DE69534873T2

DE69534873T2 - Für eine glutamat-dekarboxylase-aktivität kodierende rekombinierende viren

Info

Publication number: DE69534873T2
Application number: DE69534873T
Authority: DE
Inventors: Alexis Bemelmans; Marie-Claude Geoffroy; Philippe Horellou; Jean-Francois Julien; Jacques Mallet; Michel Perricaudet; Jean-Jacques Robert; Emmanuelle Vigne
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1995-03-21
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2015-03-22
Also published as: KR100403893B1; ATE320502T1; WO1995025805A1; AU2140695A; JPH09511394A; KR970701785A; EP1681354A2; EP0752003A1; CA2184297C; FI963755A0; US20020028212A1; MX9604026A; EP0752003B1; FI963755A7; FI963755L; CA2184297A1; DE69534873D1; NO963806D0; IL113052A0; EP1681354A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Vektoren viralen Ursprungs, ihre Herstellung und ihre Verwendung, insbesondere für die Behandlung und/oder Prävention neurodegenerativer Krankheiten. Ganz besonders betrifft die Erfindung rekombinante Adenoviren, die eine DNA-Sequenz umfassen, die für ein Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität codiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung dieser Vektoren, die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen und ihre therapeutische Verwendung, insbesondere in einer Gentherapie.
Die GABAergen Bahnen stellen die Wichtigste hemmende Gruppe des Nervensystems der Vertebraten dar. Die Störung der Aktivität der GABAergen Neuronen manifestiert sich mit Dyskinesien oder Krämpfen unmittelbar auf Ebene des gesamten Organismus. Zudem ist die Rolle der cerebralen Gamma-Aminobuttersäure (GABA) nicht auf die Neurotransmission beschränkt. Es ist ihr nämlich eine neurotrophe Wirkung während der Entwicklung, insbesondere in der Neuroretina, zugeschrieben worden. Darüber hinaus ist die GABA ebenfalls in den β-Zellen der Langerhans-Inseln vorhanden, wo sie eine Rolle bei der Regulation der Insulinproduktion zu spielen scheint.
Die Möglichkeit der Wiederherstellung oder der Induktion einer de novo GABA-Synthese in einer bestimmten Region des Organismus stellt folglich ein bedeutendes therapeutisches Interesse dar, sowohl für Leiden, die mit einer Degeneration von GABAergen Neuronen direkt verbunden sind, wie auch für Leiden, die auf GABA-Agonisten ansprechen. Die vorliegende Erfindung liefert eine besonders vorteilhafte Lösung für dieses Problem. Die vorliegende Erfindung beschreibt nämlich die Entwicklung von Vektoren viralen Ursprungs, die in einer Gentherapie einsetzbar sind und die Fähigkeit besitzen, eine Glutamatdecarboxylase-Aktivität in vivo lokal und wirksam zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung beschreibt daher einen neuen Versuchsansatz für die Behandlung von Leiden, die mit einer GABA-Defizienz verbunden sind, und der daraus besteht, die in vivo GABA-Synthese durch die gezielte Freisetzung eines biologisch aktiven Enzyms zu induzieren.
Die Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität ist ein Enzym, das in hinreichend spezifischer Weise die Umwandlung von Glutamat zu Gamma-Aminobuttersäure (GABA) mit Hilfe eines Cofaktors, des Pyridoxalphosphats (Vitamin B6), katalysiert. In nativem Zustand liegt dieses Enzym in Form eines Dimers von 120 Kilodalton vor. Nach Reduktion der Disulfidbrücken zeigt die Überprüfung mittels spezifischer Elektroimmunoanalyse (Western Blot) zwei Banden mit 65 und 67 Kilodalton. Kürzlich ist gezeigt worden, dass diese beiden Monomeren zwei verschiedenen Proteinen entsprechen, die von unterschiedlichen Genen codiert sind (Erlander et al., Neuron 7 (1991) 91). Die beiden Moleküle, von nun an als GAD 67 und GAD 65 bezeichnet, unterscheiden sich in enzymatischer Hinsicht, wobei die kurze Form eine vermindertere Affinität für Pyridoxalphosphat aufweist, und durch ihre subzelluläre Lokalisierung, wobei die kurze Form mehr in den neuronalen Fortsätzen vorliegt, während die lange Form sich im Perikaryon anhäuft. Die lange Form ist wegen ihrer geringeren Abhängigkeit von der Pyridoxalphosphat-Konzentration folglich eher in der Lage, sich in verschiedenen Zelltypen zu exprimieren. Dagegen zeigt die GAD 65 die Besonderheit, dass sie sich bei Fehlen von Pyridoxalphosphat durch die Umwandlung in ein Apoenzym ohne eine katalytische Aktivität rasch inaktiviert. Die umgekehrte Umwandlung, vom Apoenzym zum aktiven Holoenzym, geschieht relativ langsam.
Zudem ist die Expression von GAD 67 und 65 nicht auf das Nervengewebe beschränkt. Die beiden GAD-Formen liegen auch in den β-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas vor. Anti-GAD-Autoantikörper sind auch bei Patienten detektiert worden, die an einer sehr seltenen neurologischen Krankheit leiden, dem Stiff-man-Syndrom, das durch eine Muskelhypertonie gekennzeichnet ist und von einer Degeneration bestimmter GABAerger Neuronen begleitet ist. Ein nicht zu vernachlässigender Anteil dieser Kranken (20%) entwickelt zudem einen Diabetes Typ I. Ebenso ist GAD 67 ebenfalls in der Hülle der Flagelle von Spermatozoiden relativ häufig, was stark vermuten lässt, dass sie eine wichtige Rolle im oxidativen Katabolismus spielt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass es möglich ist, eine Enzymaktivität in vivo zu bilden, die ihrerseits in der Lage ist, die Synthese eines Neurotransmitters, der GABA, zu fördern oder zu induzieren. Die vorliegende Erfindung beruht ebenfalls auf der Entwicklung von Vektoren, die eine effiziente, lokale und dauerhafte Freisetzung eines bei der GABA-Synthese in vivo aktiven Enzyms erlauben. Die vorliegende Erfindung stellt daher einen neuen Versuchsansatz für eine Gentherapie dar, der für die Behandlung und/oder Prävention neurodegenerativer Krankheiten besonders vorteilhaft ist.
Die Anmelderin ist ganz besonders an der Verwendung von Vektoren viralen Ursprungs für die in vivo Übertragung, insbesondere in das Nervensystem, einer Glutamatdecarboxylase-Aktivität interessiert. Auf besonders vorteilhafterweise Weise hat die Anmelderin nun gezeigt, dass es möglich ist, rekombinante Viren zu konstruieren, die eine für die GAD codierende DNA-Sequenz enthalten, diese rekombinanten Viren zu verabreichen, und dass diese Verabreichung eine stabile, lokale und effiziente in vivo Expression einer biologisch aktiven GAD, insbesondere im Nervensystem, ohne einen cytopathologischen Effekt erlaubt. Die vorliegende Erfindung ergibt sich ganz besonders aus dem Nachweis von besonders vorteilhaften Eigenschaften bestimmter Viren für die Expression einer GAD-Aktivität und die Konstruktion von viralen Vektoren (defekten Viren, denen bestimmte virale Regionen fehlen, die bestimmte Promotoren etc. enthalten), was eine besonders effiziente Expression der GAD-Aktivität in den geeigneten Geweben erlaubt. Die vorliegende Erfindung stellt daher virale Vektoren bereit, die direkt in einer Gentherapie verwendbar, besonders angepasst und wirksam sind, um die GAD-Expression in vivo zu steuern.
Ein erster Gegenstand der Erfindung beruht folglich auf einem defekten rekombinanten Adenovirus, das ohne die Regionen seines Genoms ist, die für seine autonome Replikation in einer Zielzelle erforderlich sind, und das eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-Aktivität codiert und unter der Kontrolle von Signalen steht, die ihre Expression in den Nervenzellen erlauben.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines derartigen defekten rekombinanten Virus zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention der Alzheimer Krankheit, der Chorea Huntington oder der Epilepsie.
Im Sinne der Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität" jedes Protein, das in der Lage ist, die Produktion von GABA aus Glutamat zu induzieren oder zu fördern. Ganz besonders ist das Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-Aktivität ganz oder zum Teil aus den GAD65 und GAD67-Proteinen oder Derivaten davon gewählt.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gebildete Glutamatdecarboxylase-Aktivität kann eine menschliche GAD oder eine tierische GAD sein. Die für die GAD65 und 67 codierende DNA-Sequenz ist von verschiedenen Spezies und besonders von dem Menschen (Bu et al., PNAS 89 (1992) 2115) und der Ratte (Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173) kloniert und sequenziert worden. Um ihren Einbau in einen viralen Vektor gemäß der Erfindung zu erlauben, sind diese Sequenzen zum Beispiel durch eine gerichtete Mutagenese, insbesondere für die Insertion von geeigneten Restriktionsstellen, vorteilhaft modifiziert. Die nach Stand der Technik beschriebenen Sequenzen sind nämlich nicht für eine Verwendung gemäß der Erfindung konstruiert und vorausgehende Anpassungen können sich als erforderlich herausstellen, um hohe Expressionsniveaus zu erhalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt man die Verwendung einer für die menschliche GAD codierenden DNA-Sequenz. Zudem ist es, wie oben angegeben, ebenfalls möglich, ein für ein Derivat der GAD 65 oder 67 codierendes Konstrukt zu verwenden, insbesondere ein Derivat der menschlichen Glutamatdecarboxylasen. Ein derartiges Derivat umfasst zum Beispiel jede Sequenz, die mittels Mutation, Deletion und/oder Addition bezogen auf die native Sequenz erhalten worden ist und für ein Produkt codiert, das die Fähigkeit beibehalten hat, die Bildung von GABA aus Glutamat zu induzieren oder zu fördern. Diese Modifikationen können mit dem Fachmann bekannten Techniken (siehe nachfolgende allgemeine molekularbiologischen Techniken) hergestellt sein. Die biologische Aktivität der so erhaltenen Derivate kann anschließend ohne weiteres bestimmt werden, wie es insbesondere in Beispiel 2 gezeigt ist. Die Derivate im Sinne der Erfindung können ebenfalls mittels Hybridisierung aus Nukleinsäure-Banken unter Verwendung der nativen Sequenz oder eines Fragments davon als Sonde erhalten sein.
Diese Derivate sind insbesondere Moleküle mit einer größeren Affinität für ihre Bindungsstellen, Moleküle, die eine größere Widerstandsfähigkeit gegen Proteasen besitzen, Moleküle mit einer größeren therapeutischen Wirksamkeit oder geringeren Nebenwirkungen oder möglicherweise neuen biologischen Eigenschaften. Die Derivate schließen ebenfalls modifizierte DNA-Sequenzen ein, die eine verbesserte in vivo Expression erlauben.
Von den bevorzugten Derivaten kann man ganz besonders die natürlichen Varianten, die Moleküle, in denen bestimmte N- oder O-Glycosylierungsstellen modifiziert oder supprimiert worden sind, die Moleküle, in denen ein oder mehrere Reste substituiert worden sind, oder die Moleküle nennen, in denen alle Cystein-Reste substituiert worden sind (Muteine). Man kann ebenfalls die Derivate, die durch Deletion von Regionen erhalten sind, die nicht oder wenig an der Wechselwirkung mit den in Betracht kommenden Bindungsstellen beteiligt sind oder die eine unerwünschte Aktivität exprimieren, und die Derivate nennen, die im Vergleich zur nativen Sequenz zusätzliche Reste umfassen, wie zum Beispiel ein N-terminales Methionin und/oder ein Sekretionssignal und/oder ein Verbindungspeptid.
Die DNA-Sequenz, die für die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete GAD codiert, kann eine cDNA, eine genomische DNA oder ein Hybridkonstrukt sein, das zum Beispiel aus einer cDNA besteht, in der ein oder mehrere Introns inseriert wären. Es kann sich ebenfalls um synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung einer cDNA oder gDNA. Insbesondere erlaubt die Verwendung einer genomischen DNA eine bessere Expression in den menschlichen Zellen.
In einer ersten Anwendungsform betrifft die Erfindung ein defektes rekombinantes Adenovirus, das eine cDNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein mit einer GAD-Aktivität codiert. In einer anderen bevorzugten Anwendungsform der Erfindung umfasst das Virus eine gDNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer GAD-Aktivität codiert.
Die Viren gemäß der Erfindung sind defekt, d.h. sie sind nicht zu einer autonomen Replikation in der Zielzelle fähig. Generell ist das Genom der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten defekten Viren folglich ohne wenigstens die Sequenzen, die für die Replikation des besagten Virus in der infizierten Zelle erforderlich sind. Diese Regionen können entweder eliminiert (ganz oder teilweise) oder funktionsunfähig gemacht oder mit anderen Sequenzen und besonders mit der für die GAD codierenden DNA-Sequenz substituiert sein. Bevorzugt behält das defekte Virus dennoch die Sequenzen seines Genoms, die für die Verpackung der viralen Partikel erforderlich sind.
Da es sich ganz besonders um Adenoviren handelt, sind verschiedene Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften etwa variieren, beschrieben worden. Von diesen Serotypen bevorzugt man im Rahmen der vorliegenden Erfindung die humanen Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder die Adenoviren tierischen Ursprungs (siehe die Anmeldung FR 93 05954 ). Von den im Rahmen der vorliegenden Erfindung zweckdienlichen Adenoviren tierischen Ursprungs kann man die Adenoviren caninen, bovinen, murinen (Beispiel Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovinen, porcinen, avianen oder auch simianen (Beispiel: SAV) Ursprungs nennen. Vorzugsweise ist das Adenovirus tierischen Ursprungs ein canines Adenovirus, bevorzugter ein CAV2 Adenovirus [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)].
Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der Erfindung Adenoviren humanen oder caninen oder gemischten Ursprungs.
Vorzugsweise umfassen die defekten Adenoviren der Erfindung die ITRs, eine die Verpackung erlaubende Sequenz und die Sequenz, die für das Protein mit einer GAD-Aktivität codiert. Noch bevorzugter sind im Genom der Adenoviren der Erfindung das E1-Gen und wenigstens eines der E2, E4, L1-L5-Gene funktionsunfähig. Das in Betracht kommende virale Gen kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik und insbesondere durch vollständige Suppression, Substitution, partielle Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen in dem oder den in Betracht kommenden Genen funktionsunfähig gemacht sein. Derartige Modifikationen können in vitro (in der isolierten DNA) oder in situ mit Hilfe gentechnischer Verfahren oder auch durch Behandlung mit mutagenen Agentien erhalten sein.
Die defekten rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung können mit jeder dem Fachmann bekannten Technik hergestellt sein (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie mittels homologer Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid, das unter anderem die für die GAD codierende DNA-Sequenz trägt, hergestellt sein. Die homologe Rekombination erfolgt nach Co-Transfektion besagter Adenoviren und Plasmid in einer geeigneten Zelllinie. Die verwendete Zelllinie soll vorzugsweise (i) mit besagten Elementen transformierbar sein und (ii) die Sequenzen umfassen, die in der Lage sind, den Teil des Genoms des defekten Adenovirus zu komplementieren, vorzugsweise in integrierter Form, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Zelllinie kann man die menschliche embryonale Nierenzelllinie 293 erwähnen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die insbesondere den linken Teil des Genoms (12%) eines Ad5-Adenovirus, in ihrem Genom integriert, enthält. Strategien für die Konstruktion von Vektoren, die von Adenoviren abstammen, sind ebenfalls in den Anmeldungen FR 93 05954 und FR 93 08596 beschrieben worden.
Danach werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, nach den herkömmlichen molekularbiologischen Techniken wiedergewonnen und gereinigt, wie es in den Beispielen veranschaulicht ist.
Die später erhaltenen Ergebnisse zeigen die besonders interessanten Eigenschaften der Adenoviren für die in vivo Expression eines Proteins mit einer GAD-Aktivität. Zudem weisen die Adenovirus-Vektoren gemäß der Erfindung außerdem bedeutende Vorteile auf, wie insbesondere ihre sehr hohe Infektionseffizienz von Nervenzellen, was die Durchführung von Infektionen mit sehr geringen Virussuspensionsvolumina erlaubt. Zudem ist die Infektion mit diesen viralen Vektoren der Erfindung sehr lokal auf die Injektionsstelle begrenzt, was Diffusionsrisiken für benachbarte Zellen vermeidet.
Vorteilhafterweise ist in den Vektoren der Erfindung die Sequenz, die für das Protein mit einer GAD-Aktivität codiert, unter der Kontrolle von Signalen gestellt, die ihre Expression in den Nervenzellen erlauben. Bevorzugt handelt es sich um heterologe Expressionssignale, nämlich um Signale, die sich von denjenigen unterscheiden, die natürlicherweise für die GAD-Expression verantwortlich sind. Es kann sich insbesondere um Sequenzen, die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder um synthetische Sequenzen handeln. Besonders kann es sich um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Zum Beispiel kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die von dem Genom der Zelle stammen, die man zu infizieren wünscht. Ebenso kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die von einem Genom eines Virus, einschließlich des eingesetzten Virus, stammen. In dieser Hinsicht kann man zum Beispiel die E1A, MLP, CMV, LTR-RSV-Promotoren nennen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition von Aktivierungssequenzen, Regulationssequenzen oder von Sequenzen modifiziert sein, die eine Gewebe-spezifische Expression erlauben. Es kann nämlich besonders vorteilhaft sein, Expressionssignale zu verwenden, die in den Nervenzellen spezifisch oder überwiegend aktiv sind, damit die DNA-Sequenz nur exprimiert wird und ihre Wirkung nur ausübt, wenn das Virus eine Nervenzelle wirksam infiziert hat. In dieser Hinsicht kann man zum Beispiel die Promotoren der Neuronen-spezifischen Enolase (Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187), das GFAP (Sarkar et al., J. Neurochem. 57 (1991) 675), etc. nennen.
In einer bestimmten Anwendungsform betrifft die Erfindung ein defektes rekombinantes Adenovirus, das eine cDNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer GAD-Aktivität codiert, unter der Kontrolle des LTR-RSV-Promotors umfasst.
In einer anderen bestimmten Anwendungsform betrifft die Erfindung ein defektes rekombinantes Adenovirus, das eine gDNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer GAD-Aktivität codiert, unter der Kontrolle des LTR-RSV-Promotors umfasst.
Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, dass der LTR-Promotor des Rous Sarkom-Virus (RSV) eine dauerhafte und bedeutende Expression der GAD-Aktivität in den Zellen des menschlichen Nervensystems, insbesondere des Zentralnervensystems, erlaubte.
Überhaupt betrifft in einer bevorzugten Form die Erfindung ein defektes rekombinantes Adenovirus, das eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer GAD-Aktivität codiert, unter der Kontrolle eines Promotors umfasst, der eine überwiegende Expression im Nervensystem erlaubt.
Die Expression wird als überwiegend im Sinne der Erfindung betrachtet, wenn die Expressionsniveaus in den Nervenzellen höher sind, selbst wenn eine Restexpression in anderen Zelltypen beobachtet wird.
Wie zuvor angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls jegliche Verwendung. eines wie oben beschriebenen Adenovirus für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Prävention der Alzheimer Krankheit, der Chorea Huntington oder der Epilepsie.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere wie zuvor beschriebene defekte rekombinante Adenoviren umfasst. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Hinblick auf die Verabreichung über den topischen, oralen, parenteralen, intranasalen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intraokularen, transdermalen, etc. Weg formuliert sein. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einen für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion in das Nervensystem des Patienten, pharmazeutisch verträglichen Träger. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder trockene, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln, die nach Hinzufügen von gegebenenfalls sterilem Wasser oder physiologischer Saline, die Bildung injizierbarer gelöster Stoffe erlauben. Die direkte Injektion in das Nervensystem des Patienten ist von Vorteil, denn diese erlaubt, den therapeutischen Effekt auf Ebene der affizierten Gewebe zu konzentrieren. Die direkte Injektion in das Zentralnervensystem des Patienten erfolgt vorteilhafterweise mit einer stereotaktischen Injektionsapparatur. Die Verwendung einer derartigen Apparatur erlaubt nämlich mit einer großen Genauigkeit die Injektionsstelle anzuvisieren. Lokale Injektionen, wie insbesondere intranigrale Injektionen in den Lobus temporalis, in die epileptischen Herde oder auch in das Intestinalepithel können besonders von Vorteil sein.
Die für die Injektion eingesetzten Dosen an defektem rekombinantem Adenovirus können in Abhängigkeit verschiedener Parameter und besonders in Abhängigkeit des viralen Vektors, der angewandten Verabreichungsart, der betreffenden Krankheit oder auch der erstrebten Behandlungsdauer angepasst sein. Im Allgemeinen sind die Adenoviren gemäß der Erfindung in Form von Dosen formuliert und verabreicht, die zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu/ml und vorzugsweise 10⁶ bis 10¹⁰ pfu/ml enthalten. Der Ausdruck pfu („Plaque forming unit") entspricht der Virulenz einer Viruslösung und ist mit einer Infektion einer geeigneten Zellkultur bestimmt, und im Allgemeinen 48 Stunden durch die Anzahl an Plaques von infizierten Zellen gemessen. Die Bestimmungsverfahren des pfu-Titers einer Viruslösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
Die GABA-Freisetzung, die mit der Gentherapie gemäß der Erfindung erhalten ist, bildet einen besonders wirksamen therapeutischen Versuchsansatz, um den exzitotoxischen Phänomenen entgegenzuwirken, die für degenerative Nervenkrankheiten wie die amyotrophen Lateralsklerosen verantwortlich sind.
Die Vektoren der Erfindung weisen folglich antikonvulsive und nervenprotektive Eigenschaften auf. Von den therapeutischen Anwendungen der Vektoren der Erfindung kann man insbesondere die Behandlung bestimmter Epilepsieformen nennen, insbesondere die Formen, die einer jeglichen pharmakologischen oder chirurgischen Behandlung widerstehen, wie die limbischen Epilepsien des Lobus temporalis. Ebenfalls können die Vektoren der Erfindung verwendet sein für die Behandlung exzitotoxischer cerebraler Läsionen unterschiedlicher Ursache, insbesondere ischämischer Ursache, wie auch für die Behandlung medullärer Traumatismen, die in der Lage sind, exzitotoxische Läsionen auszulösen.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft jede Säugerzelle, die mit einem oder mehreren wie oben beschriebenen defekten rekombinanten Adenoviren infiziert ist. Ganz besonders betrifft die Erfindung jede humane Zellpopulation, die mit diesen Viren infiziert ist. Es kann sich insbesondere um Fibroblasten, Myoblasten, Hepatozyten, Keratinozyten, Endothelzellen, Gliazellen, etc. handeln.
Die Zellen gemäß der Erfindung können von Primärkulturen stammen. Diese können mit jeder dem Fachmann bekannten Technik entnommen und dann unter Bedingungen kultiviert werden, die ihre Proliferation erlauben. Wenn es sich insbesondere um Fibroblasten handelt, können diese ohne weiteres aus Biopsien, zum Beispiel nach der von Ham beschriebenen Technik [Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255], erhalten sein. Diese Zellen können zur Infektion mit den Viren direkt verwendet oder zum Beispiel durch Einfrieren konserviert werden, um autologe Banken im Hinblick auf eine weitere Verwendung zu etablieren. Die Zellen gemäß der Erfindung können ebenfalls Sekundärkulturen sein, die zum Beispiel aus zuvor etablierten Banken erhalten sind (siehe zum Beispiel EP 228458 , EP 289034 , EP 400047 , EP 456640 ).
Die kultivierten Zellen werden danach mit den rekombinanten Adenoviren infiziert, um ihnen die Fähigkeit zu verleihen, eine GAD-Aktivität zu bilden. Die Infektion wird gemäß den dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt. Insbesondere kann der Fachmann je nach verwendetem Zelltyp und der erwünschten Anzahl an Viruskopien pro Zelle die Infektionsmultiplizität und eventuell die Anzahl an durchgeführten Infektionscyclen anpassen. Selbstverständlich müssen die Schritte unter geeigneten Sterilbedingungen durchgeführt sein, wenn die Zellen für eine in vivo Verabreichung bestimmt sind. Die für eine Infektion der Zellen eingesetzten Dosen an rekombinantem Virus können je nach erstrebtem Ziel vom Fachmann angepasst sein. Die zuvor beschriebenen Bedingungen für die in vivo Verabreichung können für die in vitro Infektion übernommen werden.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Implantat, das mit einem oder mehreren wie oben beschriebenen defekten rekombinanten Adenoviren infizierte Säugerzellen und eine extrazelluläre Matrix umfasst. Bevorzugt umfassen die Implantate gemäß der Erfindung 10⁵ bis 10¹⁰ Zellen. Bevorzugter umfassen sie davon 10⁶ bis 10⁸ Zellen.
Ganz besonders umfasst die extrazelluläre Matrix in den Implantaten der Erfindung einen Gelbildner und möglicherweise einen Träger, der eine Verankerung der Zellen erlaubt.
Für die Herstellung der Implantate gemäß der Erfindung können verschiedene Typen an Gelbildnern verwendet sein. Die Gelbildner sind für den Einschluss der Zellen in einer Matrix mit der Konstitution eines Gels und gegebenenfalls zur Förderung der Verankerung der Zellen auf dem Träger verwendet. Verschiedene Zelladhäsionsmittel können folglich als Gelbildner verwendet sein, wie insbesondere Kollagen, Gelatine, Glucosaminoglycane, Fibronektin, Lektine, etc. Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung Kollagen. Es kann sich um Kollagen humanen, bovinen oder murinen Ursprungs handeln. Bevorzugter verwendet man Typ I Kollagen.
Wie es zuvor angegeben ist, umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorteilhafterweise einen Träger, der die Verankerung der Zellen erlaubt. Der Ausdruck „Verankerung" bezeichnet jegliche Form einer biologischen und/oder chemischen und/oder physikalischen Wechselwirkung, die eine Adhäsion und/oder Fixierung der Zellen auf dem Träger zur Folge hat. Zudem können die Zellen den verwendeten Träger entweder bedecken oder in das Innere dieses Trägers eindringen oder beides tun. Man bevorzugt im Rahmen der Erfindung die Verwendung eines festen, nicht toxischen und/oder biologisch verträglichen Trägers. Insbesondere kann man Polytetrafluorethylenfasern (PTFE) oder einen Träger biologischen Ursprungs verwenden.
Die Implantate gemäß der Erfindung können an verschiedenen Stellen des Organismus implantiert sein. Insbesondere kann die Implantation in der Peritonealhöhle, im subkutanen Gewebe (einem Bereich über dem Schambein, Fossae iliacae oder inguinalae, etc.), in einem Organ, Muskel, Tumor, im Zentralnervensystem oder auch unter einer Mukosa erfolgen. Die Implantate gemäß der Erfindung sind besonders vorteilhaft, insofern sie die Kontrolle der Freisetzung des therapeutischen Produkts im Organismus erlauben: Diese ist zuallererst durch die Infektionsmultiplizität und durch die Anzahl an implantierten Zellen bestimmt. Danach kann die Freisetzung entweder durch Entfernen des Transplantats, was definitiv die Behandlung beendet, oder durch Verwendung von regulierbaren Expressionssystemen kontrolliert sein, die eine Induktion oder Suppression der Expression der therapeutischen Gene erlauben.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein sehr wirksames Mittel für die Behandlung oder Prävention neurodegenerativer Krankheiten dar. Sie ist ganz besonders für die Behandlung der Alzheimer Krankheit, der Chorea Huntington und der Epilepsie angepasst. Außerdem kann für diese Behandlung sowohl der Mensch wie auch jedes Tier, wie Schafe, Rinder, Haustiere (Hunde, Katzen, etc.), Pferde, Fische etc., in Betracht kommen.
Die vorliegende Erfindung wird noch erschöpfender mit Hilfe der Beispiele und Figuren beschrieben, die als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung betrachtet werden sollen.
Legende der Figuren
1: Struktur des pLTRIXGAD67-Vektors
2a und 2b: Infektion der HiB5 und ST14a-Zelllinien mit einem Ψ-2 Klon, der ein Produzent für die GAD codierende rekombinante Retroviren ist.
3: Glutamatdecarboxylase-Aktivität verschiedener Klone, die von Zelllinien abstammen, die mit einem für die GAD codierenden rekombinanten Retrovirus infiziert sind.
4 und 5: Kontrolle der in vivo Transplantation der GAD exprimierenden HiB5-Klone (4B) und St14a-Klone (5A und 5B) im Vergleich mit nicht-infizierten ST14a-Zellen (4A).
6: In vitro GABA-Freisetzung von den gentechnisch veränderten Zellen.
Allgemeine molekularbiologische Techniken
Die in der Molekularbiologie herkömmlicherweise eingesetzten Verfahren, wie die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation der Plasmid-DNA im Cäsiumchlorid-Gradienten, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten mittels Elektroelution, die Phenol- oder Phenol-Chloroform-Extraktion von Proteinen, die DNA-Fällung in salzhaltigem Medium mit Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli, etc.. sind dem Fachmann gut bekannt und sind in der Literatur ausführlich beschrieben [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds.), „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Serie M13 sind im Handel erhältlich (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligationen können die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe mittels Elektrophorese in Agarose- oder Polyacrylamidgelen getrennt, mit Phenol oder einem Gemisch aus Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß Herstelleranleitung inkubiert werden.
Das Auffüllen der überhängenden 5'-Enden kann mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (Biolabs) gemäß den Herstellerbestimmungen erfolgen. Die Zerstörung der überhängenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Herstellerempfehlungen. Die Zerstörung der überhängenden 5'-Enden erfolgt mit Hilfe einer S1-Nuklease-Behandlung.
Die in vitro gerichtete Mutagenese von synthetischen Oligonukleotiden kann gemäß dem von Taylor et al. entwickelten Verfahren [Nucleic. Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] unter Verwendung des von Amersham gelieferten Kits erfolgen.
Die enzymatische Amplifikation der DNA-Fragmente mit der PCR [Polymerase catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K.B. und Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] genannten Technik kann unter Verwendung eines „DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) entsprechend Herstellerangaben durchgeführt werden.
Die Verifizierung der Nukleotidsequenzen kann mit dem von Sanger et al. entwickelten Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] unter Verwendung des von Amersham gelieferten Kits erfolgen.
Beispiele
Beispiel 1. Konstruktion des pLTR IX GAD67-Vektors, der das für die GAD67 codierende Gen unter der Kontrolle des LTR-Promotors des Rous Sarkom-Virus trägt (1).
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Vektors, der eine für die GAD67 codierende cDNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Promotors umfasst, der aus der LTR des Rous Sarkom-Virus (LTR-RSV) besteht.
1.1. Ausgangsvektor (pLTR IX):
Der pLTR IX-Vektor enthält insbesondere die linke Region des Ad5-Adenovirus, umfassend die ITR und die Verpackungsstelle, den LTR-Promotor von RSV und eine Region des Ad5-Adenovirus, die vom pIX-Gen bis zur EagI-Restriktionsstelle reicht und die die in vivo homologe Rekombination erlaubt. Dieser Vektor ist von Stratford-Perricaudet et al. beschrieben worden (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
1.2. Konstruktion einer cDNA-Sequenz, die für die GAD67 codiert.
Um die Herstellung des Vektors gemäß der Erfindung zu erlauben, ist eine für die GAD67 der Ratte codierende cDNA-Sequenz folgendermaßen konstruiert worden:

– Ein cDNA-Klon, der der mRNA der GAD67-Glutamatdecarboxylase entspricht, ist mit Hilfe einer immunologischen Durchmusterung einer cDNA-Expressionsbank des Rattengehirns, die im lambda GT11-Vektor konstruiert ist, isoliert worden (Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173). Die Art und die genaue Position der für die GAD67 codierenden Sequenz in dem isolierten Klon ist durch Sequenzierung des Inserts ermittelt worden. Das im Klon enthaltene Insert ist dann durch Verdau mit Hilfe des EcoRI-Enzyms isoliert, dann in die entsprechende Stelle des pSPT18-Vektors oder Bluescript-Vektors (Pharmacia) subkloniert worden.

1.3. Konstruktion des pLTR IX GAD67-Vektors
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des pLTR IX GAD67-Vektors, der die für die GAD67 codierende Sequenz unter Kontrolle der LTR des RSV-Virus wie auch Sequenzen des Ad5-Adenovirus enthält, die die in vivo Rekombination erlauben.
Das EcoRI-HindIII-Fragment mit 2 kb ist durch enzymatischen Verdau aus dem in Beispiel 1.2 hergestellten Konstrukt isoliert worden. Dieses 2 kb Fragment enthält die GAD67 codierende Sequenz, die sich 118 bp stromaufwärts des Translationsinitiationscodons erstreckt und 70 bp stromabwärts des Terminationscodons liegt. Dieses Fragment ist mittels Elektrophorese auf einem LMP („Low Melting Point") Agarosegel isoliert und gereinigt worden und dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden, um freie Enden zu erhalten. Dieses Fragment ist dann in die SalI-kompatible Stelle des pLTR IX-Vektors inseriert worden (Beispiel 1.1.), um den GAD67-pLTR IX-Vektor zu erzeugen. Die gesamte Nukleotidsequenz des GAD67-Inserts ist danach mittels Didesoxynukleotid-Sequenzierung verifiziert worden.
Beispiel 2. Funktionalität des GAD67-pLTR IX-Vektors
Die Fähigkeit des GAD67-pLTR IX-Vektors, in einer Zellkultur eine biologisch aktive Form der GAD zu exprimieren, ist durch eine transitorische Transformation von 293-Zellen gezeigt worden. Hierfür sind die Zellen (2 × 10⁶ Zellen pro Schale mit 10 cm Durchmesser) in Gegenwart von Transfectam transfiziert worden (8 μg Vektor). Die Expression der für die GAD codierenden Sequenz und die Produktion des biologisch aktiven Proteins sind mit folgenden Tests nachgewiesen worden:

– Nachweis und Quantifizierung der GAD-mRNA erfolgte mit der Northern-Blot-Technik (siehe zum Beispiel Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173 für ein detailliertes Protokoll)
– Detektion des GAD-Proteins erfolgte mit der Western-Blot-Technik unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers K2 (Chemicon) (siehe ebenfalls Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173 für ein detailliertes Protokoll)
– Nachweis und Quantifizierung der GAD-Aktivität (Synthese von GABA) aus dem Zelllysat. Hierfür werden die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion lysiert und das Lysat wird durch Zentrifugation mit 100.000 g geklärt. Das Lysat wird nun in Gegenwart eines anti-GAD-Antikörpers inkubiert, der wiederum selbst an Sepharose-Kügelchen gebunden ist. Der eingesetzte Antikörper ist insbesondere der Antikörper Nr. 1440, der die Eigenschaft aufweist, die katalytische Aktivität der GAD zu erhalten (Oertel et al., Neurosci. 6 (1981) 2715). Selbstverständlich können andere Antikörper, die vergleichbare Eigenschaften aufweisen, eingesetzt und eventuell hergestellt werden. Der Antikörper-GAD-Komplex wird anschließend vom Zelllysat getrennt und in Gegenwart von [1-¹⁴C] L-Glutamat inkubiert. Das im Verlauf der Reaktion freigesetzte ¹⁴CO₂, das die Umwandlung von Glutamat in GABA widerspiegelt, wird auf einem Hyamin-getränkten Filter gesammelt und im Flüssigszintillationszähler gezählt. Zwei Negativkontrollen, ein vorimmunisiertes Antiserum und ein spezifischer GAD-Hemmer, die γ-Acetylen-GABA, erlauben die Subtraktion des Hintergrunds und folglich die Bestimmung des spezifischen Signals (siehe auch Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173).

Beispiel 3. Konstruktion eines rekombinanten Ad-GAD67-Adenovirus, das eine für die GAD67 codierende Sequenz enthält
Der GAD67-pLTR IX-Vektor ist linearisiert und mit einem defizienten adenoviralen Vektor in die Helferzellen (293-Linie) co-transfiziert worden, die in trans die von den E1-Regionen (E1A und E1B) des Adenovirus codierten Funktionen mitbringen.
Genauer, das Ad-GAD67-Adenovirus ist durch eine in vivo homologe Rekombination zwischen einem mutierten Ad-d11324 Adenovirus (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) und dem pLTR IX-GAD67-Vektor nach dem folgenden Protokoll erhalten worden: das GAD67-pLTR IX-Plasmid und das Ad-d11324-Adenovirus, linearisiert mit dem ClaI-Enzym, sind in die 293-Linie in Gegenwart von Calciumphosphat co-transfiziert worden, um die homologe Rekombination zu erlauben. Die so erzeugten rekombinanten Adenoviren sind durch eine Plaque-Aufreinigung selektiert worden. Nach der Isolierung wird die DNA des rekombinanten Adenovirus in der 293-Zelllinie amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führt, der nicht gereinigtes rekombinantes defektes Adenovirus mit einem Titer von ungefähr 10¹⁰ pfu/ml enthält.
Die viralen Partikel werden danach mittels Zentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Gradieriten nach bekannten Techniken gereinigt (siehe insbesondere Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Das Ad-GAD67-Adenovirus kann bei –80°C in 20% Glycerin aufbewahrt werden.
Beispiel 4. Funktionalität des Ad-GAD67-Adenovirus
Die Fähigkeit des Ad-GAD67-Adenovirus, Zellen in Kultur zu infizieren und im Kulturmedium eine biologisch aktive Form der GAD67 zu exprimieren, ist mittels Infektion der humanen 293-Zelllinie gezeigt worden. Das Vorliegen von aktiver GAD67 im Kulturüberstand ist dann unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 bestimmt worden.
Diese Untersuchungen erlauben zu zeigen, dass das Adenovirus eine biologisch aktive Form der GAD67 in Zellkultur gut exprimiert.
Beispiel 5. In vivo Übertragung des GAD67-Gens von einem rekombinanten Adenovirus
Dieses Beispiel beschreibt die in vivo Übertragung des GAD67-Gens mit Hilfe eines adenoviralen Vektors gemäß der Erfindung. Es zeigt, wie die Wirkungen der Vektoren der Erfindung auf verschiedene Tiermodelle nachgewiesen werden können.
Das rekombinante GAD67-Adenovirus kann in verschiedene Stellen des Nervensystems injiziert werden. Insbesondere erfolgt die Injektion in die folgenden verschiedenen Stellen: in den medianen Kern des Septums, in den dorsalen Teil des Hippocampus, in das Striatum, in die Substantia nigra und in den entorhinalen Cortex.
Das injizierte Adenovirus ist das in Beispiel 3 hergestellte Ad-GAD67-Adenovirus, das in gereinigter Form (3,5 × 10⁶ pfu/ml) in einer Phosphat gepufferten Saline (PBS) verwendet wird. Die Injektionen erfolgen mit Hilfe einer Kanüle (280 μm Außendurchmesser), die mit einer Pumpe verbunden ist. Die Injektionsgeschwindigkeit ist auf 0,5 μl fest eingestellt, hernach bleibt die Kanüle weitere 4 Minuten an Ort und Stelle, bevor sie entfernt wird.
Die Injektionsvolumina in den Hippocampus, in das Septum, Striatum und in die Substantia nigra betragen jeweils 3, 2, 2 × 3 und 2 μl. Die Konzentration an injiziertem Adenovirus beträgt 3,5 × 10⁶ pfu/μl.
Für die Injektion in den Hippocampus sind die stereotaktischen Koordinaten folgendermaßen: AP = –4; ML = 3,5; V = –3,1 (die Koordinaten von AP und ML sind mit Bezug auf das Bregma festgelegt, die V-Koordinate ist auf die Oberfläche des Cranium auf Niveau des Bregma bezogen).
Für die Injektion in das Septum sind die stereotaktischen Koordinaten folgendermaßen: AP = 1; ML = 1; V = –6 (die Koordinaten von AP und ML sind mit Bezug auf das Bregma festgelegt, die V-Koordinate ist auf die Oberfläche des Cranium auf Niveau des Bregma bezogen). Unter dieser Bedingung bildet die Kanüle einen Winkel von 9° bezogen auf die Vertikale (in medio-lateralem Sinne), um den medianen venösen Sinus zu umgehen.
Für die Injektion in die Substantia nigra sind die stereotaktischen Koordinaten folgendermaßen: AP = –5,8; ML = +2; V = –7,5 (die Koordinaten von AP und ML sind mit Bezug auf das Bregma festgelegt, die V-Koordinate ist auf die Dura mater bezogen).
Für die Injektionen in das Striatum sind die stereotaktischen Koordinaten folgendermaßen: AP = +0,5 und –0,5; ML = 3; V = –5,5 (die Koordinaten von AP und ML sind mit Bezug auf das Bregma festgelegt, die V-Koordinate ist auf die Dura mater bezogen).
Die therapeutischen Wirkungen der Verabreichung des Adenovirus gemäß der Erfindung sind mit drei verschiedenen Analysen nachgewiesen worden: einer histologischen und immunhistochemischen Analyse, einer quantitativen Analyse und einer Verhaltensanalyse, die die Fähigkeit der Vektoren der Erfindung bestätigt, eine biologisch aktive GAD in vivo zu produzieren.
Referenzbeispiele
Beispiel 6. Konstruktion des retroviralen pMoMuLV-GAD-Plasmids, das das für die GAD 67 codierende Gen trägt.
Die cDNA der Glutamatdecarboxylase der Ratte, die in ein retrovirales Plasmid inseriert worden ist, umfasst 163 nicht codierende Basenpaare in 5' und 377 in 3'. Der für die GAD codierende offene Leserahmen umfasst 1782 Basenpaare. Diese cDNA ist zwischen den beiden LTR des Vektors unter der transkriptionellen Kontrolle der 5'-LTR inseriert. Die retrovirale Sequenz enthält dort ebenfalls eine Sequenz, die ihre Verpackung erlaubt. Schließlich enthält das Plasmid auch ein Gen für die Ampicillinresistenz, das die Selektion der Bakterien nach ihrer Transformation erlaubt.
Schema der rekombinanten retroviralen Sequenz des Plasmids:
Diese cDNA der GAD 67 der Ratte ist aus dem pY21-GAD-Plasmid durch SalI/PstI-Schneiden erhalten worden, um ein Fragment mit 2,32 Kilobasen zu erzeugen, das die für die GAD codierende Sequenz umfasst. 28 mg pY21-GAD-Plasmid sind mit 5 Einheiten eines jeden Enzyms eine Stunde bei 37°C geschnitten worden. Nach Verdau ist die DNA mit Ethanol gefällt worden, dann ist das GAD-Insert nach einer Elektrophorese auf 1% LMP-Agarosegel (mit einer niedrigen Schmelztemperatur) gereinigt worden.
Der pMoMuLV-TH-Vektor, der die für die Transkription und Integration erforderlichen Sequenzen (beziehungsweise „LTR" und „ψ") umfasst, ist mit den Enzymen SalI und NsiI geschnitten worden. Dieses Schneiden hat die Entfernung der cDNA der Tyrosinhydroxylase des Vektors und die Erzeugung einer Klonierungsstelle für die cDNA der GAD erlaubt (die Enzyme NsiI und PstI bilden kompatible kohäsive Enden). 10 mg DNA sind mit 5 Enzymeinheiten in einer Stunde bei 37°C geschnitten worden. Der Vektor ist mit demselben Verfahren wie die cDNA der GAD gereinigt worden.
90 ng cDNA der GAD und 360 ng pMoMuLV-Vektor sind über Nacht bei 16°C in Gegenwart von T4-Bakteriophagen DNA-Ligase ligiert worden.
Die Hälfte der ligierten DNA ist in kompetente E. coli Bakterien (XL1 Blue) mittels Elektroporation eingeführt worden und die transformierten Zellen sind in einer 100 mg/ml Ampicillin enthaltenden LB/Agarose Petri-Schale selektiert worden. Die rekombinanten pMoMuLV-GAD-Klone sind durch Verdau mit den Enzymen HindIII und KpnI, die den Vektor und das Insert asymmetrisch schneiden, identifiziert worden. Die Analyse von 24 bakteriellen Klonen durch Schneiden mit HindIII/KpnI hat von diesen eine Isolierung von 4 Klonen erlaubt, die dem erwarteten Plasmid entsprechen. Einer dieser Klone ist für die Herstellung des retroviralen Plasmids verwendet worden.
Das pMoMuLV-GAD-Plasmid ist mittels Reinigung der Plasmid-DNA eines rekombinanten Klons im CsCl-Gradienten nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research, Vol. 7: 1513–1523, 1979) hergestellt worden.
Beispiel 7. Transfektion der Retrovirus-Produzentenzellen.
Für diesen Schritt haben wir die ψ-2-Zelllinie verwendet, die ein Provirus besitzt, das alle für die Verpackung der retroviralen Transkripte erforderlichen Funktionen exprimiert, das aber für das Verpackungssignal ψ defekt ist. Aufgrund dieser Deletion sind die Transkripte des Provirus nicht verpackt. Im Gegenteil wird ein Retrovirus, dem diese Verpackungsfunktionen fehlen, das aber hierfür eine Sequenz besitzt, von dieser trans-komplementierenden Zelle verpackt werden können.
Die ψ-2-Zellen sind mit dem pMoMuLV-GAD-Plasmid und einem Plasmid (pUC-SV_NEO), das ein Gen für die Neomycinresistenz enthält, mit Hilfe einer Calciumphosphat-Präzipitation co-transfiziert worden (Chen und Okayama, Molecular and Cellular Biology, Vol. 7: 2745–2752, 1988). Ein Präzipitat, das 20 mg pMoMuLV-GAD und 2 mg pUC-SV_NEO umfasst, ist 18 Stunden mit 10⁶ Zellen in Kontakt gebracht worden. Anschließend wird die Kultur in DMEM-Medium (Gibco), supplementiert mit Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin; 100 Einheiten/ml Streptomycin) und fötalem Kälberserum (10% vol/vol), weiter kultiviert.
Zwei Tage nach der Transfektion werden die Zellen in sieben Petri-Schalen (10 cm Durchmesser) überführt und im selben Medium kultiviert, dem 600 mg/ml Neomycin zugegeben ist, um die transfizierten Zellen zu selektieren.
Fünfzehn Tage nach Beginn der Selektion werden die Neomycin-resistenten Klone mit einer Pasteur-Pipette entnommen und in einem 25 cm² Kolben kultiviert.
Wenn die Zellen der Neomycin-resistenten ψ-2-Klone konfluent sind, werden sie mit dem neuen Medium 12 Stunden in Kontakt gebracht. Dieses Medium, das die von den ψ-2-Zellen produzierten Retroviren enthält, wird geerntet, in Flüssigstickstoff eingefroren und bei –80°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 8. Durchmusterung der ψ-2-Klone mittels Infektion der Zellen der NIH-3T3-Linie.
Um die Qualität und die Quantität der von den verschiedenen ψ-2-Klonen produzierten Retroviren zu bestimmen, sind die ψ-2-Klone mittels Untersuchung ihres Infektionspotenzials auf den Zellen der NIH-3T3-Linie (Fibroblasten-Zelllinie, die aus immortalisierten Fibroblasten der Maus besteht) indirekt getestet worden. Hierfür sind die retroviralen Überstände der 35 ψ-2-Klone zur Infizierung der Zellen verwendet worden, und nach Infektion sind sie entweder für eine Durchführung eines Western-Blots geerntet oder für eine immuncytochemische Detektion der GAD fixiert worden (2). Die Ergebnisse dieser Versuche haben uns erlaubt, den ψ-2-Klon zu selektieren, der das stärkste Infektionspotenzial aufwies.
Beispiel 9. Infektion der HiB5- und ST14a-Zelllinien mit den Retroviren
Die retroviralen Überstände, die von dem in Beispiel 8 selektierten ψ-2-Klon stammen, sind für eine Infektion der beiden Vorläufer-Zelllinien HiB5 und ST14a des Zentralnervensystems verwendet worden:

– HiB5: Zelllinie, die von einer Primärkultur des Hippocampus der Ratte (sechzehnter Tag des embryonalen Stadiums) stammt und mit dem thermosensitiven T-Antigen von SV40 immortalisiert ist. Die Zellen dieser Linie sind Vorläufer von neuronalen Zellen und Gliazellen (Renfranz et al., Cell Vol. 66: 713–729, 1991).
– ST14a: diese Linie ist auf die gleiche Art und Weise wie die vorhergehende Linie immortalisiert worden, stammt aber von einer Primärkultur des Striatums der Ratte ab.

Die Zellen der HiB5- und ST14a-Linien besitzen die Eigenschaft, sich in vitro bei 33°C zu teilen, stellen aber die Zellteilung ein, sobald sie in das Zentralnervensystem der Nager implantiert sind, deren Körpertemperatur bei 39°C liegt. Diese Zellen können sich folglich leicht in vitro (bei 33°C) weiterentwickeln und sind in vivo nicht tumorgen.
Sie müssen bei der Infektion nicht konfluent sein: die Zellteilung (und die DNA-Synthese, die sie zur Folge hat) ist für die Integration des retroviralen Genoms in das Genom der Wirtszelle erforderlich (Lo et al., Molecular Neurobiology Vol. 2: 156–182, 1988).
Das Medium wird mit dem retroviralen Überstand ersetzt, zu dem 10 mg/ml Polybren gegeben worden ist. Die Zellen bleiben zwölf Stunden mit dem retroviralen Überstand in Kontakt, dann wird das Medium mit normalem Medium ersetzt.
Für diese nicht leicht zu infizierenden Zellen haben wir ein Verfahren der wiederholten Infektionen angewandt: die Zellen sind fünfmal jeweils einmal pro Tag in fünf Tagen infiziert worden. Der Prozentsatz an infizierten Zellen ist nach jeder Infektion immuncytochemisch bestimmt worden.
Nach fünf Infektionen lag der Prozentsatz an infizierten Zellen bei 33% für die HiB5-Linie und bei 17% für die ST14a-Linie (2a und 2b).
Wir haben eine Subklonierung dieser infizierten Zelllinien unternommen, um die GAD exprimierende Zellklone zu erhalten. Petri-Schalen (10 cm Durchmesser) sind mit den infizierten Zellen mit jeweils 1000, 500 oder 200 Zellen pro Schale besät worden. Die isolierten Zellklone sind nach 15 Kultivierungstagen entnommen worden. Wir haben 17 von der HiB5-Linie stammende Klone und 20 von der ST14a-Linie stammende Klone isoliert.
Beispiel 10. Funktionalität des pMoMuLV-G-Retrovirus
Die GAD-Enzymaktivität ist mit dem Verfahren von Hamel et al. (Journal of Neurochemistry Vol. 39: 842–849, 1982), das von Brass et al. (Journal of Neurochemistry Vol. 59: 415–424, 1992) modifiziert ist. Das Prinzip dieser Enzymaktivitätsmessung beruht auf dem Nachweis der GABA, die aus einem Tritium-markierten Vorläufer (³H-Glutamat) bei Inkubation des die GAD enthaltenden Proteinextraktes bei 37°C gebildet wird. Diese Reaktion erfolgt in Gegenwart des Cofaktors der GAD (Pyridoxalphosphat) und eines Inhibitors der GABA-Transaminase, um die gebildete GABA zu erhalten. Die gebildete Tritium-markierte GABA wird anschließend von Glutamat mit Hilfe einer Ionenaustauscherharzsäule getrennt, dann wird die Menge an gebildeter GABA mit Hilfe eines Szintillationszählers ermittelt. Das detaillierte Protokoll der quantitativen Bestimmung ist folgendermaßen:
Die Zellen werden in einem Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,4), der EDTA (10 mM), Rinderserumalbumin (BSA, 5 mg/l) und Triton X-100 (0,5% vol/vol) enthält, lysiert. Die enzymatische Reaktion erfolgt mit 80 ml Zelllysat, zu dem gegeben wird: (1) 10 ml Lösung, die Pyridoxalphosphat (200 mM, Cofaktor der GAD) und Aminoethyl-iso-thiouroniumbromid (10 mM, Inhibitor der GAD-Transaminase) enthält; (2) 10 ml Lösung, die 5 mM nicht markiertes Glutamat und 10⁶ dpm Tritium-markiertes Glutamat, das nach dem Verfahren von Bird (1976) unmittelbar vor Verwendung gereinigt wird, enthält.
Die Reaktionsmischung wird dann 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe einer unmittelbar vor Verwendung zubereiteten 0,5 ml Kupferlösung (6,92 g/l CuCl₂; 59,6 g/l Na₃PO₄; 21,68 g/l Natriumborat) beendet, die eine Komplexierung des Glutamats erlaubt. Die Suspension wird 10 Minuten auf Eis gehalten, damit sich der Komplex bildet, dann wird der Kupferniederschlag mittels Zentrifugation (13.000 rpm, 5 Minuten) entfernt.
Der Überstand wird auf eine Dowex Harzsäule (AG-1X8 Acetat, Biorad) gegeben, die das verbleibende Glutamat zurückhält. Die Säule wird zweimal mit 0,5 ml Wasser gewaschen. Das GABA-Produkt wird durch Zählen des in 10 ml Szintillationsflüssigkeit (Aqueous Counting Scintillant, Amersham) gelösten Eluats bestimmt.
Der Hintergrund der Reaktion wird durch Ersetzen des Zelllysats mit Lysepuffer ohne Zellen ermittelt. Die Konzentration der Proteine des Zelllysats wird der Methode von Bradford folgend (Analogical Biochemistry Vol. 72: 248–254, 1976) bestimmt. Die Enzymaktivität ist in nmol gebildete GABA/mg Proteine/Stunde ausgedrückt.
Die Messung der Glutamatdecarboxylase-Aktivität ist bei jedem Klon durchgeführt worden, der von den mit dem für die GAD codierenden rekombinanten Retrovirus infizierten Zelllinien stammt. Gleichzeitig ist die GAD-Aktivität in den Striatum-Extrakten und des Retrovirus produzierenden ψ-2-Klons bestimmt worden. Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung sind in 3 dargestellt. So exprimierten von den 17 Klonen, die von infizierten HiB5-Zellen stammten, 3 große Mengen an GAD. Ebenso exprimierten von den Klonen, die von der ST14a-Linie abstammten, 3 von 20 die GAD stark. Ein HiB5-Klon und ein ST14a-Klon sind für eine Transplantation behalten worden, wobei ihre Glutamatdecarboxylase-Enzymaktivität jeweils erreichte:

– HiB5-Klon: 5,17 nmol/mg Protein/Stunde
– ST14a-Klon: 7,20 nmol/mg Protein/Stunde
– Striatum: 7,13 nmol/mg Protein/Stunde.

Man kann ebenfalls einen Western-Blot nach dem von Towbin et al. beschriebenen Protokoll (P.N.A.S. Vol. 76: 4350–4354, 1979) durchführen:
30 ml Zelllysat (gleicher Puffer wie für die Zellaktivität) wird im kochenden Wasserbad in Gegenwart von 15 ml „Laemmli Blau" (Laemmli, Nature Vol. 227: 680–685, 1970) denaturiert. Diese Lösung wird auf ein 0,1% haltiges SDS 10% Polyacrylamidgel geladen. Die Migration erfolgt über Nacht bei 30 mV. Nach Migration werden die Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die GAD wird mittels Immundetektion nachgewiesen.
Die Immundetektionen haben uns die Charakterisierung der GAD auf Western-Blot-Membranen auf Zelllinien-Kulturen und auf Gewebeschnitten nach Transplantation erlaubt. Sie sind mit einem Serum von GAD-immunisierten Kaninchen durchgeführt worden. Das Serum ist 1 : 3000 verdünnt eingesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert worden. Der erste Antikörper ist mit Peroxydase (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories) detektiert worden. Im Falle von Gewebeschnitten, die nach Transplantationen erhalten waren, ist der erste Antikörper ebenfalls mit einem Fluorescein-markierten zweiten Antikörper (FITC goat anti-rabbit, Nordic) detektiert worden.
Beispiel 11. In vivo Übertragung des GAD67-Gens von einem rekombinanten Retrovirus
Die Klone, die von den HiB5- und ST14a-Zelllinien abstammen und eine Enzymaktivität zeigen, sind in das Striatum von Sprague-Dawley Ratten transplantiert worden, die zuvor mit Equitesin anästhesiert worden waren.
7,5 × 10⁵ Zellen, die in 3 ml serumfreiem DMEM aufgenommen sind, sind in 3 Minuten in die folgenden Koordinaten stereotaktisch injiziert worden:

– Vorderseite: +0,6 mm bezogen auf das Bregma,
– Seite: +3 mm bezogen auf das Bregma,
– Tiefe: –4,5 mm bezogen auf die Dura mater.

Die Nadel ist vor dem Entfernen 3 Minuten an Ort und Stelle gelassen worden.
Ein bis zwei Wochen nach der Transplantation sind die Tiere mit einer 4% Paraformaldehyd-Lösung bei 4°C perfundiert worden und die Gehirne sind seziert und mit dem Gefrier-Mikrotom geschnitten worden (Dicke 40 μm). Eine immunhistochemische Untersuchung ist durchgeführt worden. Der erste Antikörper (polyklonaler anti-GAD-Kaninchen-Antikörper) ist entweder mit einem Peroxidase-gekoppelten zweiten Antikörper oder mit einem fluoreszierenden zweiten Antikörper detektiert worden. Wir haben folglich eine für die GAD spezifische Immunmarkierung in den Transplantaten von infizierten HiB5- und ST14a-Zellen verglichen mit Transplantaten, die von nicht infizierten Zellen stammen, nachweisen können (4 und 5), in 4A sind die nicht infizierten ST14a-Zellen dargestellt, 4B zeigt den HiB5-Klon, der das Transgen exprimiert, 5A und 5B zeigen den ST14a-Klon, der das Transgen exprimiert. In allen 4 und 5 weisen die Pfeile auf die infizierten Zellen, die das Transgen exprimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die infizierten Klone eine starke Expression des Transgens nach Transplantation aufrechterhalten.
Beispiel 12. In vitro GABA-Freisetzung
Die GABA-Freisetzung von den HiB5-GAD- und ST14a-GAD-Klonen, die für die Transplantation berücksichtigt worden sind, ist in vitro untersucht worden.
Hierfür sind die Klone auf einer Platte mit 6 Vertiefungen kultiviert worden, dann mit einer Lösung von „Hank's balanced salts" (HBSS, Gibco) vor einer weiteren Inkubation im selben Medium fünfzehn Minuten gespült worden. Nach Inkubation ist das Medium geerntet, zwecks Entfernung der Zellen zentrifugiert und mittels HPLC analysiert worden. Die Zellen sind ebenfalls für die Bestimmung der Proteinkonzentration geerntet worden. Die HPLC ist nach der von Kehr und Ungerstedt beschriebenen Methode (J. Neurochem. Vol. 51: 1308–1310, 1988) durchgeführt worden und hat den Nachweise einer bedeutenden Freisetzung von GABA von den Zellen in ihr Kulturmedium erlaubt. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.

Claims

Defektes rekombinantes Adenovirus, das ohne Regionen seines Genoms ist, die für seine autonome Replikation in einer Zielzelle erforderlich sind, und eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität codiert und unter der Kontrolle von Signalen steht, die ihre Expression in den Nervenzellen erlauben.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine gDNA-Sequenz ist.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für das gesamte oder einen Teil des GAD67-Proteins oder eines Derivats davon codiert.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für das gesamte oder einen Teil des GAD65-Proteins oder eines Derivats davon codiert.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale aus viralen Promotoren ausgewählt sind.
Adenovirus gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale aus den E1A, MLP, CMV und LTR-RSV-Promotoren ausgewählt sind.
Defektes rekombinantes Adenovirus gemäß Anspruch 1, umfassend eine cDNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität unter der Kontrolle des LTR-RSV-Promotors codiert.
Defektes rekombinantes Adenovirus gemäß Anspruch 1, umfassend eine gDNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität unter der Kontrolle des LTR-RSV-Promotors codiert.
Defektes rekombinantes Adenovirus gemäß Anspruch 1, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Glutamatdecarboxylase-(GAD)-Aktivität unter der Kontrolle eines Promotors codiert, der eine hauptsächliche Expression in den Nervenzellen erlaubt.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein humanes Adenovirus des Typs Ad2 oder Ad5 oder um ein canines Adenovirus des Typs CAV-2 handelt.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es die ITR und eine die Verpackung erlaubende Sequenz umfasst und in dem das E1-Gen und wenigstens eines der E2, E4, L1-L5 Gene nicht funktionsfähig sind.
Adenovirus gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor aus dem Promotor der für Neuronen spezifischen Enolase und dem GFAP-Promotor ausgewählt ist.
Verwendung eines Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und/oder für die Prävention der Alzheimer Krankheit, der Chorea Huntington oder der Epilepsie.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere defekte rekombinante Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie in injizierbarer Form vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu/ml und vorzugsweise 10⁶ bis 10¹⁰ pfu/ml defekte rekombinante Adenoviren umfasst.
Säugerzelle, die von einem oder mehreren defekten rekombinanten Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 infiziert ist.
Zelle gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich eine humane Zelle handelt.
Zelle gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine humane Zelle des Typs Fibroblast, Myoblast, Hepatozyt, Endothelzelle, Gliazelle oder Keratinozyt handelt.
Implantat, umfassend infizierte Zellen gemäß Ansprüchen 18 bis 20 und eine extrazelluläre Matrix.
Implantat gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Matrix einen Gelbildner umfasst, der vorzugsweise aus Kollagen, Gelatine, Glucosaminoglycanen, Fibronektin und Lektinen ausgewählt ist.
Implantat gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Matrix ebenfalls einen Träger umfasst, der die Verankerung der infizierten Zellen erlaubt.
Implantat gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger vorzugsweise aus Polytetrafluorethylenfasern besteht.