DE69920953T2

DE69920953T2 - Dibenzofluorene derivative als antitumormittel

Info

Publication number: DE69920953T2
Application number: DE69920953T
Authority: DE
Inventors: F. Frederick BECKER; K. Bimal BANIK
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-22
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2019-11-23
Also published as: WO2000032583A9; CA2352878A1; US6362200B1; US6479662B2; DE69920953D1; US20020103191A1; ATE278681T1; EP1135379A1; US6184224B1; EP1135379B1; WO2000032583A1; JP2002531445A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen mit Antitumoraktivität. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, Verfahren zur Verwendung der Verbindungen, um Tumorwachstum in Säugern zu hemmen, und Verfahren zur Herstellung der Verbindungen.
Bei vielen Tausenden Menschen wird jedes Jahr Krebs diagnostiziert, und obgleich große Fortschritte in der Krebstherapie gemacht worden sind, sind die existierenden Behandlungen in vielen Fällen nicht erfolgreich. Unter den Problemen mit existierenden Therapien sind: (1) Antikrebsmittel, die Patienten verabreicht werden, haben oft toxische Wirkungen auf Nicht-Krebszellen im Körper des Patienten, (2) Krebszellen, deren Wachstum mit bestimmten Arzneistoffen gehemmt werden kann, werden manchmal resistent gegen diese Arzneistoffe und (3) einige Krebserkrankungen können nicht wirksam mit einem einzigen Arzneistoff behandelt werden und manchmal auch nicht mit einer Kombination unterschiedlicher Antikrebsmittel. Ein lange bestehendes Bedürfnis nach neuen Antikrebsmitteln existiert, die eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften haben: (1) Fähigkeit, das Wachstum von Krebszellen zu hemmen, (2) annehmbare Toxizitätsniveaus gegenüber Nicht-Krebszellen, (3) Wirksamkeit gegen Krebszellen, die gegenüber anderen Arzneistoffen resistent sind, und (4) ein unterschiedlicher Wirkungsmechanismus als bei existierenden Arzneistoffen, so daß, wenn der neue Arzneistoff in Kombination mit einem existierenden Arzneistoff verwendet wird, die Wahrscheinlichkeit, daß die Krebszellen Kreuzresistenz entwickeln, verringert ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen mit einer Formel, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
oder Salze derselben, wie definiert in Anspruch 1. In den obigen Formeln ist wenigstens eines von R₁-R₁₃ in Formel (I) oder wenigstens eine von R₁ bis R₁₂ in Formel (II) -R₁₄Z. R₁₄ ist eine substituierte oder unsubstituierte Amino- oder Amidogruppe, vorzugsweise mit von 2 bis 12 Kohlenstoffatomen. Z ist eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, vorzugsweise mit von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen. Der Rest von R₁-R₁₃ in Formel (I) oder R₁-R₁₂ in Formel (II) wird unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Nitro, substituierten oder unsubstituierten Amino- oder Amidogruppen, vorzugsweise mit von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, und Alkylgruppen, vorzugsweise mit von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, besteht.
Wie oben erwähnt, sind Salze der beanspruchten Verbindungen Teil der vorliegenden Erfindung. Beispiele für geeignete Salze schließen die Hydrochlorid-, Iodid- und Methansulfonat-Salze ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
In einer Ausführungsform der Erfindung, in der die Verbindung Formel I hat, ist R₁₁-R₁₄Z und sind R₁-R₁₀ und R₁₂-R₁₃ unabhängig Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Nitro, substituiertes oder unsubstituiertes Amino oder Amido mit von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, in der die Verbindung Formel II hat, ist R₁₁-R₁₄Z und sind R₁-R₁₀ und R₁₂ unabhängig Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Nitro, substituiertes oder unsubstituiertes Amino oder Amido mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen.
R₁₄ hat vorzugsweise die Formel -NHR₁₅-, worin R₁₅ eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe mit von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist. R₁₅ ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus -CO(CH₂)_nCO-, -(CH₂)_m; und -CO(CH₂)_qCHCH(CH₂)_rCO- besteht, worin n, m, q und r unabhängig eine Zahl von 0 bis 6 sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist n von 1 bis 4, ist m von 2 bis 6, ist q von 0 bis 2 und ist r von 0 bis 2. Z ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus Piperidinyl, Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Pyrrolidinyl, Hydroxyethylpiperazinyl, Aminoethylpiperazinyl und Aminomethyldihydroxypiperidinyl besteht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung, wie oben beschrieben, und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassen. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen, bei dem eine tumorhemmende Menge einer Verbindung, wie oben beschrieben, einem Säuger verabreicht wird.
Eine weitere Offenbarung ist ein Verfahren zum Synthetisieren einer cyclischen Kohlenwasserstoff-Keto-Verbindung. Das Verfahren umfaßt den Schritt der Umsetzung einer typischen Kohlenwasserstoffverbindung, die wenigstens zwei Ringe umfaßt, mit einem Metallbismutat in Gegenwart einer Säure. Das Metallbismutat kann zum Beispiel ein Alkalimetallbismutat, wie etwa Natriumbismutat, sein. Als ein weiteres Beispiel kann es Zinkbismutat sein. In bestimmten Ausführungsformen dieses Verfahrens kann die Säure eine organische Säure, wie etwa Essigsäure, oder eine Mineralsäure, wie etwa Schwefelsäure, sein. Fakultativ kann die Reaktion in Gegenwart eines organischen Lösemittels, wie etwa Aceton, stattfinden. Der cyclische Kohlenwasserstoff-Reaktant umfaßt vorzugsweise von 10 bis 50 Kohlenstoffatome.
Die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich in der Krebstherapie, entweder für sich selbst oder in Kombination mit weiterer Antitumor-Chemotherapie oder -Strahlungstherapie.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Syntheseschema, das in Beispiel 1 beschrieben ist.
2-4 beschreiben Syntheseschemata, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Polycyclische aromatische Verbindungen sind in breitem Umfang in der Natur verteilt und werden als signifikante Umwelt-Karzinogene angesehen [1]. Bisher ist beträchtliche Forschung auf die Synthese der polycyclischen Ringsysteme [2] und Untersuchung von deren Stoffwechselaktivierung in Zielzellen gerichtet worden. Mehrere Hypothesen [3] sind vorgeschlagen worden, um die Korrelationen zwischen der Struktur dieser Metabolite, ihren zellulären Wechselwirkungen und ihrer Karzinogenität zu etablieren. Letztlich interkalieren die meisten der polycyclischen Stoffwechselprodukte, die als Karzinogene wirken, mit DNA oder binden sich kovalent an diese. Die Untersuchung mehrerer häufig verwendeter Tumormittel zeigte zwei gemeinsame Strukturmerkmale [4]: sie haben ein planares Ringsystem und eine basische Seitenkette. Es könnte daher vorhergesagt werden, daß zusätzlich zu anderen zellulären Wechselwirkungen diese Verbindungen zunächst eine starke Wechselwirkung mit den Lipid-Domänen der Plasmamembranen und anderen Membranen in der Zelle zeigen würden [5].
In einigen Fällen ist gezeigt worden, daß DNA-interkalierende Antitumormittel mit Zellmembranen in Wechselwirkung treten, und diese haben in einigen Fällen Antitumoraktivitäten gezeigt, ohne die Zellstruktur weiter zu penetrieren. Dies würde sie dann in eine Klasse von Arzneistoffen stellen, die generisch membranstabilisierende Mittel (MSA) genannt worden sind [6]. Dies sind Mittel, die die Membranstabilität gegen verschiedene Stressoren erhöhen und oft bei höherer Konzentration Membrandestabilisierung induzieren. Sie können zum Beispiel bei niedrigeren Konzentrationen als antihämolytische Mittel wirken und bei höheren Konzentrationen Hämolyse verursachen. Um die Bedeutung dieser primären Wechselwirkungen mit der Plasmamembran von Tumorzellen bei Antitumoreffekten zu bestimmen, haben wir eine synthetische und biologische Forschungsbewertung von einzigartigen polycyclischen aromatischen Verbindungen vorgenommen. Dies beruhte auf unserem Glauben, daß die potentielle Verwendung solcher Verbindungen als Antitumormittel nicht systematisch erforscht worden ist [7], insbesondere wenn eine spezifische Modifikation angewendet wird, um die Membranwechselwirkung als den primären Effekt von Antitumoraktivität zu verstärken. Auf dieser Basis begannen wir diese systematische Analyse mit dem Synthetisieren einer Reihe von Dibenzofluoren-Derivaten und untersuchten ihre biologischen Wirkungen in vitro an einem Panel von menschlichen Tumorzelllinien.

Eine Reihe von Verbindungen der vorliegenden Erfindung und Referenzverbindungen sind hergestellt worden und sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Verbindung Nr.	Verbindungsname
Tx-37	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl)]-4-(4'N-methyl-piperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-38	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl]-4-(1'-piperidinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-47	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl]-4-(4'N-methyl-piperazinyl)-but-2-en-1,4-dicarboxiamid
Tx-48	N-[11'-13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl]-4-(1'-piperidinyl)-but-2-en-1,4-dicarboxiamid
Tx-49	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl]-4-(4'N-methyl-piperazinyl-hydrochlorid)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-50	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-on]-4-(4'N-methyl-piperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-51	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-one]-4-(1'-piperidinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-66	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-hydroxy]-4-(4'N-methyl-piperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-67	N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-hydroxy]-4-(1'-piperidinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-68 (Referenz)	N-[2'-(9'H-Fluorenyl)]-4-(4'N-methyl-piperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid
Tx-69 (Refernez)	N-[2'-(9'H-Fluorenyl)]-4-(1'-piperidinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid

Verfahren zum Synthetisieren der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in den Beispielen unten beschrieben. Therapeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, werden vorzugsweise auch einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe einschließen, wie etwa Kochsalzlösung, und können auch einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Füllstoffe und/oder zusätzliche biologisch aktive Substanzen einschließen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen in Säugern, insbesondere in Menschen, verwendet werden. Spezifische menschliche Malignitäten, für die diese Verbindungen nützlich sein sollten, schließen Brust-, Enddarm-, Eierstock- und Prostatakrebserkrankungen, Melanome, Leukämie/Lymphome und möglicherweise auch andere ein. Die Verbindungen werden einem Säuger in einer Menge verabreicht, die darin wirksam ist, das Wachstum von Tumorzellen im Säuger zu hemmen. Die Verabreichung kann geeigneterweise parenteral und durch intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, intralymphatische, intraperitoneale, subkutane, interpleurale oder intrathekale Injektion erfolgen. Eine solche Verabreichung wird vorzugsweise nach einem Zeitplan wiederholt, bis Tumorregression oder -verschwinden erreicht worden ist, und kann in Zusammenhang mit anderen Formen von Tumortherapie verwendet werden, wie etwa chirurgischem Eingriff oder Chemotherapie mit anderen Mitteln. Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in einer Dosis verabreicht, die zwischen ungefähr 0,01 und 100 mg/kg Körpergewicht des Säugerpatienten beträgt.
Die vorliegende Erfindung kann aus den folgenden Beispielen weiter verstanden werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel betrifft die Synthese von polycyclischen aromatischen Ketonen.
Die Oxidationskraft von Natriumbismutat in sauren Medien ist durch die leichte Umwandlung von zweiwertigen Mangan-Salzen zu siebenwertigem Mangan belegt [8]. Im Vergleich zu anderen, üblichen Oxidationsmitteln ist die Verwendung dieses Reagens in der synthetischen organischen Chemie nicht umfangreich erforscht worden. Rigby [9] zeigte die Spaltung von vicinalen Diolen und die Umwandlung von Acyloinen zu α-Diketonen durch Natriumbismutat. Dieses Reagens wurde auch für die Oxidation von Phenolen [10], Olefinen [11] und α-Ketolen [12] verwendet. Vor kurzem wurden einige andere Bismut-Derivate für die Oxidation verschiedener funktioneller Gruppen entwickelt [13].
Die Oxidation benzylischer Methylene zu den Ketonen durch DDQ [14], PCC [15], CrO₃ [16], tBuOOH [17], Tetrapyridinsilberperoxydisulfat [18] ist in der Literatur bekannt. Vor kurzem berichteten Harvey et al. [19] über eine neue Oxidationsmethode mit n-BuLi in Gegenwart von molekularem Sauerstoff. Obgleich diese Methode attraktiv ist, hat sie mehrere Beschränkungen. Die Oxidation einiger strukturell ähnlicher benzylischer Verbindungen konnte zum Beispiel mit dieser Methode nicht erreicht werden. Dimerbildung in starken basischen Medien wurde beobachtet und Mischungen von Produkten wurden in einigen Fällen gebildet. Am wichtigsten ist es, daß man extreme Vorsicht walten lassen muß, um erfolgreiche Resultate zu erzielen, da die Methode absolut trockene und inerte Medien erfordert.
Wir haben nunmehr benzylische Methylene unter Rückflußbedingung zu Ketonen oxidiert, unter Verwendung von Natriumbismutat in Essigsäure. Wie dargestellt in 1 wurden kommerziell erhältliches Tetralin (1), Diphenylmethan (5), 9,10-Dihydroanthracen (3), Dibenzosuberan (9), Fluoren (7a) und 2-Nitrofluoren (7b) ohne weiteres durch Natriumbismutat in Essigsäure in die entsprechenden Ketone 2, 6, 4, 8a, 8b und 10 umgewandelt. Wir wählten zwei synthetische Verbindungen, 2,3-Benzofluoren (11) und 13H-Dibenzo[a,g]fluorenz (13), berichtet von Harvey et al. [14], für die Oxidationsstudie aus und produzierten die Ketone 12 und 14 in guter Ausbeute. Das Vorhandensein von Essigsäure ist für die Durchführung der Reaktion erforderlich. Wir fanden heraus, daß das Fortschreiten der Reaktion sehr langsam wurde, wenn sie ohne Essigsäure durchgeführt wurde. Verwendung von 10% Schwefelsäure veränderte jedoch nicht die Reaktionszeit, die mit Essigsäure beobachtet wurde. Um die Reaktanten in Kontakt mit dem Oxidationsmittel zu halten, wurde Aceton als ein Cosolvens zugegeben.
Die Oxidation von 1, 5, 7, 9, 11 und 13 ergab die Monoketone 2, 6, 8, 10, 12 und 14 in 50 bis 90% Ausbeute. Das Vorhandensein des Diketons im Rohprodukt wurde nicht beobachtet, während Verbindung 3 ein Diketon 4 in 72% Ausbeute ergab. Es wurden während dieser Oxidation keine Nebenprodukte, wie etwa Hydroxy, Acetate, Chinone oder Dicarbonsäure, beobachtet.
Der Mechanismus der durch Natriumbismutat induzierten Oxidation ist nicht fest etabliert. Es ist gezeigt worden, daß die Oxidation von Phenolen durch Natriumbismutat in neutralem aromatischen Lösemittel durch Ein-Elektronen-Oxidation [10(e)] (durch eine Radikal-Zwischenstufe) abläuft. Man glaubt, daß eine ähnliche Reaktion in Gegenwart von Essigsäure als dem Lösemittel durch einen Zwei-Elektronen-Oxidationsprozeß [10(f)] (Carbonium-Ion) eintritt. Der vorgeschlagene Mechanismus hat eine enge Ähnlichkeit mit der durch Chromsäure vermittelten benzylischen Oxidation [20]. Somit stellen wir die Hypothese auf, daß unsere säurekatalysierte, durch Natriumbismutat induzierte Oxidation von benzylischen Methylenen einem der oben erwähnten Prozesse folgen könnte.
Ein repräsentatives Verfahren ist wie folgt:
Zur Ausgangs-Methylenverbindung (20 mmol) in Essigsäure (4 ml, 50%) und Aceton (2 ml) wurde Natriumbismutat (80 mmol) zugegeben und die Mischung wurde unter einer Argon-Atmosphäre auf Rückfluß erhitzt. Am Ende der Reaktion, angezeigt durch TLC, wurde die Mischung durch ein Celite-Kissen filtriert und mit Wasser (10 ml) verdünnt. Die Mischung wurde mit Methylenchlorid (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit Natriumbicarbonatlösung (3 × 10 ml, 10%), Salzlösung (10 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck konzentriert. Das resultierende Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Alle Produkte sind durch einen Vergleich von Schmp., TLC und NMR mit authentischen Verbindungen charakterisiert worden.
Beispiel 2
Dieses Beispiel betrifft die Synthese von Dibenzofluoren-Derivaten.
Wir haben eine neue Oxidationsmethode für die Umwandlung benzylischer Methylene zu benzylischen Ketonen in polycyclischen Systemen durch Natriumbismutat entwickelt. So wurde, wie dargestellt in 2, pentacyclisches Dibenzofluoren 101 in guter Ausbeute zum Dibenzofluoren an 102 oxidiert.
Wir haben auch eine leichte Reduktion der polycyclischen aromatischen Nitroverbindungen zu polycyclischen aromatischen Aminen (z.B. 103 zu 104) durch Samarium-Metall in Gegenwart katalytischer Mengen Iod gezeigt (siehe 3).
Durch Verwendung dieser zwei Methoden wurde unser Interesse erweckt, die Antitumorwirkungen von strukturell komplexen, angulären polycyclischen Dibenzofluoren[a,g]-Systemen mit einer sehr reaktiven Methylen-Brückengruppe zu untersuchen. Wir glauben, daß eine Brückeneinheit im polycyclischen aromatischen System eine wichtige Rolle spielen könnte, da diese Kationen-, Anionen- und Radikal-Zwischenstufen bilden kann. Dieses Beispiel beschreibt die Nitrierungsstudie des 13-H-Dibenzofluorens (101) und Studien zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung mehrerer 13-unsubstituierter und 13-substituierter Diamide (110, 111 und 112).
Wir stellten pentacyclisches Dibenzo[a,g]fluoren (110] in 20% Ausbeute durch Befolgen der Methode, die von Harvey [21] berichtet worden ist, her. Funktionalisierung von Benzol- und Naphthalin-Derivaten durch elektrophile Reaktion [22] ist routinemäßige organische Chemie. Die Orientierung des Elektrophils in solchen monocyclischen oder bicyclischen Derivaten ist vorhersagbar. Eine ähnliche Substitutionsreaktion in polycyclischen aromatischen Systemen ist sehr schwierig und die Stelle des Angriffs folgt keiner bekannten Orientierungsregel. Tatsächlich ist sehr wenig über die elektrophile Substitutionsreaktion in polycyclischen aromatischen Systemen bekannt [23].
Wir planten, eine 4-Kohlenstoffkettenseitenkette mit einer heterocyclischen Base am Ende mit dem aromatischen Ring über Stickstoff zu verknüpfen [24]. Daher war unsere Aufgabe, Aminobenzodifluoren 106 für die anschließende Derivatisierung herzustellen. Zu diesem Zweck setzten wir das Keton 102 mit Salpetersäure in Essigsäure unter verschiedenen Bedingungen um und erhielten kein gewünschtes Nitro-Derivat. Der Kohlenwasserstoff 101 erzeugte jedoch eine einzige Nitroverbindung 105 mit Salpetersäure-Essigsäure bei 0-5°C in 80% Ausbeute (siehe 2). Die Stellung der Nitrogruppe im aromatischen System wurde mit NMR-Spektren bestimmt. Das NMR-Spektrum (400 MHz) des bekannten Kohlenwasserstoffs 101 wurde aufgenommen. Auf der Basis der homonuklearen Entkopplung und von COSY-NMR-Studien wurden alle Protonen 101 wie folgt zugeordnet: (400 MHz, CDCl₃) δ: 8,81 (d, 1H, J = 8,46 Hz, H₇), 8,50 (d, 1H, J = 8,68 Hz, H₆), 8,02 (d, J = 8,22 Hz, H₁), 7,89-7,96 (m, 3H, H₄, H₅, H₁₀), 7,70 und 7,79 (2H, ABq, J = 8,23 Hz, H₁₁, H₁₂), 7,60-7,65 (m, 1H, H₈), 7,45-7,54 (m, 3H, H₂, H₃, H₉). Diese Zuordnungen wurden von den Daten unterstützt, die von Jones et al. berichtet worden waren [25]. Das NMR-Spektrum der Nitroverbindung 105 zeigte das Fehlen des AB-Quartetts, das in 101 vorhanden war. Das Spektrum von 105 zeigte ein neues Singulett bei δ 8,39 und ein neues Dublett bei δ 8,44 (J = 8,75 Hz). Wir eliminierten die Positionen C₁, C₄, C₇ und C₁₀ für die Nitrogruppe, weil das Singulett bei δ 8,44 lag. Die Positionen C₅, C₆, C₈ und C₉ wurden auf der Basis der homonuklearen Entkopplung und des COSY-Experimentes eliminiert. Der Bereich (δ 7,5-7,6) des Kohlenwasserstoffs 101 blieb in 105 unbeeinflußt, was klar die Positionen C₂ und C₃ für die Nitrogruppe 105 ausschloß. Wir eliminierten Positionen C₁₂ wegen des Downfield- Dubletts bei δ 8,44. Das ¹³C-NMR-Spektrum von 105 zeigte das Vorhandensein von neun quartären Kohlenstoffen. Das Signal bei δ 123,58 aufgrund des C₁₁-Kohlenstoffs (verifiziert durch HETCOR-Studie) war im Spektrum von 105 nicht vorhanden. Ein neuer Peak bei δ 145,24 tauchte wegen der Nitrogruppe auf. Somit bestimmten wir C₁₁ als die Stelle der Nitrogruppe in 105 auf der Basis der umfangreichen NMR-Studie.
Reduktion der Nitroverbindung 105 zur Aminoverbindung 106 wurde mit Pd-C(10%)-Ammoniumformiat [26], Samarium-Iod und Pd-C(10%)-Hydrazin-Hydrat [27] durchgeführt. Wir stellten fest, daß Hydrazin-Hydrat und Pd/C (10%) die besten Ergebnisse ergaben.
Unsere nächste Aufgabe war, die Seitenketten 109 herzustellen und sie an das Amin 106 zu koppeln (siehe 4). Die Säure 109 wurde durch Kochen von Bernsteinsäureanhydrid (107) mit Piperidin (108a) und N-Methylpiperazin (108b) unter Rückfluß hergestellt. Das Amin 106 wurde dann mit den Seitenketten 109 durch die Mischanhydridmethode [28] kondensiert.
Die gewünschten Diamide 110 wurden durch Säulenchromatographie isoliert. Die benzylische Methylengruppe in 110 wurde mit molekularem Sauerstoff [29] oxidiert, um das Keton 111 zu erhalten, das anschließend zum Alkohol 112 reduziert wurde. Alle neuen Verbindungen ergaben befriedigende Spektraldaten.
Die Verbindungen dieses Beispiels (siehe 2, 3 und 4) korrelieren mit der Auflistung der Verbindungen nach Tx-Nummer in Tabelle 1 wie folgt:

Verbindung Verbindung Tx-Nr.

110a Tx-38

110b Tx-37

111a Tx-51

111B Tx-50

112a Tx-67

112b Tx-66
Beispiel 3
Dibenzofluoren-in-vitro-Zytotoxizitätstests
Jedes Dibenzofluoren-Derivat wurde getestet, wie unten beschrieben werden wird, gegen sechs bis acht kultivierte Tumorzelllinien menschlichen und/oder tierischen Ursprungs, von denen wenigstens die Hälfte aus dem NCI-Panel von Testtumoren ausgewählt wurde. In jedem Experiment wurde Adriamycin (ADR) als eine maximal positive Kontrolle verwendet. Anschließend an unsere Bestimmung, daß das Dibenzofluoren-Derivat Tx-37 konsistente, hoch positive Wirkungen zeigte, wurde es auch in das Panel von Testagentien in jedem Experiment einbezogen, in dem die Dibenzofluoren-Derivate getestet wurden.
In-Vitro-Zytotoxizitätsbestimmungen
Die Daten sind IC₅₀-Werte (MTT-Test), berichtet als μg/ml, für 72 Stunden kontinuierliche Einwirkung des Arzneistoffes. Die Arzneistoffe wurden hergestellt in DMSO:PEG300 (1:1). Weiter wurden Verdünnungen in einem Zellkulturmedium mit fötalem Rinderserum durchgeführt.
Testtumorlinien

BRO

menschliches Melanom

HT-29

menschliches Enddarmadenokarzinom

P388/0

murine lymphatische Leukämie

MCF-7

menschliches Brustkarzinom

HL-60

menschliche promyelozytische Leukämie

OVCAR 3

menschliches Eierstockkarzinom

Zusätzliche Tumorlinien, gegen die die Arzneistoffe in bestimmten Reihen getestet wurden, schlossen L1210 (Leukämie), PC3 (Prostata) und mehrere andere ein.
Die Verbindungen wurden auf Löslichkeitseigenschaften in Trägerstoffen bewertet, die zur Verwendung in Zellkultur geeignet wären. Die Verbindungen wurden zu den Zelllinien unter kontinuierlicher Kultur für 72 Stunden zugegeben. Wachstumshemmung relativ zur Kontrollzellkultur wurde mit der MTT-Methode am Ende von 72 Stunden bestimmt. Dies ist ein Test auf die relative Fähigkeit einer Verbindung, Zellwachstum, nicht Überleben zu hemmen. Wachstumshemmung kann jedoch Zelttod und/oder Zytostase widerspiegeln.
Zusammengefaßte Ergebnisse der in-vitro-Zytotoxizitätstests, insbesondere durchschnittliche IC₅₀-Werte für die verschiedenen Tumorlinien, sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Ein IC₅₀-Wert oberhalb von 50 μg/ml zeigt, daß es ungenügende Zytotoxizität der Verbindung gab, um eine 50%-Hemmung des Zellwachstums bei 50 μg/ml zu erreichen. In einigen Fällen beobachteten wir Zytotoxizität bei 100 μg/ml, aber wenige der Arzneistoffe waren bei dieser Konzentration leicht löslich und die Daten sind nicht verläßlich.
ADR produzierte invariabel die beschriebene Antitumorwirkung gegen alle Tumorlinien in Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml Kulturmedium. Die Wirkung der Tx-Verbindungen wurde in die unten beschriebenen fünf Aktivitätsgruppen unterteilt. In allen Fällen wurde, wenn die Aktivität gegen eine einzelne Tumorlinie sich radikal von derjenigen gegen alle anderen unterschied, eine Notiz über diese Spezifizität gemacht, aber das Mittel wurde eingruppiert, wie bestimmt durch die Mehrzahl der Ergebnisse.
Gruppe A. Diese Mittel waren gegen alle Tumorlinien in Konzentrationen unterhalb von 5 μg/ml wirksam. Einige dieser Verbindungen waren bei weniger 1 log Unterschied von der Aktivität von ADR wirksam.
Gruppe B. Diese Mittel waren gegen alle Tumorlinien bei weniger als 10 μg/ml wirksam.
Gruppe C. Diese Mittel waren gegen ein Drittel bis der Hälfte aller getesteten Tumorlinien bei Gehalten von weniger als 10 μg/ml wirksam.
Gruppe D. Diese Mittel waren gegen eine oder zwei der sechs oder acht getesteten Tumorlinien bei Konzentrationen von weniger als 10 μg/ml wirksam.
Gruppe E. Diese Mittel erzeugten eine gewisse Antitumorwirkung bei Dosen oberhalb von 10 μg/ml, aber weniger als 20 μg/ml.
Gruppe F. Diese Mittel waren „wirksam" gegen einige Tumorlinien oberhalb von 20 μg/ml, zeigten aber oft keine Antitumorwirkung.
Tabelle 3

GRUPPE A Tx-37 Tx-49 Tx-66
GRUPPE B Tx-50 Tx-67
GRUPPE C Tx-47
GRUPPE E Tx-68
GRUPPE F Tx-38 Tx-48 Tx-51 Tx-69

In Zusammenfassung dieser Befunde war die aktivste Verbindung, die in dieser Reihe produziert worden war, Tx-37, das Dibenzofluoren-Molekül mit einem endständigen heterocyclischen N-Methylpiperazin-Ring. Obgleich das Hydrochloridsalz (Tx-49) oder das Hinzufügen einer Hydroxyleinheit an Position 13 (Tx-66) nur geringfügige Veränderung der Aktivität erzeugten, erzeugte die Substitution einer Ketoneinheit an Position 13 (Tx-50) eine leichte Verringerung der Aktivität. Die Einführung einer ungesättigten Bindung in die Alkylkette bei Tx-37 (Tx-47) verringerte seine Aktivität signifikant.
Tx-38 mit einem endständigen heterocyclischen Piperidin-Ring zeigte keine signifikante Antitumoraktivität und die Einführung einer ungesättigten Bindung in dieses Molekül erzeugte wenig oder keine Veränderung (Tx-48). Das Hinzufigen der Hydroxyleinheit an Position 13, das nur geringfügige Änderung bei Tx-37 bewirkte, erhöhte jedoch die Aktivität von Tx-38 erheblich (Tx-67).
Wie wir bei anderen Verbindungen auf der Basis anderer polycyclischer Ringstrukturen berichtet haben, zeigten diejenigen, die in einem N-Methylpiperazin-Ring endeten, wieder weit größere Aktivität als diejenigen, die in einem Piperidin-Ring endeten. Somit besitzen Tx-38 und Tx-51 geringe oder keine Aktivität, verglichen mit den signifikanten Aktivitäten von Tx-37 und Tx-50 gegen alle Tumorlinien. Die Modifikation anderer Komponenten des Moleküls, wie etwa die Einführung der Hydroxyleinheit an Position 13 von Tx-38 (Tx-67) verringerte oder eliminierte diese Unterschiede jedoch oft; in diesem Fall durch erhebliches Verstärken seiner Aktivität.
Die vorstehende Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung soll keine vollständige Liste aller möglichen Ausführungsformen der Erfindung sein. Die Fachleute auf diesem Gebiet werden anerkennen, daß Modifikationen in den hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen vorgenommen werden können, die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung lägen.
LITERATURSTELLEN
Die folgenden Literaturstellen werden hierin durch Bezugnahme spezifisch in dem Umfang miteinbezogen, daß sie beispielhafte verfahrensmäßige oder andere Details liefern, die ergänzend sind zu denjenigen, die hierin angegeben sind.

[1] Für einen allgemeinen Überblick siehe: Freudenthal R., Jones PW. Carcinogenesis – a comprehensive survey. New York: Raven Press, 1976; Vol. 1-3.
[2] Für ein neueres Beispiel siehe: Harvey RG. Polycyclic aromatic hydrocarbons. Wiley-VCH, 1997.
[3] Di Raddo P., Chan TH. J. Org. Chem. 1982; 47:1427 und darin zitierte Literaturstellen
[4] Für einige neuere Beispiele: (a) Cherubim P., Deady LW., Dorkos M., Quazi NH., Baguley BC., Denny WA. Anti-cancer drug design. 1993; 8:429. (b) Palmer BD., Lee HH, Baguley BC, Denny WA. J. Med. Chem. 1992; 35:258. (c) Atwell GJ, Rewcastle GW, Baguley BC, Denny WA. J. Med. Chem. 1987; 30:664 und darin zitiere Literaturstellen
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Claims

Verbindung mit einer Formel, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
oder ein Salz derselben; wobei R₁₁-R₁₄Z ist, wobei R₁₄ die Formel NHR₁₅ hat, wobei R₁₅ eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe mit von 2-6 Kohlenstoffatomen ist, und Z ausgewählt ist aus substituierten Piperazinylgruppen, unsubstituierten Piperazinylgruppen, substituierten Piperidinylgruppen und unsubstituierten Piperidinylgruppen mit von 1-12 Kohlenstoffatomen; wobei R₁-R₁₀, R₁₂ und R₁₃ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Nitro, Amino oder Amidogruppen mit von 1-12 Kohlenstoffatomen und Alkylgruppen mit von 1-12 Kohlenstoffatomen besteht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus -CO(CH₂)_nCO-, -(CH₂)_m und -CO(CH₂)_qCHCH(CH₂)_rCO- besteht, wobei n von 1-4 ist, m von 2-6 ist, q von 0-2 ist und r von 0-2 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Piperidinyl, Piperazinyl, Hydroxyethylpiperazinyl, Aminoethylpiperazinyl und Aminomethyldihydroxypiperidinyl besteht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl)]-4-(4'N-methylpiperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid; N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluorenyl)]-4-(4'N-methylpiperazinyl-hydrochlorid)-butan-1,4-dicarboxiamid; und N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-hydroxy]-4-(4'N-methylpiperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-on]-4-(4'N-methylpiperazinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid; und N-[11'-(13'H-Dibenzo[a,g]-fluoren-13'-hydroxy]-4-(1'-piperidinyl)-butan-1,4-dicarboxiamid.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁₅ eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe mit von 2-6 Kohlenstoffatomen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfasst.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen, welches den Schritt der Verabreichung einer Menge, die darin wirksam ist, das Tumorzellwachstum zu hemmen, von besagter Verbindung an einen Säuger umfasst.