JPH0673459B2 - ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃおよびｎａｄｐｈ―チトクロムｐ―４５０還元酵素を同時に酵母内で発現させることを目的とした発現用プラスミドｐａｒｍ１，ならびにｐａｒｍ１を菌体内に保持する酵母菌体 - Google Patents
ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃおよびｎａｄｐｈ―チトクロムｐ―４５０還元酵素を同時に酵母内で発現させることを目的とした発現用プラスミドｐａｒｍ１，ならびにｐａｒｍ１を菌体内に保持する酵母菌体Info
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- JPH0673459B2 JPH0673459B2 JP24277285A JP24277285A JPH0673459B2 JP H0673459 B2 JPH0673459 B2 JP H0673459B2 JP 24277285 A JP24277285 A JP 24277285A JP 24277285 A JP24277285 A JP 24277285A JP H0673459 B2 JPH0673459 B2 JP H0673459B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
- C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ラット肝チトクロムＰ−450cおよびNADPH−
チトクロムＰ−450還元酵素遺伝子を同時に酵母内で発
現させるための発現用プラスミド、ならびに該プラスミ
ドにより形質転換したラット肝チトクロムＰ−450cおよ
びNADPH−チトクロムＰ−450還元酵素を生産する酵母菌
体に関する。
チトクロムＰ−450還元酵素遺伝子を同時に酵母内で発
現させるための発現用プラスミド、ならびに該プラスミ
ドにより形質転換したラット肝チトクロムＰ−450cおよ
びNADPH−チトクロムＰ−450還元酵素を生産する酵母菌
体に関する。
哺乳動物の肝ミクロソームに存在する電子伝達系は、チ
トクロムＰ−450（以下Ｐ−450と略称する）とNADPH−
チトクロムＰ−450還元酵素（以下Fptと略称する）とか
ら構成される複合酵素系で、種々の基質に対して特有の
酸化活性を有する。
トクロムＰ−450（以下Ｐ−450と略称する）とNADPH−
チトクロムＰ−450還元酵素（以下Fptと略称する）とか
ら構成される複合酵素系で、種々の基質に対して特有の
酸化活性を有する。
本発明者らは、すでに、ラット肝チトクロムＰ−450c遺
伝子を単離した（なお、該遺伝子の塩基配列は、Nuclei
c Acids Res.,12,6,p2929−2938（1984）に記載されて
いる。）。さらにこの遺伝子を酵母内で発現させること
にも成功した。また、Ｐ−450cを発現させる酵母内発現
プラスミドpAMC1ほ構築し、該プラスミドにより形質転
換された酵母菌体を用いて、Ｐ−450cを大量に生産し、
高い酸化活性を発揮させることに成功した（特開昭61−
88878）。
伝子を単離した（なお、該遺伝子の塩基配列は、Nuclei
c Acids Res.,12,6,p2929−2938（1984）に記載されて
いる。）。さらにこの遺伝子を酵母内で発現させること
にも成功した。また、Ｐ−450cを発現させる酵母内発現
プラスミドpAMC1ほ構築し、該プラスミドにより形質転
換された酵母菌体を用いて、Ｐ−450cを大量に生産し、
高い酸化活性を発揮させることに成功した（特開昭61−
88878）。
さらに、ラット肝Fpt遺伝子を酵母内発現ベクターへ組
み込み、酵母内発現プラスミドpARF1を構築し、該プラ
スミドを用いて形質転換することにより、ラット肝Fpt
を生産する酵母を製造した（特開昭62−19085）。
み込み、酵母内発現プラスミドpARF1を構築し、該プラ
スミドを用いて形質転換することにより、ラット肝Fpt
を生産する酵母を製造した（特開昭62−19085）。
本発明者らは、さらに研究を進め、この度、Ｐ−450c発
現プラスミドpAMC1およびFp1発現プラスミドpARF1を改
造して作成したpTRF2から、各々、酵母アルコール脱水
素酵素Ｉ（以下ADH1と略称する）遺伝子のプロモーター
とターミネーターとの間にはさまれたＰ−450c及びFpt
遺伝子部分をプロモーター、ターミネーターごとBamHI
により切り出し、プラスミドpAAH5（Washigton Researc
h Foundationより入手可能、Methodstn Euzymology,10
1,partc,p192〜201,Amereらの方法により製造できる。
なお酵母ADH1遺伝子プロモーターは、Washington Resea
rch Foundationの米国出願第299,733に含まれており、
米国において工業的，商業的目的で使用する場合は権利
者からの権利許諾を必要とする。）のBamHI部位に挿入
することにより、プラスミドpARM1を構築し、該プラス
ミドにより酵母を形質転換しＰ−450cとFptを同時に生
産する酵母の製造に成功した。
現プラスミドpAMC1およびFp1発現プラスミドpARF1を改
造して作成したpTRF2から、各々、酵母アルコール脱水
素酵素Ｉ（以下ADH1と略称する）遺伝子のプロモーター
とターミネーターとの間にはさまれたＰ−450c及びFpt
遺伝子部分をプロモーター、ターミネーターごとBamHI
により切り出し、プラスミドpAAH5（Washigton Researc
h Foundationより入手可能、Methodstn Euzymology,10
1,partc,p192〜201,Amereらの方法により製造できる。
なお酵母ADH1遺伝子プロモーターは、Washington Resea
rch Foundationの米国出願第299,733に含まれており、
米国において工業的，商業的目的で使用する場合は権利
者からの権利許諾を必要とする。）のBamHI部位に挿入
することにより、プラスミドpARM1を構築し、該プラス
ミドにより酵母を形質転換しＰ−450cとFptを同時に生
産する酵母の製造に成功した。
本発明により得られる酵母菌体は、Ｐ−450cのみを生産
する酵母菌体と比べて、約２倍高い酸化活性を有してお
り、この菌体を酸化反応工程や産業廃水中の有機化合物
の酸化的除去等に有利に応用することができる。また、
本発明により得られた酵母形質転換体は、アセトアニリ
ドのｐ−位のみを特異的にかつ効率よく水酸化する能力
を有しており、解熱、鎮痛剤として有用なアセトアミノ
フェンの生産に利用できる優れた性質を有している。
する酵母菌体と比べて、約２倍高い酸化活性を有してお
り、この菌体を酸化反応工程や産業廃水中の有機化合物
の酸化的除去等に有利に応用することができる。また、
本発明により得られた酵母形質転換体は、アセトアニリ
ドのｐ−位のみを特異的にかつ効率よく水酸化する能力
を有しており、解熱、鎮痛剤として有用なアセトアミノ
フェンの生産に利用できる優れた性質を有している。
本発明のプラスミドは、例えば、次の方法で作成するこ
とができる。即ち、本発明者らの発明に係る特許出願
（特開昭61−88878）に記載したプラスミドARF1およびp
RFCC5からADH1遺伝子プロモーター、Fptをコードする遺
伝子およびADH1ターミネーターを含むプラスミドpTRF2
を図２に概要を示した方法で作成し、これから、4.1kb
のDNA断片を制限酵素BamHIで切り出す。一方、本発明者
らの発明に係る特許出願（特開昭61−88878）に記載さ
れているプラスミドpAMC1から、ADH1遺伝子プロモータ
ー、Ｐ−450cをコードする遺伝子およびADH1遺伝子ター
ミネーターを含む3.7kbのDNA断片を制限酵素BamHIで切
り出す。次に、これらのDNA断片を酵素発現プラスミドp
AAH5（Methods in Enzymology 101,part C P192−201,A
mmererらの方法により製造することができ、Wshington
Research Foundationより入手可能）のBamHI部位に挿入
することにより構築することができる。
とができる。即ち、本発明者らの発明に係る特許出願
（特開昭61−88878）に記載したプラスミドARF1およびp
RFCC5からADH1遺伝子プロモーター、Fptをコードする遺
伝子およびADH1ターミネーターを含むプラスミドpTRF2
を図２に概要を示した方法で作成し、これから、4.1kb
のDNA断片を制限酵素BamHIで切り出す。一方、本発明者
らの発明に係る特許出願（特開昭61−88878）に記載さ
れているプラスミドpAMC1から、ADH1遺伝子プロモータ
ー、Ｐ−450cをコードする遺伝子およびADH1遺伝子ター
ミネーターを含む3.7kbのDNA断片を制限酵素BamHIで切
り出す。次に、これらのDNA断片を酵素発現プラスミドp
AAH5（Methods in Enzymology 101,part C P192−201,A
mmererらの方法により製造することができ、Wshington
Research Foundationより入手可能）のBamHI部位に挿入
することにより構築することができる。
さらに、このプラスミドを用いて酵母、例えばサッカロ
ミセス・セレビシェーAH22株（ATCC38626）を形質転換
することにより、ラット肝チトクロムＰ−450cとFptを
同時に生産する形質転換酵母を製造することができる。
ミセス・セレビシェーAH22株（ATCC38626）を形質転換
することにより、ラット肝チトクロムＰ−450cとFptを
同時に生産する形質転換酵母を製造することができる。
以下に実施例をあげ、本発明をより詳細に説明する。本
発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。
発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。
実施例１ プラスミドpTRF2の構築 ステップ1: 両側にHindIII切断部位とHinfI切断部位を持つオリゴヌ
クレオチドアダプター、 ５′AGCTTTAAACATGGGGG3′および、５′AGTCCCCCATGTTT
AA3′をアプライドバイオシステム社380A型DNA合成機を
用い合成した。
クレオチドアダプター、 ５′AGCTTTAAACATGGGGG3′および、５′AGTCCCCCATGTTT
AA3′をアプライドバイオシステム社380A型DNA合成機を
用い合成した。
取得したオリゴヌクレオチドアダプターは、高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製した後、５′末端リン酸化
した。
ロマトグラフィーにより精製した後、５′末端リン酸化
した。
ステップ2: プラスミドpRFCC5（特開昭62−19085）に記載の方法で
製造できる）約５μｇを250μｌの制限酵素反応液Ｍ〔1
0mMトリスー塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、1mMジチオス
レイトール、50mM NaCl〕に溶解し、25ユニットのPvuII
とHindIIIを加え、37℃で１時間切断反応を行い、Fptの
アミノ基末端側をコードするDNA断片を調整し、これを1
00μｌの制限酵素反応液Ｍに溶解し、15ユニットのHinf
Iで切断することにより、約700bpのHinfI−PvuII断片を
調整した。
製造できる）約５μｇを250μｌの制限酵素反応液Ｍ〔1
0mMトリスー塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、1mMジチオス
レイトール、50mM NaCl〕に溶解し、25ユニットのPvuII
とHindIIIを加え、37℃で１時間切断反応を行い、Fptの
アミノ基末端側をコードするDNA断片を調整し、これを1
00μｌの制限酵素反応液Ｍに溶解し、15ユニットのHinf
Iで切断することにより、約700bpのHinfI−PvuII断片を
調整した。
一方、プラスミドpBR322（約２μｇ）を各々10ユニット
のPvuII、HindIII、SalIとともに、50μｌの制限酵素反
応液Ｍ中で、37℃１時間切断反応させることにより、約
2.3kbのHindIII−PvuII断片を調整した。
のPvuII、HindIII、SalIとともに、50μｌの制限酵素反
応液Ｍ中で、37℃１時間切断反応させることにより、約
2.3kbのHindIII−PvuII断片を調整した。
得られたHinfI−PvuII断片（約0.5μｇ）とHindIII−Pv
uII断片（約0.5μｇ）をステップ１で得られたオリゴヌ
クレオチドアダプター約１μｇと共にリガーゼ反応液
〔66mMトリスー塩酸（pH7.6）、66mM MgCl2、10mMDTT、
1mMATP〕中で15℃20時間インキュベートし、T4DNAリガ
ーゼ32ユニットによる環状化を行った。
uII断片（約0.5μｇ）をステップ１で得られたオリゴヌ
クレオチドアダプター約１μｇと共にリガーゼ反応液
〔66mMトリスー塩酸（pH7.6）、66mM MgCl2、10mMDTT、
1mMATP〕中で15℃20時間インキュベートし、T4DNAリガ
ーゼ32ユニットによる環状化を行った。
反応混液を用いて、大腸菌DH1株を形質転換し、得られ
た形質転換体からプラスミドDNAを調整した。プラスミ
ドDNAのうち、AhaIII切断で1800、690、450bpのDNA断片
を生じ、しかもPvuII、HindIII切断で700bpのDNA断片を
与えるものをプラスミドpRFA1とした。
た形質転換体からプラスミドDNAを調整した。プラスミ
ドDNAのうち、AhaIII切断で1800、690、450bpのDNA断片
を生じ、しかもPvuII、HindIII切断で700bpのDNA断片を
与えるものをプラスミドpRFA1とした。
ステップ3: プラスミドpRFA1（約１μｇ）に52ユニットのHindIII、
PvuIIを加え、50μｌの制限酵素反応液Ｍ中で37℃１時
間切断し、低融点アガロースゲル電気泳動により約700b
pのDNA断片を調整した。一方、プラスミドpRFCC5をステ
ップ２と同様にHindIII、PvuIIで切断し、Fptのカルボ
キシ基末端側をコードするDNA断片を調整した。
PvuIIを加え、50μｌの制限酵素反応液Ｍ中で37℃１時
間切断し、低融点アガロースゲル電気泳動により約700b
pのDNA断片を調整した。一方、プラスミドpRFCC5をステ
ップ２と同様にHindIII、PvuIIで切断し、Fptのカルボ
キシ基末端側をコードするDNA断片を調整した。
面DNA断片をあらかじめHindIIIで切断し、アルカリ性ホ
スファターゼ処理を施した発現ベクターpAAH5（0.5μ
ｇ）とともに混合し、50μｌのリガーゼ反応液中で、32
ユニットのT4DNAリガーゼを添加して、15℃で終夜イン
キュベートした。
スファターゼ処理を施した発現ベクターpAAH5（0.5μ
ｇ）とともに混合し、50μｌのリガーゼ反応液中で、32
ユニットのT4DNAリガーゼを添加して、15℃で終夜イン
キュベートした。
反応混液を用いて大腸菌DH1株を形質転換した。
得られた形質転換体をＬ培地（１あたり10gポリペプ
トン、5g酵母エキス、5g NaCl、1gグルコースを含む）
中で培養し、Birnboimらの方法〔Nucleic Acids Res.,
7,1513−1523（1979）〕に従ってプラスミドDNAを調製
し、BamHI、NcoIによる切断で、2.1、1.4、0.7kbのDNA
を与えるプラスミドをpTRF2とした。このプラスミドpTR
F2の制限酵素地図を図２に示す。
トン、5g酵母エキス、5g NaCl、1gグルコースを含む）
中で培養し、Birnboimらの方法〔Nucleic Acids Res.,
7,1513−1523（1979）〕に従ってプラスミドDNAを調製
し、BamHI、NcoIによる切断で、2.1、1.4、0.7kbのDNA
を与えるプラスミドをpTRF2とした。このプラスミドpTR
F2の制限酵素地図を図２に示す。
実施例2:プラスミドpARM1の構築 ステップ1: 約５μｇのプラスミドpAMC1を50μｌの制限酵素反応液
Ｈ〔10mMトリスー塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、1mMジチ
オスレイトール、150mM NaCl〕中で15ユニットの制限酵
素BamHI（宝酒造社より購入）で切断した後、ADH1プロ
モーター、Ｐ−450cをコードする遺伝子及びADH1ターミ
ネーターを含む3.7KbのDNA断片を低融点アガロースゲル
電気泳動により回収した。
Ｈ〔10mMトリスー塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、1mMジチ
オスレイトール、150mM NaCl〕中で15ユニットの制限酵
素BamHI（宝酒造社より購入）で切断した後、ADH1プロ
モーター、Ｐ−450cをコードする遺伝子及びADH1ターミ
ネーターを含む3.7KbのDNA断片を低融点アガロースゲル
電気泳動により回収した。
ステップ2: 約５μｇのプラスミドpTRF2を同様にして制限酵素BamHI
で切断した後、ADH1プロモーター、Fptをコードする遺
伝子及びADH1ターミネーターを含む4.1KbのDNA断片を低
融点アガロースゲル電気泳動により回収した。
で切断した後、ADH1プロモーター、Fptをコードする遺
伝子及びADH1ターミネーターを含む4.1KbのDNA断片を低
融点アガロースゲル電気泳動により回収した。
ステップ3: プラスミドpAAH5（約５μｇ）を同様にして制限酵素Bam
HIで切断した後、２ユニットの大腸菌のアルカリ性ホス
ファターゼ（宝酒造社より購入）を添加し、60℃で１時
間反応させた。
HIで切断した後、２ユニットの大腸菌のアルカリ性ホス
ファターゼ（宝酒造社より購入）を添加し、60℃で１時
間反応させた。
フェノール−クロロホルム抽出を行った後、エタノール
沈澱によりDNAを回収した。
沈澱によりDNAを回収した。
ステップ4: ステップ１〜３で得られたDNA断片を50μｌのリガーゼ
反応液中で混合し、32ユニットのT4DNAリガーゼ（宝酒
造社より購入）を添加し、15℃で20時間インキュベート
した。
反応液中で混合し、32ユニットのT4DNAリガーゼ（宝酒
造社より購入）を添加し、15℃で20時間インキュベート
した。
続いて、反応混液を用いて、大腸菌DH1株を形質転換し
た。
た。
得られた形質転換体をＬ培地（１当たり、10gポリペ
プトン、5g酵母エキス、5g NaCl、1gグルコースを含
む）中で培養し、Birnboimらの方法（Nucleic Acids Re
s.,７、1513−1523）に従ってプラスミドDNAを単離し
た。
プトン、5g酵母エキス、5g NaCl、1gグルコースを含
む）中で培養し、Birnboimらの方法（Nucleic Acids Re
s.,７、1513−1523）に従ってプラスミドDNAを単離し
た。
プラスミドDNAを制限酵素BamHIで切断し、3.7kbのDNA断
片と4.1kbのDNA断片を両方含むプラスミドをpARM1とし
た。
片と4.1kbのDNA断片を両方含むプラスミドをpARM1とし
た。
また、プラスミドpARM1を制限酵素HindIIIおよびNcoIで
切断後、アガロースゲル電気泳動でDNA断片の大きさを
決定した結果、Ｐ−450c、Fpt遺伝子は図１に示した様
に“he ad to tail"に接続していることが判明した。
切断後、アガロースゲル電気泳動でDNA断片の大きさを
決定した結果、Ｐ−450c、Fpt遺伝子は図１に示した様
に“he ad to tail"に接続していることが判明した。
プラスミドpARM1におけるBamHI断片の挿入方向は決定し
ていないが、ADH1プロモーターの挿入方向は発現量に関
係していないと考えられるので、逆方向に挿入されたプ
ラスミドもプラスミドpARM1と本質的に同一である。
ていないが、ADH1プロモーターの挿入方向は発現量に関
係していないと考えられるので、逆方向に挿入されたプ
ラスミドもプラスミドpARM1と本質的に同一である。
実施例3:プラスミドpARM1による酵母の形質転換 YPD培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グ
ルコース）5mlにサッカロミセス・セレビシェー（sacch
aromyces cerevisiae）AH22株（ATCC38626）を植菌し、
30℃で16〜18時間培養した。培養液1mlを遠心分離（100
00rpm、１分間）することにより集菌した後、得られた
菌体を0.2M LiClで洗浄した。得られた菌体を20μｌの1
M LiClに懸濁し、プラスミドpARM1 DNA約１μｇ、70％
ポリエチレングリコール4000 30μｌを加え、30℃で１
時間インキュベートした。次いで、滅菌水140μｌを加
え、100μｌずつSDプレート（0.67％酵母窒素源不含ア
ミノ酸、２％グルコース、20μg/mlヒスチジン、２％寒
天）に広げ、30℃でインキュベートすることにより、形
質転換サッカロミセス・セレビシェー（saccharomyces
cerevisiae）AH22（pARM1）株を得た。
ルコース）5mlにサッカロミセス・セレビシェー（sacch
aromyces cerevisiae）AH22株（ATCC38626）を植菌し、
30℃で16〜18時間培養した。培養液1mlを遠心分離（100
00rpm、１分間）することにより集菌した後、得られた
菌体を0.2M LiClで洗浄した。得られた菌体を20μｌの1
M LiClに懸濁し、プラスミドpARM1 DNA約１μｇ、70％
ポリエチレングリコール4000 30μｌを加え、30℃で１
時間インキュベートした。次いで、滅菌水140μｌを加
え、100μｌずつSDプレート（0.67％酵母窒素源不含ア
ミノ酸、２％グルコース、20μg/mlヒスチジン、２％寒
天）に広げ、30℃でインキュベートすることにより、形
質転換サッカロミセス・セレビシェー（saccharomyces
cerevisiae）AH22（pARM1）株を得た。
実施例4:AH22（pARM1）株のＰ−450含量の測定 上述の形質転換体AH22（pARM1）株およびAH22（pAMC1）
株の培養液（SD合成培地、菌体濃度約2x107細胞/ml）そ
れぞれ100mlを集菌し、20mlの100mM燐酸カリウム緩衝液
（pH7.0）に懸濁した後、遠心分離した。得られたペレ
ットを再び2mlの100mM燐酸カリウム緩衝液（pH7.0）に
懸濁し、1mlずつ２本のキュベットに分注した、サンプ
ル側のキュベットに一酸化炭素を吹きこんだ後、両キュ
ベットにジチオナイト５〜10mgを添加し、撹拌後、約15
分間放置した。400〜500nmにおける差スペクトルを測定
し、△E447−490＝91mM-1cm-1という値をもとにしてＰ
−450含量を算出した。その結果、AH22（pARM1）株の菌
体当たりのＰ−450含量は、AH22（pAMC1）株の場合と、
ほとんど同じであることがわかった 実施例5:AH22（pARM1）株のアセトアニリドｐ−水酸化
によるアセトアミノフェン生成量の測定 SD合成培地中で約1.5x107細胞/mlまで培養したAH22（pA
RM1）、AH22（pAMC1）株の培養液中に、それぞれ1.5Mア
セトアニリド（メタノール溶液）を添加し、終濃度25mM
とした。その後、振盪培養を続けながら、１時間毎に一
定量を分取し、遠心分離で得られる培養上清をHPLCにか
け、生成したアセトアミノフェンを定量した。HPCLは、
μBondapak C18（4x300mm）を用い、メタノール：水：
酢酸（15:84:1v/v）で溶出し、A245nmで検出した。その
結果、AH22（pARM1）株のＰ−450c依頼性アセトアニリ
ドｐ−水酸化活性は、AH22（pAMCl）株の約２倍であ
り、AH22（pARMCl）株ではＰ−450cと同時に発現したFp
tにより、活性が上昇したことがわかった。
株の培養液（SD合成培地、菌体濃度約2x107細胞/ml）そ
れぞれ100mlを集菌し、20mlの100mM燐酸カリウム緩衝液
（pH7.0）に懸濁した後、遠心分離した。得られたペレ
ットを再び2mlの100mM燐酸カリウム緩衝液（pH7.0）に
懸濁し、1mlずつ２本のキュベットに分注した、サンプ
ル側のキュベットに一酸化炭素を吹きこんだ後、両キュ
ベットにジチオナイト５〜10mgを添加し、撹拌後、約15
分間放置した。400〜500nmにおける差スペクトルを測定
し、△E447−490＝91mM-1cm-1という値をもとにしてＰ
−450含量を算出した。その結果、AH22（pARM1）株の菌
体当たりのＰ−450含量は、AH22（pAMC1）株の場合と、
ほとんど同じであることがわかった 実施例5:AH22（pARM1）株のアセトアニリドｐ−水酸化
によるアセトアミノフェン生成量の測定 SD合成培地中で約1.5x107細胞/mlまで培養したAH22（pA
RM1）、AH22（pAMC1）株の培養液中に、それぞれ1.5Mア
セトアニリド（メタノール溶液）を添加し、終濃度25mM
とした。その後、振盪培養を続けながら、１時間毎に一
定量を分取し、遠心分離で得られる培養上清をHPLCにか
け、生成したアセトアミノフェンを定量した。HPCLは、
μBondapak C18（4x300mm）を用い、メタノール：水：
酢酸（15:84:1v/v）で溶出し、A245nmで検出した。その
結果、AH22（pARM1）株のＰ−450c依頼性アセトアニリ
ドｐ−水酸化活性は、AH22（pAMCl）株の約２倍であ
り、AH22（pARMCl）株ではＰ−450cと同時に発現したFp
tにより、活性が上昇したことがわかった。
図１は、本発明のプラスミドpARM1構築方法の概要およ
びプラスミドpARM1の制限酵素他図を示す図である。図
中、黒く塗った部分はＰ−450ccDNAを、斜線部分はFptc
DNAを示す。 図２は、プラスミドpTRF2の構築方法の概略およびプラ
スミドpTRF2の制限酵素地図を表す図である。図中、黒
く塗った部分はFpt cDNAを、斜線部分は構築に用いた
合成アダプターを示す。 図３（３−１及び３−２）は、Ｐ−450cコーディング領
域の塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を
示す図である。 図４（４−１及び４−２）は、Fptコーディング領域の
塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す
図である。
びプラスミドpARM1の制限酵素他図を示す図である。図
中、黒く塗った部分はＰ−450ccDNAを、斜線部分はFptc
DNAを示す。 図２は、プラスミドpTRF2の構築方法の概略およびプラ
スミドpTRF2の制限酵素地図を表す図である。図中、黒
く塗った部分はFpt cDNAを、斜線部分は構築に用いた
合成アダプターを示す。 図３（３−１及び３−２）は、Ｐ−450cコーディング領
域の塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を
示す図である。 図４（４−１及び４−２）は、Fptコーディング領域の
塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す
図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (54)【発明の名称】 ラット肝チトクロムＰ―450ＣおよびＮＡＤＰＨ―チトクロムＰ―450還元酵素を同時に酵母内で 発現させることを目的とした発現用プラスミドＰＡＲＭ１，ならびにＰＡＲＭ１を菌体内に保持 する酵母菌体
Claims (4)
- 【請求項１】ラット肝チトクロムＰ−450c遺伝子および
哺乳動物のNADPH−チトクロムＰ−450還元酵素遺伝子を
同時に酵母菌体内で発現させることができる発現プラス
ミドであって、哺乳動物のNADPH−チトクロムＰ−450還
元酵素遺伝子を少なくとも２個有し、かつ該遺伝子が存
在する間の連結領域にラット肝チトクロムＰ−450c遺伝
子が挿入された構造を少なくとも１つ有するプラスミ
ド。 - 【請求項２】約22400塩基対からなり、下記の制限酵素
地図で表されるpARM1である特許請求の範囲第１項記載
のプラスミド。 - 【請求項３】ラット肝チトクロムＰ−450c遺伝子および
哺乳動物のNADPH−チトクロムＰ−450還元酵素遺伝子を
同時に酵母菌体内で発現させることができる発現プラス
ミドであって、哺乳動物のNADPH−チトクロムＰ−450還
元酵素遺伝子を少なくとも２個有し、かつ該遺伝子が存
在する間の連結領域にラット肝チトクロムＰ−450c遺伝
子が挿入された構造を少なくとも１つ有するプラスミド
を保持する酵母菌株。 - 【請求項４】約22400塩基対からなり、下記の制限酵素
地図で表されるpARM1を保持する特許請求の範囲第３項
記載の酵母菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24277285A JPH0673459B2 (ja) | 1985-10-31 | 1985-10-31 | ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃおよびｎａｄｐｈ―チトクロムｐ―４５０還元酵素を同時に酵母内で発現させることを目的とした発現用プラスミドｐａｒｍ１，ならびにｐａｒｍ１を菌体内に保持する酵母菌体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24277285A JPH0673459B2 (ja) | 1985-10-31 | 1985-10-31 | ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃおよびｎａｄｐｈ―チトクロムｐ―４５０還元酵素を同時に酵母内で発現させることを目的とした発現用プラスミドｐａｒｍ１，ならびにｐａｒｍ１を菌体内に保持する酵母菌体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62104582A JPS62104582A (ja) | 1987-05-15 |
| JPH0673459B2 true JPH0673459B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=17094049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24277285A Expired - Lifetime JPH0673459B2 (ja) | 1985-10-31 | 1985-10-31 | ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃおよびｎａｄｐｈ―チトクロムｐ―４５０還元酵素を同時に酵母内で発現させることを目的とした発現用プラスミドｐａｒｍ１，ならびにｐａｒｍ１を菌体内に保持する酵母菌体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673459B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH062067B2 (ja) * | 1988-08-16 | 1994-01-12 | 工業技術院長 | 酵母ｎａｄｐｈ‐チトクロムｐ４５０還元酵素産生菌株 |
| DE69122016T2 (de) * | 1990-09-26 | 1997-04-30 | Sumitomo Chemical Co | Mitochondriales P450 |
| JP2517894B2 (ja) * | 1994-08-12 | 1996-07-24 | 住友化学工業株式会社 | フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 |
| ATE412060T1 (de) * | 1999-08-06 | 2008-11-15 | Du Pont | Bioproduktion von para-hydroxy-zimtsäure |
-
1985
- 1985-10-31 JP JP24277285A patent/JPH0673459B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62104582A (ja) | 1987-05-15 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |