DE69918072T2

DE69918072T2 - P53-regulierte gene

Info

Publication number: DE69918072T2
Application number: DE69918072T
Authority: DE
Inventors: J. Arnold LEVINE; E. Maureen MURPHY; H. David MACK; C. Kurt GISH; Yat Edward TOM
Original assignee: Affymetrix Inc; Princeton University
Current assignee: Affymetrix Inc; Princeton University
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: US6171798B1; EP1064404A1; WO1999050456A1; JP2002509732A; CA2324444A1; DE69918072D1; AU3208599A; HK1038595A1; EP1064404B1; US20010039013A1; US6020135A; ATE269415T1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Genregulation, insbesondere das Gebiet der Regulation von Genen, die an der Tumorentstehung beteiligt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
P53 ist der Name eines humanen Tumorsuppressorgens und von dessen Proteinprodukt. Bei ungefähr 55 Prozent aller beim Menschen auftretenden Krebserkrankungen ausgehend von vielen Zell- oder Gewebetypen existieren Mutationen in beiden Allelen des p53-Gens. Menschen, die solche Mutationen geerbt haben, werden im Laufe ihres Lebens Krebs entwickeln.
Das p53-Protein ist ein Transkriptionsfaktor, welcher die Expression einer großen Anzahl von Genen reguliert. Hohe Konzentrationen eines aktiven p53-Wildtyp-Proteins in einer Zelle bewirken, dass diese Gene mit einer hohen Rate transkribiert werden. Eine Ermittlung der Funktionen von einigen von diesen "p53-regulierten oder -induzierbaren Genen" informiert dieses Fachgebiet darüber, wie das p53-Protein Menschen vor Krebserkrankungen schützt.
Es gibt in diesem Fachgebiet einen Bedarf, p53-induzierbare Gene und deren Funktionen zu entdecken, so dass wir möglicherweise eine Chance haben, die Effekte von p53-Mutationen bei Krebs zu umgehen, indem die p53-induzierbaren Gene aktiviert und die p53-reprimierbaren Gene reprimiert werden, so dass das Wachstum des Krebses angehalten wird. Dementsprechend liefert die Ermittlung von solchen p53-regulierten Genen nützliche und wertvolle Informationen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Diagnose von Krebs oder zur Bestimmung des p53-Status in einer Probe, die unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, bereitgestellt. Das Niveau der Expression eines RNA-Transkripts oder von dessen Translationsprodukt in einer ersten Probe eines ersten Gewebes wird mit dem Niveau der Expression des Transkripts oder Translationsprodukts in einer zweiten Probe eines zweiten Gewebes verglichen. Das erste Gewebe steht unter Verdacht, neoplastisch zu sein, und das zweite Gewebe ist ein normales humanes Gewebe. Das erste und zweite Gewebe sind von dem gleichen Gewebetyp. Das Transkript ist ein Transkript von einem Gen, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100, wie in 1 gezeigt, ausgewählt wird. Die erste Probe wird als neoplastisch oder als ein mutiertes p53 enthaltend eingestuft, wenn herausgefunden wird, dass die Expression in der ersten Probe die gleiche ist wie oder geringer ist als in der zweiten Probe.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Diagnose von Krebs oder zur Bestimmung des p53-Status in einer Probe, die unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, bereitgestellt. Das Niveau der Expression eines RNA-Transkripts oder von dessen Translationsprodukt in einer ersten Probe eines ersten Gewebes wird mit dem Niveau der Expression des Transkripts oder Translationsprodukts in einer zweiten Probe eines zweiten Gewebes verglichen. Das erste Gewebe steht unter Verdacht, neoplastisch zu sein, und das zweite Gewebe ist ein normales humanes Gewebe. Das erste und zweite Gewebe sind von dem gleichen Gewebetyp. Das Transkript ist ein Transkript von einem Gen, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100, wie in 2 gezeigt, ausgewählt wird. Die erste Probe wird als neoplastisch oder als ein mutiertes p53 enthaltend eingestuft, wenn herausgefunden wird, dass die Expression in der ersten Probe die gleiche ist wie oder höher ist als in der zweiten Probe.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von Krebs oder zur Bestimmung des p53-Status in einer Probe, die unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein. Das Niveau der Expression von wenigstens einem RNA-Transkript oder von dessen Translationsprodukt in einer ersten Probe eines ersten Gewebes wird mit dem Niveau der Expression der Transkripte oder Translationsprodukte in einer zweiten Probe eines zweiten Gewebes verglichen. Das erste Gewebe steht unter Verdacht, neoplastisch zu sein, und das zweite Gewebe ist ein normales humanes Gewebe. Das erste und zweite Gewebe sind von dem gleichen Gewebetyp. Die erste Gruppe von RNA-Transkripten besteht aus Transkripten von Genen, die aus der Gruppe von Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100, wie in 1 gezeigt, ausgewählt werden. Die zweite Gruppe von RNA-Transkripten besteht aus Transkripten von Genen, die aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 7-24 und 25-100, wie in 2 gezeigt, ausgewählt werden. Die erste Probe wird als neoplastisch oder als ein mutiertes p53 enthaltend eingestuft, wenn herausgefunden wird, dass die Expression von wenigstens einem aus der ersten Gruppe von RNA-Transkripten oder Translationsprodukten in der ersten Probe die gleiche ist wie oder niedriger ist als in der zweiten Probe, und wenn herausgefunden wird, dass die Expression von wenigstens einem aus der zweiten Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten in der ersten Probe die gleiche ist wie oder höher ist als in der zweiten Probe.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bewertung der Karzinogenität eines Wirkstoffs bereitgestellt. Ein Testwirkstoff wird mit einer humanen Zelle kontaktiert. Das Niveau der Expression von wenigstens einem Transkript oder von dessen Translationsprodukt wird in der humanen Zelle nach Umset zung oder Kontaktierung mit dem Mittel bestimmt. Das Transkript stammt von einem Gen, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird. Ein Wirkstoff, welcher das Niveau der Expression eines in 1 angegebenen Gens erniedrigt oder ein Wirkstoff, welcher das Niveau der Expression eines in 2 angegebenen Gens erhöht, wird als ein potentielles Karzinogen identifiziert.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten gerichtet. Ein Polynukleotid wird an Krebszellen eines Patienten verabreicht. Das Polynukleotid umfasst eine kodierende Sequenz eines Gens, welches aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 ausgewählt wird. Die Krebszellen des Patienten beherbergen ein mutiertes p53-Gen. Als ein Ergebnis der Verabreichung wird das Gen in Zellen des Krebses exprimiert.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten gerichtet. Es wird ein Antisense-Konstrukt, welches wenigstens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens, welches aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird, umfasst, an Krebszellen eines Patienten verabreicht. Die kodierende Sequenz befindet sich in 3'→5'-Orientierung in Bezug auf einen Promotor, welcher deren Expression kontrolliert. Die Krebszellen beherbergen ein mutiertes p53-Gen. Als ein Ergebnis der Verabreichung wird eine Antisense-RNA in Zellen des Krebses exprimiert.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Screening auf Wirkstoffe, welche für die Behandlung von Krebs verwendet werden können, bereitgestellt. Eine Zelle, die eine p53-Mutation enthält, wird mit einer Testsubstanz umgesetzt oder kontaktiert. Die Expression eines Transkripts oder von dessen Translationsprodukt wird überwacht. Das Transkript stammt von einem Gen, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird. Eine Testsubstanz wird als ein potentieller Wirkstoff bzw. ein potentielles Arzneimittel für die Behandlung von Krebs identifiziert, wenn sie die Expression eines Gens, wie in 1 gezeigt, erhöht oder die Expression eines Gens, wie in 2 gezeigt, erniedrigt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Screening auf Wirkstoffe, welche für die Behandlung von Krebs verwendet werden können. Eine Tumorzelle, die MDM2 überexprimiert, wird mit einer Testsubstanz umgesetzt bzw. kontaktiert. Es wird die Expression eines Transkripts oder von dessen Translationsprodukt überwacht. Das Transkript stammt von einem Gen, welches aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird. Eine Testsubstanz wird als ein potentieller Wirkstoff bzw. ein potentielles Arzneimittel für die Behandlung von Krebs identifiziert, wenn diese die Expression eines Gens, wie in 1 gezeigt, erhöht oder die Expression eines Gens, wie in 2 gezeigt, erniedrigt.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung stellt einen Satz von wenigstens zwei Nukleotidsonden, welche an einen Satz von p53-regulierten Genen hybridisieren, bereit. Die Gene werden aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt.
Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung stellen diesem Fachgebiet Verfahren zur Diagnose, Behandlung und Auffindung von Wirkstoffen bzw. Arzneimitteln für Krebserkrankungen bereit. Zusätzlich stellt sie einen bequemen und schnellen Karzinogenitätstest bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Tabelle, die durch p53 induzierte Gene zeigt. Die Spaltenüberschriften sind, wie folgt: "Eb1" bezeichnet die Zelllinie EB1-α, d.h. eine Zelllinie, welche ein durch Zink induzierbares p53-Gen enthält. "EB" bezeichnet die Zelllinie EB1, eine Zelllinie, welche ein mutiertes p53-Gen aufweist, das kein detektierbares p53-Protein produziert oder exprimiert. "PM" bezeichnet die Anzahl von perfekt basenpaarbildenden ("perfect match") Oligonukleotiden für ein Gen, welches hybridisierte, und "MM" bezeichnet die Anzahl von fehlgepaarten ("mismatch") Oligonukleotiden für ein Gen, welches hybridisierte. "Ratio" ist das Verhältnis der Intensität von EB1-α zu EB1. "Aufnahmenummer" bezieht sich auf eine GenBank-Aufnahmenummer ("accession number"). "EST?", wenn abgehakt, gibt an, dass die Funktion der Nukleinsäuresequenz nicht bestimmt worden ist. "SAGE?", wenn abgehakt, gibt an, dass eine Analyse unter Verwendung der SAGE-Technik ebenfalls dieses Gen als p53-reguliert nachgewiesen hat. Siehe http://welchlink.welch.jhu.edu/~molgen-g/P53-SAGE.HTM.
2 ist eine Tabelle, welche durch p53 reprimierte Gene zeigt. Die Spaltenüberschriften sind die gleichen wie in Figur 1.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Es ist eine Entdeckung der hiesigen Erfinder, dass p53 ein ganzes Spektrum von Genen reguliert, wobei die Expression von deren mRNA- und Proteinprodukten erhöht und erniedrigt wird. Diese Gene sind zuvor noch nicht als p53-reguliert identifiziert worden.
In einigen Fällen sind die biologischen Funktionen der Gene unbekannt. Jedoch zeigt die jetzt ermittelte Regulation durch p53 an, dass die Gene an dem Fortschreiten und Anhalten des Zellzyklus beteiligt sind.
Eine Auswahl von 6800 humanen Genen wurde auf die Auswirkungen einer p53-Expression auf deren Expression hin getestet. Ein solches massives Screening erlaubt die Identifizierung von vielen Genen, von denen zuvor noch nicht bekannt war, dass sie p53-reguliert sind.
Es ist gezeigt worden, dass der genetische Status von p53-Allelen (mutiert oder Wildtyp) mit einem neoplastischen Zustand gut korreliert. Dementsprechend kann basierend auf dem Status von p53-Allelen von Zellen eine Diagnose bereitgestellt werden. Das Niveau der Expression eines RNA-Transkripts oder von dessen Translationsprodukt kann unter Verwendung von jeglichen Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden. Es können spezifische Oligonukleotidsonden für- die relevanten Gene in Hybridisierungsexperimenten verwendet werden, wie in diesem Fachgebiet bekannt ist. Es kann ein jegliches Hybridisierungsformat zur Bestimmung von spezifischen RNA-Konzentrationen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Northern-Blots, Slot-Blots, Dot-Blots und Hybridisierung an Oligonukleotid-Anordnungen (Arrays). Die Spezifität der Hybridisierung kann durch Variieren der Ausmaße der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ermittelt werden. Zusätzlich kann ein Vergleich von fehlgepaarten mit perfekt gepaarten Oligonukleotidsonden verwendet werden, um die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Um die Expressionsniveaus eines speziellen Translationsprodukts (Protein) zu bestimmen, können Antikörper, welche für das Protein spezifisch sind, leicht verwendet werden. Wieder kann ein jegliches Format, welches in diesem Fachgebiet bekannt ist, für die Messung der Konzentrationen von speziellen Proteinen verwen det werden, einschließlich Sandwich-Assays, ELISAs, Immunpräzipitationen und Western-Blots. Es kann in solchen Assays ein jeglicher von monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, Einzelketten-Antikörpern und Antikörperfragmenten verwendet werden. Die Spezifität von immunologischen Reaktionen kann unter Verwendung von Kompetitor-Antikörpern oder -Proteinen wie auch durch Variieren der Immunreaktionsbedingungen bestimmt werden. Das Überwachen der Konzentrationen von Expressionsprodukten umfasst das Bestimmen von Mengen eines speziellen Expressionsprodukts. Bestimmte Mengen müssen nicht absolute Mengen sein, sondern können relative Mengen sein, welche unter unterschiedlichen Bedingungen beispielsweise in Gegenwart und Abwesenheit einer Testverbindung bestimmt werden.
Erfindungsgemäße Sonden können markiert oder unmarkiert, an eine andere Substanz gebunden oder in Lösung, synthetisch hergestellt oder aus der Natur isoliert sein. Sonden können Nukleinsäuren, entweder RNA oder DNA, die in der Natur vorkommende Nukleotidbasen oder modifizierte Basen enthalten, sein. Die Sonden können normale Nukleotidbindungen oder Peptidbindungen enthalten. Oligonukleotidsonden können eine jegliche Länge, welche eine aussagekräftige Hybridisierungsspezifität ermöglicht, aufweisen. Dementsprechend können Sonden so klein wie 10 Nukleotide sein, und sie sind vorzugsweise zwischen 12 und 30 Nukleotiden lang. Oligonukleotidsonden können jedoch signifikant länger sein, im Bereich von 30 bis 100 Nukleotiden, 100 bis 500 Nukleotiden oder 500 bis 2000 Nukleotiden. Sonden können an Polymere, welche entweder löslich oder nicht-löslich sind, angeheftet werden. Sonden können an feste Substrate, wie Filter, Folien, Chips, Objektträger und Körnchen, angeheftet oder gebunden werden.
Anordnungen (Arrays) mit hoher Dichte sind für das Überwachen der Expressionskontrolle auf der transkriptionellen, RNA-Prozessierungs- und -Abbau-Ebene besonders nützlich. Die Her stellung und Anwendung von Anordnungen mit hoher Dichte bei der Überwachung der Genexpression sind zuvor offenbart worden, beispielsweise in WO 97/10365, WO 92/10588, der U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer ("Ser.No."; "Serial No.") 08/772,376, eingereicht am 23. Dezember, 1996; mit der Seriennummer 08/529,115, eingereicht am 15. September 1995; mit der Seriennummer 08/168,904, eingereicht am 15. Dezember 1993; mit der Seriennummer 07/624,114, eingereicht am 0.6. Dezember 1990, mit der Seriennummer 07/362,901, eingereicht am 07. Juni 1990, welche allesamt in diese Unterlagen für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen werden. In einigen Ausführungsformen unter Verwendung von Anordnungen mit hoher Dichte werden Oligonukleotid-Anordnungen mit hoher Dichte unter Verwendung von Methoden, wie der "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis" (VLSIPS), welche in dem U.S.-Patent mit der Nummer 5,445,934, welches in diese Unterlagen für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen wird, offenbart wird, synthetisiert. Jedes Oligonukleotid nimmt eine bekannte Lage auf einem Substrat ein. Eine Nukleinsäure-Zielprobe wird mit einer Anordnung von Oligonukleotiden mit hoher Dichte hybridisiert und dann wird die Menge von Zielnukleinsäuren, welche mit jeder Sonde in der Anordnung hybridisiert haben, quantifiziert. Eine bevorzugte Quantifizierungsmethode besteht darin, ein konfokales Mikroskop und fluoreszierende Markierungen zu verwenden. Das GeneChip^®-System (Affymetrix, Santa Clara, CA) ist für die Quantifizierung der Hybridisierung besonders geeignet; für die Fachleute auf diesem Gebiet wird jedoch offensichtlich sein, dass jegliche ähnliche Systeme oder andere effektiv äquivalente Detektionsmethoden ebenfalls verwendet werden können.
Gewebeproben, welche gemäß der Erfindung getestet werden können, sind jegliche, die von einem Patienten, unabhängig davon, ob ein Mensch, anderes Haustier oder im Rahmen der Veterinärmedizin behandelbares Tier, gewonnen werden. Wirbeltiere sind bevorzugt, wie Mäuse, Menschen, Pferde, Kühe, Hunde und Katzen, obwohl ein jeglicher Organismus, für welche der p53-Status bestimmt werden kann, verwendet werden kann. Die Form der Proben kann eine jegliche sein, die routinemäßig in diesem Fachgebiet zur Bestimmung der Mengen von speziellen Proteinen oder mRNA-Molekülen verwendet wird. Die Proben können fixiert oder nicht-fixiert, homogenisiert, lysiert, kryokonserviert u.s.w. werden. Es ist am meisten wünschenswert, dass übereinstimmende Gewebeproben als Kontrollen verwendet werden. Dementsprechend wird beispielsweise ein mutmaßliches kolorektales Karzinomgewebe mit einem normalen kolorektalen Epithelgewebe verglichen werden.
Die nachfolgenden 1 und 2 zeigen Gene, die durch p53 induziert bzw. durch p53 reprimiert werden. Gene, die mit einem Häkchen in der mit "SAGE" überschriebenen Spalte identifiziert werden, sind jene, von denen angenommen wird, dass sie zuvor als p53-reguliert identifiziert worden sind. Von Genen, die nicht abgehakt sind, wird angenommen, dass sie zuvor als p53-regulierte Gene nicht bekannt waren. Von den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 wird angenommen, dass sie solche zuvor unbekannten p53-regulierten Gene sind.
Obwohl das Bestimmen der Expression eines jeglichen einzelnen der als p53-reguliert identifizierten Gene für Diagnose und Assays nützlich sein kann, kann es wünschenswert sein, größere Sätze zu verwenden, um die beobachteten globalen zellulären Auswirkungen zu bestätigen. In dieser Hinsicht kann es wünschenswert sein, auf wenigstens 2, 5, 10, 20, 30, 32, 50, 70 oder 77 Gene aus einer oder beiden Regulations-Kategorien zu testen. Es kann nützlich sein, sowohl induzierte als auch reprimierte Gene zu verwenden, um so eine globale Momentaufnahme der Genregulation zu erhalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Oligonukleotid-Sonden für RNA-Transkripte an feste Träger angeheftet. Solche Träger sind vorzugsweise Anordnungen (Arrays), wo Nukleinsäuremoleküle an das Substrat an vorher festgelegten Positionen angeheftet sind. In einer besonderen Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle an dem Substrat synthetisiert. In einer anderen Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle auf den festen Träger nach Synthese oder Isolierung aufgebracht.
Testproben für mRNA werden typischerweise aus den Gewebeproben gewonnen und können direkt verwendet oder, wie folgt, weiterverarbeitet werden. Die Proben-mRNA wird unter Verwendung von reverser Transkriptase umgekehrt transkribiert, um cDNA zu bilden. An die cDNA wird an deren 5'- oder 3'- oder beide Enden ein Promotor ligiert. (5' und 3' beziehen sich auf die Orientierung auf dem kodierenden DNA-Strang). Wenn zwei Promotoren an einer cDNA verwendet werden, können sie gleich oder unterschiedlich sein. Die cDNA wird dann als eine Matrize für eine in vitro-Transkription, um Test-mRNA zu bilden, verwendet. Die Test-RNA kann dann verwendet werden, um an Nukleinsäuremoleküle oder – sonden, vorzugsweise auf einem festen Träger, mehr bevorzugt auf einer Oligonukleotid-Anordnung (Array), zu hybridisieren. Diese Weiterverarbeitungsschritte sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt.
Die hier entdeckten regulierten Gene können die Grundlage für einen Karzinogenitätstest bilden. Testwirkstoffe werden ausgewertet, um zu sehen, ob ihre Wirkungen auf humane Zellen die Auswirkungen eines Verlusts von p53 nachahmen. Dementsprechend werden die Wirkstoffe im Wesentlichen hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewertet, eine p53-Mutation oder eine Mutation in einem anderen Gen, welches sich in dem gleichen Regulationsweg befindet, oder einen nicht-genetischen Effekt, welcher einen p53-Verlust nachahmt, zu induzieren. Testwirkstoffe, von denen fest gestellt wird, dass sie wenigstens einen Teil der gleichen Konstellation von Wirkungen wie ein p53-Verlust auf die Regulation der hier als p53-reguliert identifizierten Gene haben, werden als potentielle Karzinogene identifiziert. Es kann jedes einzelne identifizierte Gen verwendet werden, wie dies ebenso wenigstens 2, 5, 10, 20, 30, 32, 40, 50, 70, 90, 100, 125 oder 145 der hier identifizierten Gene werden können.
Die hier als p53-induziert identifizierten Gene können therapeutisch an Krebszellen abgegeben werden. Antisense-Konstrukte der hier als p53-reprimiert identifizierten Gene können therapeutisch an Krebszellen abgegeben werden. Das Ziel einer solchen Therapie besteht darin, die Vermehrungsrate der Krebszellen zu verlangsamen. Eine Expression der Sense-Moleküle und von deren Translationsprodukten oder die Expression der Antisense-mRNA-Moleküle hat die Wirkung, die Vermehrungsrate von Krebszellen zu hemmen oder Apoptose (eine radikale Verringerung der Vermehrungsrate einer Zelle) zu induzieren. Sense-Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise in Konstrukten abgegeben, in welchen ein Promotor funktionsfähig mit der kodierenden Sequenz an dem 5'-Ende verknüpft ist und die Transkription der kodierenden Sequenz initiiert. Antisense-Konstrukte enthalten einen Promotor, welcher funktionsfähig mit der kodierenden Sequenz an dem 3'-Ende derart verknüpft ist, dass bei einer Initiation der Transkription an dem Promotor ein RNA-Molekül transkribiert wird, das der zu dem nativen mRNA-Molekül des Gens komplementäre Strang ist.
Eine Abgabe von Nukleinsäuremolekülen kann durch viele Mittel oder Maßnahmen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, bewerkstelligt werden. Genabgabevehikel (GDVs) stehen für eine Abgabe von Polynukleotiden an Zellen, Gewebe oder an ein Säugetier für eine Expression zur Verfügung. Beispielsweise kann eine Polynukleotidsequenz der Erfindung entweder lokal oder systemisch in einem GDV verabreicht werden. Diese Konstrukte können virale oder nicht-virale Vektor-Strategien in in vivo- oder ex vivo-Modalitäten einsetzen. Die Expression einer solchen kodierenden Sequenz kann durch Verwendung von endogenen Säugetier- oder heterologen Promotoren induziert werden. Die Expression der kodierenden Sequenz in vivo kann entweder konstitutiv oder reguliert sein. Die Erfindung umfasst Genabgabevehikel, welche in der Lage sind, die in Betracht gezogenen Polynukleotide zu exprimieren. Das Genabgabevehikel ist vorzugsweise ein viraler Vektor und mehr bevorzugt ein retroviraler Vektor, adenoviraler Vektor, ein Vektor aus einem adeno-assoziierten Virus (AAV), einem Herpesvirus oder einem alpha-Virus. Der virale Vektor kann auch ein viraler Astrovirus-, Coronavirus-, Orthomyxovirus-, Papovavirus-, Paramyxovirus-, Parvovirus-, Picornavirus-, Poxvirus-, Togavirus-Vektor sein. Siehe allgemein Jolly, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994); Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994), Connelly, Human Gene Therapy 6:185-193 (1995) und Kaplitt, Nature Genetics 6:148-153 (1994).
Die Abgabe von Gentherapiekonstrukten dieser Erfindung in Zellen ist nicht auf die oben erwähnten viralen Vektoren beschränkt. Es können andere Abgabemethoden und -mittel eingesetzt werden, wie beispielsweise Nukleinsäureexpressionsvektoren, polykationische kondensierte DNA, welche allein mit abgetötetem Adenovirus verknüpft oder nicht-verknüpft ist, siehe beispielsweise Curiel, Hum Gene Ther 3:147-154 (1992), mit Liganden verknüpfte DNA, siehe beispielsweise Wu, J. Biol. Chem. 264:16985-16987 (1989), eukaryotische Zellabgabevehikel-Zellen, siehe beispielsweise U.S.-Seriennummer 08/240,030, eingereicht am 09. Mai 1994, und U.S.-Seriennummer 08/404,796, Abscheidung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien, eine manuell betätigte Gentransferpartikel-Pistole, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,149,655 beschrieben, ionisierende Strahlung, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,206,152 und in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/11033 beschrieben, Nukleinsäureladungs-Neutralisierung oder Fusion mit Zellmembra nen. Zusätzliche Ansätze werden in Philip, Mol. Cell. Biol. 14:2411-2418 (1994), und in Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-585 (1994), beschrieben. Es kann ein Partikelvermittelter Gentransfer eingesetzt werden, siehe beispielsweise die provisorische U.S.-Anmeldung ("provisional application") Nr. 60/023,867. Kurz zusammengefasst, kann die Sequenz in herkömmliche Vektoren, die herkömmliche Kontrollsequenzen für eine Expression auf hohem Niveau enthalten, inseriert und dann mit synthetischen Gentransfermolekülen, wie polymeren DNA-bindenden Kationen, wie Polylysin, Protamin und Albumin, verknüpft mit Zellansteuerungs-Liganden, wie Asialoorosomucoid, wie in Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987), Insulin, wie in Hucked, Biochem. Pharmacol. 40:253-263 (1990), Galactose, wie in Plank, Bioconjugate Chem. 3:533-539 (1992), Lactose oder Transferin, inkubiert werden. Es kann auch nackte DNA eingesetzt werden. Beispielhafte Verfahren zur Einführung von nackter DNA werden in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 90/11092 und dem U.S.-Patent mit der Nr. 5,580,859 beschrieben. Die Aufnahmeeffizienz kann bei Verwendung von biologisch abbaubaren Latexkörnchen verbessert werden. Mit DNA beschichtete Latexkörnchen werden nach einer Endozytose-Initiation durch die Körnchen effizient in Zellen transportiert. Das Verfahren kann durch Behandlung der Körnchen, um die Hydrophobizität zu erhöhen, weiter verbessert werden und dadurch das Aufbrechen des Endosoms und die Freisetzung der DNA in das Zytoplasma erleichtern. Liposome, die als Genabgabevehikel wirken können, werden in dem U.S.-Patent mit der Nr. 5,422,120, den PCT-Patentveröffentlichungen mit den Nr. WO 95/13796, WO 94/23697 und WO 91/144445 und EP Nr. 524,968 beschrieben.
Durch Verwendung der hier offenbarten p53-regulierten Gene können Arzneimittel oder Wirkstoffe, welche bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden können, gescreent und identifiziert werden. Zellen von zwei Arten können mit Testsubstanzen kontaktiert werden. Die Zellen dürfen kein p53-Wildtyp-Allel tragen oder die Zellen können das MDM2-Genprodukt überexprimieren. MDM2 sequestriert Wildtyp-p53. Dementsprechend ahmen MDM2-überexprimierende Zellen Zellen nach, die eine genetische p53-Defizienz aufweisen. Eine Expression von einem oder mehreren der p53-regulierten Gene der Erfindung wird in Gegenwart der Testsubstanz überwacht. Eine Testsubstanz, die einen oder mehrere der regulatorischen Effekte von p53 auf die p53-regulierten Gene nachahmt, ist ein potentielles therapeutisches Mittel für die Behandlung von Krebs. Solche Mittel können nachfolgend in einer beliebigen Anzahl von anderen Assays getestet werden, um ihre letztendliche Nützlichkeit als Arzneimittel zu bestimmen.
Es werden Sätze von mindestens zwei Oligonukleotidsonden bereitgestellt. Die Sonden sind vorzugsweise mit den Genen ausschließlich perfekt basenpaarbildende ("matched") Sonden. Es können jedoch Fehlpaarungs-Sonden, welche weniger als 5% fehlgepaarte Nukleotide enthalten, verwendet werden. Die Sonden hybridisieren an die hier in den 1 und 2 offenbarten p53-regulierten Gene. Besonders nützliche Gene sind jene mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und jene mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2. Es ist bevorzugt, dass alle der Oligonukleotidsonden an p53-regulierte Genen hybridisieren, obwohl es zulässig sein kann, dass Sonden für andere vorhandene Gene, die nicht p53-reguliert sind, vorhanden sind. Die Sonden für andere Gene machen vorzugsweise weniger als 50% der Sonden aus und machen mehr bevorzugt weniger als 25%, 15%, 10%, 5%, 2% oder 1% aus. Die Sätze von p53-regulierten Genen können wenigstens fünf, zehn, fünfzehn, zwanzig, fünfundzwanzig, dreißig, fünfzig, fünfundsiebzig, 100 oder 140 Oligonukleotidsonden (für) p53-regulierte Gene, wie hier offenbart, umfassen. Die Sonden können an ein Polymer angeheftet, löslich oder unlöslich, in der Natur vorkommend oder synthetisch sein. Die Sonden können an einen festen Träger angeheftet sein, sich in einer Gelmatrix oder in Lösung befinden. Die Sonden können individuell verpackt und innerhalb eines einzelnen Behälters enthalten sein oder können in Form von einer oder mehreren Mischungen gemischt sein. Die Sonden sind vorzugsweise auf einem festen Träger in einer Anordnung (Array) aufgebracht.
Die obige Offenbarung beschreibt die Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele, die hier allein für Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden und den Umfang der Erfindung nicht beschränken sollen, erreicht werden. Die folgenden Verfahren wurden in den nachfolgend aufgeführten Beispielen verwendet.
BEISPIEL
Eb-1-Zellen wurden von einem humanen Kolonkarzinom abgeleitet und diese Zellen weisen ein mutiertes p53-Gen, welches kein detektierbares p53-Protein produziert oder exprimiert, auf. Ein p53-Wildtyp-Gen wurde in diese Zellen unter der Regulation eines Metallothionein (MT)-Promotors inseriert. In Gegenwart von Zink exprimiert dieser Promotor das p53-Gen, aber in Abwesenheit (oder bei geringen Konzentrationen) von Zink wird wenig oder gar kein e) p53-mRNA oder -Protein produziert. Dementsprechend sind p53-mRNA und -Protein durch Zink induzierbar und die p53-regulierten Gene werden in ähnlicher Weise durch die Zugabe von Zink induziert. Die Eb-1-Zellen (ursprüngliche Zelllinie) ohne ein induzierbares p53-Wildtyp-Gen werden als Eb-1 bezeichnet und Eb-1-Zellen mit dem induzierbaren MT-p53-Gen werden als Eb-1 (a) bezeichnet.
Eb-1-Zellen und Eb-1 (α)-Zellen wurden in Kultur vermehrt und entweder unbehandelt gelassen oder Zink ausgesetzt. Vier Stunden und zehn Stunden nach der Zugabe von Zink wurden diese Zellen für eine Analyse geerntet.
Die mRNA wurde aus diesen Zellen extrahiert und gereinigt. Es wurde ein oligo-dT-Primer verwendet, um eine reverse Transkriptase-Kopie der mRNA herzustellen, und dann wurde ein Oligonukleotidlinker an das Ende der cDNA ligiert, wobei der Linker eine T-7-Promotor-Sequenz darin inkorporiert aufweist. Alle cDNAs wurden in Vektoren kloniert, die dann eingesetzt wurden, um mRNA-Kopien in vitro unter Verwendung der T-7-RNA-Polymerase und von fluoreszierenden biotinylierten Nukleotiden herzustellen. Die RNA-Produkte wurden bis zu einer durchschnittlichen Größe von 50 Nukleotiden Länge hydrolysiert.
Die hydrolysierte RNA wurde an einen Chip hybridisiert, welcher Desoxyoligonukleotidsequenzen (mit einer Länge von 25) enthält, die sich aus einer Datenbank von 6800 bekannten Genen oder EST-Sequenzen ableiten. Es gibt eine 20-fache Redundanz für jedes) Gen oder EST-Sequenz und für jede perfekte Sequenz-Paarung eine fehlgepaarte Sequenz (eine unterschiedliche Base in der Mitte der Sequenz von 25 Nukleotiden).
Nach einer kurzen Hybridisierung, welche die Rate (Menge) von fluoreszierender Sonde, welche an jeden Satz von 20 Oligonukleotidsequenzen hybridisierte, wurden die Chips gewaschen und durch ein digitales konfokales Mikroskop abgelesen, um die Intensität der Fluoreszenz-Ablesung zu quantifizieren. Die Genexpression oder mRNA-Konzentration wird durch Veränderungen der Fluoreszenz-Ablesung für Sondenpaare gemessen. Die Spezifität der Messungen wird durch das Verhältnis der Hybridisierung an eine Sonde mit perfekter Sequenzpaarung verglichen mit der Hybridisierung an eine Sonde mit Fehlpaarung angegeben.
Für dieses Experiment wurde eine Kontrolle ausgeführt; Eb-1-Zellen, welche mit Zink behandelt wurden oder unbehandelt waren. Hier war keine p53-cDNA vorhanden, so dass die einzige Variable die Exposition der Zellen gegenüber Zink war. Von allen Genen oder Sequenzen, die in diesen Zellen getestet wurden (6800), veränderten nur sechs ihre Genexpressionsmuster in Reaktion auf zugesetztes Zink und fünf (1-5) von diesen sechs Genen stehen unter der Kontrolle von durch Zink und Cadmium induzierbaren Promotoren. Dieses Experiment dient als eine hervorragende Kontrolle für die p53-Regulation von Genen.
Für das Experiment wurden Eb-1 (α)-Zellen mit Zink behandelt oder unbehandelt gelassen und nach vier oder zehn Stunden wurden die Zellen geerntet. RNA wurde präpariert und weiterverarbeitet, wie oben beschrieben. Die Hybridisierung an die 6800 unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen auf dem Chip (jede cDNA hatte eine zwanzigfache Sequenzredundanz, welche verschiedene Sequenzen in der cDNA abdeckte) wurde ausgeführt und die Analyse der Daten erfolgte durch einen Algorithmus. Die folgenden Kriterien wurden eingesetzt, um ein Gen als p53-induzierbar oder durch p53 reprimiert zu akzeptieren: (1) die relative Intensität des Niveaus der mRNA-Hybridisierung eines induzierten Gens oder eine Abnahme bei einem reprimierten Gen lag über 160 relativen Einheiten; es ist gezeigt worden, dass dies ein reproduzierbares Niveau mit minimalen statistischen Schwankungen war; (2) der Anteil von Sondenpaaren (mittels korrekter Basenpaarungen hybridisiert und aufgrund von Fehlpaarungen nicht hybridisiert) hatte 0,85 oder höher (17 von 20 perfekten Paarungen) zu sein; (3) das Verhältnis der Induktion durch p53 oder Repression durch p53 im Vergleich zu zellulärer RNA aus Zink-induzierten Eb-1-Zellen war fünffach oder höher. Dementsprechend wird anhand von dieser Analyse nur über Gene berichtet, deren mRNA-Konzentrationen ausgehend von einer hohen Grundlinie fünffach zunahmen oder fünffach abnahmen.
Von 6800 cDNAs, welche auf dem Chip detektierbar waren, wurden 70 Gene durch p53 induziert und 77 wurden durch p53 reprimiert.
Erneut gab es hervorragende Positivkontrollen in diesem Experiment. Es wurden die bekannten p53-induzierbaren Gene, wie p21-WAF-1, IGF-BP-3, MDM-2, GAD-45, wie auch einige 53-induzierbare Gene, über die erst unlängst berichtet worden ist (PIGS); durch diese Chip-Hybridisierung detektiert. In ähnlicher Weise wurde ein reprimiertes Gen, MAP-4, über welches zuvor in der Literatur berichtet worden ist, nach einer p53-Induktion in Eb-1 (α)-Zellen reprimiert, wie in diesem Experiment detektiert wurde.
1 listet die Gene auf, die durch p53 induziert werden, und 2 listet die Gene auf, die durch p53 reprimiert werden.

Claims

Verfahren zur Diagnose von Krebs oder zur Bestimmung des Status, ob p53 Allele mutiert oder Wildtyp sind, in einer Probe, die unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, Schritte umfassend, bei denen man: das Niveau der Expression eines RNA Transkriptes oder dessen Translationsproduktes in einer ersten Probe von einem ersten Gewebe mit dem Niveau der Expression des Transkriptes oder des Translationsproduktes in einer zweiten Probe von einem zweiten Gewebe vergleicht, wobei das erste Gewebe unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, und das zweite Gewebe ein normales humanes Gewebe ist, wobei das erste und zweite Gewebe von dem gleichen Gewebetyp sind und wobei das Transkript das Transkript von einem Gen ist, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100, wie in 1 gezeigt, ausgewählt wird; die erste Probe als neoplastisch oder als ein mutiertes p53 enthaltend kategorisiert, wenn herausgefunden wird, daß die Expression in der ersten Probe niedriger als in der zweiten Probe ist.
Verfahren zur Diagnose von Krebs oder zur Bestimmung des Status, ob p53 Allele mutiert oder Wildtyp sind, in einer Probe, die unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, Schritte umfassend, bei denen man: das Niveau der Expression eines RNA Transkriptes oder dessen Translationsproduktes in einer ersten Probe von einem ersten Gewebe mit dem Niveau der Expression des Transkriptes oder dessen Translationsproduktes in einer zweiten Probe von einem zweiten Gewebe vergleicht, wobei das erste Gewebe unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, und das zweite Gewebe ein normales humanes Gewebe ist, wobei das erste und zweite Gewebe von dem gleichen Gewebetyp sind und wobei das Transkript das Transkript von einem Gen ist, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100, wie in 2 gezeigt, ausgewählt wird; die erste Probe als neoplastisch oder als ein mutiertes p53 enthaltend kategorisiert, wenn herausgefunden wird, daß die Expression in der ersten Probe höher als in der zweiten Probe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von mindestens zwei der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von mindestens fünf der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von mindestens zehn der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von mindestens zwanzig der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von mindestens 32 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von mindestens fünfzig der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Vergleich von 70 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem ein Vergleich von 77 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das Niveau der Expression der RNA Transkripte unter Verwendung eines Arrays von Nukleinsäuremolekülen, die an vorgegebenen Positionen auf einem Substrat befestigt sind, bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das Niveau der Expression des RNA Transkripts durch ein Verfahren bestimmt wird, das Schritte umfaßt, bei denen man: Proben mRN A aus den Proben erhält; die Proben mRNA revers transkribiert, um DNA zu erzeugen; einen Promotor an die DNA ligiert; unter Verwendung der DNA als Vorlage in vitro transkribiert, um eine Test mRNA zu bilden; die Test RNA an einen Array mit Nukleinsäuremolekülen hybridisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein Immunoassay durchgeführt wird, um das Niveau der Expression zu bestimmen.
Verfahren zur Diagnose von Krebs oder zu Bestimmung des Status, ob p53 Allele mutiert oder Wildtyp sind, in einer Probe, die unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, Schritte umfassend, bei denen man: das Niveau der Expression mindestens eines RNA Transkriptes oder dessen Translationsproduktes in einer ersten Probe von einem ersten Gewebe mit dem Niveau der Expression der Transkripte oder Translationsprodukte in einer zweiten Probe von einem zweiten Gewebe vergleicht, wobei das erste Gewebe unter Verdacht steht, neoplastisch zu sein, und das zweite Gewebe ein normales humanes Gewebe ist, wobei das erste und zweite Gewebe von dem gleichen Gewebetyp sind, und wobei die erste Gruppe von RNA Transkripten aus Transkripten von Genen besteht, die aus der Gruppe von Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100, wie in 1 gezeigt, ausgewählt werden und wobei die zweite Gruppe von RNA Transkripten aus Transkripten von Genen besteht; die aus der Gruppe bestehend aus Genen mit den Nummern 7-24 und 25-100, wie in 2 gezeigt, ausgewählt werden; die erste Probe als neoplastisch oder ein mutiertes p53 enthaltend kategorisiert, wenn herausgefunden wird, daß die Expression von mindestens einem aus der ersten Gruppe der RNA Transkripte oder Translationsprodukte in der ersten Probe niedriger als in der zweiten Probe ist und die Expression mindestens einer aus der zweiten Gruppe der Transkripte oder Translationsprodukte in der ersten Probe höher als in der zweiten Probe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens zwei der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens fünf der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens zehn der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens zwanzig der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens dreißig der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens fünfzig der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem ein Vergleich von mindestens siebzig der Transkripte oder Translationsprodukte aus jeder Gruppe von Transkripten oder Translationsprodukten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Niveau der Expression der RNA Transkripte durch Verwendung von Arrays von Nukleinsäuremolekülen, die auf einem Substrat an vorgegebenen Positionen befestigt sind, bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Niveau der Expression des RNA Transkripts durch ein Verfahren bestimmt wird, das Schritte umfaßt, bei denen man: Proben mRNA aus den Proben erhält; die Proben mRNA revers transkribiert, um DNA zu bilden; einen Promotor an die DNA ligiert; unter Verwendung der DNA als Vorlage in vitro transkribiert, um eine Test mRNA zu bilden; die Test RNA an einen Array mit Nukleinsäuremolekülen hybridisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem ein Immunoassay durchgeführt wird, um das Niveau der Expression zu bestimmten.
Verfahren zur Bewertung der Karzinogenität eines Wirkstoffs, das Schritte umfaßt, bei denen man: einen Testwirkstoff mit einer humanen Zelle kontaktiert; das Niveau der Expression mindestens eines Transkriptes oder dessen Translationsproduktes in der humanen Zelle nach Umsetzung mit dem Wirkstoff bestimmt; wobei das Transkript von einem Gen stammt, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird, wobei ein Wirkstoff, der das Niveau der Expression von einem Gen, das in 1 identifiziert ist, erniedrigt oder ein Wirkstoff, der das Niveau der Expression von einem Gen, das in 2 identifiziert ist, erhöht, ein potentielles Karzinogen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von mindestens zwei der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von mindestens fünf der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von mindestens zehn der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von mindestens zwanzig der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von mindestens fünfzig der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von 70 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von 90 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von 100 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von 125 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Bestimmung des Niveaus der Expression von 145 der Transkripte oder Translationsprodukte durchgeführt wird.
Verwendung eines Polynucleotids, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfaßt, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 ausgewählt wird, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten, wobei die Krebszellen des Patienten ein mutiertes p53 Gen enthalten und das Polynucleotid den Krebszellen verabreicht wird, so daß das Gen in den Zellen des Krebs exprimiert wird.
Verwendung eines Antisense Konstrukts, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfaßt, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs bei einem Patienten, wobei die Krebszellen des Patienten ein mutiertes p53 Gen enthalten und das Antisense Produkt den Krebszellen verabreicht wird, so daß die Antisense RNA in den Zellen des Krebs exprimiert wird.
Verfahren zum Screening von Wirkstoffen, die für die Behandlung von Krebs verwendet werden können, Schritte umfassend, bei denen man: Zellen, die eine p53 Mutation enthalten mit einer Testsubstanz umsetzt, die Expression eines Transkriptes oder des Translationsproduktes überwacht, wobei das Transkript von einem Gen stammt, das aus der Gruppe bestehend aus den Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird, wobei eine Testsubstanz als potentieller Wirkstoff zur Behandlung von Krebs identifiziert wird, wenn es die Expression eines Gens, wie in 1 gezeigt, erhöht oder die Expression eines Gens, wie in 2 gezeigt, erniedrigt.
Verfahren zum Screening für Wirkstoffe, die für die Behandlung von Krebs verwendet werden können, Schritte umfassend, bei denen man: eine Tumorzelle, die MDM2 überexprimiert, mit einer Testsubstanz umsetzt; die Expression eines Transkriptes oder des Translantionsproduktes überwacht, wobei das Transkript von einem Gen stammt, das aus der Gruppe bestehend aus Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und Genen mit den Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt wird, wobei eine Testsubstanz als ein potentieller Wirkstoff zur Behandlung von Krebs identifiziert wird, wenn dieser die Expression eines Gens, wie in 1 gezeigt, erhöht oder die Expression eines Gens, wie in 2 gezeigt, erniedrigt.
Satz von mindestens zwei Oligonukleotidsonden, die an mindestens zwei aus einem Satz von p53 regulierten Genen hybridiseren, wobei die p53 regulierten Gene aus der Gruppe bestehend aus Genen mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und Genen mit der Nummern 7-24 und 26-100 in 2 ausgewählt werden und wobei die Oligonukleotidsonden mindestens 12 aufeinander folgende Nukleotide der mindestens 2 Gene umfassen.
Satz gemäß Anspruch 40 der fünf Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der zehn Oligonukleotidsonden umfaßt
Satz gemäß Anspruch 40 der fünfzehn Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der zwanzig Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der fünfundzwanzig Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der dreißig Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der fünfzig Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der fünfundsiebzig Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der 100 Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40 der 140 Oligonukleotidsonden umfaßt.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden an einem Polymer befestigt sind.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden an einem festen Träger befestigt sind.
Satz gemäß Anspruch 40, der Sonden umfaßt, die (i) an jedes der Gene mit den Nummern 1-8, 10, 12, 14-58, 60-68 und 70-100 in 1 und Gene mit den Nummern 7-2 und 26-100 in 2 hybridisieren und (ii) die mindestens, 12 aufeinander folgende Nukleotide von jedem der Gene umfassen.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden in einer Gelmatrix vorliegen.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden in Lösung vorliegen.
Satz gemäß Ansprach 40, bei dem die Sonden einzeln in einem einzelnen Behälter verpackt sind.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden auf einem festen Träger angeordnet sind.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden zwischen 12 und 30 aufeinander folgende Nukleotide von den mindestens zwei Genen umfassen.
Satz gemäß Anspruch 40, bei dem die Sonden zwischen 30 und 100 aufeinander folgende Nukleotide von den mindestens zwei Genen umfassen.