JPH09511394A - グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄ）活性をコードする組換えウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）活性を有する蛋白質をコードする異種ＤＮＡ配列を含む組換えウイルス、その調製法、および特に変性性神経学的疾患の治療および／または予防のためのそれらの治療的使用。

Description

【発明の詳細な説明】 グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）活性をコードする組換えウイルス 本発明は、ウイルス起源の組換えベクター、それらの調製法、ならびに特に神 経変性性疾患の治療および／または予防のためのそれらの使用に関する。より具 体的には本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性（ＧＡＤ）を有する蛋 白質をコードするＤＮＡ配列を含む組換えウイルスに関する。本発明は更に、そ れらのベクターの調製法、それらを含む薬剤学的組成物、および特に遺伝子療法 の際のそれらの治療的使用にも関する。 ＧＡＢＡ作動性経路は脊椎動物における神経系を阻害する主な群である。ＧＡ ＢＡ作動性ニューロンの活性の欠損は即時にジスキネジーもしくは痙攣となって 全身に現れる。それに加え、脳のガンマー−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の役割は神 経伝達のみに限定されている訳ではない。発生中の神経栄養作用、特に網膜神経 におけるものは実際のところＧＡＢＡが原因となっている。それに加えＧＡＢＡ はランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）島のβ細胞内にも存在し、そこでは ＧＡＢＡはインシュリンの産生の調節におけるある種の役割を担っているようで ある。身体の厳密な領域内でのデノボでのＧＡＢＡ合成の復帰もしくは設置の可 能性は従って、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性に直接関連する症状、およびＧ ＡＢＡアゴニストに応答する症状の両者にとっての主な治療的利点を有する。本 発明はこの問題に対する特に有利な解答を提供する。 本発明は実際に、遺伝子療法に用いることができ、局所的かつ効率的様式でイン ビボでグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を発現することが可能であるウイル ス起源のベクターの開発を記載する。従って本発明は、生物学的に活性な酵素の 標的化放出によるＧＡＢＡのインビボ合成を誘導することを含んでなるＧＡＢＡ 欠損症に関連する症状を治療するための新規の研究法を記載する。 グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性（ＧＡＤ）は、比較的特異的な様式でグ ルタミン酸のガンマー−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）への転化の触媒作用を、補助因 子であるリン酸ピリドキサル（ビタミンＢ₆）の助けを借りて行う酵素である。 天然の状態ではこの酵素は１２０キロダルトンの二量体の形態で存在する。ジス ルフィド架橋の還元後の、特異的電子免疫的分析（ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ ）ブロット）による調査により６５および６７キロダルトンでの２本のバンドが 示される。これら２つのモノマーが個別の遺伝子によりコードされる２つの異な る蛋白質に相当することが最近証明された（Ｅｒｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｎｅｕｒｏｎ ７（１９９１）９１）。今後ＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５と称さ れるこの２つの分子は酵素的観念からは互いに異なるものであり、短形態はリン 酸ピリドキサルに対して低めの親和性を示し、そしてそれらの細胞内局在性に関 しては短形態の方がニューロン伸長部内でよりはっきりと呈示される一方で、長 形態は神経細胞体内に蓄積する。この長形態はリン酸リピドキサルの濃度依存性 がより低く、そのため様々なタイプの細胞内で発現される可能性が最も高いもの である。他方、ＧＡＤ６５はアポ酵素へと転化されることによりリン酸ピリドキ サルの非存在下で迅速に不活化され、酵素活性を喪失するという特徴を有する。 アポ酵素から活性ホロ酵素への逆転化は比較的ゆっくりである。 それに加え、ＧＡＤ６７および６５の発現は神経組織に限定されているのでは ない。両ＧＡＤ共が膵臓のランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）島のβ細胞 内にも共存する。従って抗−ＧＡＤ自己抗体が、非常に稀な神経学的疾患であり 、筋緊張冗進を特徴としかつ所定のＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性を随伴する スティッフマン（Ｓｔｉｆｆ−ｍａｎ）症候群を患う患者において検出されてい る。それに加え、有意な比率を占めるこれらの蛋白質（２０％）がＩ型糖尿病に おいても発現する。同様にＧＡＤ６７も精子の鞭毛の被膜内に比較的豊富に存在 し、その被膜内ではＧＡＤ６７が酸化的異化における主要な役割を担っているこ との強い証拠が存在する。 本発明は、次には神経伝達物質であるＧＡＢＡの合成を冗進もしくは誘導する ことが可能な酵素活性をインビボで産生することが可能であることの発見である 。本発明は更に、ＧＡＢＡの合成にインビボで作用する酵素の効率的、局在的、 かつ持続的な放出を可能にするベクターの開発でもある。従って本発明は、神経 変性性病体の治療および／または予防に特に有利な遺伝子療法への新規の研究法 を提供する。 本出願人は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性のインビボ、特に神経系で の輸送用のウイルス起源のベクターの使用をより具体的に記載する。特に有利な 様式では、本出願人は今回、ＧＡＤをコードするＤＮＡ配列を含む組換えウイル スをそれらの組換えウイルスをインビボで投与する目的で構築することが可能で あること、およびその投与により安定、局在的、かつ効率的なＧＡＤ（これはイ ンビボ、特に神経系で生物学的に活性であり、かつ細胞病理学的効果を示さない ）の発現が可能と なることを示している。本発明はより具体的には、ＧＡＤ活性の発現用の所定の ウイルスの特に有利な性質の証明、ＧＡＤ活性の特に効率的でありかつ適切な組 織内での発現を可能にさせるウイルス性ベクター（所定のウイルス領域の欠損を 生じ、所定のプロモーターなどを含む欠陥ウイルス）の構築によりもたらされる 。従って本発明は、インビボでのＧＡＤの発現を指令するための特に安定かつ効 果的な、遺伝子療法において直接的に用いることができるウイルス性ベクターを 提供する。 従って本発明の第一主題は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を有する蛋 白質をコードするＤＮＡ配列を含む欠陥組換えウイルスである。 本発明の主題は更に、神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される 薬剤学的組成物の調製のためのそのような欠陥組換えウイルスの使用でもある。 本発明の目的上、用語「グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性（ＧＡＤ）を有 する蛋白質」はグルタミン酸からのＧＡＢＡの産生を誘導もしくは冗進すること が可能ないずれかの蛋白質を意味する。より具体的には、グルタミン酸デカルボ キシラーゼ活性を有する蛋白質は、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７蛋白質、もしく はそれらの誘導体の全部もしくは部分から選択される。 本発明の枠組み内で産生されるグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性はヒトも しくは動物のＧＡＤであることができる。ＧＡＤ６５および６７をコードするＤ ＮＡ配列が様々な種、そして特にヒト（Ｂｕ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ８９（ １９９２）２１１５）およびラット（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７３（１９８７）１７３）からクローン化および配列 決定されている。本発明に 従うウイルス性ベクター内へのそれらの組込みを可能にさせる目的では、これら の配列を特に、適切な制限部位の挿入用には例えば部位特異的突然変異誘発によ って、有利な様式で改変する。従来の技術に記載される配列は本発明に従う使用 のために構築されることは意図されてはおらず、かつ高発現レベルを取得する目 的では予備調節が必要となることがある。本発明の枠組み内ではヒトＧＡＤをコ ードするＤＮＡ配列を用いることが好ましい。その上、先に示すように、ＧＡＤ ６５もしくは６７の誘導体、特にヒトＧＡＤ（複数）の誘導体をコードする構築 物を用いることも可能である。このような誘導体は例えば、天然の配列と比較す ると突然変異、欠失、および／または添加により取得され、かつグルタミン酸か らのＧＡＢＡの産生を誘導もしくは冗進させる能力を保存する産物をコードする いずれかの配列を含む。これらの改変は当業者に知られる技術により作製するこ とができる（例えば、以下の一般的分子生物学的技術を参照されたい）。そのよ うにして取得された誘導体の生物学的活性は、その後には、特に実施例２に示さ れる要領で容易に決定することができる。本発明に従う誘導体は更に、プローブ として天然の配列もしくはその断片を用いて核酸ライブラリーからのハイブリダ イゼーションにより取得することもできる。 これらの誘導体は特に、それらの結合性部位に対してより大きな親和性を有す る分子、プロテアーゼに対してより大きな耐性を示す分子、より大きな治療的効 果もしくはより低い副作用、あるいは可能性としては新規の生物学的特性を有す る分子である。これらの誘導体は更に、インビボでの発現冗進を可能にする改変 化ＤＮＡ配列をも含む。 好ましい誘導体の中でも、より具体的には天然の変異体を挙げること ができ、その分子内では所定のＮ−もしくはＯ−グリコシル化部位が改変もしく は抑制されているか、一つもしくは複数の残基が置換されているか、あるいは全 てのシステイン残基が置換されている（突然変異蛋白質）。更には、重要な結合 部位との相互作用に全くもしくは殆ど関わることがない領域、あるいは所望され ない活性を発現する領域の削除により取得される誘導体、ならびに天然の配列と 比較すると追加的残基（例えば、Ｎ−末端メチオニンおよび／または分泌シグナ ルおよび／または連結用ペプチド）を含む誘導体を挙げることもできる。 本発明の枠組み内で用いられるＧＡＤをコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡ、ゲ ノムＤＮＡ、あるいは例えば一つもしくは複数の挿入断片を挿入することができ るｃＤＮＡを含んでなるハイブリッド構築物であることができる。これは更に、 合成もしくは半合成配列であってもよい。特に有利な様式ではｃＤＮＡもしくは ｇＤＮＡが用いられる。特にゲノムＤＮＡの使用によりヒト細胞内での発現冗進 が可能となる。 第一態様では、本発明は、ＧＡＤ活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ配 列を含む欠陥組換えウイルスに関する。本発明の他の好ましい態様では、そのウ イルスはＧＡＤ活性を有する蛋白質をコードするｇＤＮＡ配列を含む。 本発明のベクターは様々なタイプのウイルスから調製することができる。アデ ノウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、 もしくはレトロウイルスを用いることが好ましい。 本発明に従うウイルスは欠陥性であり、それはすなわち、それらは標的細胞内 では自律的に複製することが不可能であるということである。従って一般的には 本発明の枠組み内で用いられる欠陥ウイルスのゲノム は、感染化細胞内での前記ウイルスの複製にとって必須な配列を少なくとも欠失 している。これらの領域は、除去する（完全もしくは部分的に）か、もしくは非 機能的にさせるか、もしくは他の配列および特にＧＡＤをコードするＤＮＡ配列 で置換するかのいずれかを行うことができる。それにもかかわらずその欠陥ウイ ルスが、そのウイルス粒子の被包化にとって必須な配列をそのゲノム内に保持す ることが好ましい。 より具体的にアデノウイルスに関しては、構造および特性を幾分異にする様々 な血清型が既に特徴決定されている。これらの血清型の中でもタイプ２もしくは ５のヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）、あるいは動物起源のアデノ ウイルス（フランス特許出願第９３ ０５９５４号を参照されたい）の使用が本 発明の枠組み内では好ましい。本発明の枠組み内で使用することができる動物起 源のアデノウイルスの中では、イヌ、ウシ、ネズミ（例えば：ＭＡＶ１、Ｂｅａ ｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブ タ、鳥類、もしくは別法ではサル（例えば：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスを挙 げることができる。動物起源のアデノウイルスがイヌのアデノウイルスであるこ とが好ましく、ＣＡＶ２アデノウイルス［一例では、Ｍａｎｈａｔｔａｎ株、も しくはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］であることがより好ましい。 ヒトもしくはイヌ、あるいは混合起源のアデノウイルスが本発明の枠組み内で用 いられることが好ましい。 本発明の欠陥アデノウイルスがＩＴＲ（複数）、被包化を可能にさせる配列、 およびＧＡＤ活性を有する蛋白質をコードする配列を含むことが好ましい。本発 明のアデノウイルスのゲノム内ではＥ１遺伝子ならびに、Ｅ２、Ｅ４、およびＬ １−Ｌ５遺伝子の内の少なくとも一つが非機 能性であることが更に一層好ましい。重要なウイルス遺伝子が当業者に知られる いずれかの技術、および特に全体的抑制、置換もしくは部分除去、あるいは重要 な遺伝子（一つもしくは複数）の内の一つもしくは複数の塩基の添加により非機 能性にされることがあり得る。このような改変はインビトロ（単離されたＤＮＡ における）もしくはインサイチューで、例えば遺伝子工学的技術によるか、もし くは別法では突然変異誘発剤での処理により取得することができる。 本発明に従う欠陥組換えアデノウイルスは当業者に知られるいずれかの技術に より調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １０１ （１９９１）１９５、欧州特許第１８５ ５７３号；Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ． ３（１９８４）２９１７）。特にそれらを、アデノウイルスと、中でもＧ ＡＤをコードするＤＮＡ配列との間の相同組換えにより調製することができる。 相同組換えは、適切な細胞株内への前記アデノウイルスおよびプラスミドの同時 トランスフェクション後に生じる。用いられる細胞株は好ましくは、（ｉ）前記 因子によるトランスフォーメションが可能であり、かつ（ｉｉ）好ましくは組換 えの危険性を回避する目的で組込み形態で、その欠陥アデノウイルスゲノム部分 を補うことが可能である配列を含むべきである。細胞株の一例としては、ヒト胎 児の腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ． ３６（１９７７）５９）を挙げることができ、この細胞株は特にそのゲノム 内に組込まれた、Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの左側部分（１２％）を含む。 アデノウイルスに由来するベクターを構築するための手法もやはり、フランス特 許出願第９３ ０５９５４号およびフランス特許出願第９３ ０８５９６号に既 に記載され ている。 次には既に増幅させてあるアデノウイルスを、実施例に説明される通常の分子 生物学的技術に従って回収および精製する。 アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）に関しては、それらは比較的小さなＤＮＡウ イルスであり、このウイルスはそれ自体が感染する細胞のゲノム内に安定かつ部 位特異的様式で組み込まれる。それらは広範囲のスペクトラムの細胞を感染する ことが可能であり、その際には細胞の増殖、形態、もしくは分化におけるいずれ かの効果を誘導することはない。その上、それらはヒトにおける病理には関わっ ていないように思われる。ＡＡＶ（複数）のゲノムが既にクローン化、配列決定 、および特徴決定されている。そのゲノムは約４７００塩基を含み、かつ各末端 に約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を含み、この領域がそのウイルスに とっての複製起点として作用する。残りのゲノムは被包化機能を保持する２つの 主要領域に分離され、それらは：ゲノムの左側部分（これはそのウイルス遺伝子 のウイルス複製および発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含む）；ゲノムの右側部分（ これはそのウイルスカプシド蛋白質をコードするｃａｐ遺伝子を含む）、である 。 アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）に関しては、それらは比較的小さなＤＮＡウ イルスであり、このウイルスはそれ自体が感染する細胞のゲノム内に安定かつ部 位特異的様式で組み込まれる。これらは広範囲のスペクトラムの細胞を感染する ことが可能であり、その際には細胞の増殖、形態、もしくは分化におけるいずれ かの効果を誘導することはない。その上、それらはヒトにおける病理には関わっ ていないように思われる。ＡＡＶ（複数）のゲノムが既にクローン化、配列決定 、および特徴決定 されている。そのゲノムは約４７００塩基を含み、かつ各末端に約１４５塩基の 逆方向反復領域（ＩＴＲ）を含み、この領域がそのウイルスにとっての複製起点 として作用する。残りのゲノムは被包化機能を保持する２つの主要領域に分離さ れ、それらは：ゲノムの左側部分（これはそのウイルス遺伝子のウイルス複製お よび発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含む）；ゲノムの右側部分（これはそのウイル スカプシド蛋白質をコードするｃａｐ遺伝子を含む）、である。 インビトロおよびインビボでの遺伝子の輸送用のＡＡＶ（複数）から取得され るベクターの使用が既に刊行物に記載されている（特に、国際公開第９１／１８ ０８８号；国際公開第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、 米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８ ５２８号、を参照された い）。これらの特許出願は、ＡＡＶ（複数）から取得される様々な構築物（これ らの構築物からはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が削除され、かつ目的の遺 伝子での置換が行われている）、および前記目的の遺伝子のインビトロ（培養中 の細胞上で行われる）もしくはインビボ（生物体中で直接行われる）での輸送用 のそれらの使用が記載されている。本発明に従う欠陥組換えＡＡＶ（複数）は、 ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）による感染を受ける細胞株内 への、２つのＡＡＶ逆方向反復領域（ＩＴＲ）でフランクされるＥＴＳインヒビ ターをコードする配列を含むプラスミド、およびＡＡＶ被包化遺伝子（ｒｅｐお よびｃａｐ遺伝子）を保持するプラスミドの同時トランスフェクションにより調 製することができる。産生される組換えＡＡＶ（複数）をその後に通常の技術に より精製する。 ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスに関しては、組換えベクター の構築が既に刊行物に広範囲にわたり記載されており、：特に、Ｂｒｅａｋｆｉ ｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９１）２０３； 欧州特許第４５３２４２号、欧州特許第１７８２２０号、Ｂｅｒｎａｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ． ７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍ ｉｃ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９など、を参照された い。特にレトロウイルスは組込み性ウイルスであり、これは選択的に分裂細胞に 感染する。従ってこれらは癌適用についての目的のベクターを構築する。レトロ ウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲ、１つの被包化配列、および３つのコーデ ィング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含む。レトロウイルス由来の組 換えベクター内では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は一般的には完全も しくは部分的に削除されており、かつ目的の異種核酸配列により置換されている 。これらのベクターは、例えば特にＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー（Ｍｏｌｏｎ ｅｙ）白血病ウイルス、ＭｏＭＬＶとも称される）、ＭＳＶ（マウスモロニー（ Ｍｏｌｏｎｅｙ）肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ（ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウ イルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイ ルス）、もしくは別法ではフレンド（Ｆｒｅｉｅｎｄ’ｓ）ウイルスのような様 々なタイプのレトロウイルスから調製することができる。 目的の配列を含む組換えレトロウイルスを構築するには、特にＬＴＲ（複数） 、被包化蛋白質、および前記目的の配列を含むプラスミドを一般的に構築し、そ してその後にそれを用いてそのプラスミドで欠損を生じているレトロウイルス機 能をトランスで提供することが可能ないわゆる被包化細胞株をトランスフェクト する。一般的にはそのため被包化株 はｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を発現することが可能である。このよう な被包化株は既に従来の技術に記載されており、そしてそれらは特にＰＡ３１７ 株（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ株（国際公開第９０／ ０２８０６号）、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２株（国際公開第８９／０７１５ ０号）である。しかしながらこれらの組換えレトロウイルスは転写活性を抑制さ せるためのＬＴＲ（複数）内での改変、ならびにｇａｇ遺伝子の一部分を含む伸 長化被包化配列を含むことがある（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏ ｌ． ６１（１９８７）１６３９）。産生される組換えレトロウイルスはその後 に通常の技術により精製される。本発明の具体的事例ではレトロウイルスを、Ｇ ＡＤをコードする遺伝子を含むレトロウイルスプラスミドと、トランス相補性細 胞株との間の相同組換えにより調製することができ、この相同組換えにより、ゲ ノムがそのトランスジーンをコードするウイルス性粒子を産生することが可能と なるであろう。細胞株の例としては特に細胞株Ψ−２を挙げることができ、この 細胞株はｐＭＯＶ−Ψ^-（被包化配列「Ψ」が削除されているマウスモロニー（ Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）を含むプラスミド）でのトラ ンスフェクションによりＮＩＨ−３Ｔ３株（マウス繊維芽細胞株）から取得され る（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３３、１５３−１５９、１９８３）。 本発明の実施のためには、アデノイウイルスもしくは欠陥組換えレトロウイル スを用いることが最も特に有利である。以下に示される結果は、ＧＡＤ活性を有 する蛋白質のインビボでの発現のためのアデノウイルスおよびレトロウイルスの 特に有利な特徴を実際に記載している。その上、 本発明に従うアデノウイルスおよびレトロウイルスベクターはそれに加えて、例 えば特に神経細胞の非常に高い感染効率（このことにより少量のウイルス懸濁物 から感染を実施することが可能となる）のような主要な利点を有する。それに加 え、本発明のこれらのウイルスベクターでの感染は注入の部位にかなり局在化さ れ、このことにより近隣諸細胞への拡散の危険性が回避される。 有利なことに、本発明のベクターにおいてはＧＡＤ活性を有する蛋白質をコー ドする配列は神経細胞内でのそれ自体の発現を可能にさせるシグナルの制御下に 置かれる。それらが異種発現シグナルであることが好ましく、それはすなわちＧ ＡＤの発現の天然の状態での原因となるものとは異なるシグナルということであ る。それらは特に他の蛋白質の発現の原因となる配列もしくは合成配列であって もよい。特にそれらは真核生物もしくはウイルスの遺伝子のプロモーター配列で あることができる。例えばそれらは、感染が所望される細胞のゲノムから取得さ れるプロモーター配列であることができる。同様にそれらは、用いられるウイル スを初めとするウイルスのゲノムから取得されるプロモーター配列であることが できる。これに関しては例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶ−ＬＴ Ｒプロモーターなどを挙げることができる。それに加えこれらの発現配列を、活 性化因子配列、調節配列、もしくは組織特異的発現を可能にさせる配列の添加に より改変することができる。実際のところ神経細胞内で特異的もしくは優先的に 活性を示し、その結果、そのウイルスが実際に神経細胞を感染した際のみにその ＤＮＡ配列が発現されかつその効果を生じる発現シグナルを用いることが特に有 利であることがある。これに関しては、ニューロン特異的エノラーゼプロモータ ー （Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ ５（１９９０）１ ８７）、およびＧＦＡＰプロモーター（Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅ ｕｒｏｃｈｅｍ．５７（１９９１）６７５）などを挙げることができる。 具体的態様では本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの制御下にＧＡＤ活性 を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を含む欠陥組換えウイルスに関する。 他の具体的態様では本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの制御下にＧＡＤ 活性を有する蛋白質をコードするｇＤＮＡ配列を含む欠陥組換えウイルスに関す る。 本出願人は実際に、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が、ヒトの細 胞、特に中枢神経系におけるＧＡＤ活性の持続的かつ実質的な発現を可能にする ことを示している。 好ましい態様では更に、本発明は神経系における優先的発現を可能にさせるプ ロモーターの制御下にＧＡＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む 欠陥組換えウイルスに関する。 発現は、たとえ残存性発現が他のタイプの細胞に観察されたとしても、その発 現レベルが神経細胞内で一層高い場合には、本発明の目的のためには優先的とし て見なされる。 先に示されるように本発明は更に、神経変性性疾患の治療および／または予防 が意図される薬剤学的組成物の調製のために先に記載されるウイルスのいずれか の使用にも関する。より具体的には本発明は、パーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏ ｎ’ｓ）病、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、筋萎縮性側索硬化 症（ＡＬＳ）、ハンチントン（Ｈｕ ｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、癲癇、および脳血管性変性症などの治療および／ま たは予防が意図される薬剤学的組成物の調製のためのこれらのウイルスのいずれ かの使用に関する。 本発明はまた、先に記載される一つもしくは複数の欠陥組換えウイルスを含む 薬剤学的組成物にも関する。これらの薬剤学的組成物は、局所、経口、非経口、 鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、もしくは経皮投与などのために調剤される ことがある。本発明の薬剤学的組成物が、特に患者の神経系内への直接注入のた めの、注入用製剤用の薬剤学的に許容される賦形剤を含むことが好ましい。これ は具体的には等張滅菌溶液、あるいは乾式、特に凍結乾燥させた（この場合には 、その事例に依存して、滅菌した水もしくは生理学的食塩水の添加の際に、注入 用溶液の調製が可能となる）組成物であることがある。患者の神経系内への直接 注入が有利であり、それはそのことにより冒された組織のレベルに治療効果を濃 縮することが可能となるためである。患者の中枢神経系内への直接注入は、定位 注入装置により有利に実施される。そのような装置の使用により実際に、非常に 高い精度で注入部位を標的化することが可能となる。側頭葉内、癲癇巣内への例 えば特に黒質内注入のような局所注入か、もしくは別法では腸上皮細胞内への局 所注入が特に有利であることがある。 注入用に用いられる欠陥組換えウイルスの用量は様々なパラメーターに従い、 そして特にウイルスベクター、用いられる投与の様式、関与する病理、もしくは 別法では治療の所望される持続期間に従って調節することができる。一般的には 本発明に従う組換えアデノウイルスは、１０⁴ｐｆｕ／ｍｌと１０¹⁴ｐｆｕ／ｍ ｌとの間、そして好ましくは１０⁶〜 １０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投与剤の形態で製剤および投与される。用語「ｐｆｕ（プ ラーク形成単位）」はウイルス溶液の感染性に相当し、かつ適切な細胞培養物を 感染させ、そして一般的には４８時間後に感染化細胞のプラーク数を測定するこ とにより決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は刊行物 に非常に詳しく記載されている。アデノウイルスに関しては、本発明に従う組成 物は産生性細胞を直接含むことがあり、そのためそれらを移植することができる 。 本発明に従う遺伝子療法により取得されるＧＡＢＡ放出は、例えば筋萎縮性硬 化症のような変性性神経疾患の原因となる刺激毒性現象を遮断するの特に効果的 な治療的研究法を構成する。 従って本発明のベクターは抗痙攣性および神経保護的特性を有する。本発明の ベクターの治療的適用法の中でも具体的には、所定の形態の癲癇の治療、特に例 えば側頭葉の治療抵抗性癲癇のようないずれかの薬理学的もしくは外科的治療に も耐性を示すものの治療を挙げることができる。本発明のベクターは更に、様々 な起源、特に虚血起源の刺激毒性性脳病変の治療用、ならびに刺激毒性性病変を 生じる可能性がある延髄損傷の治療用にも用いることができる。これらは更に、 糖尿病、特にＩ型糖尿病の治療においても大きな治療価値を有するものであり、 その価値というのは例えば前糖尿病個体においてＧＡＤに対する許容性を誘導す ることによるものであり、このことによりこの疾患の症状の原因となる自己免疫 性攻撃を回避することが可能となる。これに関しては、例えば腸におけるＧＡＤ の多量ではあるが良好な局在性を示す合成もやはり明白な糖尿病の症例における 明確な治療価値を有するものであり、その治療価値というのは細胞性自己免疫応 答を抑制することによるものである。 本発明の他の主題は、先に記載される一つもしくは複数の欠陥組換えウイルス による感染を受けたいずれかの哺乳類に関する。より具体的には本発明は、それ らのウイルスによる感染を受けたいずれかのヒト細胞集団に関する。それは具体 的には繊維芽細胞、筋芽細胞、角膜実質細胞、内皮細胞、および神経膠細胞など であることがある。 本発明に従う細胞は初期培養物から取得することができる。これらは当業者に 知られるいずれかの技術により回収し、そしてその後にそれらの増殖を可能にさ せる条件下で培養することができる。より具体的に繊維芽細胞に関しては、これ らは生検から、例えばＨａｍ［Ｍｅｔｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２１ａ（ １９８０）２５５］により記載される技術に従って容易に取得され得る。これら の細胞は、ウイルスによる、もしくは例えば凍結により保存されたウイルスによ る感染のため、自己ライブラリーの確立のため、後続使用のために直接用いるこ とができる。本発明に従う細胞は更に、例えば予備的に確立されたライブラリー から取得される二次培養物であり得る（例えば、欧州特許第２２８４５８号、欧 州特許第２８９０３４号、欧州特許第４０００４７号、欧州特許第４５６６４０ 号、を参照されたい）。 この培養細胞はその後には、ＧＡＤ活性を生じる能力をそれらの細胞に付与す るように、組換えウイルスで感染させる。感染は当業者に知られる技術に従って インビトロで実施される。具体的には、用いられる細胞のタイプおよび細胞当た りのウイルスの所望されるコピー数に依存して当業者は感染多重度、および場合 によっては実施される感染周期数を調節することができる。これらの段階は、細 胞がインビボで投与されることが意図される場合には適切な滅菌条件下で実施さ れるべきであるこ とは明らかに理解される。細胞の感染用に用いられる組換えウイルスの用量は、 所望される目的に従って当業者により調節され得る。インビボでの投与のために 先に記載された条件をインビトロでの感染に適用することができる。 本発明の他の主題は、先に記載される一つもしくは複数の欠陥組換えウイルス 、ならびに細胞外マトリックスで感染させた哺乳類細胞を含む移植片に関する。 本発明に従う移植片が、１０⁵〜１０¹⁰の細胞を含むことが好ましい。それらが １０⁶〜１０⁸の細胞を含むことがより好ましい。 より具体的には、本発明の移植片では細胞外マトリックスは、ゲル化剤および 場合によっては細胞の固着を可能にする支持体を含む。 本発明に従う移植片の調製のためには様々なタイプのゲル化剤を用いることが できる。ゲル化剤は、ゲルの構造を有するマトリックス内への細胞の組込みのた め、および適切な場合には支持体上への細胞の固着を冗進させるために用いられ る。従って様々な細胞接着剤をゲル化剤として用いることができ、それらは例え ば特に、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン、お よびレシチンなどである。コラーゲンが本発明の枠組み内で用いられることが好 ましい。これはヒト、ウシ、もしくはマウス起源のコラーゲンであることがある 。タイプＩコラーゲンが用いられることがより好ましい。 先に示されるように、本発明に従う組成物は有利なことに細胞の固着を可能に する支持体を含む。用語「固着」は、その支持体上への細胞の粘着および／また は結合をもたらす生物学的および／または化学的および／または物理学的相互作 用のいずれかの形態を意味する。その上、そ の細胞は用いられる支持体を覆うかもしくはその支持体の内側に貫通するか、あ るいはその両方のいずれかであり得る。固形で無毒性および／または生物適合性 である支持体の使用が本発明の枠組み内では好ましい。具体的には、ポリテトラ フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）線維もしくは生物学的起源の支持体の使用が可能 である。 本発明に従う移植片を体内の様々な部位に移植することができる。具体的には その移植を腹膜腔内、皮下組織内（恥骨上領域、腸骨窩および鼠径窩など）、臓 器、筋肉、腫瘍、中枢神経系内、あるいは別法では粘膜下で実施することができ る。本発明に従う移植片は、それらにより体内での治療用産物の放出を制御する ことが可能となるという点で特に有利であり：この放出は最初に感染多重度によ り、そして移植した細胞数により決定される。次にこの放出を、その移植片の除 去（これは永久にその治療を停止させる）、もしくは調節可能な発現系の使用（ これは、その治療用遺伝子の発現を誘導もしくは抑制することを可能にする）の いずれかにより制御することができる。 従って本発明は、神経変性性疾患の治療もしくは予防のための非常に有効な手 段を提供する。これは最も具体的にはアルツハイマー（Ａｌｔｚｈｅｉｍｅｒ’ ｓ）病、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、癲癇、およびＡＬＳの治療に適用される。それに加え、 この治療をヒト、ならびに例えばヒツジ、ウシ、家畜動物（イヌ、およびネコな ど）、ウマ、および魚類などのようないずれかの動物の両方に適用することがあ る。 本発明は以下の実施例および図面の助けを借りて一層完全に記載されるであろ うが、それらの実施例および図面は説明的かつ非制限的として 見なされるべきである。図面の説明文 図１：ベクターｐＬＴＲＩＸＧＡＤ６７の構造 図２ａおよび２ｂ：ＧＡＤをコードする組換えレトロウイルスを産生するΨ− ２クローンによるＨｉＢ５およびＳＴ１４ａの感染。 図３：ＧＡＤをコードする組換えレトロウイルスで感染させた細胞株から取得 された様々なクローンのグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性。 図４および５：非感染化ＳＴ１４ａ細胞と比較した際のＧＡＤを発現するＨｉ Ｂ５（図４Ｂ）およびＳＴ１４ａ（図５Ａおよび５Ｂ）のインビボでの移植の調 節。 図６：遺伝子改変を施した細胞によるインビトロでのＧＡＢＡの放出。一般的分子生物学的技術 分子生物学で通常用いられる方法（例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出、 塩化セシウム密度勾配液中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースもしく はアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、蛋白質のフ ェノールもしくはフェノール−クロロホルム抽出、食塩水培地中でのＤＮＡのエ タノールもしくはイソプロパノール沈殿、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）内でのトランスフォーメーションなど）は当業者には熟知されて おり、かつ刊行物に広範囲にわたり記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｕ ｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、「Ｃ ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７］。 ｐＢＲ３２２−およびｐＵＣ−タイプのプラスミド、ならびにＭ１３シリーズ のファージは市販品起源のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。 連結のためにはＤＮＡ断片を、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳 動によりそれらのサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロ ロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後に供給社の推奨 事項に従ってファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下でイ ンキュベートすることができる。 突出性５’末端の充填は、供給社の説明事項に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ ポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片 を用いて実施することができる。突出性３’末端の破壊は、製造業者の推奨事項 に従って用いられるファージ Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社 ）の存在下で実施される。突出性５’末端の破壊はＳ１ヌクレアーゼでの制御的 処理により実施される。 合成オリゴヌクレオチドによるインビトロでの部位特異的突然変異誘発は、Ｔ ａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４ ９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布さ れるキットを用いて実施することができる。 いわゆるＰＣＲ技術［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉ ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉ ｓ Ｋ．Ｂ． ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１ ５５ （１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡ断片の酵素的増幅を、ＤＮＡサ ーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌａｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ ｒ Ｃｅｔｕｓ社）を製造業者の説明事項に従って用いて実施することができる 。 ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により 開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実 施することができる。実施例 実施例１．ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス ＬＴＲプロモーターの制御下にＧ ＡＤ６７をコードする遺伝子を保持するベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７の 構築 この実施例は、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス ＬＴＲ（ＲＳＶ−ＬＴＲ） を含んでなるプロモーターの制御下に、ＧＡＤ６７をコードするｃＤＮＡ配列を 含むベクターの構築法を記載する。 １．１． 出発ベクター（ｐＬＴＲ ＩＸ）：ベクターｐＬＴＲ ＩＸは具体 的にはＩＴＲおよび被包化部位を含むＡｄ５アデノウイルスの左側領域、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ならびにｐＩＸ遺伝子からＥａｇＩ制限部位にまで広が るＡｄ５アデノウイルスの領域（この領域によりインビボでの相同組換えが可能 となる）を含む。このベクターはＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９０（１９９２）６２６）に より記載された。 １．２． ＧＡＤ６７をコードするｃＤＮＡ配列の構築。 本発明に従うベクターの調製を可能にするためには、ラットのＧＡＤ６７をコ ードするｃＤＮＡ配列を以下の要領で構築した： − グルタミン酸デカルボキシラーゼ ＧＡＤ６７ ｍＲＮＡに相当するｃＤ ＮＡクローンを、ベクター ラムダーＧＴ１１内で構築されたラット脳のｃＤＮ Ａ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングにより単離した（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７３（１９８７）１７３） 。単離されたクローン中のＧＡＤ６７をコードする配列の性質および正確な位置 はその挿入断片の配列決定により決定した。このクローンを含む挿入断片をその 後に酵素ＥｃｏＲＩでの消化により単離し、そしてそれに次いでベクターｐＳＰ Ｔ１８もしくはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の対応部位内に サブクローン化した。 １．３． ベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７の構築。 この実施例は、ＲＳＶウイルスＬＴＲの制御下にＧＡＤ６７をコードする配列 、ならびにインビボでの組換えを可能にさせるＡｄ５アデノウイルス配列を含む ベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７の構築法を記載する。 ２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、実施例１．２．において調製し た構築物からの酵素的消化により単離した。この２ｋｂ断片はＧＡＤ６７をコー ドする配列を含み、かつ翻訳開始用のコドンの上流の１１８ｂｐ目、および停止 コドンの下流に位置する７０ｂｐ目にまで広がる。この断片をＬＭＰ（低融点（ Ｌｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ））アガロースゲル電気泳動により単離お よび精製し、そしてその後にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を生 じさせた。その後 にこの断片をベクターｐＬＴＲ ＩＸ（実施例１．１．）のＳａｌＩ適合性部位 内に挿入してベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７（図１）を作製した。その後 にＧＡＤ６７挿入断片の全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド配列決定 法により確認した。 実施例２． ベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７の機能性 ベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７がＧＡＤの生物学的活性形態を細胞培養 物内に発現する能力を、細胞２９３の一過性トランスフェクションにより証明し た。このためには細胞（直径１０ｃｍのディッシュ当たり２×１０⁶の細胞）を トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）の存在下でトランスフェクトさ せた（８μｇのベクター）。ＧＡＤをコードする配列の発現および生物学的に活 性な蛋白質の産生は以下の検査により証明される： − ノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロット技術によるＧＡＤ ｍＲＮＡの検出お よび定量化（詳細な方法については例えば、Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７３（１９８７）１７３、を参照されたい） − Ｋ２ ポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いるウエスタン（Ｗ ｅｓｔｅｒｎ）ブロット技術によるＧＡＤ蛋白質の可視化（詳細な方法について 例えば、Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７ ３（１９８７）１７３、を参照されたい） − 細胞溶解物を用いるＧＡＤ活性（ＧＡＢＡの合成）の証明および定量化。こ のためにはトランスフェクション後４８時間目に細胞を溶解し、そしてその溶解 物を１００，０００ｇでの遠心分離により清澄化させる。その後にこの溶解物を 、それ自体がセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ビーズに連結させてある抗−ＧＡＤ抗体の存在下でインキュベートする。用いら れる抗体は具体的には抗体＃１４４０であり、これはＧＡＤの触媒活性を保存す る特徴を有する（Ｏｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ６（１９ ８１）２７１５）。類似の特徴を有する他の抗体を用い、かつ場合によっては調 製することができることが理解される。この抗体−活性ＧＡＤ複合体をその後に 細胞溶解物から分離し、そして［１−¹⁴Ｃ］Ｌ−グルタミン酸の存在下でインキ ュベートする。この反応中に放出される¹⁴ＣＯ₂はグルタミン酸のＧＡＢＡへの 転移を反映し、この¹⁴ＣＯ₂をハイアミン（ｈｙａｍｉｎｅ）で浸透させたフィ ルター上に捕獲し、そして液体シンチレーションによる計数を行った。２つの陰 性対照により、バックグラウンドノイズを引き去ること、およびそのため特異的 シグナルを決定することが可能となり、それらの陰性対照とは；一つは前免疫抗 血清であり、そしてもう一つのものはＧＡＤ−特異的インヒビター アセチレン −γ−ＧＡＢＡである（やはり、Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃ ｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７３（１９８７）１７３、を参照されたい）。 実施例３：ＧＡＤ６７をコードする配列を含む組換えアデノウイルスＡｄ−ＧＡ Ｄ６７の構築 ベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７を直線化させ、そして欠陥アデノウイル スベクターと共に、アデノウイルスＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）によりコー ドされる機能をトランスで提供するヘルパー細胞（株２９３）内に同時トランス フェクトさせた。 より具体的には、Ａｄ−ＧＡＤ６７アデノウイルスを、突然変異体アデノウイ ルスＡｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａ ｌ．、Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）とベクターｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ ６７との間でのインビボでの相同組換えにより、以下の方法により従って取得し た：酵素ＣｌａＩにより直線化させたプラスミドｐＬＴＲ ＩＸ ＧＡＤ６７お よびＡｄ−ｄ１１３２４アデノウイルスを、リン酸カルシウムの存在下で株２９ ３内に同時トランスフェクトさせて相同組換えを可能にさせた。そのようにして 作製された組換えアデノウイルスをプラーク精製により選択した。単離後、その 組換えアデノウイルスＤＮＡを細胞株２９３内で増幅させ、そのことにより約１ ０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する非精製化組換え欠陥アデノウイルスを含む培養 上清を取得した。 その後にこのウイルス粒子を、既知の技術に従う塩化セシウム密度勾配液上で の遠心分離により精製する（特に、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ ５２（１９７３）４５６、を参照されたい）。Ａｄ−ＧＡＤ６７アデノウ イルスは２０％グリセロール中、−８０℃下で保存することができる。 実施例４：Ａｄ−ＧＡＤ６７アデノウイルスの機能性 Ａｄ−ＧＡＤ６７アデノウイルスが培養物中の細胞を感染し、かつＧＡＤ６７ の生物学的活性形態を培養培地中に発現する能力を、ヒト２９３株を感染させる ことにより証明した。その後に培養物上清中の活性ＧＡＤ６７の存在を実施例２ におけるものと同一の条件下で決定した。 これらの研究により、アデノウイルスが実際に細胞培養物中にＧＡＤ６７の生 物的活性形態を発現することを示すことが可能となる。 実施例５：組換えアデノウイルスによるＧＡＤ６７遺伝子のインビボ輸送 この実施例は本発明に従うアデノウイルスベクターによるインビボでのＧＡＤ ６７遺伝子の輸送法を記載する。この実施例は様々な動物モデルで本発明のベク ターの効果をどのように証明することができるかを示す。 組換えアデノウイルスＧＡＤ６７を神経系の様々な地点に注入することができ る。具体的にはその注入は以下に示す異なる地点で実施することができ、それら の地点とは：中隔の正中核、海馬の背側部、線条、内側嗅皮質の黒質、である。 注入したアデノウイルスは実施例３において調製され、リン酸緩衝化食塩水溶 液（ＰＢＳ）内での精製化形態で用いられるＡｄ−ＧＡＤ６７アデノウイルス（ ３．５×１０⁶ｐｆｕ／μｌ）である。注入はポンプに連結させてあるカニュー レ（外径２８０μｍ）の助けを借りて実施される。注入速度を０．５μｌ／分に 固定し、注入後にはカニューレを更に４分間差し込んだままにし、その後に引き 抜く。 海馬、中隔、線条、および黒質への注入容積は、各々３、２、３、および２μ ｌである。注入したアデノウイルス濃度は３．５×１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 海馬への注入のための定位座標値は以下のとうりである：ＡＰ＝−４；ＭＬ＝ ３．５；Ｖ＝−３．１（ＡＰおよびＭＬ座標値はブレグマに関連して決定され、 Ｖ座標値はブレグマの頭蓋骨の表面に関連して決定される）。 中隔への注入のための定位座標値は以下のとうりである：ＡＰ＝１；ＭＬ＝１ ；Ｖ＝−６（ＡＰおよびＭＬ座標値はブレグマに関連して決定され、Ｖ座標値は ブレグマの頭蓋骨の表面に関連して決定される）。こ の条件下ではカニューレは正中静脈洞を回避する目的で頭頂（中外側方向）に関 して９度の角度をとっている。 黒質への注入のための定位座標は以下のとうりである：ＡＰ＝−５．８；ＭＬ ＝＋２；Ｖ＝−７．５（ＡＰおよびＭＬ座標値はブレグマに関連して決定され、 Ｖ座標値は硬脳膜に関連して決定される）。 線条への注入のための定位座標は以下のとうりである：ＡＰ＝＋０．５および −０．５；ＭＬ＝３；Ｖ＝−５．５（ＡＰおよびＭＬ座標値はブレグマに関連し て決定され、Ｖ座標値は硬脳膜に関連して決定される）。 本発明に従うアデノウイルスの投与の治療効果は以下の３つのタイプの分析に より証明され、それらは：組織学的および免疫組織学的分析、定量的分析、なら びに行動的分析であり、これらは本発明のベクターが生物学的に活性なＧＡＤを インビボで産生する能力を反映する。 実施例６． ＧＡＤ６７をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスプラスミ ドｐＭｏＭｕＬＶ−ＧＡＤの構築 レトロウイルスプラスミド内に挿入されたラットのグルタミン酸デカルボキシ ラーゼｃＤＮＡは、５’末端に１６３の非コーディング塩基対、および３’末端 に３７７の非コーディング塩基対を含む。ＧＡＤをコードする読み取り枠は１７ ８２塩基対を含む。このｃＤＮＡは、５’ＬＴＲの転写制御下、このベクターの ２つのＬＴＲの間に挿入された。このレトロウイルス配列は更に、その被包化を 可能にさせる配列ｙを含む。最終的にはこのプラスミドは、形質転換後にその細 菌を選択することを可能にするアンピリシン耐性遺伝子を含む。このプラスミド の組換えレトロウイルス配列の概略図は以下のとうりである： このラットＧＡＤ６７ ｃＤＮＡはプラスミドｐＹ２１−ＧＡＤから、ＧＡＤ をコードする配列を含む２．３２キロベースの断片を作製する目的でのＳａｌＩ ／ＰｓｔＩ開裂により抽出された。２８ｍｇのプラスミドｐＹ２１−ＧＡＤを５ 単位の各酵素で１時間、３７℃下で開裂させた。消化後、ＤＮＡをエタノールで 沈殿させ、そしてその後にＧＡＤ挿入断片を１％の低融点アガロースゲルでの電 気泳動後に精製した。 転写および組込みに必須なレトロウイルス配列（各々「ＬＴＲ」および「Ψ」 ）を含むベクターｐＭｏＭｕＬＶ−ＴＨを酵素ＳａｌＩおよびＮｓｉＩにより開 裂させた。この開裂により、そのベクターからチロシンヒドロキシラーゼｃＤＮ Ａを除去し、そしてＧＡＤ ｃＤＮＡのためのクローニング部位（付着末端に適 合するＮｓｉＩおよびＰｓｔＩ酵素形態）を作製することが可能となった。１０ ｍｇのＤＮＡを５酵素単位で１時間、３７℃下で開裂させた。このベクターをＧ ＡＤ ｃＤＮＡと同一の方法により精製した。 ９０ｎｇのＧＡＤ ｃＤＮＡおよび３６０ｎｇのベクターｐＭｏＭｕＬＶを４ 単位のバクテリオファージ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、１６℃で一晩連結 させた。 連結させたＤＮＡの半量を電気穿孔法によりコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ ）細菌（ＸＬ１ブルー）内に組込ませ、そしてその形質転換細胞を、１００ｍ ｇ／ｍｌのアンピリシンを含むＬＢ／アガロースペト リ（Ｐｅｔｒｉ）ディッシュ上で選択した。組換えｐＭｏＭｕＬＶ−ＧＡＤクロ ーンを、そのベクターおよび挿入断片を非対称に開裂するＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎ Ｉ酵素での消化により同定した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ開裂による２ ４の細菌クローンの分析により、予測されたプラスミドに相当するものの内の４ つを単離することが可能となった。これらのクローンの内の一つをレトロウイル スプラスミドの産生に用いた。 プラスミドｐＭｏＭｕＬＶ−ＧＡＤを、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方 法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ ７：１５１３− １５２３、１９７９）に従ってＣｓＣｌ密度勾配液上で組換えクローンからのプ ラスミドＤＮＡの単離により調製した。 実施例７． レトロウイルス−産生性細胞のトランスフェクション この段階のために我々は、レトロウイルス転写物の被包化に必要とされる全レ トロウイルス機能を発現するプロウイルスを有するが、Ψ被包化シグナルについ ては欠陥を示すΨ−２細胞株を用いた。この欠陥のため、このプロウイルス転写 物は被包化されない。他方で被包化機能については欠陥を示すが、配列ｙを保持 するレトロウイルスは、このトランス相補性細胞により被包化され得る。 Ψ−２細胞を、プラスミドｐＭｏＭｕＬＶ−ＧＡＤ、およびネオマイシン耐性 遺伝子（ｐＵＣ−ＳＶ_NEO）を保持するプラスミドで、リン酸カルシウム沈殿（ Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ ７：２７４５−２７５２、１９８８）の助け を借りて同時トランスフェクトした。２０ｍｇのｐＭｏＭｕＬＶ−ＧＡＤおよび ２ｍｇのＰＵＣ−ＳＶ_NEOを 含む沈殿物を１８時間、１０⁶の細胞と接触させたままにした。次に、その培養 を、抗生物質（ペニシリン：１００単位／ｍｌ；ストレプトマイシン：１００ｍ ｇ／ｍｌ）ならびにウシ胎仔血清（１０％ ｖｏｌ／ｖｏｌ）を補足してあるＤ ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）内で継続させた。 トランスフェクション２日後に、その細胞を７枚のペトリ（Ｐｅｔｒｉ）ディ ッシュ（直径１０ｃｍ）に移し、そしてトランスフェクトされた細胞を選択する 目的で６００ｍｇ／ｍｌのネオマイシンを補足してある同一培地中で培養した。 選択開始後１５日目にネオマイシン−耐性クローンをパスツールピペットで回 収し、そして２５ｃｍ²フラスコ内で培養する。 ネオマイシン−耐性Ψ−２クローンの細胞が密集状態になった時点でその細胞 を新鮮な培地に１２時間接触させる。Ψ−２細胞により産生されるレトロウイル スを含むこの培地を回収し、液体窒素中で凍結し、そして使用するまで−８０℃ 下に保存する。 実施例８． ＮＩＨ−３Ｔ３株の細胞の感染によるΨ−２クローンのスクリーニ ング 様々なΨ−２クローンにより産生されるレトロウイルスの質および量を決定す る目的で、後者のクローンをＮＩＨ−３Ｔ３株（マウス繊維芽細胞から不滅化さ せた繊維芽細胞タイプの細胞株）の細胞における感染能を調査することによる間 接的検査を行った。このためには３５のΨ−２クローンのレトロウイルス上清を 用いて細胞を感染させ、そして感染後にはそれらを、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒ ｎ）ブロットを実施する目的では回収するか、あるいは免疫細胞化学的方法によ りＧＡＤを検出する目的では固定化させるかのいずれかを行った（図２）。これ らの実験 の結果により我々は、最高の感染能を有するΨ−２クローンを選択することが可 能となった。 実施例９． レトロウイルスによるＨｉＢ５およびＳＴ１４ａ細胞株の感染 実施例８において選択されたΨ−２クローンから取得されるレトロウイルス上 清を用いて中枢神経系の２つの前駆細胞株、ＨｉＢ５およびＳＴ１４ａを感染さ せた。 −ＨｉＢ５：ＳＶ４０熱感受性Ｔ抗原により不滅化させたラット海馬初期細胞 （１６日令の胎仔）から取得される細胞株。この株の細胞はニューロンタイプお よび神経膠タイプの細胞についての前駆体である（Ｒｅｎｆｒａｎｚ ｅｔ ａ ｌ．、Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ ６６：７１３−７２９、１９９１）。 −ＳＴ１４ａ：この株は前述の株と同一の様式で不滅化させたが、ただしラッ ト線条初期培養物から取得される。 ＨｉＢ５およびＳＴ１４ａ株の細胞は３３℃下ではインビトロで分裂する性質 を有するが、体温が３９℃である齧歯類の中枢神経系内に一旦移植すると増幅を 停止する。そのためこれらの細胞をインビトロで容易に培養することができ（３ ３℃下で）、かつこれらはインビボでは腫瘍形成性を示さない。 これらは感染の間には密集してはならず、それは：細胞分裂（およびその細胞 が生じるＤＮＡ合成）は、そのレトロウイルスゲノムが宿主細胞内に組込まれる のに必須であるためである（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕ ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２：１５６−１８２、１９８８）。 培地はレトロウイルス上清については１０ｍｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙ ｂｒｅｎｅ）が予め添加されているものに交換する。細胞は１２時間はレトロウ イルス上清と接触させたままにさせ、そしてその後にその培地を通常培地に交換 する。 これらの細胞が容易に感染されないとすると、反復感染法の使用を行うが、つ まり：細胞を一日当たり一回の割合で５日間５回感染させた。感染細胞のパーセ ンテージを各感染後に免疫細胞化学的方法により決定した。 ５回の感染後、感染細胞のパーセンテージはＨｉＢ５株については３３％であ り、かつＳＴ１４ａ株については１７％であった（図２ａおよび２ｂ）。 我々は、ＧＡＤを発現する細胞性クローンを取得する目的でこれらの感染細胞 株のサブクローニングを実施した。ペトリ（Ｐｅｔｒｉ）ディッシュ（直径１０ ｃｍ）に、ディッシュ当たり１０００、５００、もしくは２００の細胞の割合で の感染細胞での接種を施した。単離された細胞性クローンを培養１５日後に回収 した。我々は、ＨｉＢ５株から取得された１７のクローン、およびＳＴ１４ａ株 から取得された２０のクローンを単離した。 実施例１０． ｐＭｏＭｕＬＶ−Ｇレトロウイルスの機能性 ＧＡＤの酵素活性は、Ｂｒａｓｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ５９：４１５−４２４、１９９２）により改変された Ｈａｍｅｌらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ３９：８４２−８４９、１９８２）により評定する。この酵素活性測定 の原理は、トリチウム化前駆体（³ Ｈ−グルタミン酸）から形成されるＧＡＢＡを、ＧＡＤを含む蛋白質抽出物を３ ７℃でインキュベートすることによる検出に基づく。この反応はＧＡＤについて の補助因子（リン酸ピリドキサル）、およびＧＡＢＡトランスアミナーゼのイン ヒビターの存在下で生じるため、形成されるＧＡＢＡは保存される。その後には 、形成されたトリチウム化ＧＡＢＡをイオン交換樹脂カラムによりグルタミン酸 から分離させ、そしてその後には、形成されたＧＡＢＡの量をシンチレーション 計数器の助けを借りて評定する。このアッセイについての詳細な方法は以下のと うりである：細胞を、ＥＤＴＡ（１０ｍｇ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、５ ｍｇ／ｌ）、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．５％ ｖｏｌ／ｖｏｌ）を 含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）中で溶解させる。 酵素反応は、８０ｍｌの細胞溶菌物を用い、それらに以下のものを添加して開 始させることで実施される：（１）リン酸ピリドキサル（２００ｍＭ、ＧＡＤに つての補助因子）および臭化アミノエチルイソチオウロニウム（１０ｍＭ、ＧＡ ＢＡトランスアミナーゼのインヒビター）を含む１０ｍｌの溶液；（２）５ｍＭ の非ラベル化グルタミン酸および１０⁶ｄｐｍの精製されたトリチウム化グルタ ミン酸を含む１０ｍｌの溶液（これらの溶液はＢｉｒｄ法（１９７６）に従い、 使用直前に調製される）。 その後にこの反応混合物を３７℃で９０分間インキュベートする。この反応は 、使用直前に調製された０．５ｍｌの第二銅溶液（ＣｕＣｌ₂ ６．９２ｇ／ｌ ；Ｎａ₃ＰＯ₄ ５９．６ｇ／ｌ；ホウ酸ナトリウム ２１．６８ｇ／ｌ）の添加 により停止され、このことによりグルタミン酸が複合体を形成することが可能と なる。この懸濁物を氷上に１０分間 保持させて複合体を形成させ、そしてその後にその第二銅沈殿物を遠心分離（１ ３，０００ｒｐｍ、５分）により除去する。 この上清をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）樹脂カラム（ＡＧ−１Ｘ８アセテート 、Ｂｉｏｒａｄ社）（この樹脂はグルタミン酸を保持する）にかける。このカラ ムを２度、０．５ｍｌの水で洗浄する。産生されたＧＡＢＡを、１０ｍｌのシン チレーション液（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ 、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）中に溶解される溶出液を計数することにより決定する。 反応のバックグラウンドノイズは、その細胞溶解物を無細胞溶解用緩衝液で置 き換えることにより評定される。その細胞溶解物中の蛋白質の濃度は、Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ法（Ａｎａｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ７２ ：２４８−２５４、１９７６）に従って決定される。この酵素活性は、形成され るＧＡＢＡのｎモル／ｍｇ蛋白質／時間として表現される。 グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性の測定はＧＡＤをコードする組換えレト ロウイルスで感染させた株から取得される各クローンについて実施した。それと 平行させてＧＡＤ活性を、線条およびレトロウイルス産生性ｙ−２クローンの各 抽出物について決定した。このアッセイの結果が図３に示される。従って、感染 させたＨｉＢ５細胞から取得される１７のクローンの内、３つが高レベルのＧＡ Ｄを発現した。同様に、ＳＴ１４ａ株から取得されたクローンについては２０の 内の３つが高レベルのＧＡＤを発現した。一つのＨｉＢ５クローンおよび一つの ＳＴ１４ａクローンを移植用に選択したが、それらのグルタミン酸デカルボキシ ラーゼ酵素活性は各々以下の値にまで達していた： −ＨｉＢ５クローン：５．１７ｎモル／ｍｇ蛋白質／時間。 −ＳＴ１４ａクローン：７．２０ｎモル／ｍｇ蛋白質／時間。 −線条：７．１３ｎモル／ｍｇ蛋白質／時間。 ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットも、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ． Ｖｏｌ ７６：４３５０−４３５４、１９７３）により記載される方法に従 って実施することができる。 ３０ｍｌの細胞溶解物（細胞性活性についてのものと同一緩衝液）を、１５ｍ ｌの「レムリーブルー（Ｌａｅｍｍｌｉ ｂｌｕｅ）」（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａ ｔｕｒｅ Ｖｏｌ ２２７：６８０−６８５、１９７０）の存在下、沸騰水浴槽 上で変性させる。この溶液を、０．１％ ＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミ ドゲルにかける。このゲルを一晩３０ｍＶで泳動させる。泳動後、蛋白質をニト ロセルロース膜上に転移させる。ＧＡＤを免疫検出法により顕色させる。 免疫検出法により、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット膜上、培養細胞株 上、および移植後の組織片上でのＧＡＤの特徴決定が可能となる。これらは出発 物質としてＧＡＤ−免疫化ウサギ血清を用いて実施した。その血清を３０００倍 に希釈し、そして一晩４℃下でインキュベートした。初期抗体はパーオキシダー ゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ社）で顕色させた。移植後に取得される組織片の場合には、初期抗体は、 フルオレセインでラベル化させた第二抗体（ＦＩＴＣヤギ抗−ウサギ抗体、Ｎｏ ｒｄｉｃ社）でも顕色させた。 実施例１１． 組換えレトロウイルスによるＧＡＤ６７遺伝子のインビ ボでの転移 ＨｉＢ５およびＳＴ１４ａ細胞株から取得され、かつ酵素活性を示すクローン を、エクイテシン（ｅｑｕｉｔｅｓｉｎ）で予め麻酔してあるスプラーグ−ドー レイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）種のラットの線条内に移植した。 ３ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中に混合させた７．５×１０⁵細胞を３分間にわたり 、以下の座標値での定位術により注入した： −前方値：ブレグマに関して＋０．６ｍｍ、 −後方値：ブレグマに関して＋３ｍｍ、 −深度：脳硬膜に関して−４．５ｍｍ。 針を３分間挿入したままにさせてから引き抜く。 移植後１〜２週間目に、その動物に４℃の４％パラホルムアルデヒド溶液を注 入し、そして脳を凍結用ミクロトームを用いて解剖および切片化（厚さ４０ｍｍ ）した。免疫組織化学的調査を実施した。初期抗体（ウサギ抗−ＧＡＤポリクロ ーナル抗体）を、パーオキシダーゼ連結化第二抗体か、もしくは蛍光第二抗体か のいずれかで顕色させた。そのため我々は、非感染細胞から取得される移植片と 比較した際に、感染化させたＨｉＢ５およびＳＴ１４ａ細胞の移植片中にＧＡＤ −特異的免疫ラベルを証明することが可能となった（図４および５）。図４Ａで は非感染化ＳＴ１４ａ細胞が示され、４Ｂではトランスジーンを発現するＨｉＢ ５クローンが示され、５Ａおよび５Ｂではトランスジーンを発現するＳＴ１４ａ クローンが示される。図４および５ではそのいずれにおいても、矢印はトランス ジーンを発現する感染細胞を示す。これらの結果により、感染化クローンは移植 後に高レベルのトランスジーンの発現を保持する ことが証明される。 実施例１２． インビトロでのＧＡＢＡの放出 移植用に選択されたＨｉＢ５−ＧＡＤおよびＳＴ１４ａ−ＧＡＤクローンによ るＧＡＢＡの放出をインビトロで検討した。 このためにはクローンを６−ウエルプレート内で培養し、そしてその後にハン クス（Ｈａｎｋ’ｓ）平衡塩タイプの溶液（ＨＢＳＳ）Ｇｉｂｃｏ社）ですすぎ 、その後に同一培地中で１５分間インキュベートした。インキュベーション後に は、この培地を回収し、遠心分離にかけて細胞を除去し、そしてＨＰＬＣによる 分析を行う。蛋白質濃度を評定する目的で細胞も回収した。ＨＰＬＣは、Ｋｅｈ ｒおよびＵｎｇｅｒｓｔｅｄｔ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ ５１：１ ３０８−１３１０、１９８８）により記載される方法に従って実施し、そしてそ れらの培養培地中でのその細胞によるＧＡＢＡの実質的放出を証明することを可 能とさせた。これらの結果が図６に示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/48 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＭ 48/00 ＡＡＭ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 7/00 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＡＢ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オレルー， フイリツプ フランス・エフ−75014パリ・リユフエル マ４−６ (72)発明者 ジユリアン， ジヤン−フランソワ フランス・エフ−92160アントニイ・リユ アルテユール−ブランシエ６ (72)発明者 マレ， ジヤツク フランス・エフ−75013パリ・リユシヤル コ18 (72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス・エフ−28320エクロスヌ・リユ ドシヤルトル31 (72)発明者 ロベール， ジヨン−ジヤツク フランス・エフ−92330ソー・ブールバー ルデスグランジユ12 (72)発明者 ビニユ， エマニユエル フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ル−ガルー60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性（ＧＡＤ）を有する蛋白質をコー ドするＤＮＡ配列を含む欠陥組換えウイルス。 ２． ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求の範囲１に記 載のウイルス。 ３． ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求の範囲１に記 載のウイルス。 ４． ＤＮＡ配列がＧＡＤ６７蛋白質もしくはその誘導体の全部もしくは部分 をコードすることを特徴とする、請求の範囲１〜３の内の一つに記載のウイルス 。 ５． ＤＮＡ配列がＧＡＤ６５蛋白質もしくはその誘導体の全部もしくは部分 をコードすることを特徴とする、請求の範囲１〜３の内の一つに記載のウイルス 。 ６． ＤＮＡ配列が神経細胞内でのそれ自体の発現を可能にするシグナルの制 御下に置かれることを特徴とする、請求の範囲１〜５の内の一つに記載のウイル ス。 ７． 発現シグナルがウイルスプロモーターから選択されることを特徴とする 、請求の範囲６に記載のウイルス。 ８． 発現シグナルが、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶ−ＬＴＲプロ モーターから選択されることを特徴とする、請求の範囲７に記載のウイルス。 ９． ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの制御下にあるグルタミン酸デカルボキシ ラーゼ活性（ＧＡＤ）を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を含む欠陥組換 えウイルス。 １０． ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの制御下にあるグルタミン酸デカルボキシ ラーゼ活性（ＧＡＤ）を有する蛋白質をコードするｇＤＮＡ配列を含む欠陥組換 えウイルス。 １１． 神経細胞内での優先的発現を可能にさせるプロモーターの制御下にある グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性（ＧＡＤ）を有する蛋白質をコードするＤ ＮＡ配列を含む欠陥組換えウイルス。 １２． 標的細胞内でのそれ自体の複製に必須なそれ自体のゲノムの領域を喪失 していることを特徴とする、請求の範囲１〜１１の内の一つに記載のウイルス。 １３． アデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲１〜１２の内の一 つに記載のウイルス。 １４． タイプＡｄ２もしくはＡｄ５のヒトアデノウイルス、あるいはＣＡＶ− ２タイプのイヌアデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲１３に記載 のウイルス。 １５． アデノ関連性ウイルスであることを特徴とする、請求の範囲１〜１２の 内の一つに記載のウイルス。 １６． レトロウイルスであることを特徴とする、請求の範囲１〜１２の内の一 つに記載のウイルス。 １７． ＭｏＭｕＬＶファミリーのレトロウイルスであることを特徴とする、請 求の範囲１６に記載のウイルス。 １８． ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であることを特徴とする、請求の範囲１〜 １２の内の一つに記載のウイルス。 １９． 神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物 の調製のための、請求の範囲１〜１８の内の一つに記載される ウイルスの使用。 ２０． パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、アルツハイマー（Ａｌｚ ｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、癲癇、 もしくはＡＬＳの治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物の調製の ための、請求の範囲１９に記載の使用。 ２１． 請求の範囲１〜１８の内の一つに記載される一つもしくは複数の欠陥組 換えウイルスを含む薬剤学的組成物。 ２２． 注入用形態であることを特徴とする、請求の範囲２１に記載の薬剤学的 組成物。 ２３． １０⁴ｐｆｕ／ｍｌと１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌの間、および好ましくは１０⁶ 〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請 求の範囲２１もしくは２２に記載の薬剤学的組成物。 ２４． 請求の範囲１〜１８の内の一つに記載される一つもしくは複数の組換え ウイルスで感染させた哺乳類細胞。 ２５． ヒト細胞であることを特徴とする、請求の範囲２４に記載の細胞。 ２６． 繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、神経膠細胞、もしくは角膜 実質細胞タイプのヒト細胞であることを特徴とする、請求の範囲２７に記載の細 胞。 ２７． 請求の範囲２４〜２６に記載される感染細胞、および細胞外マトリック スを含む移植片。 ２８． 細胞外マトリックスが好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミ ノグリカン、フィブロネクチン、およびレクチンから選択されるゲル化用化合物 を含むことを特徴とする、請求の範囲２７に記載の移 植片。 ２９． 細胞外マトリックスが更に、感染細胞の固着を可能にする支持体を含む ことを特徴とする、請求の範囲２７もしくは２８に記載の移植片。 ３０． 支持体が好ましくはポリテトラフルオロエチレン線維でできていること を特徴とする、請求の範囲２９に記載の移植片。