
疎水性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｓ、東洋
曹達工業社製）に加えた。同一緩衝液で充分に非吸着分
を除いた後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
を含む２−０％飽和硫酸アンモニウム段階濃度勾配法に
て溶出を行なった。以上、精製の全ての操作は５℃以下
で行なった。なお、この精製エステラーゼは、実施例２
で得られた酵素と同様の物理化学的並びに酵素化学的性
質を有していた。また、上記各精製過程における比活性
及び回収率は、下記第１１表の通りである（酵素活性は
実施例１記載の方法で測定し、蛋白量はローリー法で測
定）。
【００４０】
【表１１】
【００４１】実施例１２ 実施例１１で得られた精製エステラーゼのアミノ酸組成
を次の条件下にて、アミノ酸自動分析計（日立製作所製
ｍｏｄｅｌ　　Ｌ−８５００）を用いて測定した。 （全アミノ酸の測定）２．０ｍｇ精製酵素蛋白を６Ｎ塩
酸１ｍｌと共に試験管に添加し、減圧下封管した。この
サンプルを１１０℃で、２０、４０及び７０時間加水分
解した後、減圧下で溶媒を留去し、残査を０．０２Ｎ塩
酸に溶解して全アミノ酸分析用のサンプルとした。 （システイン、シスチンの測定）モール（Ｍｏｏｒｅ）
の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ　　Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ，２３８，
２３５−２３７（１９６３））に従い、試料を過ギ酸で
処理し、システイン酸として測定した。 （トリプトファンの測定）シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ
）らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５１
，１９３６−１９４０（１９７６））に従って測定した
。結果は、下記第１２表の通りである。なお、分子量は
６２０００として計算し、アスパラギンとアスパラギン
酸及びグルタミンとグルタミン酸は、いずれもそれらの
総和をもとめた。また、セリン、スレオニンについては
、加水分解により徐々に分解するため、０時間の値を外
挿法でもとめた。
【００４２】
【００４３】実施例１３ 実施例１１で得られた精製エステラーゼのカルシウム含
量を、精製エステラーゼを透析した後、原子吸光分光光
度計（日立製作所製ｍｏｄｅｌ　　Ｚ−９０００）を用
いて測定した。その結果、精製エステラーゼ中のカルシ
ウム含量は、分子量６２０００当たり、１原子であった
。
【００４４】実施例１４ 実施例１１で得られた精製エステラーゼを用いて、実施
例４と同様にして、３酪酸ジメルカプロールに対する基
質特異性を調べた。その結果、この精製エステラーゼの
活性は、５．２Ｘ１０５単位／ｍｇ蛋白であった。
【００４５】
【発明の効果】本発明のエステラーゼは、有機カルボン
酸のアルコールエステル、チオールエステル、トリグリ
セライド等広範囲の基質に対して優れた加水分解能を有
し、豚肝臓エステラーゼと同様に、有機合成反応に広く
適用しうる繁用性のあるエステラーゼである。例えばラ
セミ型化合物からの光学活性体の製造やプロキラルな化
合物からのキラル化合物の製造等に適用することができ
る。とりわけ、本発明のエステラーゼは、低級アルコキ
シ基置換フェニルグリシッド酸低級アルキルエステルに
対して強い不斉加水分解能を有するという特長を有して
いるので、例えばラセミ型トランス−３−（４−低級ア
ルコキシフェニル）グリシッド酸低級アルキルエステル
に適用すれば、塩酸ジルチアゼム等医薬化合物の合成中
間体として有用な（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−低級アル
コキシフェニル）グリシッド酸低級アルキルエステルを
極めて効率よく製造することができる。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　下記の特徴を有する新規エステラーゼ
    ：１）作用：有機カルボン酸エステルのエステル結合を
    加水分解する； ２）基質特異性：有機カルボン酸のアルキルエステル、
    トリグリセライド及びチオールエステルに作用する；３
    ）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：オリーブ油を基質とした時
    の加水分解の至適ｐＨは７．５−９．０であり、３０℃
    、１時間保存後もｐＨ５−９では安定である；４）至適
    温度及び温度安定性：オリーブ油を基質とした時の加水
    分解の至適温度は、４０−５０℃であり、ｐＨ８．０の
    条件下では５０℃以下の温度で安定である；５）分子量
    ：６２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
    ミドゲル電気泳動法） ６）等電点：４．６±０．１ ７）金属イオン等の影響：１ｍＭのカルシウムイオン存
    在下で活性化され、１ｍＭのコバルトイオン、ニッケル
    イオン、鉄イオン、エチレンジアミン四酢酸存在下では
    阻害される。
  2. 【請求項２】　　セラチア属に属し、請求項１記載の新
    規エステラーゼを産生する微生物を培養し、その培養物
    から該酵素を採取することを特徴とするエステラーゼの
    製造方法。
  3. 【請求項３】　　微生物がセラチア・マルセッセンスで
    ある請求項２記載の製造方法。
  4. 【請求項４】　　ラセミ型トランス−３−（４−低級ア
    ルコキシフェニル）グリシッド酸低級エステルを請求項
    １記載の新規エステラーゼで不斉加水分解し、反応液か
    ら未反応の（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−低級アルコキシ
    フェニル）グリシッド酸低級アルキルエステルを分離・
    採取することを特徴とする光学活性フェニルグリシッド
    酸エステルの製法。
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