DE69526331T2 - Monomere diole und daraus gebildete phosphatverknüpfte oligomere - Google Patents

Monomere diole und daraus gebildete phosphatverknüpfte oligomere

Info

Publication number
DE69526331T2
DE69526331T2 DE69526331T DE69526331T DE69526331T2 DE 69526331 T2 DE69526331 T2 DE 69526331T2 DE 69526331 T DE69526331 T DE 69526331T DE 69526331 T DE69526331 T DE 69526331T DE 69526331 T2 DE69526331 T2 DE 69526331T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
group
compound according
mmol
carbon atoms
dimethoxytrityl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69526331T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69526331D1 (de
Inventor
L. Acevedo
Dan Cook
W. Davis
J. Ecker
Normand Hebert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69526331D1 publication Critical patent/DE69526331D1/de
Publication of DE69526331T2 publication Critical patent/DE69526331T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/141—Esters of phosphorous acids
    • C07F9/143—Esters of phosphorous acids with unsaturated acyclic alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2408—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of hydroxyalkyl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2429—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of arylalkanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C07F9/5728—Five-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/59—Hydrogenated pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/65031—Five-membered rings having the nitrogen atoms in the positions 1 and 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/65031—Five-membered rings having the nitrogen atoms in the positions 1 and 2
    • C07F9/65038—Five-membered rings having the nitrogen atoms in the positions 1 and 2 condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6521—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C07F9/65335—Six-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6536—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and sulfur atoms with or without oxygen atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6544—Six-membered rings
    • C07F9/6547—Six-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00695—Synthesis control routines, e.g. using computer programs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Nitrogen- Or Sulfur-Containing Heterocyclic Ring Compounds With Rings Of Six Or More Members (AREA)

Description

  • Die Erfindung betrifft monomere Alkylenglycoleinheiten und Oligomere, die aus diesen Einheiten aufgebaut sind. Die Oligomere können synthetisiert werden, um entweder random bzw. zufällige oder vorbestimmte Sequenzen aus monomeren Einheiten aufzuweisen, können durch Phosphatbindungen verbunden sein, die Phosphorothioat-, Phosphodiester-, und Phosphoramidatbindungen umfassen. Jede der monomeren Einheiten kann eine chemische Hälfte darauf einschließen, um die oligomeren Strukturen an Proteine, Nucleinsäuren, und andere biologische Zielen zu binden. Bei bevorzugten Ausführungsformen wirken die Verbindungen der Erfindung als Inhibitoren von Enzymen wie Phospholipase A&sub2; und werden zur Behandlung von Entzündungskrankheiten verwendet, die atopische Dermatitis und entzündliche Darmerkrankung umfassen.
  • Die Phospholipasen A&sub2; (PLA&sub2;) sind eine Familie von Enzymen, die die sn-2 Esterbindung von Membranphospholipiden hydrolisieren, was zur Freisetzung einer freien Fettsäure und einem Lysophospholipid führt (siehe, Dennis, E. A., The Enymes (Die Enzyme), Bd. 16, Seiten 307- 353, Boyer, P. D., Aufl., Academic Press, New York, 1983). Erhöhte Konzentrationen vorn PLA&sub2;-Typ II korrelieren mit einer Anzahl von menschlichen Entzündungskrankheiten. Die PLA&sub2;- katalysierte Reaktion ist der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt bei der Freisetzung einer Anzahl von Pro-Entzündungsvermittlern. Arachidonsäure, eine Fettsäure, die im Allgemeinen an der sn-2-Position verknüpft ist, dient als Vorläufer von Leucotrienen, Prostaglandinen, Lipoxinen und Thromboxanen. Das Lysophospholipid kann ein Vorläufer von einem Plättchenaktivierenden Faktor sein. PLA&sub2; wird durch pro-entzündliche Zytokine reguliert, und besetzt folglich eine zentrale Position bei der Entzündungskaskade (siehe, z. B. Dennis, ibid.; Glaser, et al. TiPs Review 1992, 14, 92; und Pruzanski, et al., Inflammation 1992, 16, 451).
  • Alle bis jetzt bewerteten Säugetiergewebe haben PLA&sub2;-Aktivität gezeigt. Mindestens drei verschiedene PLA&sub2;-Typen werden beim Menschen gefunden: pankreatisch (Typ I), synoviatisch (Typ II) und zytosolisch. Studien deuten an, dass zusätzliche Isoenzyme existieren. Die von der PLA&sub2; abgesonderten Formen Typ I und Typ II teilen eine deutliche Ähnlichkeit mit Phospholipasen, die aus dem Gift von Schlangen isoliert werden. Die PLA&sub2;-Enzyme sind wichtig bei Normalfunktionen einschließlich Verdauung, Zellmembranremodulation und -reparatur, bei Vermittlung der Entzündungsreaktion. Sowohl zytosolische als auch Typ II-Enzyme sind als therapeutische Ziele von Interesse. Erhöhte Konzentrationen der PLA&sub2;-Typ II werden mit einer Vielzahl von Entzündungserkrankungen einschließlich rheumatoider Arthritis, Osteoarthrose, entzündliche Darmerkrankung und septischer Schock korreliert, wobei vermutet wird, dass Inhibitoren dieser Enzyme einen therapeutischen Nutzen haben werden. Zusätzliche Unterstützung für eine Rolle von PLA&sub2; bei der Förderung der Pathophysiologie, die bei bestimmten chronischen Entzündungskrankheiten beobachtet wird, war die Beobachtung; dass die Injektion von PLA&sub2;- Typ II in den Fußballen von Ratten (Vishwanath, et al., Inflammation, 1988, 12, 549) oder in den Gelenkraum von Hasen (Bomalaski, et al., J. Immunol. 1991, 146, 3904) eine Entzündungsreaktion hervorriefen. Wenn das Protein vor einer Injektion denaturiert war, wurde keine Entzündungsreaktion hervorgerufen.
  • Das PLA&sub2;-Typ II-Enzym aus Synovia ist ein relativ kleines Molekül (etwa 14 kD) und kann durch die Sequenz und dem Muster seiner Disulfidbindungen von dem Typ I-Enzym (d. h. pankreatisch) unterschieden werden. Beide Typen der Enzyme benötigen zur Aktivität Calcium. Die Kristallstrukturen sekretierter PLA&sub2;-Enzyme aus Gift und pankreatischer PLA&sub2;, mit und ohne Inhibitoren, wurden beschrieben (Scott, et al., Science, 1990, 250, 1541). Vor kurzem wurde die Kristallstruktur von PLA&sub2; aus menschlicher Synovia aufgeklärt (Wery, et al., Nature 1991, 352, 79). Die Strukturen klären die Rolle von Calcium und Aminosäureresten bei einer Katalyse auf. Das Calcium wirkt als Lewissäure, um das abgespaltbare Estercarbonyl zu aktivieren, und das Lipid zu binden, und eine His-Asp-Seitenkettendyade wirkt als Hauptbasenkatalysator, um ein Wassermolekülnucleophil zu aktivieren. Dies steht im Einklang mit der Abwesenheit irgendwelcher Acylenzymintermediaten, und ist auch mit dem Katalysemechanismus der Serinproteasen vergleichbar. Die katalytischen Gruppen und das Calciumion befinden sich an dem Ende einer tiefen Spalte (ca. 14 Å) in dem Enzym. Die Wände dieser Spalte berühren den Kohlenwasserstoffteil des Phospholipids und sind aus hydrophoben und aromatischen Resten zusammengesetzt. Die positiv geladene aminoterminale Helix ist über der Öffnung der hydrophoben Spalte angeordnet. Mehrere Nachweisuntersuchungen deuten an, dass der N-terminale Teil die Grenzflächenbindungsstelle ist. (siehe, z. B. Achari, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1987, 52, 441; Cho, et al., J. Biol. Chem. 1988, 263, 11237; Yang, et al., Biochem. J. 1989, 262, 855; und Noel, et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 3704).
  • In den vergangenen Jahren wurde in vielen Arbeiten über die Untersuchung des Mechanismuses und der Eigenschaften der PLA&sub2;-katalysierten Hydrolyse von Phospholipiden berichtet. Bei in vitro Assays zeigt PLA&sub2; eine Latenzphase, während der das Enzym an der Substratbilayer adsorbiert und ein Prozeß tritt auf, der Grenzflächenaktivierung genannt wird. Diese Aktivierung kann Desolvation der Enzym/Lipid-Grenzfläche oder eine Änderung des physikalischen Zustandes des Lipids um die Spaltöffnung herum involvieren. Der Anhaltspunkt, der diese Hypothese favorisiert, kommt aus Studien, die enthüllen, dass schnelle Änderungen bei der PLA&sub2;-Aktivität gleichzeitig mit Änderungen bei der Fluoreszenz einer Membranprobe auftretern (Burrack, et al., Biochemistry 1993, 32, 583). Das deutet an, dass Lippidumlagerungen während des Grenzflächenaktivierungsprozesses auftreten. PLA&sub2;-Aktivität ist um den Schmelzpunkt des Lipids herum maximal, bei dem Gel- und flüssigkristalline Lipid-Regionen coexistieren. Das steht im Einklang mit der Sensibilität der PLA&sub2;-Aktivität bezüglich der Temperatur und der Zusammensetzung des Substrates, von denen beide zu strukturell unterschiedlichen Lipidanordnungen führen können, die durch eine Grenzregion getrennt werden. Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um den physikalischen Zustand des Lipids und die Position des Enzyms während der Katalyse simultan zu identifizieren. (Grainger, et al., FEBS Lett. 1989, 252, 73). Diese Studien zeigen deutlich, dass PLA&sub2; ausschließlich an der Grenzregion zwischen flüssig- und festphasigem Lipid bindet.
  • Während die durch das Enzym katalysierte Hydrolyse der zweiten Esterbindung von 1,2- Diacylglycerophospholipiden relativ einfach ist, bleibt die mechanistische und kinetische Darstellung durch die Komplexität der Enzym-Substrat-Wechselwirkung im Dunkeln. Eine bemerkenswerte Eigenschaft von PLA&sub2; ist, dass maximale Katalyseaktivität bei dem Substrat, das aggregiert ist (d. h., Phospholipid über seiner kritischen Mizellenkonzentration) beobachtet wird, während niedrige Aktivitätsgrade bei monomeren Substraten beobachtet werden. Folglich weisen kompetitive PLA&sub2;-Inhibitoren entweder eine hohe Affinität zu der Wirkstelle des Enzyms, bevor es an die Substratbilayer bindet oder eine Teilung in der Membran auf, und konkurrieren mit dem Phospholipidsubstrat um die Wirkstelle. Obwohl eine Anzahl von Inhibitoren eine Aussicht von Inhibition von PLA&sub2; in biochemischen Assays zu zeigen scheinen (siehe, z. B. Yuan, et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 8071; Lombardo, et al., J. Biol. Chem. 1985, 260, 7234; Washburn, et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 5042; Campbell, et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1988, 1560; and Davidson, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.. 1986, 137, 587), sind Berichte, die die in vivo Aktivität beschreiben begrenzt (siehe, z. B. Miyake, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992, 263, 1302).
  • Die übliche Arzneimittelentwicklung des Typs des Verhältnisses von Struktur zu Aktivität ergibt eindeutige Produkte, aber erfordert dennoch die Herstellung von zahlreichen einzelnen Testkandidaten. Die Herstellung jeder Struktur erfordert bedeutende Mengen von Zeit und Ressourcen. Ein anderer Medikamententwicklungszugang, de novo Design von aktiven Verbindungen, der auf hochaufgelösten Enzymstrukturen basiert, war im allgemeinen nicht erfolgreich. Ein anderer weiterer Zugang involviert ein Screenen von komplexen Gärflüssigkeiten und von Pflanzenextrakten für eine gewünschte biologische Aktivität. Der Vorteil des Sceenens von Mischungen aus biologischen Quellen ist, dass eine große Anzahl von Verbindungen gleichzeitig gescreent werden kann, was in manchen Fällen zu der Entdeckung von neuen und kompexen Naturstoffen mit einer Aktivität führt, die ansonsten nicht vorrausgesagt werden könnte. Ein Nachteil ist, dass viele verschiedene Proben gescreent werden müssen und zahlreiche Reinigungen bzw. Reindarstellungen durchgeführt werden müssen, um die aktive Verbindung zu identifizieren, die oft nur in Spurenmengen vorliegt.
  • Um die Vorteile von jedem klassischen Zugang zu maximieren, wurden neue Strategien für kombinatorische Unrandomisierung von einigen Gruppen entwickelt. Auswahlverfahren wurden mit Peptidbibliotheken (siehe, z. B., Geysen, et al., J. Immun. Meth. 1987, 102, 259; Houghten et al., Nature 1991, 354, 84; und Owens, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 181, 402) und Nukleinsäuren (siehe z. B., Wyatt, et. al., (in Druck) Proc. Natl. Acad. Sci. USA; und Ecker, et al., Nuc. Acid Res. 1993, 21, 1853) verwendet. Diese Auswahlverfahren involvieren iteratives synthetisieren und screenen von zunehmend vereinfachten Untereinheiten von Oligomeren. Durch Verwendung dieser Auswahlverfahren werden Untereinheiten entweder in Zellbasierenden Assays oder auf Bindung oder Inhibition von gereinigten Proteinzielen auf Aktivität analysiert.
  • Ein Verfahren, das SURF (Synthetic Unrandomization of Randomized Fragments; siehe z. B., Ecker, et al., ibid.) genannt wird, involviert die Synthese von Oligomeruntereinheiten, die einen bekannten Rest an einer festen Monomerposition und equimolare Mischungen von Resten an allen anderen Positionen enthalten. Für eine Bibliothek mit vier Reste langen Oligomeren, die drei Monomere (A, B, C) enthalten, würden drei Untereinheiten synthetisiert werden (NNAN, NNBN, NNCN, wobei N einen gleichen Einbau von jedem der drei Monomere darstellt). Jede Untereinheit wird dann in einem funktionsbezogenen Assay gescreent und die beste Untereinheit wird identifiziert (z. B., NNAN). Eine zweite Serie von Bibliotheken wird synthetisiert und gescreent, wobei jede den feststehenden Rest von der vorhergehenden Runde, und einen zweiten feststehenden Rest (z. B. ANAN, BNAN, CNAN) enthält. Durch aufeinanderfolgende Runden von Screenen und Synthese, kann eine einzige Sequenz mit Aktivität in dem Assay identifiziert werden.
  • K. Agustyns et al. beschreiben in Nucl. Acids Research Bd. 19(10), Seiten 2587-93 (1991) die Herstellung von 1-(N-6-Benzoyladenin-9-yl)-3-(O-2-cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-4-(methoxytrityl)hydroxylbutan. Der 3,4-Dihydroxybutyladenin-Linker in diesem Dokument kann durch ein Phosphoramidit dimerisieren, das dann zu einer Phosphonat-Gruppe oxidiert wird. Die 3,4-Dihydroxybutyladeninbindungsgruppen und ihre Dimere können in Oligonucleotide eingebaut werden. Es werden keine pharmazeutischen Anwendungen der Verbindungen angegeben.
  • Es ist aus EP-A-0313219 bekannt, eine 3-Amino-1,2-propandiolgruppe in ein Oligonucleotid durch Schützen der 1-Hydroxygruppe mit Trityl, und Reaktion der 2-Hydroxygruppe mit 2- Cyanethoxy-N,N-diisopropylphosphoramidit einzubauen.
  • C. Mackellar et al. beschreiben in Nucl. Acids Research Bd. 20(13), Seiten 3411-17 (1992) 1-(4- 4'-Dimethoxytrityl)-2-cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-octadecan-1,2-ol. Diese Verbindung wird für die Einführung von lipophilen Gruppen in Oligonucleotide verwendet, aber es wurde keine pharmazeutische Verwendung beschrieben.
  • P. S. Nelson et al. beschreiben in Nucl. Acids Research Bd. 17(18), Seiten 7179-86 (1989) 1- Trityl-2-(2-cyanethyl-N,Ndiisopropylphosphoramidit)-3-Fmoc-aminopropan. Es wird keine pharmazeutische Verwendung der Verbindung beschrieben.
  • J. Grzybowski et al. beschreiben in Nucl. Acids Research Bd. 21(8), Seiten 1705-12 (1993) 1- (Dimethoxytrityl)-2-(2-cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-6-dinitrofluorphenyl-hexan Verbindung 2 g). Diese Verbindung wird für kolorimetrische Markierung von Oligonucleotiden. Es wird keine pharmazeutische Anwendung der Oligonucleotide beschrieben.
  • M-L. Fontanel et al. beschreiben in Bioconjugate Chemistry Bd. 4(5), Seiten 380-5 (1993) 1- Dimethoxytrityl-2-(2-cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit-6-(4-ethyloxycarbonyloxyphenylethyl)carbonylamino)-hexan. Die Herstellung eines Oligonucleotids, das durch vier Linkergruppen modifiziert ist, die sich von Verbindung 10 ableiten und durch Phosphonylgruppen verbunden sind, wird ebenfalls beschrieben.
  • V. A. Korshun et al. beschreiben in Bioconjugate Chemistry Bd. 3(6), Seiten 559-62 (1992) 1- Dimethoxytrityl-2-(2-cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-3- (pyrenylpropylcarbonylamino)-propan (siehe Tabelle 1, Verbindung 5). Die Verwendung dieser Verbindung zum Markieren von Oligonucleotiden wird beschreiben.
  • Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, neue monomere Alkanglycoleinheiten bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, neue monomere Alkanglycoleinheiten bereitzustellen, die in neue oligomere Strukturen eingebaut werden können.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, neue monomere Alkanglycoleinheiten, die durch Phosphor-haltige Grundgerüste verknüpft werden können.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, neue auf Alkanglycol basierende Oligomere bereitzustellen, die eine Vielfalt von funktionsbezogenen Hälften darauf zur Bindung an biologischen interessanten Stellen umfassen.
  • In einem ersten Aspekt, stellt die Erfindung einer Verbindung der Struktur I bereit:
  • bei der X, Y und Z wie in Anspruch 1 definiert werden.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen ist Y eine säurelabile Hydroxyl-Schutzgruppe wie eine Trityl-, Methoxytrityl-, Dimethoxytrityl- oder Trimethoxytritylgruppe.
  • Bei einer bevorzugten Gruppe von Verbindungen umfasst Z einen Stickstoff-haltigen Heterocyklus wie einen Imidazol- oder Carbazol-Ring. Bei einer weiteren bevorzugten Gruppe umfasst Z eine Purin- oder Pyrimidin-Nucleobase. Besonders bevorzugt werden Verbindungen, bei denen X ein aktiviertes Phosphit ist, Y eine säurelabile Hydroxyl-Schutzgruppe ist, und Z Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin oder Thymin ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch oligomere Verbindungen mit Struktur II bereit:
  • bei der X, Y, Z, EE, j, m und n wie in Anspruch 5 definiert sind.
  • Die Erfindung umfaßt ferner Verfahren zur Herstellung von oligomeren Zufalls-Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Schritte des Auswählens einer Gruppe von Monomeren mit Formel III umfassen,
  • bei der X, Y, Z, Q, j und n wie in Anspruch 27 definiert sind, und kovalent an mindestens zwei der Monomere der Gruppe binden, um die oligomere Verbindung zu bilden.
  • Die Z-Hälfte von mindestens einem Monomer der Gruppe unterscheidet sich von der Z-Hälfte eines anderes Monomers der Gruppe. Durch dieses Verfahren hergestellte Verbindungen sind oligomere Zufalls-Verbindungen mit 2 bis 50 Monomeren, vorzugsweise 2 bis etwa 25 Monomeren.
  • Weiterhin umfasssen Verbindungen der Erfindung rekombinante oligomere Verbindungen, die gemäß Anspruch 31 definiert sind, mit einem zentralen Bereich, der einen Phosphodiester oder ein Phosphorothioatoligodeoxynucleotid enthält, der bzw. das den Raum zwischen Seitenregionen einnimmt.
  • Die Verbindungen der Erfindung können als Inhibitoren von verschiedenen Enzymen einschließlich Phospholipase A&sub2;-Enzym verwendet werden. Die Verbindungen sind bei der Behandlung von Entzündungskrankheiten einschließlich atopischer Dermatitis und entzündlicher Darmerkrankung als Inhibitoren von Phospholipase A&sub2; nützlich. Die oligomeren Verbindungen der Erfindung können als Diagnostika verwendet werden, weil sie in der Lage sind, spezifisch an Nucleinsäuren zu hybrisdisieren, die für die Ätiologie von Krankheiten ineressant sind. Die Verbindungen der Erfindung können auch als Forschungsproben und Primer, besonders bei Studien von Enzym-Biochemie und Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkungen, verwendet werden.
  • Die zahlreichen Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung können von dem Fachmann mit Hinweis auf die begleitenden Figuren besser verstanden, bei denen:
  • Fig. 1-4 synthetische Verfahren für aktivierte Phosphitmonomere gemäß der Erfindung beschreiben.
  • Die monomeren Verbindungen der Erfindung können für Identifikationszwecke als substituierte Alkanglycole, d. h., substituierte Alkandiole, betrachtet werden, bei denen der Alkanabschnitt 2 bis 7 Kohlenstoffatome hat. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die Hydroxylgruppen der Alkanglycole verwendet, um angrenzende Monomere zu verknüpfen und oligomere Strukturen zu bilden. Während einer Oligomersynthese wird eine der Glycolhydroxylgruppen typischerweise mit einer Schutzgruppe blockiert und die andere Hydroxylgruppe wird mit einer aktivierten Phosphatgruppe wie eine β-Cyanethylphosphoramidatgruppe zur Reaktion gebracht. Hier wird der Ausdruck aktivierte Phosphatgruppe mit der Absicht verwendet, eine Phosphatgruppe zu bezeichnen, die eine chemische Modifikation darauf trägt, um ihre Reaktivität mit Nucleophilen zu steigern. In gleicher Weise bezeichnet der Ausdruck aktivierte Phosphitgruppe eine Phosphitgruppe, die eine chemische Modifikation trägt, um ihre Reaktivität mit Nucleophilen zu steigern. Viele solcher Modifikationen sind in dem Fachgebiet bekannt.
  • Die monomeren Verbindungen der Erfindung sind vorzugsweise unter Verwendung von Phosphat-Bindungen kovalent verknüpft. Dies erlaubt eine Verknüpfung entweder durch Flüssigphasen- oder Festphasen-Chemie. Repräsentative Flüssigphasenverfahren werden in den 11. Mai 1993 veröffentlichten United States Patent Nr. 5,210,264 beschrieben und gemeinhin in dieser Erfindung genannt. Repräsentative Festphasenverfahren sind typischerweise solche, die für DNA und RNA-Synthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie verwendet werden. (siehe, z. B., Protocols For Oligonucleotides and Analogs, Agrawal, S., Aufl., Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Eine bevorzugte synthetische Festphasensynthese verwendet Phosphoramidite als aktivierte Phosphate. Die Phosphoramidite verwenden PIII-Chemie. Die intermediären Phosphit-Verbindungen werden anschließend unter Verwendung von bekannten Verfahren zu dem PV-Zustand oxidiert. Dies ermöglicht eine Synthese der bevorzugten Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Phosphat-Bindungen in Abhängigkeit der ausgewählten Oxidationsbedingungen. Andere Phosphat-Bindungen können ebenfalls erzeugt werden. Diese umfassen Phosphorothioate, Phosphotriester, Alkylphosphonate, Phosphorselenate und Phosphoramidate.
  • Die Alkanglycolhälften können mit veschiedenen funktionellen Gruppen substituiert sein. Wenn die monomeren Verbindungen miteinander verknüpft sind, statten diese funktionellen Gruppen die resultierenden oligomeren Verbindungen mit diversen Eigenschaften ("Vielfalt") aus. Diese funktionellen Gruppen umfassen Wasserstoffbrücken-Donoren und -Acceptoren, ionische Hälften, polare Hälften, hydrophobe Hälften, aromatische Zentren, und Elektronen-Donoren und- Acceptoren. Zusammen liefern die Eigenschaften der einzelnen Monomere die Einzigartigkeit der Oligomere, bei denen sie gefunden werden. Folglich wird eine Bibliothek solcher Oligomere eine Myriade von Eigenschaften haben, d. h., "Vielfalt". Gemeinsam liefern dre Eigenschaften der einzelnen Monomere, die zusammen ein Oligomer bilden, eine Einzigartigkeit eines solchen Oligomers und verleiht ihm gewisse Merkmale zur Wechselwirkung mit zellulären, enzymatischen oder Nucleinsäure-Zielstellen. Die funktionellen Gruppen können direkt zu dem Alkanglycol-"Kern"- oder "Grundgerüst"-Abschnitt der monomeren Einheiten verknüpft sein oder sie können dazu durch eine geeignete Kette verbunden sein. Wie erkannt werden wird, ist der Kernabschnitt der monomeren Einheiten aus Alkanglycolhälften wie eine Ethylenglycoleinheit gebildet. Folglich werden die oligomeren Verbindungen der Erfindung aus einer Vielzahl von Alkanglycoleinheiten gebildet, z. B., Ethylenglycoleinheiten, die funktionelle Gruppen tragen und durch Phosphat-Bindungen miteinander verknüpft sind.
  • Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung werden die Alkanglycolkerne durch Ringöffnung einer Epoxid-Verbindung erzeugt. Bevorzugte Verbindungen sind solche, bei denen die Variable j in der vorstehenden Struktur I 1 ist. Diese Bevorzugung stammt aus dem Fakt, dass stereospezifische monomere Verbindungen, bei denen j = 1, hergestellt werden können und ihre Stereospezifität erhalten, wenn sie in oligomere Strukturen eingebaut werden. Andere Bestandteile dieser Serie, z. B., j = 2 bis 6, werden durch Verfahren hergestellt, die analog zu dem sind, das verwendet wurde, um Verbindungen herzustellen, bei denen j = 1 ist. Weil längere Homologe im allgemeinen weniger stabil sind, werden sie vorzugsweise in situ hergestellt und verwendet. Solche Herstellung und Verwendung können im allgemeinen gemäß den Verfahren von Ko, et al., J. Org. Chem. 1986, 51, 5413; Ko, et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 667; Klunder, et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 1259 durchgeführt werden. Folglich können 3,4- Epoxy-1-butanol, 4,5-Epoxy-1-pentanol, 5,6-Epoxy-1-hexanol, 6,7-Epoxy-1-heptanol, und 7,8- Epoxy-1-octanol in situ hergestellt und verwendet werden, um Verbindungen einer Struktur I zu schaffen, bei der j = 2, 3, 4, 5, bzw. 6 ist. Glycidol (2,3-Epoxy-1-propanol oder Oxiranmethanol) ist besonders zur Herstellung von Verbindungen geeignet, bei denen j = 1 ist, weil es durch Ringöffnung beides liefern kann, eine primäre Hydroxylgruppe und eine sekundäre Hydroxylgruppe, die in eine Phosphatbindung in einer oligomeren Verbindung der Erfindung eingefügt werden können. Die primäre Hydroxylgruppe leitet sich von dem Alkanol-Abschnitt, d. h., -CH&sub2;OH, von Glycidol ab, während die sekundäre Hydroxylgruppe durch Ringöffnung des Glycidol-Epoxid- Ringes erzeugt wird.
  • Monomere Verbindungen der Erfindung können durch nucleophile Addition einer funktionellen Gruppe (oder einer Kette für solch eine funktionelle Gruppe) an ein Epoxid-haltiges Ausgangsmaterial hergestellt werden. Im Allgemeinen wird diese Addition in einem geeigneten Lösungsmittel in der Gegenwart eines Katalysators durchgeführt, wie in Fig. 1 beschrieben. Wenn es notwendig ist, werden Übergangsschutzgruppen verwendet, um reaktive funktionelle Gruppen zu schützen.
  • Die nucleophile Addition an den Epoxid-Ring ist eine SN2-Reaktion, die ausschließlich an dem C-1-Kohlenstoff stattfindet. Bei Verbindungen von Struktur I, bei denen j = 1, kann racemisches oder nicht-racemisches Glycidol als Ausgangsmaterial verwendet werden. Wenn nicht-racemisches (d. h., chirales) Glycidol verwendet wird, ist das Produkt ebenfalls nicht racemisch (siehe, Hanson, Chemical Reviews 1991, 91, 437). Dies ermöglicht einen einfachen Zugang zu optisch aktiven Monomeren und auch Oligomeren, die solche Monomere inkorporieren, zu erhalten.
  • Mit dem Ziel Namen zu bezeichnen, können Verbindungen der Erfindung mit Struktur I als substituierte Alkan-Vebindungen angesehen werden. Zum Beispiel kann die resultierende Struktur als eine substituierte Propanverbindung angesehen werden, wenn j = 1 ist. Öffnen eines Epoxidringes durch nucleophile Addition einer funktionellen Gruppe oder einer Kettengruppe ergibt eine substituierte Diolverbindung, zum Beispiel, ein 1-substituiertes Propan-2,3-diol mit der funktionellen Gruppe oder der Kette, die mit dem C1-Kohlenstoff der Alkanhälfte verbunden ist. Das 1-substituierte Propan-2,3-diol weist sowohl eine primäre Hydroxylgruppe (d. h. das mit dem C3-Kohlenstoff verbundene Hydroxyl, die Hydroxymethylgruppe der Glycidolhälfte) als auch eine sekundäre Hydroxylgruppe (d. h., die mit dem C2-Kohlenstoff verbundene Hydroxylgruppe, die aus der Öffnung des Epoxidringes von Glycidol resultiert).
  • Auch wenn Verbindungen der Erfindung mit Struktur II, bei denen j = 1 ist, auf monomerer Ebene als Propanverbindungen angesehen werden, werden sie als substituierte Ethylenglycolverbindungen auf einer oligomeren Ebene angesehen, weil nur zwei der drei Kohlenstoffatome der monomeren Propaneinheit in dem oligomeren Grundgerüst enthalten sind. Beim Verlängern werden die monomeren Butanolverbindungen (j = 2) oligomere substituierte Propylenglycolverbindungen, und so weiter bei höheren Analoga. Folglich, wenn ein Propandiolmonomer in oligomere Verbindungen der Erfindung eingebaut wird, werden die C2- und C3-Kohlenstoffe der Propandiol-Hälfte Teil des oligomeren Ethylenglycolkerns, während der C1-Kohlenstoff der Propanhälfte ein intergraler Bestandteil von entweder einer Kette oder einer funktionellen Gruppe wird, die sich aus dem Kern erstreckt.
  • Um einen Einschluß in Phosphat-verbundene oligomere Verbindungen der Erfindung zu erleichtern, werden Alkandiol-haltige Monomere, die funktionelle Gruppen tragen, entweder mit einem aktivierten Phosphit oder mit einer aktivierten Phosphat-Hälfte aktiviert. Die primäre Hydroxyl-Gruppe (z. B., wenn j = 1, die C3-Propandiolhydroxylgruppe) wird vor der Phosphitylierung einer sekundären Hydroxylgruppe (z. B., wenn j = 1, die C2-Propandiol-Hydroxyl-Gruppe) geschützt. Schützen des primären Hydroxyls wird entweder vor oder nach der Ringöffnung des Epoxids durchgeführt. Weil ein Zusatz einer Schutzgruppe zu der Glycidol- Methylhydroxylgruppe seinen Epoxidring weniger reaktiv gegenüber nicht-unterstützter nucleophiler Addition macht, wird das Schützen der primären Hydroxylgruppe normalerweise nach der Öffnung durchgeführt, es sei denn, andere Überlegungen setzen solches Schützen nach der Ringöffnung ausser Kraft. Wenn Nucleophile verwendet werden, die mit der primären Hydroxylgruppe reagieren können, wird Schützen der Hydroxylgruppe vor Ringöffnung ("Pre-Ring- Öffnung") durchgeführt. Solches Schützes vor der Ring-Öffnung wird, zum Beispiel, für die Addition von Grignard-Reagenzien und dergleichen verwendet.
  • Eine säurelabile Schutzgruppe wie ein Mitglied der Trityl-Familie kann vorzugsweise zum Schützen der primären Hydroxylschutzgruppe verwendet werden, wenn solches Schützen vor oder nach Ringöffnung durchgeführt wird. Die Trityl-Familie umfasst mindestens Trityl, Monomethoxytrityl, Dimethoxytrityl und Trimethoxytrityl. Die Dimethoxytritylgruppe wird bevorzugt und kann durch Reaktion der primären Hydroxyl-Gruppe mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid eingeführt werden. Andere Hydroxylschutzgruppen können verwendet werden, so wie die von Beaucage, et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223.
  • Bei anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von säurelabilen Gruppen, die gegenüber Trichloracetessigäure-Behandlung stabil sind, die für DMT-Entfernung wie Schutzgruppen vom Boc-Typ verwendet. Sie sind stabil, um TCA-Behandlung zu überstehen, werden aber durch Trifluoressigsäure-Lösungen (z. B. 5% in CH&sub2;Cl&sub2;) entfernt. Eine andere Schutzgruppenklasse, die mit dieser Methodik kompatibel ist, ist die Allylklasse. Diese Gruppen werden unter Verwendung von Übergangsmetallkatalysatoren abgespalten. Dieser Schutzgruppen-Typ ist besonders in Fällen wertvoll, in denen die selektive Entschützung einer besondereren funktionellen Gruppe gewünscht wird, während das Oligomer immer noch an dem festen Träger hängt, wobei einer neuen reaktiven Stelle ermöglicht wird, ungeschützt zu sein. Weitere Schutzgruppentaktiken sind möglich: z. B. photolabile Schutzgruppen sind mit dieser Methodik auch kompatibel.
  • Dem Schützen der primären Hydroxylgruppe und der Ringöffnung, in beiden Anordnungen folgend, wird die sekundäre Hydroxylgruppe in eine aktivierte Phosphor-Hälfte, vorzugsweise eine aktivierte Phosphit-Hälfte, umgewandelt. Phosphitylierung kann mit einem geeigneten Reagens wie Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin durchgeführt werden. Die Phosphitylierung ergibt ein geschütztes Monomer, das entweder eine aktivierte Phosphit-Hälfte oder eine aktivierte Phosphat-Hälfte trägt und zum Einbauen in Phosphat-verknüpfte oligomere Verbindungen der Erfindung geeignet ist.
  • Oligomere Verbindungen der Erfindung können durch die in Fig. 1-4 dargestellten Verfahren synthetisiert werden. Die dargestellte Synthesestrategie legt eine Betonung auf die Leichtigkeit, mit der verschiedene vielseitige funktionelle Gruppen in ein stabiles Intermediat eingebaut werden können. Die Monomere, wie aktivierte Phosphate oder aktivierte Phospite, werden entweder zu vorbestimmten Sequenzen unter Verwendung von, zum Beispiel, Synthese-Verfahren des Standard-Oligonucleotid-Typs auf einem DNA-Synthesizer oder zu Zufalls-Sequenzen unter Verwendung von, zum Beispiel, einem kombinatorischen Verfahren wie das vorstehend beschriebene SURF-Verfahren, oligomerisert.
  • Monomereinheiten, die geschützte oder ungeschützte funktionelle Gruppen tragen, können wie in den nachstehend beschriebenen Beispielen hergestellt werden. Wenn die funktionelle Gruppe derart ist, dass sie mit anderen Hälften oder Reagenzien während der Phosphitylierung oder Oligomerisierung reagieren wird, kann die funktionelle Gruppe mit einer Schutzgruppe, vorzugsweise einer basenlabilen Schutzgruppe geschützt werden, die nach Vollendung einer Oligomersynthese entfernt wird.
  • Eine erste Gruppe von bevorzugten monomeren Verbindungen der Erfindung wird durch nucleophile Addition eines aktiven Stickstoff-haltigen Heterocycluses an Glycidol hergestellt. Für die Ziele dieser Patentanmeldung sind Stickstoff-haltige Heterocyclen einzel- oder multi-cyclische Verbindungen, die mindestens ein Stickstoff-Atom enthalten. Der Heterocyclus kann andere Heteroatome als Stickstoffatome enthalten. Solch andere Heteroatome umfassen Sauerstoff und Schwefel, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Heterocyclen sind synthetische und natürliche Purin- und Pyrimidin-Nucleobasen, z. B., Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alky-Derivate von Adenin und Guanin, 5-Halogen-Uracil und -Cytosine, 6-Aza-Uracil, -Cytosin und -Thymin, 5-Uracil (pseudo Uracil), 4-Thiouracil, 8-Halo-, Amino-, Thiol-, Thioalkyl-, Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl- und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine und 7- Methylguanin. Andere Purine und Pyrimidine umfassen die in dem United States Patent- Nummer 3,687,808 beschriebenen, in dem Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engeneering, J. I. Kroschwitz, Ed. John Wiley & Sons, 1990 auf Seiten 858-859 offenbarten und die von Englisch, et al. offenbarten, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613.
  • Solche Stickstoff-haltigen Heterocyclen können entweder zu Glycidol oder zu R-(+)-Glycidol in einem geeigneten Lösungsmittel in der Gegenwart des Katalysators wie Kaliumcarbonat zugegeben werden, wie in Fig. 2 gezeigt. Exocyclische funktionelle Gruppen bei den Stickstoff- Heterocyclen werden gegebenenfalls durch Übergangsschutzgruppen geschützt. Besonders nützliche Übergangsschutzgruppen für exocyclische funktionelle Gruppen von Nucleobasen sind Chlortrimethylsilan, Benzoylchlorid, und Isobutyrylchlorid. Die geschützte Verbindung wird dann mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in Pyridin trityliert, um ihre primäre Hydroxylgruppe zu schützen. Phosphitylierung mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin und Diisopropylethylamin in Tetrahydrofuran (THF) ergibt das entsprechende Phosphoramiditmonomer, das in eine oligomere Verbindung der Erfindung eingebaut werden kann.
  • Andere Stickstoff-haltige Heterocyclen, die als funktionelle Gruppen verwendet werden können, umfassen Imidazol, Pyrrol, Imidazolyl, Pyrazol, Indol, 1H-Indazol, β-Carbolin, Carbazol, Phenothiazin, und Phenoxazin. Eine bevorzugtere Gruppe von Stickstoff-Heterocyclen umfasst Imidazol, Pyrrol oder Carbazol. Imidazol ist besonders bevorzugt.
  • Beim Herstellen monomerer Verbindungen, einschließlich solcher Heterocyclen, wird das Schützen von exocyclischen funktionellen Gruppen mit basenlabilen Schutzgruppen, wie mit den vorstehend genannten Nucleobasen durchgeführt, die resultierende Verbindung wird mit 4,4'- Dimethoxytritylchlorid trityliert und mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin phosphityliert, um die gewünschte monomere Verbindung zu ergeben.
  • Weitere bevorzugte monomere Verbindungen der Erfindung können durch Zugabe von Alkyl-, Alkenyl-, oder Aryl-organometallischen Reagenzien zu einem Epoxid-Ring-haltigem Ausgangsmaterial, z. B., zu dem 2,3-Epoxyring von Glycidol, hergestellt werden. Dies ist in Fig. 3 dargestellt. Zur Herstellung solcher Verbindungen wird die primäre Hydroxylgruppe des Ausgangsmaterials (z. B., die Methylhydroxylgruppe von Glycidol) mit einer säurelabilen Schutzgruppe vor der Öffnung des Epoxid-Rings geschützt. Wie vorstehend, ist als Schutzgruppe eine aus der Trityl-Familie der Schutzgruppen geeignet. Folglich kann, zum Beispiel, die Zugabe eines Organomagnesiumreagenses zu 1-O-Dimethoxytritylglycidol in der Gegenwart von Dilithiumtetrachlorcuprat in einem geeignetem Lösungsmittel durchgeführt werden. Phosphitylierung unter Verwendung von Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin liefert dann die monomere Verbindung als das Phosphoramidit.
  • Weitere noch bevorzugtere monomere Verbindungen der Erfindung können durch nucleophile Addition von Ammoniak zu Glycidol. Dies ist in Fig. 4 dargestellt. Das Produkt dieser Reaktion, 1-Amino-2,3-propandiol, kann mit Benzoylchlorid geschützt werden und die geschützte Verbindung wird zum Einbau in ein Oligomer in das DMT-Phosphoramidit umgewandelt. Alternativ kann die Aminogruppe von 1-Amino-2,3-propandiol weiter funktionalisiert werden. Funktionelle Gruppe können direkt an den Stickstoff oder durch eine Kette, entweder durch Alkylierung oder Acylierung, angehängt werden. Nach der Funktionalisierung wird das Schützen mit 4,4'- Dimethoxytritylchlorid und Phosphotylierung mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin durchgeführt, um das Phosphoramiditmonomer für den Einbau in eine oligomere Verbindung der Erfindung zu ergeben.
  • Bei Verwendung der Amino-Gruppe der vorstehend-erwähnten 1-Aminoalkandiol-Verbindung als ein Verbindungspunkt einer Kette mit dem Alkandiol, kann die Amino-Gruppe entweder durch Acylierung oder Alkylierung zur Reaktion gebracht werden. Bei solch einer Reaktion wird die Amino-Gruppe mit einer bifunktionellen Bindungs-Gruppe umgesetzt, das heißt, mit einer Verbindung mit einer ersten reaktiven Gruppe zur Bindung an die monomere Alkanglycol- Verbindung und einer zweiten reaktiven Gruppe zur Bindung an die funktionelle Gruppe, die mit der monomeren Alkanglycol-Verbindung verbunden ist. Eine Gruppe der bifunktionellen Bindungs-Gruppen oder Ketten, die besonders bevorzugt sind, sind cyclische Anhydride einschliesslich Bernsteinsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid. Folglich kann, zum Beispiel, das vorstehend erwähnte 1-Amino-2,3-propandiol mit Bernsteinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht werden, um eine Amid-Bindung zwischen dem Propandiol und der Bernsteinsäure-Ketten-Gruppe zu bilden. Das andere Ende der Bernsteinsäure-Kette kann dann, zum Beispiel, durch die Bildung einer Ester- oder Amid-Bindung mit einer Hälfte funktionalisiert werden, die die gewünschte funktionalisierte Gruppe trägt. Dies wird von einer Reaktion mit 4,4'- Dimethoxytritylchlorid und dann Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin gefolgt, um das Phosphoramidit zum Einbau in oligomere Verbindungen der Erfindung zu ergeben.
  • Weitere Acyl-Gruppen können zusätzlich zu einer Amidacyl-Gruppe verwendet werden, um eine Kette mit dem vorstehend beschriebenen 1-Amino-2,3-propandiol zu verbinden. Nach Acylierung der 1-Amino-Gruppe bilden solche andere weiteren Gruppen Carbamoyl-, Thiocarbamoyl-, Ureido-, Thioureido-, und Sulfonamido-Bindungen. Carbamate und Thiocarbamate werden durch die Reaktion einer geeigneten Chlorformiat- oder ThioChlorformiat-Verbindung mit der Amino-Gruppe des 1-Amino-2,3-propandiols gebildet. Harnstoffe werden durch Reaktion von Amino-2,3-propandiol mit Isocyanaten oder Thioisocyanaten gebildet, und Sulfonamide werden durch Reaktion von 1-Amino-2,3-propandiol mit einem Sulfonylchlorid gebildet. Das andere Ende der Kette (d. h., die eine, die nicht zum Verbinden der Kette mit Amin verwendet wird), wird ausgewählt, um mit der funktionellen Gruppe zu reagieren, die mit der monomeren Einheit verbunden ist. Acyl-Bindungen, einschließlich Estern, Amiden, Carbamaten, Harnstoffen und dergleichen, sind auch für diese Anlagerung nützlich.
  • Eine weitere Gruppe von besonders nützlichen bifunktionellen Bindungs-Hälften oder -Ketten sind bestimmte heterobifunktionelle oder homobifunktionelle Linker, die von Pierce, Rockford II erhältlich sind. Diese schließen verschiedene Diimidate, N-Hydroxysuccinimidester und Sulfo- N-hydroxysiccinimidester ein. Repräsentative Diimidate schließen Dimethyladipinimidat, Dimethylpimelinimidat, Dimethylsuberinimidat und dergleichen ein. Repräsentative N- Hydroxysuccinimidester und Sulfo-N-succinimidester schliessen Disuccinimidylsuberat, Bis(sulfosuccinimidyl)suberat und dergleichen ein.
  • Eine weitere bevorzugte Gruppe von Kettenverbindungen schließt Alkyl-, Alkenyl- und Aryl- Verbindungen ein. Diese können verwendet werden, um die Amino-Gruppe von 1- Aminoalkandiol-Verbindungen zu alkylieren. Alternativ können sie direkt zu Alkandiol- Verbindungen zugesetzt werden, z. B. durch Zugabe von Alkyl-, Alkenyl- oder Aryl- Organometall-Reagenzien zu dem Epoxid-Ring eines geeigneten Startmaterials. Die Kette kann wiederum weiter mit einer funktionellen Gruppe funktionalisiert sein.
  • Bevorzugte funktionelle Gruppen sind: Alkyl-, Alkenyl-, und Alkynyl-gruppen, die wahlweise mit einem oder mehreren Halogen(en), OR&sub1;, SR&sub1;, NR&sub1;R&sub2;, C(=NH)NR&sub1;R&sub2;, NHC(=N)NR&sub1;R&sub2;, CH=O, C(=O)OH, C(=O)NR&sub1;R&sub2;, CH(NH&sub2;)(C(=O)OH; Aryl- und Aralkyl-Gruppen substituiert sind, die wahlweise mit einem oder mehreren Halogen(en), OH, SH, SCH&sub3;, NR&sub1;R&sub2;; Adamantyl; NR&sub1;R&sub2;; Heterocyclus; Purin; Pyrimidin; Phosphat; Polyether; Polyethylenglycol oder Metallkoordinationsgruppen substituiert sind.
  • Alkyl-, Alkenyl- und Alkynyl-gruppen gemäß der Erfindung umfassen substituierte und unsubstituierte unverzweigte, verzweigte, und alicyclische Kohlenwasserstoffe, einschließlich Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecy-, Pentadecyl-, Hexadecyl, Heptadecyl-, Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosyl- oder andere höhere Kohlenstoffalkyl-Gruppen, sind aber nicht darauf beschränkt. Weitere Beispiele umfassen 2-Methylpropyl-, 2-Methyl-4-ethylbutyl-, 2,4-Diethylpropyl-, 3-Propylbutyl-, 2,8-Dibutyldecyl-, 6,6-Dimethyloctyl-, 6-Propyl-6-butyloctyl-, 2-Methylbutyl-, 2-Methylpentyl- 3-Methylpentyl-, 2-Ethylhexyl- und andere verzweigte Kettengruppen, Allyl-, Crotyl-, Propargyl- 2-Pentenyl- und andere ungesättigte Gruppen, Cyclohexan, Cyclopentan, Adamantan sowie andere alicyclische Gruppen, 3-Penten-2-on, 3-Methyl-2-butanol, 2-Cyanoctyl, 3-Methoxy-4- heptanal, 3-Nitrobutyl, 4-Isopropxydodecyl, 4-Azido-2-nitrodecyl, 5-Mercaptononyl, 4-Amino-1- pentenyl sowie andere substituierte Gruppen.
  • Aryl-Gruppen gemäß der Erfindung umfassen substituierte und unsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppen wie Phenyl- und Naphthyl-Gruppen, sind aber nicht darauf beschränkt. Aralkyl-Gruppen umfassen Gruppen mit Aryl- und/oder Alkyl-Funktionalitäten, wie Benzyl- und Xylyl-Gruppen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Metallkoordinations-Gruppen gemäß der Erfindung schließen Hydroxamsäuren, Catecholamid, Acetylaceton, 2,2'-Bipyridin, 1,10-Phenanthrolin, Diessigsäure, Pyridin-2-carboxamid, Isoalkyldiamin, Thiocarbamato, Oxalat, Glycyl, Histidyl und Terpyridyl ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere Metallkoordinations-Gruppen sind bekannt, siehe zum Beispiel Mellor, D. P., Chemistry of Chelation and Chelating Agents in International Encyclopedia of Pharmacology and Therapeutics, Section 70, The Chelation of Heavy Metals, Levine, W. G. Ed., Pergamon Press, Elmford, N. Y., 1979.
  • Feststoffträger gemäß der Erfindung schliessen Regelporenglas (controlled pore glass; CPG), Oxaxyl-Regelporenglas (oxalyl-controlled pore glass; siehe, z. B., Alul, et al. Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527), TentaGel-Support - - ein Aminopolyethylenglycol-derivatisierter Träger (siehe, z. B., Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373) oder Poros - - ein Polystyrol/Divinylbenzol-Copolymer ein.
  • Eine Anzahl von Substituenten-Gruppen können in Verbindungen der Erfindung in einer geschützten (blockierten) Form eingeführt und anschließend entschützt werden, um eine endgültige, gewünschte Verbindung zu bilden. Im Allgemeinen machen Schutzgruppen chemische Funktionalität spezifischen Reaktionsbedingungen gegenüber inert und können an eine solche Funktionalität in einem Molekül angehängt oder entfernt werden, ohne dem Rest des Moleküls im Wesentlichen zu schaden. Siehe, z. B., Green und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2.te Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1991. Zum Beispiel, können Amino- Gruppen als Phthalimido-Gruppen oder als 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-Gruppen geschützt werden und Carboxyl-Gruppen können als Fluorenylmethyl-Gruppen geschützt werden. Repräsentative Hydroxyl-Schutzgruppen sind von Beaucage, et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223 beschrieben.
  • Substituenten-Gruppen gemäß der Erfindung schließen Halogene (Cl, Br, F), Hydroxyl (OH), Thiol (SH), Keto (C = O), Carboxyl (COOH), Ether, Thioether, Amidin (C(=NH)NR&sub3;R&sub4;, Guanidin (NHC(=NH)NR&sub3;R&sub4;, Glutamyl (CH(NR&sub3;R&sub4;)(C(=O)OR&sub5;), Nitrat (ONO&sub2;), Nitro (NO&sub2;), Nitril (CN), Trifluormethyl (CF&sub3;), Trifluormethoxy (OCF&sub3;), O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino (NH&sub2;), Azido (N&sub3;), Hydrazino (NHNH&sub2;), Hydroxylamino (ONH&sub2;), Sulfoxid (SO), Sulfon (SO&sub2;), Sulfid (S-), Disulfid (S-S), Silyl, heterocyclisch, alicyclisch und carbocyclisch sein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Substituenten schließen Halogene, Alkohole und Ether (ORi), Thiole und Thioether (SR&sub2;), Amine (NR&sub3;R&sub4;), Amidine [C(=NH)NR&sub3;R&sub4;], Guanidine [NHC(=NH)NR&sub3;R&sub4;], Aldehyde (CH=O), Säuren [C(=O)OH], Ester [C(=O)OR&sub5;], Amide [C(=O)NR&sub3;R&sub4;] und Glycin [CH(NH&sub2;)(C(=O)OH)] ein.
  • Besonders bevorzugte funktionelle Gruppen gemäß der Erfindung schließen monomere Einheiten mit mindestens den folgenden funktionellen Hälften: Thymin, Uracil, Adenin, Guanin, Cytosin, Imidazol, Carbazol, Aminoethyl, Carboxyethyl, Phenyl, kurz- und langkettige Alkyle, und Glycin ein. Weitere bevorzugte Gruppen schließen Amino, Benzyl, und Tetraethylenglycolgruppen ein.
  • Die Verbindungen der Erfindung können konjugierte Gruppen einschließen, die kovalent an primäre oder sekundäre Hydroxyl-Gruppen gebunden sind. Konjugierte Gruppen der Erfindung schließen Intercalatoren, Reporter-Moleküle, Polyamine, Polyamide, Polyethylenglycole, Polyether, Gruppen, die die pharmacodynamischen Eigenschaften der Oligomere verbessern, und Gruppen, die die pharmacokinetischen Eigenschaften der Oligomere verbessern. Typische konjugierte Gruppen schließen Cholesterole, Phospholipide, Biotin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridin, Fluoresceine, Rhodamine, Cumarine und Farbstoffe ein. Gruppen, die die pharmacodynamischen Eigenschaften verbessern, schließen, in dem Kontext dieser Erfindung, Gruppen ein, die eine Oligomer-Aufnahme steigern, die Oligomer-Resistenz gegenüber Zersetzung bzw. Abbau verbessern und/oder die sequenzspezifische Hybridisierung mit RNA stärken. Gruppen, die die pharmacokinetischen Eigenschaften verbessern, schließen, in dem Kontext dieser Erfindung, Gruppen ein, die die Oligomer-Aufnahme, Verteilung, Metabolismus oder Ausscheidung steigern. Repräsentative konjugierte Gruppen sind in WO-A-9307883 und US-A-5218105 offenbart.
  • Monomere Verbindungen der Erfindung können verwendet werden, um oligomere Verbindungen herzustellen, die entweder vorausgewählte Sequenzen oder Sequenzen aufweisen, die mittels kombinatorischen Strategien bestimmt sind. Eine nützliche kombinatorische Strategie ist die vorstehend erwähnte SURF-Strategie, die in WO-A-9304204 offenbart und beansprucht ist.
  • Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, eine kombinatorische Bibliothek mit einem breiten Grad an chemischer Diversität zu synthetisieren. Chemische Diversität wird bei einem Level durch Variation der Art der Phosphor-Bindung eingeführt. Zu der vorliegenden Erfindung zugängliche Phosphor-Bindungen schließen Phosphodiester (OPO), Phosphorothioat (OPS); Phosphoramidat (OPN), Phosphorothioamidat (SPN), und Alkylphosphonat (OPC) ein. Die kombinatorische Bibliothek kann mit einer einzelnen Art an Phosphor-Bindung, oder mit verschiedenen Bindungen an jeder Position des Oligomers hergestellt werden. Eine einzige OPS- Bindung kann, zum Beispiel, selektiv an irgendeiner Position in einem OPO Oligomer eingeführt werden. Tatsächlich können alle möglichen Kombinationen von OPO, OPS, OPN, SPN und OPC-Bindungen selektiv in die Oligomere eingeführt werden. Das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Bindungart an einer besonderen Position in einem Oligomer kann einen tiefgreifenden Effekt auf die Eigenschaften des Moleküls haben.
  • Im dem Fall von Phosphoramidat-gebundenen Bibliotheken ist ein weiterer Diversitätslevel aufgrund der Fähigkeit möglich, Substituenten an dem Stickstoffatom der OPN-Bindung zu haben. Folglich ist es möglich, eine breite Vielfalt von Aminen jederzeit einzuführen, wenn eine OPN- Bindung in einem Oligomer vorliegt. Es ist möglich, an dem gleichen Amin-Substituenten an jeder OPN-Bindung oder ein verschiedenes Amin an jeder Position zu haben.
  • Wie vorstehend erläutert wurde, kann chemische Diversität bei bestimmten Leveln in SURF Bibliotheken erzeugt werden. Wir haben vorstehend die Herstellung einer großen Anzahl von Monomeren beschrieben. Diese Monomere wurden hergestellt, um zwei Aspekte der chemischen Diversität zu untersuchen: Erstens ist eine breite Anzahl an funktionellen Gruppen erhältlich, die einen Bereich von chemischen Eigenschaften abdecken. Zweitens werden diese funktionellen Gruppen an verschiedene Linker-Abschnitte angehängt, die vorgesehen sind, um sie im Raum in verschieden Arten zu zeigen oder präsentieren, und dabei variable Flexibilität erlauben. Der folgende Abschnitt beschreibt einen dritten Diversitätslevel, die Inter-Rest-Bindung selber. Es muss klar sein, dass die Verfahren, die verwendet werden, um irgendeinen der Bindungsarten einzuführen, kompatibel sind. Insbesonders ist es durch Verwendung der korrekten Bedingungen möglich, Phosphat-Bindungen einschließlich OPO, OPS, OPN, SPN und OPC Bindungen auf Wunsch an irgendeiner Position in einem Oligomer, unabhängig von der Sequenz des Oligomers einzuführen. Dies ist möglich, weil die chemische Reaktion, die die Natur der Bindung definiert, von der Anhängung des Monomers an die reaktive Gruppe auf dem festen Träger (entweder Linker oder das vorgehende Monomer) getrennt ist. Insbesonders wird ein Phosphittriester erhalten, wenn ein Phosphoramidit-Monomer mit Tetrazol behandelt wird und zu dem festen Träger mit freien Hydroxyl-Gruppen zugegeben wird. Dieser Phosphittriester kann dann mit Iod behandelt werden (in der gleichen Weise wie für DNA-Synthese auf einem automatischen Synthesizer formuliert), und ergibt nach Ammoniak-Entschützung einen Phosphodiester. Alternativ kann der Phosphittriester mit Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid behandelt werden, um das entsprechende Phosphorothioat zu ergeben.
  • Wasserstoffphosphonat-Chemie weist den Vorteil auf, dass sie erlaubt, zusätzliche chemische Modifikationen in Oligomere einzuführen. Oligonucleotide Phosphodiester und Phosphorothioate wurden unter Verwendung dieses Zuganges hergestellt (siehe Froehler, B. C., Matteucci, M. D., Tetrahedron Lett. 1986, 27, 469-472), ebenso wie oligonucleotide Phosphoramidate (siehe Froehler, B. C. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 5575-5579, Letsinger, R. L., Singman, C. N., Histand, G., Salunkhe, M. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 4470-4471). Die Synthese von Oligomeren, die Phosphodiester und Phosphoramidate enthalten, ebenso wie die Verwendung von Phosphoramidat-Chemie in Verbindung mit der Synthese von Phosphoramidaten wurde beschrieben (siehe Jung, P. M., Histand, G., Letsinger R. L. Nucleosides & Nucleotides, 1994, 13, 1597-1605). In dieser zuletzt-genannten Arbeit wurden alternierende Phosphodiester- und Phosphoramidat-Oligomere durch Verbinden von Phosphoramidaten und H-Phosphonaten mit dem wachsenden Oligomer, gefolgt durch den geeigneten Oxidationsschritt hergestellt. Im Allgemeinen haben all die soweit beschriebenen Beispiele aber die gleiche Amin-Substitution bei allen Phosphoramidat-Bindungen in dem Oligomer eingebaut. Diese Studien haben die Durchführbarkeit der Verwendung der Phosphoramidat-Bindung als eine zusätzliche Stelle für den Einbau von diversen funktionellen Gruppen gezeigt. Eine breite Vielfalt von Aminen kann bei dem Oxidationsschritt verwendet werden, und die Monomere der vorliegenden Erfindung unterstützen die notwendige Chemie. Folglich werden für die Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken, die Phosphoramidat-Bindungen einbauen, die Monomere der vorliegenden Erfindung in die entsprechenden H-Phosphonat-Monoester umgwandelt. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dies unter Verwendung von PCl&sub3; und Imidazol als das Phosphitylierungsreagens verwirklicht (siehe Garegg, P. J., Regberg, T., Stawinski, J., Strömberg, R., Chem. Scr. 1986, 26, 59-62). Diese H-Phosphonat Monomere werden auf einem fetsen Träger durch Aktivierung mit Pivaloylchlorid, Adamantoylchlorid oder einem anderem geeigneten aktivierenden Mittel oligomerisiert. Das H-Phosphonat Diester-Intermediate werden zu den Phosphat Diestern unter Verwendung von Iod in wässerigem Pyridin in hohen Ausbeuten oxidiert. Dies ermöglicht einen Vergleich der Verbindungseffizienz des H-Phosphonat- und Phosphoramidit-Verfahrens. Im Wesentlichen wird die gleiche Verbindungseffizienz mit beiden Methodiken erreicht. Die H- Phosphonat Diester werden in Phosphoramidate durch Verwendung einer 10%igen Lösung des geeigneten Amins in Pyridin/CCl&sub4; (1 : 1) umgewandelt. Bei diesen Bedingungen wird ein H- Phosphonat Diester zu einem Phosphorylchlorid mittels einer Arbuzov Reaktion, gefolgt durch Verdrängung des Chlorids durch ein primäres oder sekundäres Amin, oxidiert. Es wurde gezeigt, dass der zweite Schritt bei einer breiten Anzahl von Aminen ziemlich allgemein abläuft, und zufriedenstellende Ausbeuten erzielt. Außerdem ist die Ausbeute an Phosphoramidat mit der Ausbeute an Phosphodiester vergleichbar.
  • Verschiedene Bibliotheksarten sind durch diese Methodik erhältlich. Die einfachste Art ist eine Bibliothek, die aus einem Satz von Monomeren der vorliegenden Erfindung (ein Satz von 4 bis 16 oder mehr Monomere wird typischerweise verwendet) von 2 bis 10 oder Längeneinheiten an Monomer hergestellt wird, die mit einem einzelnen Amin beim Phosphor substituiert sind. Diese Bibliotheken werden durch Split-Bead-Synthese hergestellt, die eher dem H-Phosphonat- Synthese-Protokoll als der Phosphoramidat-Chemie folgt. Die H-Phosphonat-Diester- Intermediate werden bis zum letzten Schritt intakt gelassen. An diesem Punkt werden die Oligomer-Bibliothek-Pools mit einer 10%igen Lösung des geeigneten primären oder sekundären Amin enthaltdem CCl&sub4;/Pyridin oxidiert. Dies hat zur Folge, dass alle Interrest-Bindungen zu Phosphoramidaten umgewandelt werden. Folglich ist die Bibliothek aus allen möglichen Sequenzen der Monomere zusammengesetzt, die in Untersätze getrennt werden, die bei einer feststehenden Position einzigartig sind, die durch eine konstante Phosphoramidat-Bindung miteinander verbunden werden. Es muss klar sein, dass die endgültigen Eigenschaften der Bibliothek durch die Wahl des in dem Oxidationsschritt verwendeten Amins bestimmt wird. Folglich können Wasserlöslichkeit, Pharmacokinetiken und Pharmacodynamiken der Bibliotheks- Komponenten durch die Wahl eines Amins moduliert werden. Es ist auch möglich, Oligomerbibliotheken mit gemischten Bindungen mit einer Oxidationsals Zwichenschritt herzustellen (siehe Gryaznov, S. M., Sokolava, N. I. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 3205-3208; Gryazriov, S. M., Porapov, V. K. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3715-3718; Farooqui, F., Sarin, P. S., Sun, D., Letsinger, R. L. Bioconjugate Chem., 1991, 2, 422-426; Iso, Y., Yoneda, F., Ikeda, H., Tanaka, K., Fuji, K. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 503-506). Folglich wird ein Abschnitt der Oligomerbibliothek durch H-Phosphonat-Chemie synthetisiert, der mit (R&sub2;NH, CCl&sub4;/Py oder 58, CS&sub2;/TEA oder H&sub2;O, CCl&sub4;/Py) oxidiert werden kann, und ein zweiter Abschnitt der Bibliothek wird mit einem zweiten Satz an Reagenzien synthetisiert und oxidiert. Dies bildet eine heterozygote Bibliothek, wobei ein Segment des Zufallsoligomers in jedem Untersatz eine unterschiedliche Bindung als der Rest des Moleküls aufweist. Durch Ausdehnung dieser Methodik ist es möglich, eine unterschiedliche Bindung an jeder Position der Oligomerbibliothek mittels eines unterschiedlichen Oxiadationsschrittes nach jeder Monomer-Kopplung einzubauen. Die Bindung kann durch Durchführung eines separaten Oxidationsschrittes auf einem Abschnitt auf dem H-Phosphonat Diesterverbundenen festen Träger, gefolgt durch "poolen" dieser Untersätze derart kombinatorisiert werden, dass die Monomerpositionen zufällig sind. Folglich kann jedes Monomer und die Bindung zwischen ihnen durch eine Split-Synthese-Strategie zufällig angeordnet werden.
  • Repräsentaitiv für die SURF-Strategie ist eine 2'-O-Methyl-Oligonucleotidbibliothek (siehe Ekker et al., ibid.) in der nachstehenden Tabelle I gezeigt. Tabelle I beschreibt die Auswahl eines 2'-O-Methyl-Oligonucleotids zur Bindung an ein RNA Hairpin. Die KD's, d. h. die Assoziationskonstanten, wurden durch Gel-Shift bestimmt. "X" wird verwendet, um die Position anzuzeigen, die variiert wird und Unterstreichen wird verwendet, um Positionen anzuzeigen, die während aufeinanderfolgenden Iterationen der SURF Stategie fixiert werden. TABELLE I KD(mM)
  • Diese SURF Strategie wurde nicht für Bibliotheken außer jenen verwendet, die natürlichvorkommende Nucleotide als Phosphodiester oder Phosphothioate als monomere Einheiten einsetzen. Andere kombinatorische Strategien wurden nur für Bibiliotheken verwendet, die Aminosäuren als monomere Einheiten einsetzen.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Einbau von monomeren Verbindungen mit Struktur I in der vorstehend beschriebenen SURF Strategie. Die funktionellen Gruppen, die diesen monomeren Einheiten anhängen, können in die Bibliotheken eingebaut werden, während die Vorteile von automatisierter Phophoramidit-Oligomer-Synthese beibehalten werden. Diese funktionellen Gruppen können Interaktionen der folgenden Arten verursachen: Wasserstoff- Bindung-Donor und -Acceptor, ionische, polare, hydrophobe, aromatische, und Elektronen- Donoren und Acceptoren. Bevorzugte funktionelle Gruppen schließen Aminoethyl-, Carboxyethyl-, Adenylmethyl-, Thyminylmethyl-, Imidazolylmethyl-, Benzyl-, Myristyl-, Isopropyl-, und Tetraethylenglycol-Gruppen ein.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die einfache Gestaltung der monomeren Einheiten der Erfindung die Verbindung von rationaler Medikamentengestaltung und Screen- Mechanismen für Tausende von Verbindungen ermöglicht. Dies wird durch Verwendung der Verbindungen der Erfindung in einem kombinatorischen Verfahren wie die SURF Strategien erreicht.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden funktionelle Gruppen, die den monomeren Verbindungen der Erfindung anhängen durch ihr Potential bezüglich der Wechselwirkung mit dem Enzym PLA&sub2;, und vorzugsweise der Hemmung, ausgewählt. Folglich können die Verbindungen der Erfindung für lokale und/oder systematische Behandlung von Entzündungskrankheiten einschließlich atopischer Dermatitis und entzündlicher Darmerkrankung verwendet werden. Durch Auswählen der funktionellen Gruppen kann ein Vorteil von der Bevorzugung der PLA&sub2; für anionische Vesikel gegenüber zwitterionischen Vesikeln gewonnen werden. Durch Auswählen des Grundgerüstes, das diese funktionellen Gruppen trägt, kann ein weiterer Vorteil aus dem Fakt gewonnen werden, dass das natürliche Substrat von PLA&sub2; eine Phosphat-Gruppe enthält. Folglich werden vorzugsweise Phosphodiester oder Phosphorothioat und andere Phosphat-verknüpfte Oligomere ausgewählt, die eine negativ geladene Verbindung zum Binden mit der positiv geladenen Grenzflächen-Bindungsstelle von PLA&sub2; bereitstellen.
  • Bestimmte Verbindungen der Erfindung schließen aromtische, funktionelle Gruppen ein, die das Anbinden an die Spalte des PLA&sub2;-Enzyms erleichtern. (siehe, Oinuma, et al., J. Med. Chem. 1991, 34, 2260; Marki, et al., Agents Actions 1993, 38, 202; und Tanaka, et al., J. Antibiotics 1992, 45, 1071). Benzyl- und 4-Hexylbenzyl-Gruppen sind bevorzugte aromatische Gruppen. Die Verbindungen der Erfindung können weiterhin hydrophobe funktionelle Gruppen wie Tetraethylengruppen einschließen. Weil das PLA&sub2;-Enzym einen hydrophoben Tunnel aufweist, wird angenommen, dass Hydrophobie eine wichtige Eigenschaft des Enzyms ist.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung, werden monomere Phosphoramidit- Verbindungen mit Struktur I in Bibliotheken von oligomeren Verbindungen aufgenommen und zunehmend weniger komplexe Untersätze von Oligomeren werden in kombinatorischen Screening-Verfahren wie das vorstehend beschriebene SURF Verfahren durch aufeinanderfolgende Durchgänge von Screens identifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek von oligomeren Verbindungen, die mit Aminoethyl-, Carboxyethyl-, Adenylmethyl-, Thyminylmethyl-, Tetraethylenglycol-, Imidazolylmethyl-, Benzyl-, Isopropyl-, Myristyl- oder 4- Hexylbenzyl-Gruppen funktionalisiert sind, hergestellt und auf Hemmung von- PLA&sub2;-Aktivität untersucht. Der PLA&sub2;-Assay kann unter Verwendung einer kombinatorischen Screening-Strategie wie die SURF Strategie durchgeführt werden. Für diesen Assay werden Oligomer-Bibliotheken auf Hemmung der Enzymaktivität von menschlichem PLA&sub2;-Typ II gescreent. Typischerweise enthalten diese Bibliotheken etwa 8000 verschiedene Verbindungen. Aufeinanderfolgende Iterationen des SURF Verfahrens werden durchgeführt, um einzelne Oligomere aus der Bibliothek auszuwählen. Die Bibliotheken können zusätzlich in anderen in vitro Assays gescreent werden, um ferner Hemmungsmechanismen zu bestimmen.
  • Nach Identifikation von Oligomeren in einer ersten Screening-Phase, können weitere Modifikationen in den Inhalten der Oligomerbibliotheken gemacht werden. Eine erste Screening-Iteration resultiert zum Beispiel in einer aktiven Verbindung, die eine Benzyl-Gruppe enthält, folglich kann dann dieser aromatische Rest bei aufeinanderfolgenden Iterationen des Screens unter Verwendung von substituierten Benzyl-Gruppen variiert werden. Auf diese Weise wird strukturelle Aktivität in einer stufenartigen Weise identifiziert, um wirksame Inhibitoren der enzymatischen Aktivität zu definieren.
  • Um die Identifikation eines festbindenden oligomeren PLA&sub2;-Inhibitors mittels kombinatorischen Zugangs zu maximieren, sind typischerweise eine Ansammlung von funktionellen Gruppen in einer Zufalls-Bibliothek enthalten. Die Oligomere sind in einer gleichen Weise zusammengesetzt, die analog zu der Oligonucleotid-Synthese durch Verknüpfung von monomeren Phosphoramidat-Einheiten ist, bei der die normale Nucleotid-Struktur durch diversere chemische Gruppen ersetzt ist. Bei einigen der monomeren Einheiten wurden die Nucleobasen von Nucleotiden beibehalten. Bei anderen werden die Nucleobasen mit anderen funktionellen Gruppen ausgetauscht, die ausgewählt sind, um andere Ligand-Ligand-Interaktionen bereitzustellen, als die, die durch die Nucleobasen bereitgestellt werden. Die Zucker-Hälfte eines normalen Nucleotids wird durch eine Alkylenglycol-Einheit, z. B. eine Ethylenglycol-Einheit, ausgetauscht, um ein einzigartiges Grundgerüst zu bilden. Diese Methodik schafft für eine konvergente Herstellung einer großen Anzahl von Monomeren, die eine breite Vielfalt von funktionellen Gruppen tragen. Gegebenenfalls werden funktionelle Gruppen mit basenlabilen Schutzgruppen geschützt, um eine Entschützung des Oligomers in einem Schritt nach Vollendung der Synthese zu ermöglichen.
  • Wie vorstehend vermerkt, können monomere Verbindungen mit Struktur I mit einer anderen verbunden werden, um homopolymere Strukturen zu bilden, oder sie können mit Nucleotiden und/oder anderen Hälften verknüpft werden, um heteropolymere Strukturen zu bilden. Zum Beispiel können heterozygote Strukturen gebildet werden, die einen bzw. eine oder mehrere Bereich(e) oder "Strecke(n)" der monomeren Einheiten der Erfindung einschließen, die mit einem bzw. einer oder mehreren Bereich(en) oder "Strecke(n)" von natürlich vorkommenden oder synthetischen Oligonucleotiden oder mit anderen synthetischen oder natürlichen oligomeren Verbindungen wie Peptide, Peptoide, Peptid-Nucleinsäuren, Oligo- und/oder Polysaccharide verbunden sind. Weiterhin können oligomere Verbindungen mit Struktur II in heterozygote Strukturen zusammen mit den Verbindungen eingebaut werden, die in der Patentanmeldung mit dem Titel "Oligonucleotide Mimics Having Nitrogen-Containing Linkages", die den Anwaltsaktenschwanz ISIS-1014 trägt, und in der Patentanmeldung mit dem Titel "Pyrrolidine-Containing Monomer and Oligomers" offenbart sind, die den Anwaltsaktenschwanz ISIS-1237 trägt. Die vorstehenden Patentanmeldungen sind gleichzeitig mit dieser Anmeldung eingereicht, öffentlich beigelegt, und hier durch Hinweis aufgenommen.
  • Bei der kombinatorischen Synthese von oligomeren Verbindungen der Erfindung werden die Monomere in Bibliotheken aufgenommen, einschließlich Bibliotheken, die zum Screening für PLA&sub2;-Hemmung geeignet sind. Die Bibliotheken sind weiterhin zum Screenen gegen andere interessante Ziele nützlich. Bei nicht-kombinatorischer Synthese von oligomeren Verbindungen der Erfindung werden die monomeren Einheiten in (einer) vorbestimmten Sequenz(en) unter Verwendung der normalen, für Oligonucleotid-Synthese verwendeten Standardbedingungen verbunden.
  • Um eine aktive Sequenz zu detektieren, die mittels eines kombinatorischen Verfahrens erzeugt wird, wird die Konzentration des aktiven Moleküls ausgewählt, um ausreichend groß zu sein, so dass das Molekül mit der Empfindlichkeit des gewählten Assays detektiert werden kann. Es muss klar sein, dass die Anzahl der einzigartigen Oligomer-Sequenzen innerhalb eines mittels einem kombinatorischen Verfahrens hergestellten Untersatzes von der Länge des Oligomers und der Anzahl von verschiedenen eingesetzten Monomeren abhängt. Die Anzahl an Sequenzen kann durch Erhöhung der Anzahl von Monomeren zu einer Menge, die gleich der Anzahl an Zufalls- Positionen ist, bestimmt werden. Dies ist in Tabelle II veranschaulicht. Tabelle II veranschaulicht auch die Konzentration von jeder Sequenz, wenn die Untersatz-Konzentration 100 um, eine typische Obertest-Konzentration, beträgt Wir haben festgestellt, dass die Anzahl von Monomeren und ihre Länge auf eine Bewertung der erwarteten IC&sub5;&sub0; (d. h. einer Konzentration, bei der 50% Enzymaktivität gehemmt wird) gestützt werden kann, die bei einer endgültigen oligomeren Verbindung wünschenswert ist. Für eine erwartete IC&sub5;&sub0; von 100 nm sind die in Tabelle II gezeigte Komplexitäten akzeptabel, das heißt, die in Tabelle II gezeigten Bibliotheken weisen die Komplexitäten auf, die Detektion einer einzigartigen Sequenz mit einem IC&sub5;&sub0; von etwa 100 nm oder weniger ermöglichen würden. TABELLE II Komplexität von Bibliotheken
  • Wenn fünf Monomere für die Bibliothek ausgewählt sind, dann wird die Bibliothek eine Länge von fünf Monomer-Einheiten; XNNNN, aufweisen, wobei N eine equimolare Mischung von Monomer-Einheiten ist und X eine andere Monomer-Einheit in jedem der fünf Untersätze ist. Zur Einfachheit bei der Synthese, kann die festgesetzte Position als das rechte Ende des Moleküls ausgewählt werden. Nach dem Assay zur Hemmung von PLA&sub2;-Aktivität, wie nachstehend beschrieben, ist die Position X mit dem Rest festgelegt, der die größte Hemmung ergibt und der nächste Untersatz wird synthetisiert und gescreent. Die feststehende Postion shiftet dann zu dem linken Ende des Oligomers, so dass Nicht-Randomisierung voranschreitet. Fünf Synthese- und Screening-Durchgänge sind erforderlich, um einen einzigartigen Inhibitor zu bestimmen.
  • Die Monomer-Einheiten der Verbindung sind verknüpft, um oligomere Verbindungen unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie zu bilden, die zur Standard-Synthese von Oligonucleotiden verwendet wird. Weil die Verknüfungsraten von funktionalisierten Alkylenglycol-Einheiten variieren können, kann die Reaktivität des individuellen Monomers eingestellt werden, so dass equimolarer Einbau von jedem Monomer bei jeder Zufalls-Position durchgeführt wird. Das Einstellen der Reaktivität der Monomere kann wie in den nachstehenden Beispielen durchgeführt werden. Ein weiteres Verfahren zum Durchführen solcher Einstellungen ist in der US Patentanmeldung mit dem Titel "Random Oligonucleotide Libraries and Methods Of Making The Same" offenbart, die den Anwaltsaktenschwanz ISIS-1009 trägt. Die vorstehende Patentanmeldung ist gleichzeitig mit dieser Anmeldung eingereicht worden, öffentlich beigelegt, und hier durch Hinweis aufgenommen.
  • Bei einer SURF Screening Strategie wird die Oligomermenge so ausgewählt, dass die Konzentration jedes Untersatzes in dem Anfangs-Screening-Durchgang relativ hoch ist (etwa 100 um). Es wird momentan bevorzugt, Oligomere unter Verwendung eines DNA Synthesizers zu synthetisieren. Bei solchen Synthesizern werden die Oligomere meist konventionell in einem 1 bis 4 umol Maßstab synthetisiert. Wenn die Konzentration eines Untersatzes von Bibliotheken bei etwa 100 um liegt, werden die Assays vorzugsweise mit einem kleinen Volumen von weniger als etwa 200 ul durchgeführt.
  • Beispielhafte Verbindungen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen veranschaulicht, die nicht als beschränkend angesehen werden sollen.
    • Beispiel 1 1-(1-Thymin)-2,3-propandiol
  • Zu einer gerührten Lösung aus Thymin (4,2 g, 33 mmol) in trockenem Dimethylformamid (DMF, 30 ml) wurde R-(+)-Glycidol (2,2 g, 30 mmol) und Kaliumcarbonat (50 mg, 0, 36 mmol) zugegeben. Die Suspension wurde fünf Stunden lang bei 80ºC erwärmt, anschließend abgedampft. Die Produkte wurden mit Methanol (25 ml) verdünnt und filtriert. Das Filtrat wurde abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Methanol (9 : 1, v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, lieferte das N(1)-substituierte, von N(1), N(3)-disubstituiertem freie Material, um 3,08 g (60%) zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 1,8 (s, 3, CH&sub3;); 3,35/bm, 3, CHOHCH&sub2;OH); 3,7 und 3,9 (2 m, 2, NCH&sub2;); 4,7 (bs, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,0 (bs, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,4 (s, 1, H-6); 11,2 (bs, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus). Ber. Anal. für C&sub8;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub4; (200.193): 47,99% C; 6,04% H; 13,99% N; gefunden: 47,35% C; 6,10% H; 13,67% N.
    • Beispiel 2 1-(1-Thymin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol
  • Zu einer gerührten Lösung aus 1-(1-Thymin)-2,3-propandiol (2,079 g; 12,4 mmol) in trockenem Pyridin (30 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (4,4 g; 13 mmol) zugegeben. Die Suspension wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (3/2/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 3,39 g (54%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 1,8 (CH&sub3;); 2,9 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,8 (s, 6, OCH&sub3;); 3,9 (m, 2, NCH&sub2;); 5,3 (d, 1, OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,9 (m, 4, Trityl); 7,3 (m, 9, Trityl); 11,2 (s, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus).
    • Beispiel 3 1-(1-Thymin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit] propan
  • Eine gerührte Lösung aus 1-(1-Thymin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (3,39 g; 6,7 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (2,4 ml; 14 mol) in trockenem THF (35 ml) wurde in einem Eisbad auf 10ºC gekühlt. Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (1,5 ml; 6,7 mmol) wurde zugegeben. Nach vier Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt; Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (1 : 1 : 1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 2,78 g (61%). ¹H-NMR (CD&sub3;CN): δ, 1,2 (m, 12, 6 CH&sub3;); 1,75 (d, 3, CH&sub3;); 2,45 und 2,6 (2t, 2, CH&sub2;ODMT); 3,8 (d, 6, OCH&sub3;); 6,9 und 7,3 (2 m, 14, Trityl); 9,3 (bs, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus). ¹³P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 150,19 und 150,66. Ber. Anal. für C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub7;N&sub4;O&sub7;P (702,786): 64,94% C; 6,74% H; 7,97% N; gefunden: 64,60% C; 6,91% H; 7,80 %N.
    • Beispiel 4 1-(1-Imidazol)-2,3-propandiol.
  • Eine schnell gerührte Lösung aus Imidazol (13,6 g; 0,2 mol) in DMF (250 ml) wurde mit pulverigem Kaliumcarbonat (12 g) behandelt und 30 Min. lang bei 70ºC erwärmt. Zu dieser Lösung wurde Glycidol (14,8 g; 0,2 mol) in einer Portion zugegeben und die Mischung wurde bei dieser Temperatur 36 Stunden lang gerührt. Die resultierende gelbe Suspension wurde filtriert und das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer abgedampft, um einen klaren roten Sirup zu ergeben. Der Sirup wurde mit Acetonitril (100 ml) abgezogen und dann auf einer 10,5 · 10 cm Kieselgel-Säule flash-chromatographiert. Eine Stufengradienten-Eluierung mit Ethylacetat-Methanol (9 : 1, 21, dann 4 : 1, 21) ergab das Imidazol-Produkt als einen amorphen Feststoff, 16 g, (56%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 7,55; 7,10 und 6,84 (35, 3, Imidazol); 5,08 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 4,85 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 4,05 und 3,83 (2dd, 2, CH&sub2;); 3,55 (m, 1, Methin); 3,30 und 3,18 (2m, 2CH&sub2;OH). Ber. Anal. für C&sub6;H&sub1;&sub0;N&sub2;O&sub2; (142,157): 50,69% C; 7,09% H; 19,71% N; gefunden: 50,59% C; 7,07% H; 19,59% N.
    • Beispiel 5 1-(1-Imidazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol
  • Zu einer gerührten Lösung aus 1-(1-Imidazol)-2,3-propandiol (1,0 g; 7,0 mmol) in trockenem Pyridin (15 ml) und trockenem DMF (15 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (2,61 g; 7,7 mmol) zugegeben. Die Suspension wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Ein zusätzliches Equivalent der Trityl-Verbindung (2,61 g; 7,7 mmol) wurde zugegeben. Das Rühren wurde für weitere 23 Stunden fortgesetzt und die Mischung wurde abgedampft. Der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Methanol : Ethylacetat : Triethylamin (1/19/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 432 mg (14%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 2,78; 2,95 (2m, 1, CH&sub2;ODMT); 3,7 (s, 6, 2OCH&sub3;); 3,85 (bm, 1CHOH); 3,95 und 4,1 (2m, 2NCH&sub2;); 5,25 (d, 1, OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,7 bis 7,5 (m, 13/3, DMT/Imidazol).
    • Beispiel 6 1-(1-Imidazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit] propan
  • Eine Lösung aus 1-(1-Imidazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (432 mg; 0,97 mmol) und N,N- Diisopropylethylamin (252 mg; 3,5 mmol) in trockenem DMF (35 ml) wurde in einem Eisbad auf 5ºC gekühlt. Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (233 mg; 1,1 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung wurde eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel- Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (7/3/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 498 mg (80%). ¹H- NMR (CD&sub3;CN); δ, 0,9 bis 1,2 (m, 12, CH&sub3;); 3,8 (d, 6, OCH&sub3;); 6,75 bis 7,5 (m, 13/3, ODMT, Imidazol). ³¹P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 149,83 und 150,68.
    • Beispiel 7 1-(1-Carbazol)-2,3-propandiol
  • Eine schnell gerührte Lösung aus Carbazol (14 g; 83 mmol) und R-(+)-Glycidol (6,20 g; 83 mmol) in wasserfreiem DMF (300 ml) wurde mit pulverigem Kaliumcarbonat (2,3 g) behandelt und 18 Std. lang bei 70ºC erwärmt. Die resultierende gelbe Suspension wurde filtriert und das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer abgedampft, um einen gelben Sirup zu ergeben. Der Sirup wurde mit Acetonitril (100 ml) abgezogen und dann auf einer 10,5 · 10 cm Kiselgel-Säule flashchromatographiert. Eluierung mit Ethylacetat ergab das Carbazol-Produkt als einen amorphen Feststoff, 8,25 g; (41%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 8,13; 7,60; 7,23 und 7,10 (4m, 8, Carbazol); 5,03 und 4,90 (25, 2, Hydroxyle, tauschen mit D&sub2;O aus); 4,47 und 4,27 (2dd, 2, CH&sub2;); 3,90 (m, 1, Methin); 3,40 (m, 2, CH&sub2;OH). Ber. Anal. für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub5;NO&sub2; (241,289): 74,66% C; 6,27% H; 5,80 % N; gefunden: 74,32% C; 6,25% H; 5,76% N.
    • Beispiel 8 1-(1-Carbazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol
  • Zu einer Lösung aus 1-(1-Carbazol)-2,3-propandiol (1,1 g; 4,5 mmol) in trockenem Pyridin (40 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,54 g; 4,5 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur drei Stunden lang gerührt und abgedampft. Der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (1/9/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 976 mg (39%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 2,9 bis 3,1 (2m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,7 (s, 6, 2 OCH&sub3;); 4,1 (m, 1, CHOH); 4,3 bis 4,5 (2m, 2, NCH&sub2;); 5,2 (d, 1, OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,8 bis 8,2 (m, 21, Carbazol und Trityl). Ber. Anal. für C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub3;NO&sub4; (543,661): 79,53% C; 6,12% H; 2,58% N; gefunden: 79,28% C; 6,34% H; 2,70% N.
    • Beispiel 9 1-(1-Carbazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino-2-cyanethoxyphosphit] propan
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (403 mg; 1,7 mmol) wurde zu einer Lösung aus 1-(1-Carbazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (916 mg; 1,7 mmol) und N,N- Diisopropylethylamin (445 mg; 3,4 mmol) in trockenem THF (40 ml) bei 5ºC zugegeben. Nach vier Stunden wurde die Reaktionsmischung abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel- Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (1/19/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 850 g (68%). ¹H- NMR (CD&sub3;CN); δ, 0,7 bis 1,05 (3d, 12CH&sub3;); 3,75 (d, 6, OCH&sub3;); 6, 7 bis 8,1 (m, 21, Carbazol und Trityl). ³¹P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 149,1 und 149,5. Ber. Anal. für C&sub4;&sub5;H&sub5;&sub0;N&sub3;O&sub5;P (743,881): 72,66% C; 6,77% H; 5,65% N; gefunden: 72,62% C; 6,76% H; 5,61% N.
    • Beispiel 10 1-(1-Uracil)-2,3-propandiol
  • Uracil (21,56 g; 192 mmol) wird in trockenem DMF (500 ml) unter Erwärmen gelöst und R-(+)- Glycidol (15,1 g; 203 mmol) wird zugegeben. Die Suspension wird bei 70ºC erwärmt. Nach vier Stunden wird die Reaktion abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel- Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Methanol (19/1, v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 15,62 g (44%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); δ, 3,35 (m, 3CHOHCH&sub2;OH); 3,7 und 3,9 (2m, 2, NCH&sub2;); 5,5 (m, 1 H-5); 7,5 (d, 1, H-6); 11,2 (bs, 1, NH).
    • Beispiel 11 1-(1-Uracil)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol
  • Dimethoxytritylchlorid (29,8 g; 88 mmol) wird zu einer Lösung aus 1-(1-Uracil)-2,3-propandiol (15,62 g; 84 mmol) in trockenem Pyridin (150 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird zweiundzwanzig Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (3/2/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 1,1 g (4%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); δ, 2,8 bis 3,0 (2m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,7 (s, 6, 2OCH&sub3;); 3,85 (m, 1, CHOH); 3,95 (m, 2, NCH&sub2;); 5,3 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,41 (d, 1, H-5); 6,85 (d, 4, Trityl); 7,3 und 7,4 (2m, 10, H-6 und Trityl); 11,2 (s, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus).
    • Beispiel 12 1-(1-Uracil)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit] propan
  • Eine gerührte Lösung aus 1-(1-Uracil)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (598 mg, 1,2 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (158 mg, 1,2 mmol) in trockenem THF (35 ml) wurde in einem Eisbad auf 10ºC gekühlt. Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (286 mg; 1,2 mmol) wurde zugegeben. Nach vier Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (1 : 1 : 1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 368 mg (42%). ¹H-NMR (CD&sub3;CN); δ, 1,2 (m, 12, CH&sub3;); 2,45 und 2,6 (2t, 2CH&sub2;ODMT); 3,8 (d, 6, OCH&sub3;); 6,9 und 7,3 (2m, 15, Trityl und H-6); 9,3 (bs, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus). ³¹P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 154,88 und 155,2.
    • Beispiel 13 1-[9-(N6-Benzoyl)adenin]-2,3-propandiol.
  • Zu einer gerührten Lösung aus Adenin (30,0 g; 0,22 mol) in trockenem DMF (500 ml) wurden R-(+)-Glycidol (22,0 ml; 0,33 mol) und Kaliumcarbonat (7,6 g; 55 mmol) zugegeben. Die Suspension wurde 20 Stunden lang bei 85ºC erwärmt und dann aufkonzenztriert. Der Rückstand wurde durch Kristallisation aus Methanol gereinigt, um 18,1 g (39%) Intermediat 1-(9-Adenin)- 2,3-propandiol zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d6); δ, 3,3 bis 3,4 (m, 2, CH&sub2;OH); 3,8 bis 3,9 (m, 1, CHOH); 3,9 bis 4,1 und 4,3 bis 4,4 (2m, 2NCH&sub2;); 4,8 bis 4,9 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,1 bis 5,2 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,3 (s, 2, NH&sub2;, tauscht mit D&sub2;O aus); 8,0 und 8,1 (2s, 2, C(2)-H, C(8)-H). Ber. Anal. für C&sub8;H&sub1;&sub1;N&sub5;O&sub2; (209,207): 45.93% C; 5,30% H; 33,48% N; gefunden: 45,81% C; 5,42% H; 32,93% N.
  • Zu einer Lösung aus 1-(9-Adenin)-2,3-propandiol (18,0 g; 86,0 mmol) wurde bei 0ºC Chlortrimethylsilan (32,7 ml; 257 mmol) zugegeben. Nach 15 Minuten wurde Benzoylchlorid (30,0 ml; 259 mmol) zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und 100 ml kaltes Wasser wurde zugegeben. Nach 15 Minuten wurde 100 ml kaltes konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben. Nach einer Stunde Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel- Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Methanol : Ethylacetat (1/10, v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 4,1 g (14,8%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 3,3 bis 3,5 (m, 2, CH&sub2;OH); 3,8 bis 4,0 (m, 1, CHOH); 4,1 bis 4,2 und 4, 4 bis 4,5 (2m, 2NCH&sub2;); 4,9 bis 5,0 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,2 bis 5,3 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,4 bis 8,2 (2m, 5, Benzoyl); 8,4 bis 8,8 (2s, 2, C(2)-H, C(8)-H); 11,2 (bs, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus). Ber. Anal. für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub5;N&sub5;O&sub3; (313,315): 57,50% C; 4,82% H; 22,35% N; gefunden: 57,24 5% C; 4,81% H; 21,97% N.
    • Beispiel 14 1-[9-(N6-Benzoyl)adenin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol.
  • Zu einer Lösung aus 1-[9-(N6-Benzoyl)adenin]-2,3-propandiol (4,0 g; 13 mmol) in wasserfreiem Pyridin (50 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (4,7 g; 14 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Methanol (5 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (2/8/,1; v/v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 4,2 g (53%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 2,9 bis 3,1 (2m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,7 bis 3,8 (s, 6, OCH&sub3;), 4,1 bis 4,6 (m, 3, NCH&sub2;CHOH); 5,4 bis 5,5 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,8 bis 8,2 (4m, 18, Trityl, Benzoyl); 8,3 bis 8,8 (2s, 2, C(2)- H, C(8)-H); 11,2 (bs, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus).
    • Beispiel 15 1-[9-(N6-Benzoyl)adenin]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphite]propan
  • Zu einer Lösung aus 1-[9-(N6-Benzoyl)adenin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (4,2 g; 6,8 mmol) in wasserfreiem THF (50 ml) wurden Diisopropylethylamin (2,9 ml) und Chlor-β- cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphine (1,5 ml; 6,7 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Rückstand wurde abgedampft und durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (2/8/,1; v/v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 4,54 g (82%). ¹H-NMR (CD&sub3;CN); δ, 0,9-1,1 (m, 12, CH&sub3;); 2,4 bis 2,6 (m, 2, CH&sub2;CN); 3 bis 3,2 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,4 bis 3,7 (m, 3, OCH&sub2;CH&sub2;CN, (CH&sub3;)&sub2;CH); 3,7 bis 3,8 (d, 6, OCH&sub3;); 4,3 bis 4,6 (m, 3, NCH&sub2;CHOH); 6,8 bis 7,7 (3 m, 18, Trityl, Benzoyl); 7,9 bis 8,8 (2d, 2, C(2)-H, C(8)- H). ³¹P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 149,80 und 150,75.
    • Beispiel 16 1-[9-(2-Amino-6-chlor)purin]-2,3-propandiol.
  • Zu einer Lösung aus 2-Amino-6-Chlorpurin (21,3 g; 125 mmol) in 200 ml wasserfreiem THF wurden R-(+)-Glycidol (14,0 g; 187 mmol) und Kaliumcarbonat (3,5 g, 25 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei 85ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert.
  • Das Filtrat wurde abgedampft und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat/Methanol (9/1, v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 11,74 g (38%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); δ, 3,2 bis 3,5 (m, 2, CH&sub2;OH); 3,7 bis 5,3 (2m, 3, NCH&sub2;CHOH); 4,8 bis 4,9 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,2 bis 5,3 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,8 bis 6,9 (s, 2, NHZ, tauscht mit D&sub2;O aus); 8,0 (s, 1, C(8)H). Ber. Anal. für C&sub8;H&sub1;&sub0;N&sub5;O&sub2;Cl (243,652): 39,44% C; 4,14% H; 28,74% N; gefunden: 39,41% C; 4,12% H; 28,45% N.
    • Beispiel 17 1-(9-Guanin)-2,3-propandiol.
  • 1-[9-(2-Amino-6-chlor)purin]-2,3-propandiol (2,62 g; 11 mmol) wird in 1N HCl (wässr., 100 ml) 3 Stunden lang bei 85ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eisbad gekühlt und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid basisch auf pH 10 gebracht. Das Produkt wurde als ein kristalliner Feststoff abfiltriert. Die Ausbeute betrug 2,04 g (84%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); δ, 3,2 bis 3,4 (m, 2, CH&sub2;OH); 3,7 bis 4,2 (m, 3, NCH&sub2;CHOH); 4,7 bis 4,9 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,1 bis 5,2 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,6 (s, 2, NH&sub2;, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,7 (s, 1, C(8)-H); 10,7 (s, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus). Ber. Anal. für C&sub8;H&sub1;&sub1;N&sub5;O&sub3;(225,207): 42,67% C; 4,92% H; 31,10% N; gefunden: 42,28% C; 4,88% H; 30,85% N.
    • Beispiel 18 1-[9-(N2-Isobutyryl)guanin]-2,3-propandiol.
  • Zu einer Lösung aus 1-(9-Guanin)-2,3-propandiol (17,0 g, 75,5 mmol) in Pyridin (400 ml) wurde Chlortrimethylsilan (28,6 mol; 225 mmol) bei 0ºC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten lang bei 0ºC und anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde wieder auf 0ºC gekühlt und Isobutyrylchlorid (23,7 ml, 226 mmol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde auf 0ºC gekühlt und 100 ml Eiswasser wurde zugegeben, gefolgt von 100 ml eiskaltem Ammoniumhydroxid nach 15 Minuten. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, fast bis zur Trockne eingedampft, und Methanol wurde zugegeben, um unerwünschte Nebenprodukte auszufällen und filtriert. Das Filtrat wurde abgedampft und der Rückstand durch Kieselgel- Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat/Methanol (9/1 v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 13,8 g (62%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); δ, 1 bis 1,2 (d, 6, CH&sub3;); 2,7 bis 2,9 (m, 1, COCH); 3,3 bis 3,5 (m, 2, CH&sub2;H); 3,8 bis 3,9 (m, 1, CHOH); 3,9 bis 4,3 (2m, 2, NCH&sub2;); 4,8 bis 4,9 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,1 bis 5,2 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,9 (s, 1, C(8)-H); 11,6 bis 12,2 (2s, 2, NH, CONH, beide tauschen mit D&sub2;O aus). Ber. Anal. für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub7;N&sub5;O&sub4; (295,297): 48,81% C; 5,80 % H; 23,72% N; gefunden: 48,36% C; 5,62% H; 23,10% N.
    • Beispiel 19 1-[9-(N2-Isobutyryl)guanin-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol.
  • Zu einer Suspension aus 1-[9-(N2-Isobutyryl)guanin-2,3-propändiol (5,3 g; 18 mmol) in Pyridin (100 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (6,69 g; 20 mmol) zugegeben. Der Reaktionsmischung wurde ermöglicht, 4 Stunden bei Raumtemperatur zu rühren. Nach quenchen mit Methanol wurde die Mischung abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel- Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Methanol/Ethylacetat/Triethylamin (5/95/1, %/%/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 4,9 g (45%). ¹H-NMR (DMSO d&sub6;); δ, 1,1 bis 1,2 (d, 6, CH&sub3;); 2,7 bis 3,1 (m, 3, CH&sub2;ODMT, COCH); 3,7 bis 3,9 (s, 6, OCH&sub3;); 4,1 bis 4,3 (m, 3, NCH&sub2;CHOH); 5,4 bis 5,5 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,7 bis 8,0 (m, 14, Trityl, C(8)-H); 11,5 bis 12 (2bs, 2, NH, CONH, beide tauschen mit D&sub2;O aus).
    • Beispiel 20 1-[9-(N-Isobutyryl)guanin]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Zu einer Lösung aus 1-[9-(N2-Isobutyryl)guanin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (13,12 g; 22 mmol) und Diisopropylethylamin (10 ml) in THF (200 ml) wurde, bei 0ºC, Chlor-β-cyanethoxy- N,N-diisopropylaminophosphin (5,6 ml; 25 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde aufkonzentriert und der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat mit 1% Triethylamin, sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 8,62 g (49%). ¹H-NMR (CD&sub3;CN); δ, 1,0 bis 1,2 (m, 18, CH&sub3;); 2,4 bis 2,8 (m, 2, CH&sub2;CN); 2,8 bis 3,0 (m, 1, COCH); 3,1 bis 3,3 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3, 4 bis 3,8 (m, 9, OCH&sub2;CH&sub2;CN, (CH&sub3;)&sub2;CH, OCH&sub3;); 4,2 bis 4,4 (m, 3, NCH&sub2;CHO); 6,7 bis 7,7 (m, 14, Trityl, C(8)-H); 12,3 (bs, 2, NH, CONH, beide tauschen mit D&sub2;O aus). ³¹P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 150,15 und 150,48.
    • Beispiel 21 1-(1-Cytosin)-2,3-propandiol
  • Eine Lösung aus Cytosin (11,0 g; 99 mmol), R-(+)-Glycidol (8, 9 g; 120 mmol), und Kaliumcarbonat (6,9 g, 50 mmol) in DMF (300 ml) wurde bei 85ºC 22 Stunden lang gerührt: Die rohe Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat abgedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol auskristallisiert, um eine Ausbeute von 10,5 g (57%) zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO d&sub6;); δ, 3,2 bis 3,5 (m, 3, CHOHCH&sub2;OH); 3,6 bis 3,7 (m, 1, NCH&sub2;); 3,8 bis 4,0 (dd, 1, NCH&sub2;); 4,7 bis 4,8 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 4,9 bis 5,1 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,6 bis 5,7 (d, 1, C(5)-H); 7,0 bis 7,1 (bs, 2, NH&sub2;, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,4 bis 7,5 (d, 1, C(6)-H).
    • Beispiel 22 1-[1-(N4-Benzoyl)cytosin]-2,3-propandiol
  • Zu einer eisgekühlten Suspension aus 1-(1-Cytosin)-2,3-propandiol (11,11 g; 60 mmol) in Pyridin (400 ml) wurde Chlortrimethylsilan zugegeben. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang bei Eisbadtemperatur gerührt. Benzoylchlorid wurde zugegeben und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und eiskaltes Wasser (100 ml) wurde zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren wurde eiskaltes Ammoniumhydroxid (100 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten lang gerührt und aufkonzentriert. Wasser (400 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde fast bis zum Sieden erwärmt. Das gewünschte Produkt wurde als Feststoff filtriert. Nach Trocknung betrug die Ausbeute 15,31 g (88%). ¹H-NMR (DMSO d&sub6;); δ, 3,3 bis 3,6 (m, 3, CHOHCH&sub2;OH); 3,7 bis 3,9 (bs, 1, NCH&sub2;); 4,1 bis 4,3 (d, 1, NCH&sub2;); 4,7 bis 4,9 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 5,1 (d, 1, CHOH tauscht mit D&sub2;O aus); 7,2 bis 7,3 (d, 1, C(5)-H); 7,5 bis 7,7 (m, 3, Benzoyl); 8,0 bis 8,1 (d, 3, C(6)-H, Benzoyl); 10,5 bis 11 (bs, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus).
    • Beispiel 23 1-[1-(N4-Benzoyl)cytosin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol.
  • Eine Lösung aus 1-[1-(N4-Benzoyl)cytosin-2,3-propandiol (7,0 g; 24 mmol) und 4,4'- Dimethoxytritylchlorid (9,84 g; 29 mmol) in Pyridin (100 ml) wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (6/4/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von (52%). ¹H-NMR (DMSO d&sub6;); δ, 2,9 bis 3,1 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,6 bis 3,9 (m, 7, OCH&sub3;, CHOH); 4 bis 4,3 (2m, 2, NCH&sub2;); 5,3 bis 5,4 (d, 1, OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 6,8 bis 8,2 (3m, 20, Trityl; Benzoyl, C(5)-H, C(6)-H); 11,2 (s, 1, NH, tauscht mit D&sub2;O aus).
    • Beispiel 24 1-[1-(N4-Benzoyl)cytosin]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Zu einer Lösung aus 1-[1-(N4-Benzoyl)cytosin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (7,48 g; 13 mmol) und Diisopropylethylamin (5,5 ml) in THF (50 ml) wurde Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin (3,2 ml; 14 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (1/1/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 5,7 g (57%). ¹H-NMR (CD&sub3;CN); δ, 1 bis 1,2 (m, 12, CH&sub3;); 2,4 bis 2,7 (2t, 2, CH&sub2;CN); 3,1 bis 3,3 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,5 bis 4,0 (m, 11, OCH&sub2;CH&sub2;CN, CH(CH&sub3;)&sub2;, OCH&sub3;, NCH&sub2;CH); 4,1 bis 4,4 (m, 2, NCH&sub2;); 6,6 bis 8,0 (m, 20, Trityl, Benzoyl, C(5)-H, C(6)-H). ³¹P-NMR (CD&sub3;CN); δ, 154,5 und 155,1.
    • Beispiel 25 1-O-Dimethoxytritylglycidol.
  • Glycidol (4,4 ml; 67 mmol) und Triethylamin (19 ml; 136 mmol) wurden in 120 ml wasserfreiem Dichlormethan gerührt. Dimethoxytritylchlorid (22,7 g; 67 mmol) wurde zugegeben und die Mischung wurde 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und mit Wasser und anschließend mit Kochsalzlösung gewaschen. Grobes Kieselgel wurde zugegeben und das Material wurde abgedampft. Dieses Material wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Hexan : Ethylacetat : Triethylamin (19/1/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 16,6 g (65%). ¹H-NMR (DMSO d&sub6;); δ, 2,6 bis 2,9 (2t, 2 Ring-CH&sub2;); 3,1 bis 3,2 (m, 1, CH); 3,2 bis 3,4 (2m, 2, CH&sub2;); 3,7 (s, 1, OCH&sub3;); 6,8 bis 7,4 (3 m, 13, Trityl).
    • Beispiel 26 1-O-Dimethoxytrityl-4-phenyl-2-butanol
  • Benzylmagnesiumchlorid (55 ml; 2M Lösung; 110 mmol) wurde auf -78ºC gekühlt und zu einer Lösung aus Dilithiumtetrachlorcuprat (11 ml; 0,1 M Lösung; 12 mmol) in THF (200 ml) bei - 78ºC zugegeben. Zu dieser Mischung wurde 1-O-Dimethoxytritylglycidol (8,28 g, 22 mmol) in THF (20 ml) bei -78ºC zugegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und konzentriertes Ammoniumchlorid (10 ml) wurde langsam zugegeben. Die Mischung wurde mit Wassser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan (1 : 9, v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und aufkonzentrieren, ergab eine Ausbeute von 1,37 g (17%). ¹H-NMR (CDCl&sub3;); δ, 1,6 bis 1,8 (m, 2, C&sub6;H&sub5;CH&sub2;); 2,3 bis 2,4 (d, 1, OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 2,5 bis 2,8 (m, 2, CH&sub2;CHOH); 3,0 bis 3,2 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,8 (s, 6, OCH&sub3;); 6,8 bis 7,5 (m, 18, Trityl und Phenyl).
    • Beispiel 27 1-O-Dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]-4-phenylbutan
  • 1-O-Dimethoxytrityl-4-phenyl-2-butanol (1,37 g; 2,9 mmol) und Diisopropylethylamin (1,5 ml; 8,6 mmol) wurden in THF (35 ml) gerührt und Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin (0,65 ml; 2,9 mmol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und filtriert. Das Material wurde auf grobem Kieselgel aufkonzentriert und getrocknet. Das Material wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Hexan : Triethylamin (1 : 9 : 1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 0,94 g (49%). ¹H-NMR (CDCl&sub3;); δ, 1,0 bis 1,3 (m, 12, CH&sub3;); 1,8 bis 2,1 (m, 2, C&sub6;H&sub5;CH&sub2;); 2,3 bis 2,8 (2m, 4, CH&sub2;CN, C&sub6;H&sub5;CH&sub2;CH&sub2;); 3,0 bis 3,3 (2m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,5 bis 3,9 (m, 10, CH(CH&sub3;)&sub2;, POCH&sub2;, OCH&sub3;); 3,9 bis 4,2 (m, 1, CH&sub2;CH); 6,8 bis 7,5 (3m, 18, Phenyl und Trityl). ³¹P-NMR (CDCl&sub3;); δ, 148,48 und 148,69.
    • Beispiel 28 1-Dimethoxytrityl-2-undecanol
  • Octylmagnesiumchlorid (9,4 ml; 2 M Lösung; 18,8 mmol) wurde zu einer Lösung aus Dilithiumtetrachlorcuprat (1,9 ml; 0,1 M Lösung; 0,11 mmol) in wasserfreiem THF (15 ml) bei -78ºC zugegeben. 1-O-Dimethoxytritylglycidol wurde zugegeben und der Mischung wird ermöglicht, sich auf Raumtemperatur zu erwärmen und 2 Stunden lang zu rühren. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und gesättigtes Ammoniumchlorid wurde zugegeben. Wasser wurde zugegeben und die Mischung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Dieses Material wurde filtriert und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat/Hexan/Triethylamin (5/95/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 1,1 g (60%). ¹H-NMR (CDCl&sub3;); δ, 0,8 bis 0,9 (t, 3, CH&sub3;); 1,2 bis 1,4 (m, 16, (CH&sub2;)&sub7;CH&sub2;); 2,3 bis 2,4 (d, 1, OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 3,0 bis 3,2 (m, 2, CH&sub2;ODMT); 3,7 bis 3,9 (s, 7, OCH&sub3;, CHOH); 6,8 bis 7,5 (m, 14, DMT).
    • Beispiel 29 1-Dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]undecan
  • Eine Mischung aus HPLC-gereinigtem 1-Dimethoxytrityl-2-undecanol (1,06 g; 2,2 mmol), Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (0,5 ml; 2,2 mmol), und Triethylamin (1,0 ml; 5,7 mmol) in THF (50 ml) wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde aufkonzentriert und durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat/Hexan/Triethylamin (1/9/1, v/v/%), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab die Titelverbindung.
    • Beispiel 30 Fluorenylsuccinsäure-Halbester
  • Zu einer Lösung aus 9-Fluorenylmethanol (3,29 g; 20 mmol), Succinsäureanhydrid (2,20 g; 22 mmol), und 4-Dimethylaminopyridin (0,25 g; 2 mmol) in Dichlormethan (25 ml) wurde Triethylamin (3 ml) zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit Dichlormethan (50 ml) verdünnt und mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat (3 · 50 ml) extrahiert Die vereinigten Extrakte wurden mit Ethylacetat zurückextrahiert. Die resultierende Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurde mit 3N HCl angesäuert und gekühlt. Ein Niederschlag fiel aus der Lösung aus, der nach Trocknen 3,05 g (56%) der Titelverbindung ergab.
    • Beispiel 31 Fluorenyl-[N-(amino-2,3-propandiol)]succinimid-Halbester
  • Zu einer aus Fluorenylsuccinsäure-Halbester (3,05 g; 11,24 mmol) in DMF (50 ml) wurden 1- Hydroxybenzotriazol (2,28 g; 16,86 mmol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid- HCl (3,23 g; 16,84 mmol) sequentiell zugegeben. Die Mischung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und durch eine Kanüle in einen Kolben überführt, der 1-Amino-2,3- propandiol (1,02 g; 11,24 mmol) enthielt. Die Reaktion wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde aufkonzentriert und zwischen Ethylacetat (100 ml) und Wasser (50 ml) vergeteilt. Die Phasen wurden getrennt und die wässerige Phase wurde mit Ethylacetat (3 · 50 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz); δ, 7,8 bis 7,26 (8H, m, ArH); 4,43 (2H, d, J = 6,5 Hz; CHCH&sub2;OCO); 4,23 (1H, t, J = 6,5 Hz; CHCH&sub2;OCO); 2,70 (4H, s, OCOCH&sub2;CH&sub2;COO).
    • Beispiel 32 Fluorenyl-[N-(1-amino-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol)succinimid]-Halbester
  • Eine Lösung aus Fluorenyl-[N-(2,3-propandiol)]succinimid-Halbester (0,74 g; 2,0 mmol) in Pyridin (20 ml) wurde mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,68 g; 2,0 mmol) behandelt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dünnschicht-Chromatographie-Analyse des Produkts zeigt komplette Umwandlung zu einem höher laufenden Punkt, der die charakteristische rote Farbe ergibt, wenn er mit 10% Schwefelsäure in Methanol besprüht und erwärmt wird.
    • Beispiel 33 Fluorenyl-N-{3-0-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan}succinimidester
  • Die Titelverbindung wird aus Fluorenyl-[N-(3-O-dimethoxytrityl-2-propanol)]succinimid- Halbester unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 27 hergestellt.
    • Beispiel 34 1-[(N-Benzoyl)amino]-2,3-propandiol.
  • R-(+)-Glycidol (10 ml; 0,15 mmol) und mit Ammoniak gesättigter Isopropylalkohol (70 ml) wurden in einer Bombe verschlossen und bei Raumtemperatur 5 Tage lang gerührt. Die Bombe wurde gekühlt und geöffnet. Die Lösung wurde abgedampft und der Rückstandd in Pyridin (100 ml) gelöst. Diese Lösung wurde Minuten lang mit Benzoylchlorid behandelt und filtriert. Das Filtrat wurde abgedampft und in Methanol (400 ml) gelöst, anschließend mit Ammoniumhydroxid behandelt. Die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt. Eluieren mit Ethylacetat : Methanol (19/1, v/v), sammeln der geeigneten Fraktionen und abdampfen, ergab eine Ausbeute von 9,9 g (34%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); δ, 3,1 bis 3,5 (m, 4, CH&sub2;CHOHCH&sub2;OH); 3,6 bis 3,7 (m, 1, CHOH); 4,6 bis 4,7 (t, 1, CH&sub2;OH, tauscht mit D&sub2;O aus); 4,8 bis 4,9 (d, 1, CHOH, tauscht mit D&sub2;O aus); 7,4 bis 7,6 und 7,8 bis 7,9 (m, 5, Benzoyl); 8,4 bis 8,5 (t, 1, NH).
    • Beispiel 35 1-[(N-Benzoyl)amino]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 1-[(N-Benzoyl)amino]-2,3-propandiol wird nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-[(N-Benzoyl)amino]-3-O-dimethoxytrityl-2- propanol zu ergeben. Das resultierende 1-[(N-Benzoyl)amino]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 36 1-(1-Pyrrol)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Pyrrol wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(1H-Pyrrol)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(1H-Pyrrol)- 2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(1-Pyrrol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(1-Pyrrol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 37 1-(10-Phenoxazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-](N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Phenoxazin wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(1-Phenoxazin)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(1- Phenoxazin)-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(1-Phenoxazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(1-Phenoxazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 38 1-(1-Pyrazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Pyrazol wird mit nach Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(1-Pyrazol)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(1-Pyrazol)- 2,3-propandiol wird weiterhin mit dem Verfahren von Beispiel 5 nach Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(1-Pyrazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(1-Pyrazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy- N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 39 1-(1-Indol)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Indol wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(1-Indol)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(1-Indol)-2,3- propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(1-Indol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1- (1-Indol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 40 1-(1-Indazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 1H-Indazol wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(1H-Indazol)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(1H- Indazol)-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(1-Indazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben.
  • Das resultierende 1-(1-Indazol)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β- cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 41 1-(9-Purin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Purin wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(9-Purin)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(9-Purin)-2,3- propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(9-Purin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1- (9-Purin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 42 1-(10-Phenothiazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Phenothiazin wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(10-Phenothiazin)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1- (10-Phenothiazin)-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(10-Phenothiazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(10-Phenothiazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 43 1-(9-β-Carbolin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • β-Carbolin wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(9-β-Carbolin)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-(9-β- Carbolin)-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(9-β-Carbolin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(9-β-Carbolin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β- cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 44 1-(10-Phenothiazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Phenothiazin wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(10-Phenothiazin)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1- (10-Phenothiazin)-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(10-Phenothiazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(10-Phenothiazin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 6 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 45 1-[1-(5-Propynyl)uracil]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 5-Propynyluracil wird nach dem Verfahren von Beispiel 9 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-[1-(5-Propynyl)uracil]-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-[1-(5-Propynyl)uracil]-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 10 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-[1-(5-Propynyl)uracil]-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-[1-(5-Propynyl)uracil]-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 11 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 46 1-[1-(6-Aza)thymin]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 6-Azathymin wird nach dem Verfahren von Beispiel 1 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-[1-(6-Aza)thymin]-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1- [1-(6-Aza)thymin]-2,3-propandiol wird weiterhin wie in Beispiel 2 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-[1-(6-Aza)thymin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-[1-(6-Aza)thymin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β- cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 3 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 47 1-(9-Hypoxanthin)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Hypoxanthin wird nach dem Verfahren von Beispiel 1 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-(Hypoxanthin-9-yl)-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1- (9-Hypoxanthin)-2,3-propandiol wird weiterhih wie in Beispiel 2 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-(9-Hypoxanthin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-(9-Hypoxanthin)-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird weiterhin mit Chlor-β- cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 3 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 48 1-[9-(2,6-Diamino)purin]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 2,6-Diaminopurin wird nach dem Verfahren von Beispiel 16 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-[9-(2,6-Diamino)purin]-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-[9-(2,6-Diamino)purin]-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 18 durch Behandlung mit Chlortrimethylsilan und Isobutyrylchlorid geschützt, um 1-[9- (N2,N6-Diisobuturyl-2,6-diamino)purin]-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-[9- (N2,N6-Diisobuturyl-2,6-diamino)purin]-2,3-propandiol wird wie in Beispiel 19 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-[9-(N2,N6-Diisobuturyl-2,6-diamino)purin]-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol zu ergeben. Das resultierende 1-[9-(N2,N6-Diisobuturyl-2,6- diamino)purin]-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol wird dann mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 24 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 49 1-[9-(7-Methylguanin)]-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 7-Methylguanin wird nach dem Verfahren von Beispiel 16 mit Glycidol in der Gegenwart von Kaliumcarbonat behandelt, um 1-[9-(7-Methylguanin)]-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-[9-(7-Methylguanin)]-2,3-propandiol wird weiterhin nach dem Verfahren von Beispiel 18 durch Behandlung mit Chlortrimethylsilan und Isobutyrylchlorid geschützt, um 1-[9-(N2- Isobuturyl)-(7-methylguanin)]-2,3-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-[9-(N2- Isobuturyl)-(7-methylguanin)]-2,3-propandiol wird wie in Beispiel 19 mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 1-[9-(N2-Isobuturyl)-(7-Methylguanin)]-3-O-dimethoxytrityl-2- propanol zu ergeben. Das resultierende 1-[9-(N2-Isobuturyl)-(7-methylguanin)]-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol wird dann mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 50 N-(α-Fmoc)-N'-(amino-2,3-propandiol)glycinamid
  • Eine Lösung von N-α-Fmoc-glycin-pentafluorphenylester (4,0 g; 8,6 mmol) in trockenem Dimethylformamid wurde mit 1-Amino-2,3-propandiol (0,78 g; 8,6 mmol) unter einer Argonatmosphäre behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 6 Std. lang gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der resultierende Sirup wurde über Nacht im Vakuum gehalten und dann in 40 ml heißem Ethylacetat gelöst. Die heiße Lösung wurde filtriert, und das Filtrat auf -20ºC gekühlt und über Nacht im Eisbad gehalten. Das Material, das auskristallisierte, wurde filtriert, mit kaltem Ethylacetat gewaschen und das Filtrat zu einem minimalen Volumen abgedampft. Eine zweite Inkubation bei dieser Temperatur ergab eine zweite Ausbeute an Kristallen. Die Ausbeute an weißen Kristallen beträgt 2,2 g (69%). ¹H-NMR (Dimethylsulfoxid-d&sub6;): 8,0-7,2 (m, 8, Aromat); 5,0-4,5 (m, 4, N-H und OH, austauschbar mit D&sub2;O); 4,3 (m, 3, Fmoc); 3,7 (m, 2, Glycin); 3,5-3,0 (m, 5, Propan).
    • Beispiel 51 N-(α-Fmoc)-N'-{3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]aminopropan}glycinamid
  • Eine Lösung aus N-(α-Fmoc)-N'-(amino-2,3-propandiol)glycinamid (2,0 mmol) in Pyridin (20 ml) wird mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,68 g; 2,0 mmol) nach dem Verfahren von Beispiel 32 behandelt. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um N-(α-Fmoc)-N'-(1- amino-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol)glycinamid zu ergeben, das durch Kieselgel- Chromatographie isoliert wird. Das resultierende N-(α-Fmoc)-N'-(1-amino-3-O-dimethoxytrityl- 2-propanol)glycinamid wird nach dem Verfahren von Beispiel 27 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 52 1-Dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]heptadecan
  • Dodecylbromid wird mit metallischem Magnesium in Diethylether zur Reaktion gebracht, um Dodecylmagnesiumbromid zu ergeben. Das Dodecylmagnesiumbromid wird mit 1-O- Dimethoxytritylglycidol (siehe Beispiel 25) in THF in der Gegenwart von Dilithiumtetrachlorcuprat zur Reaktion gebracht, um 1-Dimethoxytrityl-2-heptadecanol zu ergeben. Das resultierende 1-Dimethoxytrityl-2-heptadecanol wird mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin in der Gegenwart von Diisopropylethylamin in THF zur Reaktion gebracht, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 53 1-Amino-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol
  • 1-O-Dimethoxytritylglycidol (aus Beispiel 25; 10 ml; 0,15 mol) und mit Ammoniak gesättigter Isopropylalkohol (70 ml) werden in einer Bombe verschlossen und bei Raumtemperatur 5 Tage lang gerührt. Die Bombe wird gekühlt, geöffnet und die Lösung abgedampft, um das Rohprodukt zu ergeben.
    • Beispiel 54 1-[(N-Palmitoyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • 1-Amino-3-O-dimethoxytrityl-2-propanol (aus Beispiel 53) wird in 5 ml trockenem Pyridin gelöst und Chlortrimethylsilan (0,227 ml; 194 mg; 1,79 mmol) wird unter Rühren in 1 Stunde zugegeben. Palmitinsäure (359 mg; 1,40 mmol), Hydroxybenzotriazol (209 mg; 1,55 mmol) und Dimethylaminopropylethylcarbodiimid (EDC) (281 mg; 1,80 mmol) werden in 5 ml DMF (wenn erforderlich, werden 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; Co-Lösungsmittel zugegeben) und 1 Stunde lang gerührt. Diese Lösung wird dann zu der Pyridin-Lösung des rohen 1-Amino-3-O-dimethoxytrityl-2-propanols zugegeben, und die Lösung wird bis zum vollständigen Verschwinden des Ausgangsmaterials gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 ml gesättigter NaHCO&sub3; gestoppt und nach 15 Min. wurde die Lösung mit Wasser (100 ml) verdünnt, mit Ethylacetat (2 · 75 ml) extrahiert, mit NaHCO&sub3;, Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt, um 1-[(N¹-Palmitoyl)amino]-3-O- dimethoxytritylmethyl-2-propandiol zu ergeben. Das resultierende 1-[(N¹-Palmitoyl)amino]-3-O- dimethoxytritylmethyl-2-propandiol wird dann mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropylaminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 55 1-[(N-Isobutyroyl)amino]-3-O-dimethoxytrimethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von Isobuttersäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 56 1-[(N-Phenylacetyl)amino]-3-O-dimethoxytrimethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von Phenylessigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 57 Glutarsäure-monofluorenylmethylester.
  • Fluorenylmethanol (0,90 g; 4,5 mmol) und Dimethylaminopyridin (50 mg) werden in 10 ml trockenem Pyridin gelöst. Glutarsäureanhydrid (5,0 mmol) werden zugegben und die Lösung wird über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt, Natriumhydrogencarbonat (50 ml) wird zugegeben, die Lösung wird mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert, und die organsiche Phase wird verworfen. Die wässerige Phase wird auf pH 2 angesäuert, mit Ethylacetat (2 · 100 ml) extrahiert, mit Kochsalzlösung gewaschen, und das Lösungsmittel unter verminderten Druck entfernt. Der Rückstand wird durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt, um das Produkt zu ergeben.
    • Beispiel 58 1-[(N-(Fluorenylmethylglutaroyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]-propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von Glutarsäure-monofluorenylmethylester (Beispiel 57) als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 59 2-(1-Thymin)essigsäure
  • Methylbromacetat (25,5 g; 15,2 ml; 160 mmol) wurden zu einer Suspension aus K&sub2;CO&sub3; (44,2 g; 320 ml) und Thymidin (20,2 g; 160 ml) in 500 ml trockenem DMF zugegeben und über Nacht gerührt. Die Suspension wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in 120 ml H&sub2;O und 30 ml 4N HCl suspendiert, 30 Min. lang gerührt und nochmal filtriert. Der Feststoff wurde in 250 ml H&sub2;O suspendiert, dazu wurden 100 ml 2,5 M NaOH zugegeben. Die Lösung wurde fast bis zum Sieden erwärmt, gekühlt und mit konzentrierter HCl bis pH 1 angesäuert. Der Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet, um 13,6 g (73,6 mmol; 46%) reines Produkt zu ergeben. ¹H-NMR: (DMSO-d&sub6;, 200 MHz) δ 7,48 (s, 1H, H6); 4,37 (s, 2H, CH&sub2;); 1,76 (s, 3H, CH&sub3;).
    • Beispiel 60 1-{N-[2-(1-Thymidin)acetyl]amino}-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von Thymidin-2-essigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 61 N-Fmoc-3-Aminopropionsäure.
  • Natriumhydrogencarbonat (2,52 g; 30 mmol) und 3-Aminopropionsäure (1,00 g; 11,2 mmol) wurden in 50 ml Wasser gelöst und 50 ml Dioxan wurde zugegeben. Eine Lösung aus FluorenylmethylChlorformiat (3,10 g; 12,0 mmol) in 50 ml Dioxan wurde tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 6 Stunden wurde die Lösung mit Wasser (100 ml) und gesättigter Bicarbonat- Lösung (50 ml) verdünnt, einmal mit Diethylether extrahiert und die wässerige Phase mit konzentrierter HCl auf pH 2 angesäuert. Die trübe Lösung wurde mit Ethylacetat (2 · 100 ml) extrahiert, mit Kochsalz-Lösung gewaschen und mit MgSO&sub4; getrocknet. Nach Abdampfung wurde eine Mischung aus dem Titelprodukt und dem Peptiddimer erhalten. Das reine Produkt wurde durch Flash-Chromatographie erhalten. ¹H-NMR: (CDCl&sub3;, 200 MHz); δ, 7,95-7,26 (8H, m, ArH); 7,40-7,15 (3H, m, CHCH&sub2;O); 3,20 (2H, t, J = 8 Hz, CH&sub2; N); 2,40 (2H, t, J = 8 Hz, HOOCCH&sub2;).
    • Beispiel 62 1-[N-(N-Fmoc-3-aminopropionyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von N-Fmoc- 3-aminopropionsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 63 2-(N-Imidazolyl)essigsäure.
  • Imidazol (3,7 g; 54 mmol) wurde zu einer Suspension aus Natriumhydrid (2,6 g einer 60% Dispersion in Öl; 60 mmol) in 50 ml trockenem THF zugegeben. Bromessigsäure (3,4 g; 24 mmol) wurde dann zugegeben und die Mischung über Nacht gerührt. Wasser (1 ml) wurde dann zugegeben und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser (50 ml, pH > 10) aufgenommen, mit Ether extrahiert und die organische Phase verworfen. Die wässerige Phase wurde auf pH 1 mit konzentrierter HCl angesäuert und wieder mit ether extrahiert. Die wässerige Phase wurde zur Trockene abgedampft. Der ölige Rückstand wurde in absolutem Ethanol (EtOH) gelöst, um NaCl auszufällen, und aus Aceton/Methanol rekristallisiert, um 1,22 g (7,5 mmol, 30%) reines Produkt als das Hydrochlorid zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO- d&sub6;, 200 MHz); δ, 9,20 (s, Hz); 7,76 (d, J = 1,5 Hz); 7,69 (d, J = 1,5 Hz); 5,20 (s, CH&sub2;).
    • Beispiel 64 1-{N-[2-(N-Imidazolyl)acetyl]amino}-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)- 2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von N- Imidazolyl-2-essigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 65 2-(9-Adenin)essigsäureethylester.
  • Natriumhydrid (8,20 g; 60% in Öl; 205 mmol) wurde zu einer Suspension aus Adenin (25,0 g; 185 mmol) in 500 ml DMF gegeben. Nach 2 Stunden kräftigen, mechanischen Rühren war die H&sub2;-Entwicklung beendet und ein dicker Schlamm wurde erhalten. Ethylbromacetat (55,6 g; 36,9 ml; 333 mmol) wurde tropfenweise über 3 Stunden zugegeben und Rühren wurde für eine weitere Stunde fortgeführt. Wasser (10 ml) und H&sub2;SO&sub4; wurden bis zu pH 4 zugegeben. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand in 500 ml Wasser suspendiert, filtriert und mit Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde aus 400 ml Ethanol rekristallisiert, um 23,8 g (108 mmol, 58%) reines Produkt zu ergeben.
    • Beispiel 66 2-[9-(N2-Benzoyl)adenin)essigsäure.
  • Zu einer Suspension von 2-(9-Adenin)essigsäureethylester (6,06 g; 27,4 mmol) in 250 ml trockenem Pyridin wurde Benzoylchlorid (9,60 ml; 11,6 g; 82 mmol) zugegeben, und die Lösung 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Methanol (25 ml) wurde zugegeben und die Lösungsmittel wurden abgedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (2 · 250 ml) gelöst, mit 0,1N HCl, H&sub2;O, gesättigter NaHCO&sub3;, Kochsalzlösung gewaschen und mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die organischen Extrakte wurden abgedampft und der feste Rückstand wurde wieder in 250 ml THF bei 0ºC gelöst, dazu wurde 100 ml 1M NaOH zugegeben. Die Lösung wurde bei 0ºC 1 Stunde lang gerührt und mit konzentrierter HCl auf pH 1 angesäuert, und die wässerige Phase wurde einmal mit Ether extrahiert. Das Produkt, das fast sofort begann auszukristallisieren, wurde durch Filtration aufgefangen, um 4,96 g (61%) zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;, 200 MHz);
  • δ, 8,86; 8,84 (d, H2, H8); 8,1 (d, 2H, J = 7,0 Hz, Ar); 7,69-7,58 (m, 3H, Ar-H); 5,22 (s, 2H, CH&sub2;).
    • Beispiel 67 1-{{N-{2-[9-(N2-Benzoyl)adenin]acetyl}amino}}-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von 2-[9-(N2- Benzoyl)adeninessigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 68 2-[1-(N4-Benzoyl)cytosinessigsäure.
  • Cytosin-Halbhydrat (12,0 g; 100 mmol) wurde durch Co-Abdampfung mit Pyridin getrocknet, in trockenem Pyridin (250 ml) wieder gelöst, und Benzoylchlorid (70,3 g; 500 ml) wurde tropfenweise unter Kühlung zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, Wasser zugegeben und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 700 ml H&sub2;O gelöst, das 55 g NaOH enthielt. Wenn eine vollständige Auflösung stattgefunden hat, wurde Rühren 1 Stunde lang fortgeführt. Die Lösung wurde dann auf pH 4 angesäuert, und der weisse Niederschlag wurde aufgefangen, in 1 l Ethanol gekocht und wieder filtriert, um 16,1 g Benzoylcytosin zu ergeben. Fünfzehn Gramm von diesem wurden mit 9,7 g (70 mmol) K&sub2;CO&sub3; und Methylbromacetat (10,7 g; 70 mmol) in 500 ml DMF suspendiert. Die Suspension wurde 3 Tage lang gerührt, filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Wasser (100 ml) und 10 ml 4N HCl wurden zugegeben. Die Suspension wurde 15 Min. gerührt und filtriert. Der Feststoff wurde in 200 ml H&sub2;O resuspendiert, das 4,8 g NaOH enthielt. Die Suspension wurde 45 Min. gerührt, bis sich der ganze Feststoff gelöst hatte. Die Lösung wurde dann auf pH 2 angesäuert, der Feststoff durch Filtration aufgefangen und getrocknet, um 10,6 g (43%) Produkt zu ergeben. Das Produkt wurde durch NMR identifiziert.
    • Beispiel 69 1-{{N-{2-[1-(N4-Benzoyl)cytosin]acetyl}amino}}-3-O-dimethoxytritylmethyl-1-amino-2-O- [(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von 2-[1-(N4- Benzoyl)cytosinessigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 70 2-[9-(N2-Isobutyryl)guanin]essigsäure
  • Zu einer Lösung aus 2-Amino-6-chlorpurin (10 mmol) und K&sub2;CO&sub3; (15 mmol) in DMF (25 ml) wird Ethylbromacetat (10 mmol) zugegeben. Die Mischung wird 24 Std. lang kräftig gerührt, filtriert und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wird in 25 ml Pyridin resuspendiert und Isobutyroylchlorid (20 mmol) wird zugegeben. Nach 18 Std. Rühren wird Wasser zugegeben und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird in 1N HCl suspendiert und 1 Std. lang am Rückfluß erwärmt. Die Suspension wird dann auf 0ºC gekühlt, NaOH wird bis zu pH 12 zugegeben, und die Reaktion wird 1 Std. gerührt. Die Lösung wird auf pH 3 angesäuert, und das Produkt wird durch Filtration augefangen.
    • Beispiel 71 1-{{N-{2-[9-(N2-Isobutyroyl)guanin]acetyl}amino}}-3-O-dimethoxytritylmethyl-1-amino- 2-O-((N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von 2-[9-(N2- Isobutyroyl)guanin]essigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 72 Benzyl-3,6,9,12-tetraoxatridecanoat.
  • Triethylenglycolmonomethylether (10 mmol) und Benzylbromacetat (11 mmol) werden zu einer Suspension aus wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; (15 mmol) in 50 ml DMF zugegeben. Die Suspension wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Wasser wird zugegeben und die Emulsion wird mit Ethylacetat (3 · 200 ml) extrahiert, mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen, und mit MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird abgedampft und das rückständige Öl durch Flash- Chromatographie gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 73 3,6,9,12-Tetraoxytridecansäure
  • Benzyl-3,6,9,12-tetraoxatridecanoat (5 mmol) wird in Methanol (50 ml) gelöst und 10% Palladium auf Kohle wird zugegeben (100 mg Katalysator/mmol). Die Suspension wird unter 30 psi H&sub2; geschüttelt, bis das Ausgangsmaterial aufgebraucht ist. Die Suspension wird durch ein kurzes Celite-Bett filtriert, gründlich mit Methanol gewaschen, und das Lösungsmittel abgedampft. Das Produkt wird ohne Reinigung direkt verwendet.
    • Beispiel 74 1-[N-(3,6,9,12-Tetraoxatridecanoyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von 3,6,9,12- Tetraoxatridecansäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 75 Benzyl-bis-[(2-pyridyl)-2-ethyl] aminoacetat.
  • Zu einer Lösung aus K&sub2;CO&sub3; (15 mmol) in 25 ml DMF wurde 2,2'-Bis(2-pyridylethyl)-amin (10 mmol) zugegeben, gefolgt von Benzylbromacetat (12 mmol). Die Suspension wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde Wasser zugegeben, und die Suspension mit Ethylacetat (2 · 100 ml) extrahiert, mit 5% Na&sub2;CO&sub3;, Wasser, Kochsalzlösung gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet und die Lösungsmittel wurden entfernt. Das Produkt wurde durch NMR identifiziert.
    • Beispiel 76 Bis(2-(2-pyridyl)ethyl)aminoessigsäure.
  • Benzyl-bis-[(2-pyridyl)-2-ethyl]aminoacetat (5 mmol) wird in Methanol (50 ml) gelöst und 10% Palladium auf Kohle wird zugegeben (100 mg Katalysator/mmol). Die Suspension wird unter 30 psi H&sub2; geschüttelt, bis das Ausgangsmaterial aufgebraucht ist. Die Suspension wird durch ein kurzes Celite-Bett filtriert, gründlich mit Methanol gewaschen, und das Lösungsmittel abgedampft. Das Produkt wird ohne Reinigung direkt verwendet.
    • Beispiel 77 1-{{N-{Bis-[2-(2-pyridyl)ethyl]aminoacetyl}amino}}-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O- [(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von Bis(2-(2- pyridyl)ethyl)-aminoessigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 78 1-[N-(Toluolsulfonyl)aminol-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Chlortrimethylsilan (6,0 mmol) wird tropfenweise zu einer Lösung aus 1-Amino-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol (5,0 mmol) in 25 ml trockenem Pyridin zugegeben. Nach einer Stunde Rühren wird Toluolsulfonylchlorid (6,0 mmol) portionsweise zugegeben, und Rühren zwei Stunden lang fortgeführt. Die Reaktion wird mit gesättigter, wässeriger NaHCO&sub3; gequericht, und die Mischung gerührt, bis die Silylether hydrolysiert waren. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt. Die organische Phase wird mit NaHCO&sub3;, Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und das rückständige Öl durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in CHCl&sub3; gereinigt. Das resultierende 1-[N- (Toluolsulfonyl)amino]-3-dimethoxytritylmethyl-2-propanol wird mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N- diisopropyl-aminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 79 1-[N-(Trifluormethansulfonyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Chlortrimethylsilan (6,0 mmol) wird tropfenweise zu einer Lösung aus 1-Amino-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol (5,0 mmol) und Triethylamin (50 ml) in 50 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Nach 1 Stunde wird die Lösung auf -78ºC gekühlt, und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (5,5 mmol) wird tropfenweise zugegeben. Das Kühlbad wird entfernt und der Mischung wird erlaubt, auf Raumtemperatur aufzuwärmen. Das Rohprodukt wird in Pyridin gelöst und NaHCO&sub3;-Lösung wird zugegeben, um den TMS-Ether zu hydrolisieren. Das Lösungsmittel wird abgedampft, der Rückstand zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt, mit NaHCO&sub3;, Kochsalzlösung gewaschen und mit MgSO&sub4; getrocknet. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in CHCl&sub3; gereinigt. Das resultierende 1-[N- (Trifluormethansulfonyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-1-amino-2-propanol wird mit Chlorβ-cyanethoxy-N,N-diisopropyl-aminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 80 1-[N-(Benzyl)amino]-3-O-dimethoxytrimethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Chlortrimethylsilan (6,0 mmol) wird tropfenweise zu einer Lösung aus 1-Amino-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol (5,0 mmol), Imidazol (S mmol) und Triethylamin (15 mmol) in 25 ml DMF zugegeben. Nach einer Stunde Rühren wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand in Acetonitril (25 ml) und Triethylamin (10 mmol) wieder gelöst. Benzylbromid (6,0 mmol) wird zugegeben, und rühren wird über Nacht fortgeführt. Die Reaktion wird mit gesättigter, wässeriger NaHCO&sub3; gequericht, und die Mischung wird gerührt, bis die Silylether hydrolysiert sind. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt. Die organische Phase wird mit NaHCO&sub3;, Wasser, Kochsalz gewaschen und mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und das rückständige Öl durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in CHCl&sub3; gereinigt. Das resultiernde 1-[N-(Benzyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-1-amino-2-propanol wird mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropyl-aminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 81 1-[N-(Aminocarbonyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamini)-2- cyanethoxyphosphit]propan
  • Chlortrimethylsilan (6,0 mmol) wird tropfenweise zu einer Lösung aus -1-Amino-3-O- dimethoxytrityl-2-propanol (5,0 mmol) und Triethylamin (15 mmol) in SO ml tröckenem CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Nach einer Stunde wird Dimethylaminopyridin (1 mmol) zugegeben, gefolgt von Trimethylsilylisocyanat (5,5 mmol). Die Lösung wird gerührt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und das Rohprodukt in Pyridin und NaHCO&sub3;-Lösung wieder gelöst, um die TMS-Ether zu hydrolisieren. Das Lösungsmittel wird abgedampft, und der Rückstand zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt, mit NaHCO&sub3;, Kochsalz gewaschen und mit MgSO&sub4; getrocknet. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in CHCl&sub3; gereinigt. Das resultierende 1-[N- (Aminocarbonyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-propanol wird mit Chlor-β-cyanethoxy- N,N-diisopropyl-aminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 82 1-[N-(Methylaminothiocarbonyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Chlortrimethylsilan (6,0 mmol) wird tropfenweise zu einer Lösung aus 1-Amino-3-Odimethoxytrityl-2-propanol (5,0 mmol) und Triethylamin (15 mmol) in 50 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Nach einer Stunde wird Dimethylaminopyridin (1 mmol) zugegeben, gefolgt von Methylisothiocyanat (5,5 mmol). Die Lösung wird gerührt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und das Rohprodukt in Pyridin und NaHCO&sub3;- Lösung wieder gelöst, um die TMS-Ether zu hydrolisieren. Das Lösungsmittel wird abgedampft, und der Rückstand zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt, mit NaHCO&sub3;, Kochsalz gewaschen und mit MgSO&sub4; getrocknet. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in CHCl&sub3; gereinigt. Das resultiernde 1-[N- (Methylaminothiocarbonyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-1-amino-2-propanol wird mit Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropyl-aminophosphin wie in Beispiel 20 phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 83 N-α-(Fmoc)-glutaminsäure-γ-benzylester.
  • Zu einer Lösung aus γ-Benzylglutamat (10 mmol) in 50 ml Dioxan und 50 ml Wasser wird Triethylamin (25 mmol) zugegeben, gefolgt von einer Lösung aus FluorenylmethylChlorformiat (11 mmol) in 50 ml Dioxan. Die Mischung wird kräftig gerührt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist. Die Lösung wird mit konzentrierter HCl auf pH 2 angesäuert, mit Ethylacetat (2 · 250 ml) extrahiert, mit Kochsalzlösung gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet und abgedampft. Das Produkt wird ohne Reinigung verwendet
    • Beispiel 84 N-α-(Fmoc)-γ-Benzyl-L-glutaminsäurefluorenylmethylester.
  • N-α-(Fmoc)-glutaminsäure-γ-benzylester (5 mmol), Fluorenylmethanol (5,5 mmol) und Dimethylaminopyridin (0,5 mmol) werden in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Dimethylaminopropylethylcarbodiimid (EDC; 6,0 mmol) wird zugegben, und die Lösung bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständigem Verbrauch des Ausgangsmaterials wird die Lösung mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit 1% HCl, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet und abgedampft. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat und Hexan als Eluierungsmittel gereinigt.
    • Beispiel 85 N-α-(Fmoc)-L-glutaminsäure-α-fluorenylmethylester.
  • N-α-(Fmoc)-γ-Benzyl-L-glutaminsäurefluorenylmethylester (5 mmol) wird in Methanol (50 ml) gelöst und 10% Palladium auf Kohle wird zugegeben (100 mg Katalysator/mmol). Die Suspension wird unter 30 psi H&sub2; geschüttelt, bis das Ausgangsmaterial aufgebraucht wird. Die Suspension wird durch ein kurzes Celite-Bett filtriert, gründlich mit Methanol gewaschen, und das Lösungsmittel abgedampft. Das Produkt wird ohne Reinigung direkt verwendet.
    • Beispiel 86 1-[N-(N-α-(Fmoc-α-fluorenylmethyl-γ-glutamyl)amino]-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O- [(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von N-α- (Fmoc)-L-glutaminsäure-α-fluorenylmethylester als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 87 2-(N-Carbazolyl)essigsäure.
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 63 unter Verwendung von Carbazol als Ausgangsheterocyclus hergestellt.
    • Beispiel 88 1-{N-[2-(N-Carbazolyl)acetyl]amino}-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von N- Carbazolyl-2-essigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 89 N-Pyrrolyl-2-essigsäure.
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 63 unter Verwendung von Pyrrol als Ausgangsheterocyclus hergestellt.
    • Beispiel 90 1-{N-[2-(N-Pyrrolyl)acetyl])amino}-3-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N- diisoprhpylamino)-2-cyanethoxyphosphit]propan
  • Die Titelverbindung wird nach dem Verfahren von Beispiel 54 unter Verwendung von N- Pyrrolyl-2-essigsäure als Carbonsäuren-Komponente hergestellt.
    • Beispiel 91 1-(1-Imidazol)-5-dimethoxytrityl-2-pentanol
  • 1-Buten-4-ol wird nach dem Verfahren von Klunder, et al. J. Org. Chem. 1986, 51, 3710 behandelt, um 4,5-Epoxy-1-pentanol zu ergeben. Das Glycol wird nicht isoliert, sondern in situ in trockenem DMF mit gepulvertem Kaliumcarbonat und Imidazol nach dem Verfahren von Beispiel 4 behandelt, gefolgt durch Behandlung mit Dimethoxytritylchlorid wie in Beispiel 5, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 92 1-(1-Imidazol)-5-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]pentan
  • 1-(1-Imidazol)-4-dimethoxytrityl-2-pentanol wird nach dem Verfahren von Beispiel 6 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 93 1-(1-Carbazol)-8-dimethoxytrityl-2-octanol
  • 1-Octanol wird nach dem Verfahren von Klunder, et al. J. Org. Chem. 1986, 51, 3710 behandelt, um 4,5-Epoxy-1-octanol zu ergeben. Das Glycol wird nicht isoliert, sondern in situ in trockenem DMF mit gepulvertem Kaliumcarbonat und Imidazol nach dem Verfahren von Beispiel 4 behandelt, gefolgt durch Behandlung mit Dimethoxytritylchlorid wie in Beispiel 5, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 94 1-(1-Carbazol)-8-O-dimethoxytritylmethyl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]octan
  • 1-(1-Carbazol)-4-dimethoxytrityl-2-pentanol wird nach dem Verfahren von Beispiel 6 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Beispiel 95 1-(N-Morpholino)-2,3-propandiol
  • Eine schnell gerührte Lösung aus redestilliertem Morpholin (4,3 g; 50 mmol) und R-(+)-Glycidol (3,7 g; 50 mmol) in wasserfreiem Methanol (50 ml) wurde 18 Std. lang am Rückfluß erwärmt. Die resultierende Lösung wurde gekühlt und am Rotationverdampfer abgedampft, um einen leicht gelblichen Sirup zu ergeben. Dieser Sirup wurde 3 Std. lang unter Vakuum gehalten, um eine quantitative Ausbeute an Prpandiol (8,0 g) zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 4,5 (m, 2, Hydroxyle); 3,5-3,3 (m, 7); 2,4-2,1 (m, 6).
    • Beispiel 96 1-(N-Morpholino)-3-O-dimethoxytrityl-2,3-propandiol
  • Zu einer eisgekühlten Lösung aus 1-(N-Morpholino)-2,3-propandiol (8,0 g; 50 mmol) in wasserfreiem Pyridin (150 ml) und Triethylamin (10 ml) wurde pulveriges Dimethoxytritylchlorid (17 g; 50 mmol) über einen Zeitraum von 5 Minuten zugegeben. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und währenddessen wurden wasserfreie Bedingungen aufrechterhalten. Die resultierende Lösung wurde am Rotationsverdampfer abgedampft und dann auf einer 7,5 · 5 cm Säule unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol/Triethylamin (90/9,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die Ausbeute an einem bernsteinfarbenen festen Schaum beträgt 16 g (69%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ, 7,5-6,8 (m, 13, Aromat); 3,9 (s, 6, Methoxy); 10,4 und 5,7 (2m, 1, Hydroxy); 4,2-2,8 (3m, 13, Aliphat).
    • Beispiel 97 1-(N-Morpholino-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]-2,3-propandiol
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (2,4 g; 1 mmol) wurde zu einer eiskalten Lösung aus 1-(N-Morpholino-3-O-dimethoxytrityl-2,3-propandiol (4,3 g; 1 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) und Diisopropylethylamin (5 ml) zugeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und am Rotationsverdampfer abgedampft. Der resultierende klebrige Rückstand wurde auf einer 5,5 · 10 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol/Triethylamin (95/4,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden abgedampft, um das Amidit zu ergeben.
    • Beispiel 98 1-(N-Piperidin)-2,3-propandiol
  • Eine schnell gerührte Piperidin-Lösung (4,3 g; 50 mmol) und R-(+)-Glycidol in wasserfreiem Methanol (50 ml) wurden 18 Std. lang am Rückfluß erhitzt. Die Mischung wurde am Rotationsverdampfer abgedampft, um einen klaren Sirup zu ergeben, der 3 Std. lang unter Vakuum gehalten wurde, um eine quantitative Ausbeute an dem Propandiol zu ergeben (8 g). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 4,6 und 4,3 (2m, 2 Hydroxyle); 3,6 (m, 1, Methin); 3,3 und 2,3 (2m, 4, Propan); 1,4 (m, 10, Piperidin).
    • Beispiel 99 1-(N-Piperidin)-3-O-dimethoxytrityl-2,3-propandiol
  • Zu einer eiskalten Lösung aus 1-(N-Piperidin)-2,3-propandiol (6,8 g; 43 mmol) in Pyridin (75 ml) und Triethylamin (15 ml) wurde Dimethoxytritylchlorid (14,4 g; 43 mmol) über einen Zeitraum von fünf Minuten zugegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Aufrechterhaltung von wasserfreien Bedingungen gerührt. Die resultierende Lösung wurde am Rotationsverdampfer abgedampft und dann auf einer 11,5 · 5 cm Säule unter Verwendung von Ethylacetat und anschließend Ethylacetat/Methanol/Triethylamin (90/9,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die Ausbeute an gelben festen Schaum beträgt 11 g (56%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 7,4-6,8 (m, 13, Aromat); 4,5 (m, 1, Hydroxyl); 3,8 (s, 6, Methoxy); 2,9 (d, 1, Hydroxyl); 2,2 und 1,4 (2m, 14, Propan und Piperidin).
    • Beispiel 100 1-(N-Piperidin-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]- 2,3-propandiol
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (2,4 g; 1 mmol) wurde zu einer eisgekalten Lösung aus 1-(N-Piperidin-3-O-dimethoxytrityl-2,3-propandiol (4,6 g; 1 mmol) und Diisopropylethylamin (5 ml) zugeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang gerührt bei Raumtemperatur und anschließend am Rotationsverdampfer abgedampft, um einen farblosen Sirup zu ergeben. Dieser Sirup wurde auf einer 5,5 · 10 cm Säule unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol/Triethylamin (95/4,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert, um das Amidit zu ergeben.
    • Beispiel 101 1-O-Dimethoxytrityl-5-hexen-1,2-diol
  • Zu einer Lösung aus 3-O-Dimethoxytrityl-R-(+)-glycidol (8,0 g; 21 mmol) in wasserfreiem THF (80 mmol) wurde bei Raumtemperatur Lithiumtetrachlorcuprat (50 ml; 0,1 M Lösung in THF; Aldrich) zugegeben, sofort von Allylmagnesiumbromid (70 ml; 1 M Lösung in THF; Aldrich) gefolgt. Der Mischung wurde erlaubt, über Nacht unter, einer Argonatmosphäre zu rühren, und wurde anschließend durch die langsame Zugabe einer gesättigten, wässerigen Lösung aus Ammoniumchlorid (etwa 20 ml) gequericht. Die Mischung wurde weiterhin 30 Minuten lang gerührt und dann durch Celite filtriert. Das Filterbett wurde mit zusätzlichem THF gewaschen und die Filtrate wurden abgedampft. Das resultierende dunkle Öl wurde auf einer 5,5 · 10 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (90/9,5/0,5) und anschließend (80/19,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Abdampfen der geeigneten Fraktionen ergab das Diol als farbloses Öl; 8,0 g (90%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 7,5-6,8 (m, 13, Aromat); 5,8 und 5,0 (2m, 3, Alken; 4,7 (d, 1, Hydroxyl); 3,7 (s, 6, Methoxy); 3,6 (m, 1, Methin); 2,9 (m, 2, Allyl); 2,1 und 1,6 (2m, 4, Methylen).
    • Beispiel 102 1-O-Dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanethoxyphosphit]-5-hexen-1,2-diol
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (2,4 g; 1 mmol) wurde zu einer eisgekalten Lösung aus 1-O-Dimethoxytrityl-5-hexen-1,2-diol (4,2 g; 1 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (80 ml) und Diisopropylethylamin (5 ml) zugeben. Die Mischung wurde 3 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt und dann am Rotationsverdampfer abgedampft. Das resultierende Öl wurde auf einer 5,5 · 10 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden abgedampft, um das Amidit zu ergeben.
    • Beispiel 103 2-O-Benzyl-1-O-dimethoxytrityl-5-hexen-1,2-diol
  • Zu einer Lösung aus 1-O-Dimethoxytrityl-5-hexen-1,2-diol (2,0 g; 4,8 mmol) in wasserfreiem Dimethylformamid (15 ml) wurde 60%iges Natriumhydrid (0,28 g; mit Hexan gewaschen) zugegeben, sofort von Benzylbromid (0,82 g; 4,8 mmol) gefolgt. Die Mischung wurde unter einer Argonatmosphäre und 1 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt und dann am Rotationsverdampfer abgedampft. Das resultierende Öl wurde zwischen Dichlormethan (150 ml) und kalter, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (50 ml) verteilt. Die organische Phase wurde weiterhin mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer abgedampft, um ein klares gelbes Öl zu ergeben. Dieses Material wurde durch ein kurzes Kieselgelbett auf einem Sinterglastrichter unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (4/1) filtriert, um ein farbloses Öl zu ergeben; 2,0 g (82%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 7,5-6,8 (m, 18, Aromat); 5,8 und 4,9 (2m, 3, Alken); 4,6 (q, 2, Benzyl); 3,8 (s, 6, Methoxy); 3,5 (m, 1, Methin); 3,1; 2,0 und 1,6 (3m, 6, Methylen).
    • Beispiel 104 2-O-Benzyl-1-O-dimethoxytrityl-hexan-1,2,6-triol
  • Eine Lösung aus 2-O-Benzyl-1-O-dimethoxytrityl-5-hexen-1,2-diol (1,6 g; 3,1 mmol) in wasserfreiem THF (25 ml) wurde mit einem Diboran/THF-Komplex (6,3 ml einer 1M Lösung in THF) bei Raumtemperatur behandelt. Nachdem Schäumen nachgelassen hat (10 Minuten nach der Zugabe von Diboran), wurde die Mischung weiterhin 15 Minuten lang unter Argon gerührt. Die Mischung wurde mit Methanol (10 ml) behandelt, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit NaOH-Lösung (10 ml, 1N) behandelt und zusätzliche 30 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde am Rotationsverdampfer auf ein minimales Volumen abgedampft und der resultierende Rückstand wurde wieder in Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst, anschließend mit 30% Wasserstoffperoxidlösung (6 ml) behandelt. Nach 30 Minuten wurde die zweiphasige Lösung mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt und die organische Phase mit kaltem Wasser, kalter, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und abgedampft. Dieses Material wurde auf einer 3,5 · 15 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (60/39,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer abgedampft, um ein farbloses Öl zu ergeben; 0,7 g (42%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 7,5- 6,8 (m, 18, Aromat); 4,6 (q, 2, Benzyl); 4,3 (t, 1, Hydroxyl); 3,8 (s, 6, Methoxy); 3,5 (m, 1, Methin); 3,3; 3,1 und 1,3 (3m, 10, Methylen):
    • Beispiel 105 6-O-Benzoyl-2-O-benzyl-1-O-dimethoxytrityl-1,2,6-hexantriol
  • Eine Lösung aus 2-O-Benzyl-1-O-dimethoxytrityl-1,2,6-hexantriol (0,60 g; 1,14 mmol) in wasserfreiem Pyridin wurde mit Benzoylchlorid (0,24 g; 1,71 mmol) behandelt und der Mischung wurde ermöglicht, über Nacht unter einer Argonatmosphäre zu rühren. Die Reaktionsmischung wurde mit einigen Millilitern Methylalkohol behandelt und am Rotationsverdampfer abgedampft. Das resultierende Öl wurde zwischen Dichlormethan (50 ml) und kalter, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (25 ml) verteilt. Die organische Phase wurde weiterhin mit kaltem Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, dann über Magnseiumsulfat getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer abgedampft. Das resultierende Material wurde auf einer 3,5 · 15 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (80/19,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeignten Fraktionen wurden abgedampft, um ein farbloses Öl zu ergeben; 0,57 g (80%). ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ; 8,1-6,7 (3m, 23 H, Aromat); 4,6 (q, 2, Benzyl); 4,3 (t, 2, Methylen); 3,8 (s, 6, Methoxy); 3,6 (m, 1, Methin); 3,2 (m, 2, Methylen); 1,7 (m, 6, Methylen).
    • Beispiel 106 6-O-Benzoyl-1-O-dimethoxytrityl-1,2,6-hexantriol
  • Eine Lösung aus 6-O-Benzoyl-2-O-benzyl-1-O-dimethoxytrityl-1,2,6-hexantriol (0,5 g; 0,8 mmol) in Tetrahydrofuran wurde mit einen 10% Pd/C-Katalysator (0,15 g) behandelt und die Mischung wurde drei Tage lang unter einen Ballon mit Wasserstoffgas (2-3 lbs/in²) gesetzt. Der Ballon wurde wieder gefüllt und eine equivalente Katalysatormenge wurde am Ende des ersten und des zweiten Tages zu einer Gesamtmenge etwa 0,5 g zugegeben. Die Mischung wurde durch Celite filtriert, das Bett wurde mit zusätzlichem THF gewaschen und die Filtrate wurden am Rotationsverdampfer abgedampft. Der resultierende Rückstand wurde auf einer 3,5 · 10 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (80/19,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeignten Fraktionen wurden abgedampft, um 0,4 g (32%) farbloses Triol als ein farbloses Glas zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ; 8,1 (d, 2, Aromat); 7,6 bis 6,2 (m, 12, Aromat); 6,8 (d, 4, Aromat); 4,3 (t, 2, Bz-O-CH&sub2;-); 3,8 (s, 6, Methoxy); 3,2 (ddd, 2, CH&sub2;- O-DMT); 2,4 (d, 1, Hydroxyl); 1,9 bis 1,4 (m, 6, CH&sub2;).
    • Beispiel 107 6-O-Benzoyl-1-O-dimethoxytrityl-1,2,6-hexantriol-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2- cyanethoxyphosphit]-1,2,6-hexantriol
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wurde zu einer eiskalten Lösung aus 6-O- Dimethoxytrityl-1,2,6-hexantriol in Tetrahydrofuran und Diisopropylethylamin zugegeben. Die Lösung wurde 3 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt und dann am Rotationsverdampfer abgedampft. Das resultierende Öl wurde auf einer 5,5 · 10 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden abgedampft, um das Amidit zu ergeben.
    • Beispiel 108 1-O-Dimethoxytrityl-4-methylpentan-1,2-diol
  • Eine Mischung aus Isopropylmagnesiumchlorid (50 ml einer 2M Lösung in THF; Aldrich) und Dilithiumtetrachlorcuprat (10 ml einer 0,1M Lösung in THF; Aldrich) wurde auf -68ºC unter einer Argonatmosphäre gekühlt. Die Mischung wurde tropfenweise mit einer Lösung aus 3-O- Dimethoxytrityl-R-(+)-glycidol (7,3 g; 20 mmol, in 30 ml THF) behandelt, so dass diese Temperatur aufrechterhalten wurde. Die dunkle Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, und dann über Nacht gerührt. Die Mischung wurde mit kalter gesättigter Ammoniumchloridlösung (etwa 30 ml) behandelt und dann durch Celite filtriert. Das Celitebett wurde mehrmals mit zusätzlichem Tetrahydrofuran gewaschen und die Filtrate wurden am Rotationsverdampfer abgedampft. Der resultierende gelbe Sirup wurde auf einer 5,5 · 15 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeignten Fraktionen wurden abgedampft, um 5,2 g () Diol als ein farbloses Gummi zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 7,5-6,8 (m, 13, Aromat); 4,6 (d, 1, Hydroxyl); 3,7 (s, 6, Methoxy); 3,7 (m, 1, C-2- Methin); 2,9 (2m, 2, Methylen); 1,7 (m, 1, C-4 Methin); 1,2 (t, 2, Methylen); 1,9 (2d, 6, Methyle).
    • Beispiel 109 1-O-Dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-O-cyanethoxyphosphit]-4- methylpentan-1,2-diol
  • Das N,N,N',N'-Tetraisopropylamino-2-cyanethyldiphosphoramidit (3,3 g; 10,8 mmol) wurde zu einer eiskalten Lösung aus 1-O-Dimethoxytrityl-4-methylpentan-1,2-diol (3,8 g; 9 mmol) und Diisopropylammoniumtetrazolid (1,2 g; 4,5 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (40 ml) zugegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und unter einer Argonatmosphäre gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf ein minimales Volumen abgedampft und der Rückstand zwischen Dichlormethan (100 ml) und kalter gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (50 ml) verteilt. Die organische Phase wurde weiterhin mit kaltem Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer abgedampft. Der resultierende Sirup wurde auf einer 5,5 · 15 cm Kieselgelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Triethylamin (80/19,5/0,5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die geeignten Fraktionen wurden abgedampft, um 5,4 g (80%) Amidit als ein farbloses Glas zu ergeben. ³¹P-NMR (CD&sub3;OD): 153,3; 152,9 ppm.
    • Beispiel 110 1-(N,N-Bis-cyanethylamino)-2,3-propandiol
  • Eine Lösung aus R-(+)-Glycidol (0,5 g; 6,7 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (30 ml) und Triethylamin (0,5 ml) wurde mit 3,3'-Iminodipropionitril (0,825 g; 6,7 mmol) behandelt. Die Mischung wurde auf 50ºC erwärmt und 18 Std. lang unter einer Argonatmosphäre gerührt. Die Mischung wurde am Rotationsverdampfer mit einer Vakuumpumpe abgedampft, um 1,0 g (76%) eines leicht farblosen Öls zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ; 4,9 (t, 1,1º Hydroxyl); 4,7 (d, 1, 2º Hydroxyl); 3,7-3,2 (m, 5, Propan); 2,7 und 2,6 (2t, 8, Ethylen).
    • Beispiel 111 1-([N,N-Bis-cyanethyl]amino)-3-O-dimethoxytrityl-propan-2,3-diol
  • Eine Lösung aus 1-([N,N-Bis-cyanethyl]amino)-2,3-propandiol in wasserfreiem Pyridin wurde mit Dimethoxytritylchlorid behandelt und die Mischung wurde 18 Std. lang unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Die Mischung wurde mit einigen Millilitern wasserfreiem Methanol behandelt und dann am Rotationsverdampfer abgedampft. Das resultierende Öl wurde mit Toluol abgedampft und dann auf einer Kieselgelsäule chromatographiert, um die tritylierte Verbindung zu ergeben.
    • Beispiel 112 1-([N,N-Bis-cyanethyl]amino)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-Ocyanethoxyphosphit]-propan-2,3-diol
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wurde zu einer eiskalten Lösung aus 1- ([N,N-Bis-cyanethyl]amino)-3-O-dimethoxytrityl-2,3-propandiol und Diisopropylethylamin in wasserfreiem Tetrahydrofuran zugegeben. Die Mischung wurde 3 Std. lang bei Raumtemperatur und unter einer Argonatmosphäre gerührt, dann am Rotationsverdampfer abgedampft. Die resultierende Mischung wurde auf einer Kieselgelsäule chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden abgedampft, um das Phosphoramidit zu ergeben.
    • Beispiel 113 1-(N,N'-Bis-carboxamidoethylamino)-3-O-dimethoxytrityl-propan-2,3-diol
  • Eine Lösung aus 1-([N,N-Bis-cyanethyl]amino)-3-O-dimethoxytrityl-propan-2,3-diol in Tetrahydrofuran wurde mit wässeriger 1M Natriumhydroxidlösung bei Raumtemperatur behandelt. Zu der zweiphasigen Mischung wurde 30% Wasserstoffperoxid zugegeben und dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die resultierende Mischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde weiterhin mit kalter gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer abgedampft und das resultierende Öl wurde durch ein kurzes Kieselgelbett auf einem Sinterglastrichter filtriert, um das Bis-carboxamid zu ergeben.
    • Beispiel 114 1-([N,N'-Bis-carboxamidoethyl]amino)-3-O-dimethoxytrityl-2-O-[(N,N-diisopropylamino)- 2-O-cyanethoxyphosphit]-propan-2,3-diol
  • Chlor-β-cyanethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin wurde zu einer eiskalten Lösung aus 1- ([N,N'-Bis-carboxamidoethyl]amino)-3-O-dimethoxytrityl-propan-2,3-diol in wasserfreiem Tetrahydrofuran und Diisopropylethylamin zugegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur und unter einer Argonatmosphäre 3 Std. lang gerührt, dann am Rotationsverdampfer abgedampft. Die resultierende Mischung wurde auf einer Kieselgelsäule chromatographiert und die geeigneten Fraktionen wurden abgedampft, um das Phosphoramidit zu ergeben.
    • Beispiel 115 Standard-Oligomer-Verknüpfungs-Cyclus unter Verwendung von Standard DNA Syntheseprotokollen
  • Die oligomeren Makromoleküle der Erfindung werden durch einen automatisierten DNA Synthetizer (Applied Biosystems Modell 380B) synthetisiert, wie mit Standard-Oligonucleotiden unter Verwendung von Standard-Phosphoramidat-Chemie mit Oxidation durch Iod (siehe Oligonucleotide synthesis, a practical approach, M. J. Gait. Ed., Oxford University Press, New York, New York, 1990) verfahren wird. Bei Phosphorothioatoligomeren wurde die Standardoxidationsflasche durch eine 0,2M Lösung aus 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril für die stufenweise Thiation der Phosphitbindungen ersetzt. Der Thiationswarteschritt wird auf 68 Sek. erhöht und wird von dem Abdeckschritt gefolgt. Nach Abspaltung von der CPG-Säule und entblockieren in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55ºC (18 Std.) werden die Oligomere durch zweimaliges Ausfällen aus 0,5 NaCl-Lösung mit 2,5 facher Menge Ethanol gereinigt. Analytische Gelelektrophorese wird in 20% Acrylamid, 8M Harnstoff, 454 mM Tris-borat- Puffer, pH = 7,0 durchgeführt. Phosphodiester- und Phosphorothioat-Oligomere werden zur Materiallänge von der Polyacrylamid-Gelelektrophorese bewertet.
    • Beispiel 116 - Synthese von Sequenz-spezifischem Ethylenglycol-Oligomer mit Phosphodiester- Bindungen
  • "Aforvirsen" ist ein Anti-Papilloma-Mittel mit der Nucleobasensequenz:
  • TTG CTT CCA TCT TCC TCG TC.
  • Ein Ethylenglycolphosphodiester-verknüpftes Oligomer dieser vorher ausgewählten Sequenz wird unter Verwendung der T-, A-, C- und G-Reagenzien aus Beispielen 3, 15, 24 bzw. 20 durch das Verfahren von Beispiel 115 unter Verwendung von Iod als das Oxidationsreagens hergestellt, um die Phosphodiester-verknüpfte oligomere Verbindung mit der "Aforvirsen"-Sequenz zu ergeben.
    • Beispiel 117 Synthese von Sequenz-spezifischem Ethylenglycol-Oligomer mit Phosphorothioat- Bindungen
  • "Aforvirsen" ist ein Anti-Papilloma-Mittel mit der Nucleobasensequenz:
  • TTG CTT CCA TCT TCC TCG TC.
  • Ein Ethylenglycolphosphorothioat-verknüpftes Oligomer dieser vorher ausgewählten Sequenz wird unter Verwendung der T-, A-, C- und G-Reagenzien aus Beispielen 3, 15, 24 bzw. 20 durch das Verfahren von Beispiel 115 unter Verwendung von 3H-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid als das Oxidationsreagens hergestellt, um die Phosphorothioat-verknüpfte oligomere Verbindung zu ergeben.
    • Beispiel 118 Wasserstoffphosphonatverknüpfung: Allgemeines Verfahren.¹
  • Ein Teil eines festen Trägers (CPG oder anderer polymerer Träger z. B. TentaGel), der mit einem DMT-geschützem Alkohol derivatisiert ist, der durch einen Succinat-Linker (1 umol) verknüpft ist, wurde in eine DNA-Synthesesäule eingebracht, und an einem automatisiertem Synthesizer befestigt, der programmiert ist, um folgende Funktionen auszuführen.
  • 1) Waschen mit Dichlormethan.
  • 2) DMT-Gruppe wurde mit 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan entfernt.
  • 3) Waschen mit Dichlormethan und CH&sub3;CN/Pyridin (1 : 1).
  • 4) Verknüpfen: 1-Minütige Zugabe von wechselnden Teilen von 0,2M Adamantoylchlorid oder Pivaloylchlorid in CH&sub3;CN/Py (1 : 1) und 0,05 M H-Phosphonatmonomer in CH&sub3;CN/Py (1 : 1).
  • 5) Waschen mit CH&sub3;CN/Py (1 : 1).
  • 6) Wiederholen der Schritte 1 bis 5 bis die ganze Sequenz vollständig ist.
  • Das Produkt dieser Sequenz von Reaktionen ist ein H-Phosphonatdiester, der durch eins von mehreren Verfahren, einschließlich der nachstehend beschriebenen, oxidiert wird.
    • Oxidationsverfahren 1: Phosphodiester
  • Der an den festen Träger gebundene H-Phosphonatdiester wird (manuell oder automatisiert) mit gleichen Volumen von Lösung A (0,2M I&sub2; in THF) und Lösung B (N- Methylmorpholin/H&sub2;O/THF 1 : 1 : 8) 5 Min. lang behandelt, gefolgt von gleichen Volumen von Lösung A und Lösung C (TEA/H&sub2;O/THF 1 : 1 : 8) 5 Min. lang, gefolgt von waschen mit CH&sub3;CN/Py (1 : 1).
  • ¹Froehler, B. C. In Methods in Molecular Biology, Bd. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Agrawal, S. Ed.; Humanan press: Totowa, 1993, 63-80.
    • Oxidationsverfahren 2: Phosphorothioat
  • Der an den festen Träger gebundene H-Phosphonatdiester wird (manuell oder automatisiert) mit einer Lösung aus S&sub8; in CS&sub2;/Lutidin 30 Min. lang behandelt. Der feste Träger wird dann mit CH&sub3;CN/Py (1 : 1) gewaschen.
    • Oxidationsverfahren 3: Phosphoramidat
  • Der an den festen Träger gebundene H-Phosphonatdiester wird (manuell oder automatisiert) mit einer Lösung des erfordernten Amins (10% V/V) in CCl&sub4;/Pyridin 15-30 Min. lang behandelt. Der feste Träger wird dann mit CH&sub3;CN/Py (1 : 1) gewaschen.
    • Synthese einer Phosphoramidat-Bibliothek mit einheitlicher PN-Substitution, XPN(NPN)nN
  • Die Bibliothek wird auf Ethylenglycol-CPG oder auf Universal Support CPG (Zeneca, Cambridge, UK) unter Verwendung eines automatisierten DNA Synthetizers synthetisiert. Der feste Träger wird in eine Anzahl von Teilen aufgeteilt, die gleich zu der Anzahl von verwendeten Monomeren ist. Jedes Monomer wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens der H- Phosphonat-Verknüpfung mit dem Träger verbunden. Diese Teile werden gemischt und für die nächste Verknüpfung wieder geteilt. Auf diesem Wege werden die Zufallsoligomere synthetisiert bis die feststehende Position erreicht wird. Der Träger wird wieder in Teile geteilt und jedes Monomer gekuppelt. Zusätzliche Monomere können nach der feststehenden Position durch Ausführen der Verknüpfungen mit den einzelenen Pools hinzugefügt werden. Zusätzliche Zufallspositionen können dem Oligomer durch weiteres Aufteilen von jedem der Pools und rekombinieren nach dem Verknüpfen zugefügt werden, wobei beachtet wird, dass keine Pools mit verschiedenen feststehenden Positionen gemischt werden. Wenn ein Oligomeraufbau vollständig ist, müssen die H-Phosphonat-Bindungen in den einzelnen Untereinheiten nach dem allgemeinen Verfahren 3 oxidiert werden. Dies hat zur Folge, dass die gleiche Phosphoramidat-Bindung zwischen jedem Rest in der Bibliothek hergestellt wird. Wenn stattdessen dem allgemeinen Verfahren 1 oder 2 gefolgt wird, wird eine gesamte Phosphodiester- oder gesamte Phosphorothioat- Bibliothek hergestellt. Die Bibliothek-Pools werden dann von dem festen Träger abgespalten, gereinigt und wie vorstehend beschrieben auf Aktivität untersucht.
    • Synthese einer Phosphoramidat-Bibliothek mit feststehender PN-Substitution, XPN1-NPN2- (NPNn)m-N
  • Synthese einer Phosphoramidat-Bibliothek unter Verwendung von 2-substituierten DMT- Ethylenglycol-H-Phosphonat-Monomeren (P-Amidat: EGP, variable Amine, XPN1-NPN2-(NPNn)m- N). Die Bibliothek wird auf Ethylenglycol-CPG oder auf Universal Support CPG (Zeneca, Cambridge, UK) unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthetizers synthetisiert. Der feste Träger wird in eine Anzahl von Teilen aufgeteilt, die gleich der Anzahl von verwendeten Monomeren (X) ist. Jedes Monomer wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens der H- Phosphonat-Verknüpfung mit dem Träger verbunden. Die Teile werden rekombiniert, und die H- Phosphonatdiester-Bindung wird in ein Phosphoramidat unter Verwendung von Oxiadationsverfahren 3 umgewandelt. Diese Stufen werden wiederholt (teilen, verknüpfen, kombinieren), gefolgt durch Oxiadationsverfahren 3 unter Verwendung eines unterschiedlichen Amins für jede Zufallsposition in dem Oligomer. Bei der feststehenden Position wird der Träger geteilt, die Monomere werden verknüpft, aber die Untereinheiten werden für den Oxidationsschritt separat aufbewahrt. Nach Abspaltung und Aufarbeitung wird eine Bibliothek mit Zufallsmonomeren und einem unterschiedlichen Substituenten bei jeder Phosphoramidat-Verknüpfung erhalten. Es ist ebenfalls möglich, Phosphodiester- und Phosphorothioat-Verknüpfungen bei irgendeiner Position in der Oligomer-Bibliothek durch Substituieren des geeigneten Oxidationsverfahrens einzuführen.
    • Synthese einer Phosphoramidat-Bibliothek mit variabler PN-Substitution, XPNn (NPNn)m-N
  • Die Bibliothek wird auf Ethylenglycol-CPG oder auf Universal Support CPG (Zeneca, Cambridge, UK) unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthetizers synthetisiert. Der feste Träger wird in eine Anzahl von Teilen aufgeteilt, die gleich der Anzahl von verwendeten Monomeren ist. Jedes Monomer wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens der H- Phosphonat-Verknüpfung mit dem Träger verbunden. Die Teile werden rekombiniert, gemischt und in Teile aufgeteilt. Jedes Teil wird mit einem unterschiedlichen Amin nach Oxidationsverfahren 3 oxidiert, gefolgt durch kombinieren und mischen der Träger. Diese Schritte (teilen, verknüpfen, mischen, teilen, oxidieren, mischen) werden bis zur feststehenden Position wiederholt.
  • Der Träger wird dann in Teile geteilt, das Monomer wird verknüpft, und die Harzteile werden wieder für eine Oxidation nach Verfahren 3 geteilt. Nach der Aufarbeitung weist jede Unereinheit einen einheitlichen Monomerrest und Phosphoramidat-Verknüpfung, und eine equimolare Menge an jedem Monomer und Amin in dem Zufallsteil auf. Es ist ebenfalls möglich, Phosphodiester- und Phosphoramidat-Verknüpfungen in den Oligomeren durch oxidieren eines Teils von jedem H-Phosphonatdiester nach Verfahren 1 oder 2 einzubauen.
    • Beispiel 119 Herstellung von 3-Octyl-propan-1,2-diol-phosphodiester-thymidin-phosphodiesterthymidin Trimer
  • Ein Regelporenglasharz, das mit einem 3'-5'-Phosphodiester verbundenen Dimer aus Thymidin [5'-DMT-O-T-O-P(=O)-O-T-CPG] derivatisiert ist, wurde auf eine Standardweise synthetisiert. Das Harz (25,6 mg; 47,5 mmol/g Harz) wurde unter Verwendung von 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan detrityliert und dann sequentiell mit wasserfreiem Acetonitril und Pyridin gewaschen. Das Harz wurde mit einer Lösung aus 3-Octyl-1-O-dimethoxytritylpropandiol-2-H- phoshonat (25 mM) in Adamantoylchlorid (50 mM) und Pyridin fünf Minuten lang kräftig geschüttelt. Das Harz wurde dann wiederholt mit wasserfreiem Pyridin gewaschen und mit Argongas trocken geblasen. 1 ml Iod/Pyridin/Wasser-Lösung (2/90/8) wurde zu der Säule zugegeben und die Säule wurde kräftig geschüttelt. Die Säule wurde nacheinander mit Pyridin und Acetonitril gewaschen und dann mit Argongas trocken geblasen. Produkte wurden von der CPG durch 30-minütige Behandlung mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid abgespalten. Die Ammoniaklösung wurde zur Trockne abgedampft und dann mit 80% Essigsäure in Wasser 30 Minuten lang behandelt, um die Tritylgruppe zu entfernen. Eine Aliquote der Lösung zeigte einen einzigen Peak bei 26,3 Min. bei einer HPLC-Analyse (Vyadec C-18 Säule, Anzeige bei 260 nm, linearer Gradient von Ammoniumacetatpuffer (pH 7)-Acetonitril, 0-75% Acetonitril in 52 Minuten), der dem Phosphodiester Trimer entspricht.
    • Beispiel 120 Herstellung von 3-Octyl-propan-1,2-diol-morpholinophosphoramidat-thymidin- phosphodiester-thymidin Trimer
  • Ein 1-O-Dimethoxytrityl-3-octyl-propandiol-2-O-P(H)-O-T-O-P(=O)-O-T-CPG-Harz, das wie in Beispielen 118 und 119 hergestellt wird, wird mit 1 ml einer Lösung aus Morpholin/Tetrachlorkohlenstoff/Pyridin (1/5/5) 30 Minuten lang kräftig geschüttelt. Das Harz wird sequentiell mit Pyridin und dann mit Acetonitril gewaschen und dann mit Argongas trocken geblasen. Produkte werden von der CPG durch 30-minütige Behandlung mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid abgespalten. Die Ammoniaklösung wird zur Trockne abgedampft und dann mit 80% Essigsäure in Wasser 30 Minuten lang behandelt, um die Tritylgruppe zu entfernen. Eine Aliquote der Lösung wird für HPLC-Analyse des resultierenden Morpholinophosphoramidat Trimers verwendet.
    • Beispiel 121 Herstellung von 3-(N-Piperidin)-propan-1,2-diol-phosphodiester-thymidin-phosphodiesterthymidin Trimer
  • Ein Regelporenglasharz, das mit einem 3'-5'-Phosphodiester verbundenem Dimer aus Thymidin[5'-DMT-O-T-O-P(=O)-O-T-CPG] derivatisiert war, wurde nach Standardweise synthetisiert. Das Harz (24,6 mg; 47,5 mmol/g Harz) wurde unter Verwendung von 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan detrityliert und dann sequentiell mit wasserfreiem Acetonitril und Pyridin gewaschen. Das Harz wurde mit einer 1 ml Lösung des 1-(N-Piperidin)-3-O- dimethoxytritylpropandiol-2-H-phoshonats (25 mM) in Adamantoylchlorid (50 mM) und Pyridin fünf Minuten lang kräftig geschüttelt. Das Harz wurde dann wiederholt mit, wasserfreiem Pyridin gewaschen und mit Argongas trocken geblasen. 1 ml Iod/Pyridin/Wasser-Lösung (2/90/8) wurde zu der Säule zugegeben und kräftig geschüttelt. Die Säule wurde nacheinander mit Pyridin und Acetonitril gewaschen und dann mit Argongas trocken geblasen. Produkte wurden von der CPG durch 30-minütige Behandlung mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid abgespalten. Die Ammoniaklösung wurde zur Trockne abgedampft und der Rückstand mit 80% Essigsäure in Wasser 30 Minuten lang behandelt, um die Tritylgruppe zu entfernen. Eine Aliquote der Lösung zeigte einen einzigen Peak bei 12,4 Min. bei einer HPLC-Analyse unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen.
    • Beispiel 122 Herstellung von 1-N-Piperidin-3-O-dimethoxytrityl-propandiol-2- morpholinophosphoramidat-thymidin-phosphodiester-thymidin Trimer
  • Ein 3-O-Dimethoxytrityl-1-N-piperidin-propandiol-2-O-P(H)-O-T-O-P(=O)-O-T-CPG Harz, das wie in Beispielen 118 und 119 hergestellt wird, wird mit 1 ml einer Lösung aus Morpholin/Tetrachlorkohlenstoff/Pyridin (1/5/5) 30 Minuten lang kräftig geschüttelt. Das Harz wird sequentiell mit Pyridin und dann mit Acetonitril gewaschen und dann mit Argongas trocken geblasen. Produkte werden von der CPG durch 30-minütige Behandlung mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid abgespalten. Die Ammoniaklösung wird zur Trockne abgedampft und dann mit 80% Essigsäure in Wasser 30 Minuten lang behandelt, um die Tritylgruppe zu entfernen. Eine Aliquote der Lösung wird für HPLC-Analyse des resultierenden Morpholinophosphoramidat Trimers verwendet.
    • Beispiel 123 Einbau von Monomereinheiten in oligomere Strukturen unter Verwendung einer kombinatorischen Technik-Allgemeines Verfahren
  • Ein fester Träger (universeller Träger von Cambridge Research Biochemicals) wird in Teile mit gleichem Gewicht geteilt. Die Anzahl an Teilen ist gleich der Anzahl der Teile an Monomeren in der kombinatorischen Bibliothek. Jeder Teil wird mit einem der gewünschten Amidite unter Verwendung von Tetrazol als Katalysator zur Reaktion gebracht, gefolgt von Oxidation des Phosphittriesters zu dem Phosphat durch den Standardkupplungscyclus von Beispiel 115. Der DMT-Ether wird unter Verwendung von Trichloressigsäure in CH&sub2;Cl&sub2; abgespalten, um die Hydroxyl-Gruppe an dem Ende des verlängerten Oligomers zu regenerieren. Die Verlängerung der Verknüpfungsreaktion wird auf 90% optimiert, vervollständigt durch variieren der Amidit- Konzentration und der Gesamtequivalente und der Verknüpfungszeit. Nach einer Verknüpfung werden die Träger von einzelnen Verknüpfungsreaktionen sorgfältig gemischt, anschließend gleichmäßig geteilt und Amidite werden wieder einzeln mit einem Teil des Trägers zur Reaktion gebracht. Dieser Cyclus wird für jede Zufallsposition wiederholt, bis die 'feststehende' Position erreicht wird.
  • Bei der 'feststehenden' Position des Oligomers wird jedes Amidit einzeln mit einem Teil des Trägers zur Reaktion gebracht, aber die Teile werden nicht gemischt. Stattdessen wird jede Untereinheit weiterhin in die Anzahl an Teilen geteilt, die der Anzahl an Monomeren entspricht. Jeder Trägerteil wird dann mit einem unterschiedlichen Amidit zur Reaktion gebracht, gefolgt von mischen, wie vorstehend. Wiederholen dieses Cyclus für jede der unterschiedlichen Untereinheiten der Träger resultiert in Randomisation bei Positionen, die den feststehenden Positionen in der Sequenz folgen. Die resultierenden Untereinheiten sind nur in der feststehenden Position einzigartig.
  • Bei Fertigstellung der Oligomersynthese werden die Oligomere von dem festen Träger abgespalten und Phosphatschutzgruppen werden durch 1-2-stündige Inkubation in konzentriertem Ammoniak bei Raumtemperatur entfernt. Der Überstand, der das Oligomer enthält, wird dann von der Silicamasse entfernt und 6-16 Stunden lang bei 55ºC inkubiert, um die Schutzgruppen von den Rückständen zu entfernen. Das Oligomer wird entsalzt und Schutzgruppen werden durch HPLC-Größenausschluss-Chromatographie entfernt.
    • Beispiel 124 Bewertung von Verknüpfungseffizienz von Phosphoramidatmonomeren
  • Das folgende Verfahren wird verwendet, um die Ethylenglycolphosphoramidate oder andere Phosphoramidate auf Eignung zur Verwendung in einer Zufallssequenz-Festzustand-Oligomer- Synthese zu bewerten. Ein Träger für Festphasensynthese, der eine interne Referenz enthält, wird verwendet, um die Verknüpfungseffizienz zu bestimmen, den Extinktionskoeffizienten einzuschätzen, und die Verknüpfungsproduktqualität des Testphosphoramiditmonomers wie folgt zu bewerten:
  • Ein Testmonomer-Träger wird als interner Standard ausgewählt. Unter Verwendung von dT als Symbol für Thymidin, dC als Symbol für Deoxycytidin und anderen Abkürzungen, die in dem nachstehenden Text vermerkt sind, wird bei einem veranschaulichendem Testsystem an CPG- gebundenes Thymidin, das als dT-CPG identifiziert ist, als Test-Monomerträger verwendet und 5'-O-Acetyl-geschütztes, an CPG gebundenes Cytosin, das als 5'-Ac-dC-CPG identifiziert ist, wird als der interne Standard verwendet.
  • Reaktives dT-CPG wird mit einem geringeren Molarequivalent von unreaktivem 5'-Ac-dC-CPG gemischt. Der unreaktive 5'-Ac-dC-CPG interne Standard ermöglicht eine exakte Bestimmung des nicht-reagierten dT, das vor und nach der Verknüpfungsreaktion vorliegt.
  • Die Peakfläche von dT kann als AT identifiziert und die Peakfläche von dC als AC identifiziert werden. Das Anfangsverhältnis von Peakflächen von dT und dc, d. h., (AT/AC)&sub0; wird durch Abspaltung, Entschützung, und HPLC-Analyse eines Aliquots der CPG-Mischung bestimmt. Messungen werden bei einer Wellenlänge von 260 nm vorgenommen. Relative Mole von dC können als C identifiziert werden, und relative Mole von dT können als T identifiziert werden. Diese werden aus Peakflächen, Ac bzw. AT, unter Verwendung bekannter Extinktionskoeffizienten berechnet werden: C = Ac/εc und T = AT/εT. Dann kann die relative Peakfläche oder die molare Menge von dT, die anfangs vorliegt immer von der Peakfläche von dC berechnet werden:
  • AT0 = (Ac)[(AT/AC)&sub0;]
  • T&sub0; = (C)[(T/C)&sub0;]
  • auch,
  • (C)(T/C) = (AC/εC)[(AT/εT)/(AC/εC)] = (Ac/εc)(AT/AC)/(εC/εT)
  • folglich,
  • (C) [(T/C)&sub0;] = (AC/εC)[(AT/AC)&sub0;](εC,εT) = (AC/εT)[(AT/AC)&sub0;]
  • Ein interessantes Amiditmonomer, das als X identifiziert ist, wird mit einem Aliquot der CPG Mischung zur Reaktion gebracht. Reagiertes CPG wird abgespalten und mit Ammoniak entschützt, dann durch HPLC analysiert, um zu bestimmen: Die Fläche unter dem Peak für dC, d. h. AC; die Fläche unter dem Peak für nicht-reagiertes dT, d. h. ATur; und die Fläche unter dem Peak für X-T Dimer, d. h., AXT. Diese Werte werden verwendet, um die Verknüpfungseffizienz, C. E., und den X-T Dimer Extinktionskoeffizienten εXT zu berechnen.
  • Die Verknüpfungseffizienz, C. E., wird duch das Verhältnis von reagiertem dT, d. h. Tr, und dem Gesamt-dT, d. h., To definiert. Folglich, C. E. = Tr/T&sub0;. Die Verknüpfungseffizienz kann von den relativen Molen von nicht-reagiertem dT, vor, d. h. T&sub0;, und nach, d. h. Tur, Verknüpfung mit X bestimmt werden; alle drei hängen durch die Gleichung zusammen:
  • T&sub0; = Tr + Tur
  • Weil C. E. eine einheitsloser Wert ist, können HPLC-Peakflächen anstelle von relativen molaren Mengen verwendet werden, um die Berechnung durchzuführen:
  • C. E. = (Tr/T&sub0;) = (T&sub0;/T&sub0;) - (Tur/T&sub0;) = 1 - (Tur/T&sub0;) = 1 - (ATur/εT)/(AT0/εT) = 1 - (ATur/AT0) = 1 - (ATur)/[(AC)[(AT/AC)&sub0;)]
  • Die Vorstehenden sind alle messbare Mengen.
  • Der Extinktionskoefflzient ε für X, d. h., εXT, bei dem vorliegenden HPLC-Lösungssystem wird durch die C. E. für X und die realtiven Flächen der HPLC-Peaks bestimmt. Die Menge von X-T ist gleich der Menge von T, das reagiert hat. ε für dimeres X-T wird als die Peakfläche AxT definiert, die durch die Mole von in X-T vorliegendem X-T-Dimer geteilt wird, und wird wie folgt berechnet wird:
  • XT = Tr = (C. E.) (T&sub0;)
  • εXT = (AXT/XT) = (AXT)/(C. E.)(T&sub0;) = (AXT)/(C. E.)(C)[(T/C&sub0;)] = (AXT)/(C. E.)(AC/εT)[(AT/AC)&sub0;]
  • Die Vorstehenden sind alle messbare Mengen.
  • Schließlich kann die Qualität des Verknüpfungsproduktes X-T von dem Aussehen des HPLC- Chromatogramm bewertet werden. Andere signifikante Peaks (deren Aufsummierung > 10% der Produktfläche), als die die erwartet werden, sollten ebenfalls angesprochen werden. Oft sind sie das gewünschte X-T-Dimer, das Schutzgruppen behalten hat. Verschwinden dieser Peaks mit verlängerter Ammoniakbehandlung bestätigt, dass das Monomer längere Ammoniak- Entschützung als die Standard-Zeit erfordert. In anderen Fällen können die Extra-Peaks als unerwünschte Nebenprodukte oder in einigen Fällen können sie nicht identifiziert werden. Im Allgemeinen können eine Verknüpfungseffizienz von weniger als etwa 90%, eine erforderte Ammoniak-Entschützungszeit von mehr als einigen Tagen, oder das Auftreten von Nebenproduktenanteilen größer als 10% (durch UV Extinktion) als Anfangs-Richtlinien ausgewählt werden, um die Ausschließmöglichkeit eines Amidits vom Gesichtspunkt zur Verwendung in einem besonderen Satz an Amidaten zu bewerten, die beim Erzeugen von oligomeren Zufallsverbindungen verwendet werden.
    • Beispiel 125 Bewertung der Verknüpfungseffizienz eines veranschaulichenden Ethylenglycolphosphoramiditmonomers
  • Ethylenglycolphosphoramidate werden mit einem dT-CPG-Festphasen-Syntheseträger unter Bildung von Dimeren und Trimeren verbunden. Die Verknüpfung wird nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 124 durchgeführt. Die Synthese der Dimere und Trimere wird mit einem ABI 394 DNA Standard-Synthetizer (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von Standard DNA Synthesereagenzien und Syntheseprotokollen, mit der Ausnahme einer verlängerten (5 Minuten) Verknüpfungszeit durchgeführt, die jedem Synthesecyclus hinzugefügt wurde. Die Oligomere werden von dem festen Träger durch 3-tägige Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 4ºC abgespalten. Der Überstand wird von dem Träger entfernt und in einem Einschluß-Vial acht Stunden lang bei 55ºC erwärmt. Diese Lösung wird gekühlt, und der Ammoniak durch Abdampfen entfernt. Die Oligomere werden direkt auf einer Umkehrphasen- HPLC-Säule (Waters Nova-Pak Phenyl, Kat. # 10656; Millipore Corp., Milford, MA) unter Verwendung eines Gradienten aus 1% bis 75% Acetonitril in 0,1 M Ammoniumacetat; pH 7; über 50 Minuten analysiert. Das HPLC-System ist ein Waters mit einem 991 Detektor, 625 LC- Pumpe, und 714 WISP Autoinjektor. Berechnungen werden unter Verwendung von Daten durchgeführt, die bei einer Wellenlänge von 260 nm gesammelt werden.
    • Beispiel 126 Synthese einer oligomeren Ethylenglycolphosphat-Bibliothek
  • Ethylenglycolphosphatoligomere (EGP) werden unter Verwendung von Standard DNA Phosphoramiditchemie synthetisiert. Die folgenden sechs EGP-Phosphoramidite wurden in die oligomere Bibliothek eingebaut: Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Carbazol und Imidazol. EGP- Phosphoramidite wurden in wasserfreiem Acetonitril (CH&sub3;CN) zu 0,2M gelöst, mit der Ausnahme, dass EGP-Guanin ("egG") zuerst in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) zu 2M gelöst wurde und anschließend weiter zu 0,2M mit CH&sub3;CN verdünnt wurde. EGP-Phosphoramidite wurden mit einem 1-2 umol Regelporenglas (CPG)-Träger auf einem ABI 394 DNA Synthetizer unter Verwendung des Standard ABI Cycluses für eine 1 umol Maßstab Cyanethylphosphoramiditsynthese bei der Verknüpfungswartezeit verbunden, die um 5 Minuten erhöht war. Durch Auswechseln der Iod-Oxidationslösung durch eine 0,1 M Lösung aus 3H-1,2-Benzodithiol-3-on- 1,1-dioxid (Beaucage) in Acetonitril wurden ebenfalls Phosphorothioatoligomere synthetisiert. Die 5'-Dimethoxytrityl-Gruppe (DMT) eines Oligomers, das mit einem 5'-EGP-Rest endete, wurde nicht vor dem Abspalten des Oligomers von dem CPG-Träger entfernt. Detritylierung des 5'-Hydroxyls vor der Abspaltung in Amminiumhydroxid (NH&sub4;OH) führt durch die Hydrolyse des 5'-EGP-Rests zu einem cyclischen Phosphat.
  • EGP-Oligomere wurden von CPG in 1 ml 30% NH&sub4;OH 1 Stunde lang bei Raumtemperatur abgespalten. Abgespaltenes Oligomer wurde in NH&sub4;OH über Nacht (Typischerweise 12-18 Stunden) bei 55ºC entschützt. NH&sub4;OH wurde dann von dem Olgomer durch Abdampfen in dem Savant Speedvac entfernt. Das 5'-Hydroxyl wurde durch Abspalten der DMT von dem Oligomer in 1 ml 80% Essigsäure (HOAc) 1 Stunde lang entschützt. HOAc wurde dann von dem Oligomer durch Abdampfen in dem Speedvac entfernt.
  • Die Oligomere wurden in H&sub2;O resuspendiert und weiter durch eine oder mehrere von drei Verfahren gemäß Beispiel 127 gereinigt.
    • Beispiel 127 Allgemeine Oligomer-Reinigungs-Verfahren Verfahren A-Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie
  • Um Oligomere durch Umkehrphasenchromatographie zu entsalzen, wurde das Oligomer auf eine Umkehrphasensäule in etwa 100 mM Ammoniumacetat (NH&sub4;OAc) oder Natriumacetat (NaOAc) aufgebracht. Diese Säule wurde mit mehreren Säulenvoluminas (10-20) WO gewaschen, um zu entsalzen. Das Oligomer wurde mit einem Gradienten von 0% bis 100% Methanol eluiert.
    • Verfahren B-Größen-Ausschluß-Chromatouraphie
  • Um durch Größen-Ausschluß zu entsalzen, wurde das Oligomer auf eine Größen-Ausschluß- Säule, typischerweise Sephadex G10 oder G25 1,6 · 50 cm, aufgebracht, die mit der HPLC verbunden ist und mit H&sub2;O bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert. Die Oligomere eluieren in etwa 2-3 Stunden von der Säule, gefolgt von Salzen und Schutzgruppen.
    • Verfahren C-Ethylacetat-Extraktion
  • Die Oligimere können ebenfalls von den Schutzgruppen durch Ethylacetat-Extraktion gereinigt werden; aber, dieses Verfahren entsalzt nicht das Oligomer. Nach DMT-Abspaltung mit HOAc, wurde das getrocknete Oligomer in 1-2 ml Wasser resuspendiert. Ethylacetat (1 ml) wurde zu dem Oligomer zugegeben und gevortext, um Phasen zu mischen. Nachdem sich die H&sub2;O- und Ethylacetat-Phasen trennten, wurde die obere Phase, die die Ethylacetat-Phase ist, die DMT und Benzamid-Schutzgruppen enthält, von der H&sub2;O-Phase entfernt, die das Oligomer enthält. Drei Extraktionen mit Ethylacetat sind ausreichend, um das DMT und Benzamid von dem Oligomer zu entfernen.
  • Nach Reinigung durch Chromatographie oder Extraktion wurde das oligomer durch Abdampfen in dem Speedvac getrocknet. Das Oligomer wurde in H&sub2;O, typischerweise zu 0,5-2mM, resuspendiert und ≤20ºC gelagert.

Claims (31)

1. Verbindung mit einer Struktur I:
worin:
X eine aktivierte Phosphat-Gruppe, eine aktivierte 5-Phosphit-Gruppe oder ein fester Träger ist;
Y eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; und
Z ein Purin, ein Pyrimidin, ein Stickstoff-haltiger Heterocyclus, oder ein C&sub1; bis C&sub1;&sub0; geradkettiges oder verzweigtes Alkyl ist.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X eine aktivierte Phosphit-Gruppe oder ein fester Träger ist.
3. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X eine aktivierte Phosphit-Gruppe ist und Z Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin oder Thymin ist.
4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin Z ein C&sub1; bis C&sub1;&sub0; geradkettiges oder verzweigtes Alkyl ist.
5. Verbindung mit einer Struktur II:
worin:
X H, eine Phosphat-Gruppe, eine aktivierte Phosphat-Gruppe, eine aktivierte Phosphit-Gruppe, ein fester Träger, eine konjugierte Gruppe oder ein Oligonucleotid ist;
Y H, eine Hydroxyl-Schutzgruppe, eine konjugierte Gruppe oder ein Oligonucleotid ist;
E O oder S ist;
EE O&supmin; oder N(Y&sub0;)T&sub0; ist, vorausgesetzt, daß mindestens ein EE N(Y&sub0;)T&sub0; ist;
Y&sub0; H, oder [Q&sub2;]jj-Z&sub2; ist;
T&sub0;[Q&sub1;]kk-Z&sub1; ist, oder Y&sub0; und T&sub0; zusammen in einem Stickstoff-Heterocyclus miteinander verbunden sind;
Q&sub1; und Q&sub2;, unabhängig, C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkenyl, C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkynyl, C&sub4;-C&sub7;-Carbocycloalkyl oder -alkenyl, ein Heterocyclus, ein Ether mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Sauerstoff oder Schwefelatomen, ein Polyalkylglycol, oder C&sub7;-C&sub1;&sub4;-Aralkyl sind;
jj und kk, unabhängig, 0 oder 1 sind;
Z&sub1; und Z&sub2;, unabhängig, H, C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl, C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkenyl, C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkynyl, C&sub6;-C&sub1;&sub4;-Aryl, C&sub7;-C&sub1;&sub5;- Aralkyl, ein Halogen, CH=O, OR&sub1;, SR&sub2;, NR&sub3;R&sub4;, C(=NH)NR&sub3;R&sub4;, CH(NR&sub3;R&sub4;), NHC(=NH)NR&sub3;R&sub4;, CH(NH&sub2;)C(=O)OH, C(=O)NR&sub3;R&sub4;, C(=O)OR&sub5;, eine Metall-Koordinations- Gruppe, eine Reporter-Gruppe, ein Stickstoff-haltiger Heterocyclus, ein Purin, ein Pyrimidin, eine Phosphatgruppe, eine Polyethergruppe, oder eine Polyethylenglycolgruppe sind;
Z L&sub1;, L&sub1;-G&sub1;, L&sub2;, L&sub2;-G&sub2;, NR&sub3;R&sub4;, ein Stickstoff-haltiger Heterocylus, ein Purin, ein Pyrimidin, eine Phosphatgruppe, eine Polyethergruppe, oder eine Polyethylenglycolgruppe ist, vorausgesetzt, daß mindestens zwei der Z und Zm verschiedene Hälften sind;
L&sub1; Alkyl mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen oder Alkynyl mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen ist;
L&sub2; Aryl mit 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 7 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen ist;
G&sub1; Halogen, OR&sub1;, SR&sub2;, NR&sub3;R&sub4;, C(=NH)NR&sub3;R&sub4;, NHC(=NH)NR&sub3;R&sub4;, CH=O, C(=O)OR&sub5;, CH(NR&sub3;R&sub4;)(C(=O)OR&sub5;), C(=O)NR&sub3;R&sub4;, eine Metall-Koordinations-Gruppe, oder eine Phosphatgruppe ist;
G&sub2; Halogen, OH, SH, SCH&sub3;, oder NR&sub3;R&sub4; ist;
R&sub1; H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist;
R&sub2; H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Thiol-Schutzgruppe ist;
R&sub3; und R&sub4;, unabhängig, H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Amino- Schutzgruppe sind;
R&sub5; H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Säureschutzgruppe ist;
Q L&sub1;, G&sub3;, L&sub1;-G&sub3; oder G&sub3;-L&sub1;-G&sub3; ist;
G&sub3; NR&sub3;, C(=O), C(=S), C(O)-O, C(O)-NH, C(S)-O, C(S)-NH, oder S(O)&sub2;, NR&sub3;C(=O), NR&sub3;C(=S), NR&sub3;C(O)-O, NR&sub3;C(O)-NH, NR&sub3;C(S)-O, NR&sub3;C(S)-NH oder NR&sub3;S(O)&sub2; ist;
n 0 oder list;
j 1 bis 6 ist; und
m 1 bis 50 ist.
6. Verbindung gemäß Anspruch 5. worin Y eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist.
7. Verbindung gemäß irgendeinem vorstehenden Anspruch, worin Y Trityl, Methoxytrityl, Dimethoxytrityl, oder Trimethoxytrityl ist.
8. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin X H, eine aktivierte Phosphitgruppe, oder ein fester Träger ist.
9. Verbindung gemäß irgendeinem vorstehenden Anspruch, worin X ein Phosphoramidit ist.
10. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin n 1 ist und Q und jedes Qm, unabhängig, eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Carboxy-, Acetyl-, Amido-, Succinyl-, Carbamoyl-, Thiocarbamoyl-, Ureido-, Thioureido-, oder Sulfonamidoacyl-Gruppe sind.
11. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 5, worin Z und jedes Zm Stickstoff-haltige Heterocyclen sind.
12. Verbindung gemäß Anspruch 11, worin der Stickstoff-haltige Heterocyclus Imidazol, Pyrrol oder Carbazol ist.
13. Verbindung gemäß Anspruch 12, worin Z und jedes Zm, unabhängig, Imidazol oder Carbazol sind.
14. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 5, worin Z und jedes Zm, unabhängig, Purine oder Pyrimidine sind.
15. Verbindung gemäß Anspruch 14, worin Z und jedes Zm, unabhängig, Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin oder Thymin sind.
16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin n 0 ist.
17. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin Z und jedes Zm, unabhängig, Alkyl mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen sind.
18. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin Z und jedes Zm, unabhängig, C&sub1;-C&sub6; Alkyl-NH&sub2; sind.
19. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin Z und jedes Zm, unabhäng, Aryl mit 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 7 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen sind.
20. Verbindung gemäß Anspruch 19, worin Z und jedes Zm, unabhängig, Carbazol, Phenyl oder Benzyl sind.
21. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin Z und jedes Zm, unabhängig, Glutamyl sind.
22. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin m 1 bis etwa 25 ist.
23. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin Em 0 ist.
24. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin jedes Em S ist.
25. Verbindung gemäß Anspruch 5. worin sich Z und jedes Zm der Verbindung in einer vorbestimmten Sequenz befinden.
26. Verbindung gemäß Anspruch 5. worin Z und jedes Zm von der Verbindung sich in einer Zufallssequenz befinden.
27. Verfahren zur Herstellung einer oligomeren Verbindung mit einer wie in Anspruch 5 definierten Struktur II, enthaltend:
Auswählen aus einer Gruppe von Monomeren, wobei jedes der Monomere eine Struktur III hat
worin:
X H, eine Phosphat-Gruppe, eine aktivierte Phosphat-Gruppe, eine aktivierte Phosphit-Gruppe, ein fester Träger ist;
Y H oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist;
Z L&sub1;, L&sub1;-G&sub1;, L&sub2;, L&sub2;-G&sub2;, NR&sub3;R&sub4;, ein Stickstoff-haltiger Heterocylus, ein Purin, ein Pyrimidin, eine Phosphatgruppe, eine Polyethergruppe, oder eine Polyethylenglycolgruppe ist,
L&sub1; Alkyl mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen oder Alkynyl mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen ist;
L&sub2; Aryl mit 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 7 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen ist;
G&sub1; Halogen, OR&sub1;, SR&sub2;, NR&sub3;R&sub4;, C(=NH)NR&sub3;R&sub4;, NHC(=NH)NR&sub3;R&sub4;, CH=O, C(=O)OR&sub5;, CH(NR&sub3;R&sub4;)(C(=O)OR&sub5;), C(=O)NR&sub3;R&sub4;, eine Metall-Koordinations-Gruppe, oder eine Phosphatgruppe ist;
G&sub2; Halogen, OH, SH, SCH&sub3;, oder NR&sub3;R&sub4; ist;
R&sub1; H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist;
R&sub2; H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Thiol-Schutzgruppe ist;
R&sub3; und R&sub4;, unabhängig, H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Amino- Schutzgruppe sind;
R&sub5; H, Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen oder eine Säureschutzgruppe ist;
Q L&sub1;, G&sub3;, L&sub1;-G&sub3; oder G&sub3;-L&sub1;-G&sub3; ist;
G&sub3; NR&sub3;, C(=O), C(=S), C(O)-O, C(O)-NH, C(S)-O, C(S)-NH, oder S(O)&sub2;, NR&sub3;C(=O), NR&sub3;C(=S), NR&sub3;C(O)-O, NR&sub3;C(O)-NH, NR&sub3;C(S)-O, NR&sub3;C(S)-NH oder NR&sub3;S(O)&sub2; ist;
n 0 oder 1 ist;
j 1 bis 6 ist; und
kovalente Bindung von wenigstens zwei der Monomere der Gruppe, um die oligomere Verbindung zu bilden.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, worin die Z-Hälfte von mindestens einem Monomer der Gruppe verschieden von der Z-Hälfte von einem anderen Monomer der Gruppe ist.
29. Verfahren gemäß Anspruch 27, worin m 1 bis 40 ist.
30. Oligomere Verbindung, hergestellt durch das Verfahren gemäß Anspruch 27, worin m 1 bis 25 ist.
31. Heterozygote oligomere Verbindung mit einem zentralen Bereich, der einen Phosphodiester oder ein Phosphorthioatoligodeoxynucleotid enthält, der bzw. das den Raum zwischen Seitenregionen einnimmt, die eine Struktur II haben:
worin X, Y, Z, Q, E, EE, n, m, und j wie in Anspruch 5 definiert sind, aber ohne die Maßgabe, daß mindestens zwei von Z und Zm verschiedene Hälften sind.
DE69526331T 1994-01-11 1995-01-11 Monomere diole und daraus gebildete phosphatverknüpfte oligomere Expired - Fee Related DE69526331T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/179,970 US6448373B1 (en) 1994-01-11 1994-01-11 Phosphate linked oligomers formed of monomeric diols and processes for preparing same
PCT/US1995/000449 WO1995018820A1 (en) 1994-01-11 1995-01-11 Monomeric diols and phosphate linked oligomers formed therefrom

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69526331D1 DE69526331D1 (de) 2002-05-16
DE69526331T2 true DE69526331T2 (de) 2002-08-08

Family

ID=22658750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69526331T Expired - Fee Related DE69526331T2 (de) 1994-01-11 1995-01-11 Monomere diole und daraus gebildete phosphatverknüpfte oligomere

Country Status (7)

Country Link
US (2) US6448373B1 (de)
EP (1) EP0739351B1 (de)
JP (1) JP3072127B2 (de)
AT (1) ATE215960T1 (de)
CA (1) CA2180867C (de)
DE (1) DE69526331T2 (de)
WO (1) WO1995018820A1 (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6184389B1 (en) 1994-01-11 2001-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Combinatorial libraries having aminodiol monomer subunits
US6828427B1 (en) 1994-01-11 2004-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric aminodiol-containing compounds, libraries thereof, and process of preparing the same
US6548651B1 (en) * 1998-11-11 2003-04-15 Pantheco A/S Modified peptide nucleic acid (PNA) molecules
JP4183999B2 (ja) 2002-07-29 2008-11-19 日鉱金属株式会社 イミダゾールアルコールを有効成分とする表面処理剤
GB0400290D0 (en) 2004-01-08 2004-02-11 Medivir Ab dUTPase inhibitors
KR101019728B1 (ko) 2008-09-29 2011-03-07 엔자이텍 주식회사 라세믹 또는 광학적으로 활성이 있는 α―포스파티딜콜린 유도체의 제조방법
US8394948B2 (en) * 2009-09-30 2013-03-12 Glen Research Corporation Reagents utilizing a serinol scaffold for labeling synthetic oligonucleotides
AU2011214465A1 (en) 2010-02-10 2012-08-30 Novartis Ag Methods and compounds for muscle growth
EP3484908A4 (de) 2016-07-15 2020-04-08 AM Chemicals Llc Nicht-nukleosidische feste träger und phosphoramiditbausteine für die oligonukleotidsynthese
WO2018127820A2 (en) * 2017-01-04 2018-07-12 Sorrento Therapeutics Cell internalizing compounds
CN115942939B (zh) * 2019-09-27 2025-09-02 布伦塔诺生物技术联合公司 用于核苷酸探针的非对映体连接试剂
AU2020375734B2 (en) * 2019-10-28 2026-04-09 Geron Corporation Crystalline solids of 3-palmitoyl-amido-1,2-propanediol and 3-palmitoyl-amido-2-hydroxy-1-dimethoxytriphenylmethylether-propane and methods of making and using the same
KR20250134660A (ko) * 2023-02-21 2025-09-11 히트젠 주식회사 뉴클레오티드 유사체 및 그 제조 방법과 용도
WO2025148770A1 (zh) * 2024-01-08 2025-07-17 成都先导药物开发股份有限公司 修饰的核苷酸单体及其用途

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3856835A (en) * 1970-10-14 1974-12-24 Uniroyal Inc Reaction product of an organometallic compound and an aminopolyol
US5550111A (en) * 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
EP0241487B1 (de) 1985-08-28 1998-04-22 PIECZENIK, George Verfahren und mittel zur sortierung und bestimmung biologischer informationen
US5650510A (en) * 1986-11-18 1997-07-22 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Antiviral phosphonomethoxyalkylene purine and pyrimidine derivatives
CA1339303C (en) 1987-09-21 1997-08-19 Lyle John Arnold Jr. Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5212295A (en) 1990-01-11 1993-05-18 Isis Pharmaceuticals Monomers for preparation of oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
JPH05506774A (ja) 1990-02-14 1993-10-07 リセプター　ラボラトリーズ　インコーポレーテッド 有益ペプチドの産生法およびスクリーニング法
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
JPH06502300A (ja) 1990-08-03 1994-03-17 サノフィ 遺伝子発現の抑制のための化合物及び方法
NZ239250A (en) 1990-08-09 1993-12-23 Genta Inc Chirally pure non-nucleotide reagents for use in preparing
JP3116079B2 (ja) * 1990-08-10 2000-12-11 インスティチュート オブ オーガニック ケミストリ アンド バイオケミストリ アカデミー オブ サイエンス オブ ザ チェコ リパブリック ヌクレオチドの新規な製法
DE69133511T2 (de) 1990-08-13 2006-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Zuckermodifizierte oligonukleotide zum erkennen und steuern der genexpression
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5144045A (en) * 1990-11-13 1992-09-01 American Cyanamid Company Phosphocholine derivative inhibitors of phospholipase A2
US5121295A (en) * 1991-02-13 1992-06-09 Flytech Technology Company, Ltd. Computer interface card mounting device
US5419966A (en) * 1991-06-10 1995-05-30 Microprobe Corporation Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides
US5672472A (en) 1991-08-23 1997-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthetic unrandomization of oligomer fragments
EP0724447B1 (de) 1991-10-24 2003-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen
US5210264A (en) 1992-01-10 1993-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. S-(2,4-dichlorobenzyl)-β-cyanoethyl phosphorothioate diester
US6300058B1 (en) 1992-01-29 2001-10-09 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Method for measuring messenger RNA
US5656745A (en) * 1993-09-17 1997-08-12 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
US5886177A (en) * 1994-01-11 1999-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphate linked oligomers

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09508105A (ja) 1997-08-19
EP0739351A1 (de) 1996-10-30
JP3072127B2 (ja) 2000-07-31
EP0739351A4 (de) 1998-10-21
DE69526331D1 (de) 2002-05-16
US20030065146A1 (en) 2003-04-03
ATE215960T1 (de) 2002-04-15
CA2180867C (en) 2004-12-14
CA2180867A1 (en) 1995-07-13
WO1995018820A1 (en) 1995-07-13
EP0739351B1 (de) 2002-04-10
US6448373B1 (en) 2002-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5886177A (en) Phosphate linked oligomers
US5714606A (en) Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5717083A (en) Phosphoramidate and phosphorothiomidate oligomeric compounds
EP0152459B1 (de) Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
DE69030745T2 (de) Verfahren und Reagens zur Sulfurierung von Organophosphiten
AU739468B2 (en) Activators for oligonucleotide synthesis
DE69227793T2 (de) Verfahren und Verbindungen für die Festphase-Synthese von Oligonukleotiden und Analogen
JPH02169598A (ja) 新規なハイドロゲンホスホノジチオエート組成物
EP0399330A1 (de) Modifiziertes Phosphoramidit-Verfahren zur Herstellung von modifizierten Nukleinsäuren
EP2753607A1 (de) Bicyclo-[6,1,0-]non-4-yn-reagenzien zur chemischen modifizierung von oligonukleotiden
WO1995001363A1 (de) Methylphosphonsäureester, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
JPH10512569A (ja) 非ヌクレオチドリンエステルオリゴマー
EP0739351B1 (de) Monomere diole und daraus gebildete phosphatverknüpfte oligomere
DE60209128T2 (de) Aktivatoren für die oligonukleotidsynthese
DE60103145T2 (de) Verfahren zur herstellung von phoshphorothioate triestere
DE60109047T2 (de) Synthone zur herstellung von oligonukleotiden
US6184389B1 (en) Combinatorial libraries having aminodiol monomer subunits
EP1012152B1 (de) Verfahren zur herstellung von oxazaphosphorin-2-aminen
DE69732101T2 (de) Kombinatorische schutzgruppestrategie für multifunktionelle molekule
EP0391850A2 (de) Ungesättigte Aminodicarbonsäurederivate
DE69129399T2 (de) Phosphorylierungsmittel und Verfahren zur Bildung einer asymmetrischen Phosphodiesterbindung unter Verwendung desselben Mittels

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee