JPS619292A - Ｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アミノ酸のＮ−カルバミル体から微生物酵素
系を利用して相当するＬ−アミノ酸を製造する方法に関
する。

〔従来の技術〕

従来、微生物酵素系を利用したＤＬ−Ｐｉ−カルバミル
アミノ酸よシのＬ−アミノ酸の製造方法については、Ｄ
Ｌ−Ｎ−カルバミルメチオニンよシのＬ−メチオニンの
製造法が知られている（特公昭５５−２９６７Ｂ号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、微生物酵素系を利用して、Ｎ−カルバ
ミルアミノ酸から、Ｌ−メチオニン以外の有用な特定の
Ｌ−アミノ酸を製造する方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はＬ−アミノル酸の製造方
法に関する発明であって、Ｌ−Ｎ−カルバミルアミノ酸
のカルバミル基を不斉的に加水分解する能力を有するシ
ュードモナス属微生物の培養液、菌体又は菌体処理物を
、下記一般式ｌ： 畷 ＮＨ！ で表される基を示す）で表されるＮ−カルバミルアミノ
酸のＤＬ一体又はＬ一体に作用させ、生成した和尚する
Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする。

本発明方法で使用するＮ−カルバミルアミノ酸は、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、チロシン、セリン、グ
ルタミン酸、バリン、イソロイシン又はヒスチジンの各
ＤＬ−若しくはＬ−Ｎ−カルバミル体である。

本発明方法の原料は、公知の物質であるか、公知の方法
によって得ることができるものであシ、例えばＤ　Ｌ　
−Ｎ−カルバミルアミノ酸は、ＤＬ−アミノ酸にシアン
化カリウム等を反応させる公知の方法で、またアミノ酸
のＤＬ−ヒダントイン誘導体を適当な条件で加水分解す
る方法で得ることができる。

次に本発明方法で使用するシュードモナス属（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａａ　）微生物としては、その培養液をその
まま用いることもできるが、生菌体、凍結菌体、凍結乾
燥菌体又は菌体磨砕物若しくは　　　　′菌体抽出物の
ような菌体処理物を使用してもよい。また、変異処理に
よシ性能の向上した変異株なども、よシ効果的に使用で
きることはいうまでもない。

上記シュードモナス属微生物のうちで好適な例としては
、本発明者等が自然界から新たに分離した新菌種でおる
、シュードモナス属ＤＫ−９１０菌株（ＦＩＲＭ　Ｐ−
７４７３）がある。

以下、上記ＤＫ−９１０菌株の菌学的諸性質を示す。

１、　　形　　　態 （１）　　細胞の形及び大きさ二〇、２〜α３　Ｘ　１
．２〜五５μｍ。

桿菌 （２）　　多形性の有無：　　無 （３）運動性の有無：　有 （４１９毛の有無、着生状態：　有、極毛（５）胞子の
有無：　　　無 （６）　　グラム染色性：　　　　陰性（７）抗　酸　
性：　　無 Ｚ　各培地での生育状態 （１）　　肉汁寒天平板培養 コロニー〇色：　白クリーム色 コロニーの形状二　円形 コロニーの隆起：　中央凸状 コロニーの周縁：　金縁 （２）　　肉汁寒天斜面培養 生育状態二　　適度 光　沢：　　　有、半透明 形　状：　　　糸状 （３）　　肉汁液体培養 混濁の程度二　適度、均一に濁る 沈　殿：　　有 液面での生育：薄い膜形成 （４）　肉汁ゼラチン穿刺培養：　液化しない（５）　
　リドマス・ミルク：　−液化しない、アルカリ変 五　生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：　　　　　有 （２）脱窒反応二　　　　　　　陽 （３）ＭＲテスト：　　　　　　陰 （４）　ＶＰテスト：　　　　　　陰 （５）インドールの生成：　　　陰 （６）硫化水素の生成：　　　　陽 （７）　　デンプンの加水分解：　　陰（８）　　クエ
ン酸の利用：　コーナー（Ｋｏｓｅｒ　）培地及びクリ
ステンセン （Ｏｈｒｉｅｔｅｎｓｅｎ）培地 共利用する （９）　　無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニウム
塩共利用する （ＩＱ　　色素の生成：　　　　　　無（１〃　　ウレ
アーゼ：　　　　　　陰（２）　オキシダーゼ：　　　
　　陽 （至）　カタラーゼ：　　　　　　陽 α尋　酸素に対する態度：　　好気性 （至）生育の範囲 温　　度＝　　　　　　　１５〜３６℃１）Ｈ：　　　
　　５．１〜９．６ αＱ　　ＯＦテスト：　酸化的（ｏｚｉａａｔｉｖｅ　
）ｌ　　　　　　αη　糖類からの酸及びガスの生成の
有無糖　類　　　　　　酸　　、ガス ■　Ｌ−アラビノース　　−　　　− ■　Ｄ−’キシロース　　　＋　　　−■　Ｄ−グルコ
ース　　　−　　　− ■　Ｄ−マンノース　　　±　　　− ■　Ｄ−フラクトース　　−　　　− ■　Ｄ−ガラクトース　　−　　　− の　麦芽糖　　　　　　　−− ■　ショ糖　　　　　　　−− ■乳糖　　　−− ［相］　トレハロース　　　　−− 〇　Ｄ−ソルビット　　　−− ｏ　Ｄ−マンニット　　　−− ［相］　イノフット　　　　　−　　　−［相］　グリ
セリン　　　　−− （至）　ＤＭＡ分解性：　　　　陽 α坤　カゼイン分解性：　　　陰 翰　耐塩性：　Ｎａ０６２　％で生育、５％で不生育 ｅ優　炭化水素の資化性 ■　ｐ−ヒドロキシ安息香酸　　− ■　グルコン酸　　　　　　　　十 ■乳酸　　　　　十 ■酢酸　　　　　十 ■　グルコース　　　　　　　　十 〇　ショ糖　　　　　　　　　　十 の　キシロース　　　　　　　　− 〇　ラクトース　　　　　　　　− ■　マンニット　　　　　　　　　− 以上の菌学的諸性質を、パージエイ式分類［Ｂａｒｇｅ
プｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅ　　ｂａｃｔｅ−ｒｉＯ１０ｇ７　（第８版）
（１９７４）参照〕に基づいて検索すると、上記ＤＫ−
９１０菌株は（１）グラム陰性、桿菌（２）運動性を有
し極上を有す（３）好気性（４）硝酸塩を還元（５）脱
窒能陽性（６）オキシダーゼ陽性などから、シュードモ
ナス属に属する細菌であることが判明した。

このＤＫ−９１’０菌株を大量に得る培養法としては、
通常の通気液体培養等の公知方法で十分で、培地には該
微生物が資化し゛うる炭素源、窒素源、無機塩及び微量
有機栄養源が含まれる。

更に、ＤＬ−又はＬ−カルバミルフェニルアラニンなど
を゛少量添加すれば酵素活性が増強される。培養は例え
ば、ｐＨ４〜Ｎ、温度１５〜４０℃の条件下で５〜１２
０時間行えばよい。

本発明方法の反応条件について以下説明する一１ｆ、Ｎ
−カルバミルアミノ酸の使用濃度は、０．１〜５０重ｉ
チ、ｐＨ４〜Ｎ、好ましくはｐＨ６〜９の範囲で良好な
結果を得る。この範囲外では酵素活性の発現及び安定性
の点で実用上適さない。反応の進行に伴ってｐＨは変動
するため、適当な中和剤で所望のｐＨに維持することが
望ましい。反応温度は１５〜５０℃の範囲がよく、また
、反応系に少量の金属イオン、例えばＭｎ０７４、Ｃｏ
ｏ／！４等をＮ〜１０　ｍＭ程度添加すれば反応性に良
い結果を与える。

反応液からＬ−アミノ酸を分離するＫは、例えば菌体等
の不溶物を遠心分離等によシ除去後の上清を、Ｈ型強酸
性カチオン樹脂に通しＬ−アミノ酸を吸着後、アンモニ
ア水で溶出し、更に濃縮、冷却してＬ−アミノ酸を結晶
で得ることができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によシ更に具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。なお、特に
断わらない限り、各例中の％は重量％である。

実施例１ グルコースα５％、酵母エキスα２９ｂ、Ｉ）ン酸水素
二ナトリウムα１％、リン酸二水素カリウムｎ、ｏｓｌ
、硫酸マグネシウムＣＬＯ５％を含む培地（ｐＨ７５）
５−を試験管に分注し、１２０℃で１５分間滅菌した。

これに別に殺菌し７’ｃＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニル
アラニンを、最終濃度がα０５％になるように添加した
後、シュードモナス属ＤＫ−９１０菌を接種し、３０℃
で２４時間振とり培養した。この培養液より１　　　菌
体を遠心分離して集め、同量の生理食塩水で洗浄後、各
別に下記第１表に記載のＬ−Ｎ−カルバミルアミノ酸α
１Ｍ及び塩化マンガン（１５ｍＭを含むＮＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）５−中に懸濁させ、３５℃で１０
時間反応させた。［ｔｅｌ生成物をバイオアッセイ〔フ
ェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、グルタミ
ン酸、インロイシン及びバリンの定量には、ラクトバチ
ルス・アラビノザス（Ｌａｃｔｏｂａａｉｌｌｕｓａｒ
ａｂｉｎｏｓｕｓ　）ムＴＯＯ８０１４を、またヒスチ
ジン及びセリンの定量にはストレプトコッカス・ファエ
カリス（８ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｊｃａｌｉ
ｓ　）ムＴｏ。

８０４３　　を用いた〕とＨＰＬＯによシ定量し九結果
を第１表に示す。両分桁値が一致したことから、いずれ
の場合も、目的生成物は相当するＬ−アミノ酸と確認し
た。

第　　１　　表 実施例２ 培地１００ｗＩｔを含む５００＋ｄ容の三角フラスコを
用いる以外は実施例１と同様に培養して得た菌体を、下
記第２表に記載のＤＬ−Ｎ−カルノくミルアミノ酸α２
Ｍ及び塩化マンガン１　ｍＭを含む０．１　Ｍ　）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）１００−中に懸濁させ、５０
℃で２０時間反応させた。

遠心分離による除菌後の上清を、強酸性カチオン樹脂ア
ンバーライトエＲ−１２０（Ｈ型、ロームアンドハース
社製）に通し吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水
で溶出させた。濃縮後、冷却して結晶を析出させた。こ
れを再結晶し、乾燥して、ＨＰＬＯ％ＴＬＯ，バイオア
ッセイ、ＮＭＲ及び旋光度分析を行ったところ、第２表
に示すように、各相補するＬ−アミノ酸の標品と一致す
ることを確認した。

第　　２　　表 Ｎ５Ｎ塩酸溶液 実施例３ 実施例１におけるＤ１．＋−Ｎ−カルバミルアミノ酸な
Ｌ−Ｎ−カルバミルアミノ酸に変えた以外は実施例１と
同様な操作を行って、和尚するＬ−アミノ酸の結晶を得
た。これらの分析結果は、標品のＬ−アミノ酸と一致し
喪。結果を下記第３表に示す。

第　　３　　表 実施例４ 実施例２と同様にして得た洗浄掬体を、塩化マンガン１
　ｍＭを含む（ＬＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ２Ｏ）２
０ｄ中に懸濁させた。この懸濁液を、水冷下において、
２０　ｋＨｚの超音波で３分間３回処理して、菌体破砕
液を調髪した。こ（ＤｉＫ、ＤＬ−４１−カルバミルフ
ェニルアラニンをα２ＭＫなるように添加し、３０℃で
２０時間反応させた。反応後、不溶物を遠心除去して得
た上清中のアミノ酸を、ＨＬＰ　Ｏ及びバイオアッセイ
した結果、生成物は、Ｌ−フェニルアラニンと確認した
。

実施例５ 実施例１と同様に３０℃で２４時間培養した培養液に、
ＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンを０，１Ｍにな
るように添加し、３０℃で更に２０時間振とうを続けた
。遠心分離による除菌後の上清中のアミノ酸を、ＨＬＰ
Ｃ！及びバイオアッセイした結果、生成物はＬ−フェニ
ルアラニンと確認した。

〔発明の効果−〕

以上説明したように、本発明によれば、各種のＮ−カル
バミルアミノ酸のＬ一体を、シュードモナス属微生物に
より、効率良く、相当するＬ−アミノ酸に変換すること
かで−きる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−Ｎ−カルバミルアミノ酸のカルバミル基を不斉
   的に加水分解する能力を有するシュードモナス属微生物
   の培養液、菌体又は菌体処理物を、下記一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼…〔 I 〕 （式中Ｒは、式▲数式、化学式、表等があります▼、▲
   数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼
   、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼、又は▲数式、化学式、表等がありま
   す▼ で表される基を示す）で表されるＮ−カルバミルアミノ
   酸のＤＬ−体又はＬ−体に作用させ、生成した相当する
   Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸
   の製造方法。