DK144946B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af sulfonater af s-adenosyl-l-methionin - Google Patents

Description

as) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (in 1^946Β

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET _ (21) Ansøgning nr. 3153/75 (51) lnt.Cl.a C 07 H 19/16 (22) Indleveringsdag 11· jul. 1975 (24) Løbedag 11 · Jul. 1975 (41) Aim. tilgængelig 13· jan. 1976 (44) Fremlagt 12. jul. 1982 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 12. jul. 1974, 25128/74, IT

(71) Ansøger BIORESEARCH NETHERLAND B.V., 3011 BH Rotterdam, NL.

(72) Opfinder Alberto Fiecchi, IT.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Analogifremgangsmåde til frem·* stilling af sulfonater af S-a« denosyl-L-methionin.

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte sulfonater af S-adenosylmethionin (SAM), nærmere betegnet salute af SAM og organiske sulfonsyrer eller blandede salte af SAM, organiske sulfonsyrer og svovlsyre, hvorved man går ud fra et SAM-picrolonatt opnået ved fremstilling af en koncentreret vandig opløsning af SAM og udfældning af det i opløsningen tilstedeværende SAM med en mættet opløsning af picrolonsyre i vand eller i et organisk opløsningsmiddel, CD som er opløseligt i vand.

LO

rj) SAM er et produkt af naturlig oprindelse, der findes i alle levende tt organismer fra bakterier til planter, fra éncellede organismer til r— * □ 2 U4946 højere pattedyr omfattende mennesket, og strukturen, der har været kendt et stykke tid, er som følger: nh2 ΤΠ CH, NHo I i 3 I 2

CH-CH-CH-CH-CHo-S-CHo-CH9-CH-COOH

II 2 2 2 OH OH -0--

X

hvori X er en generisk anion.

I levende organismer dannes SAM ved intervention af enzymer (S-adenosylmethioninsynthetase eller S-adenosyltransferase) i den cytoplasmiske ambit ud fra methionin, der optages med næringsmidlerne, eller fra ATP, der er til stede som energireserve i enhver levende celle.

Det har været kendt i nogen tid, at SAM er et produkt af fundamental vigtighed i et større antal biologiske reaktioner i forbindelse med enzymatisk transmethylering, og det har derfor altid været anset som et meget vigtigt reagens inden for biokemien.

Det store problem med dette stof har imidlertid altid været dets store.ustabilitet ved eller over stuetemperatur, og dets fremstillingsmetoder, som er besværlige og ikke let kan udføres i industriel målestok.. · I de senere år har forskningen inden for dette område været rettet mod at stabilisere SAM i en sådan grad, at det kunne anvendes inden for den biologiske forskning. Man har således søgt at fremstille salte, som er stabile under normale temperatur- og fugtighedsbetin-gelser. På denne måde er chloridet og sulfatet af SAM blevet fremstillet, men de kan kun anvendes som reagenser inden for biokemien og kun i meget kort tid, fordi de selv i tør tilstand kun har en begrænset stabilitet ved lave temperaturer. Endvidere er fremgangsmå- 3 144946 derne til fremstilling af disse salte kun velegnede til fremstilling af små mængder, men bestemt ikke til fremstilling af produktet i industriel målestok.

Fra dansk patentansøgning nr. 4227/73 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af et SAM-tri-p-toluensulfonat, som er meget mere stabilt end sulfatet, og i dansk patentansøgning nr. 3429/74 er beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af dobbeltsalte af SAM med svovlsyre og p-toluensulfonsyre, som er ubegrænset stabile ved stuetemperatur .

Det har nu overraskende vist sig, at man kan fremstille hidtil u-kendte salte af SAM, der er absolut stabile med tiden ved temperaturer op til 45° C, ved en tilsvarende fremgangsmåde, der nemt og økonomisk kan udføres i industriel målestok, og som tilmed giver høje udbytter. Disse salte har overrraskende vist sig at være i besiddelse af stærk kurativ virkning inden for mange områder af den humane terapi, ofte tilsyneladende uden korrelation mellem disse områder.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Der var ikke på forhånd grund til at tro, at de simple sulfonater og sulfat/sulfonat-dobbelssalte af SAM, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ville have en bedre stabilitet end det kendte tri-p-toluensulfonat og en lige så god stabilitet som de i ans. nr. 3429/74 omhandlede sulfat/p-toluensulfonat-dobbeltsalte. Faktisk er begge de først kendte salte af SAM, nemlig chloridet og sulfatet, afledt af stærke mineralsyrer, men deres stabilitet er helt forskellig, selv om begge er ustabile ved stuetemperatur. Endvidere er tri-p-toluensulfonatet af SAM meget mere stabilt end sulfatet, men mindre stabilt end sulfat/p-toluensulfonat-dobbeltsal-tet.

Det eneste der kunne udledes heraf på ansøgningstidspunktet var, at stabiliteten af SAM-salte hverken afhænger af den saltdannende syres styrke eller dens struktur. Når disse muligheder var udelukket, fandtes der ingen måde at forudsige noget om stabiliteten af 4 144946 andre salte.

Man antager nu, at stabiliteten af SAM-salte afhænger af arrangementet af SAM-molekylerne i det faste salts krystalmønster. Men da en sådan fordeling af molekylerne i krystalmønstret er helt ukendt for alle de hidtil fremstillede salte, og da der ikke kendtes nogen metode til at bestemme den eller i det mindste give en eller anden ide om den, er det klart, at fagmanden ikke havde nogen mulighed for at udlede noget om muligheden af at fremstille andre stabile salte af SAM. Det må også tages i betragtning, at alle de sul-fonsyrer, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er forskellige fra p-toluen-sulfonsyre i form og størrelse.

De hidtil ukendte salte, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er salte af SAM og sulfonsyrer svarende til formlen SAM.4RS0^H, hvori RSO^H er en af følgende syrer tmethansulfonsyre, ethansulf onsyre, 1-n-dodecansulfonsyre, 1-n-octadecansulfonsyre, chlorethansulfonsyre, 2-bromethansulfonsyre, 2-hydroxyethansulfonsyre, 3-hydroxypropansulfonsyre, d, 1- og d,l-10-campher-sulfonsyre, d-, 1-og d,1-3-bromcampher-lO-sulfonsyre og cysteinsyre. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles også salte af SAM med sulfonsyre svarende til den almene formel SAM.3R, hvori RSO^H er en af følgende syrer: benzensulfonsyre, p-chlorbenzensulfonsyre, 2-mesitylbenzen-sulfonsyre, 4-biphenylsulfonsyre, 1-naphthalensulfonsyre, 2-naphthalen-sulfonsyre, 5-sulfosalicylsyre og p-acetylbenzensulfonsyre. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles også salte af SAM med følgende syrer: 1,2-ethandisulfonsyre, svarende til formlen SAM. 2C2H4(SO^H) 2, o-benzendisulfonsyre, svarende til formlen SAM.1,5C6H4(S03H)2, og chondroitinsvovlsyre svarende til formlen SAM.4C14H21N014S.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles endvidere dobbeltsalte af SAM med svovlsyre og enhver af de foregående sulfonsyrer, svarende til de almene formler SAMf.HS04“.H2S04.RS03H og SAM+.HS04“.H2S04.2RS03H, hvori RS03H betyder enhver af de førnævnte sulfonsyrer eller repræsenterer den ækvivalente syre i tilfældet: med ethandisulfonsyre, o-ben- 5 144946 zendi sulf onsyre eller chondroi tinsvovl syre..

Det store tekniske fremskridt, der opnås med disse hidtil ukendte salte, er deres stabilitet ved temperaturer op til 45° C i tør tilstand. SAM-indholdet i alle syrerne forbliver uændret, selv efter 360 dage ved 45° C i tør tilstand. De to mest stabile salte af SAM, der kendes til dato, nemlig chloridet og sulfatet, viser et SAM-indhold efter 30 dage ved 45° C i tør tilstand på henholdsvis 20 og 50 pct. Efter 60 dage er det førstnævnte fuldstændig dekomponeret, medens sulfatet kun indeholder 5 pct. af den oprindelige SAM-mængde.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de hidtil ukendte sulfonsyresalte består i det væsentlige af følgende trin: (a) Fremstilling af en opløsning rig på SAM, enten ved ekstraktion fra naturlige kilder, der indeholder produktet, eller ved enzymatisk syntese fra adenosintriphosphat (ATP) og methionin.

(b) Udfældning af SAM til stede i den filtrerede vandige opløsning ved hjælp af en mættet vandig opløsning af picrolon-syre eller med opløsninger af samme syre i organiske opløsningsmidler, der er opløselige i vand, såsom methyl", ethyl", propyl", isopropyl", n-butyl· eller isobutylalkohol eller acetone, methylethylketon, methylisobutylketon, ethylacetat, tetrahydrofuran, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol, dioxan eller dimethylformamid.

(c) Opløsning af det frafiltrerede bundfald i en opløsning af en de førnævnte sulfonsyrer i en alkohol, såsom methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, sek-butanol eller 2-methoxyethanol eller 2-ethoxyethanol.

(d) Tilsætning til opløsningen af et organisk opløsningsmiddel, der er blandbart med den anvendte alkohol, såsom benzen, toluen, diethylether, diisopropylether, acetone, methylethylketon, methylisobutylketon, ethyl- eller methylacetat, tetrahydrofuran eller chloroform.

6 U4946 (e) Fraskillelse af den organiske væske og genopløsning af bundfaldet i en opløsning af syren anvendt i trin (c) i en af de alkoholer, der blev anvendt i trin (c), og behandling af opløsningen med aktivt kul.

(f) Tilsætning til opløsningen af et organisk opløsningsmiddel, der er i stand til at udfælde det rene SAM-salt i en krystallinsk og let filtrerbar form, hvilket opløsningsmiddel vælges blandt de, der er angivet under trin (d).

De første to trin i fremgangsmåden til opnåelse af dobbeltsaltene med svovlsyre, er identiske, medens de påfølgende trin kan udføres som følger: (c') Opløsning af det filtrerede bundfald i en blanding bestående af lige volumendele af et opløsningsmiddel, der er delvis blandbart med vand, såsom methylethylketon, methyl-isobutylketon, n-butanol eller isobutanol, og en vandig opløsning med lige store normaliteter af en af de førnævnte sulfonsyrer og svovlsyre.

(df)‘ Fraskillelse af den organiske fase og tilsætning til den vandige opløsning af en keton eller en alkohol, der er fuldstændig opløselig i vand.

(er) Fraskillelse af den vandige væske og genopløsning af bundfaldet i en 10-20 pct. opløsning af syren anvendt under (c') i et af de alkoholiske opløsningsmidler i trin (c) og behandling med aktivkul.

(f) Tilsætning af et organisk opløsningsmiddel, der er i stand til at udfælde det rene SAM i en krystallinsk og let filtrerbar form.

Ifølge en udførélsesform for opfindelsen opnås dobbeltsaltene ved at underkaste de simple salte, der opnås efter førnævnte trin (d) følgende behandlinger: 7 144946 (e’’) Genopløsning af bundfaldet i en vandig opløsning med lige store normaliteter af svovlsyre og syren anvendt i trin (c) og behandling af opløsningen med aktivkul.

(fM) Tilsætning af et organisk opløsningsmiddel, der er i stand til at udfælde det rene SAM-salt i en krystallinsk og filtr erbar form.

Som anført før kan trin (a) i fremgangsmåden udføres på forskellige måder, der er lige effektive til at opnå en koncentreret opløsning af SAM.

Ifølge et alternativ kan gær (Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis etc.), der er beriget med SAM ved tilsætning af methionin under egnede betingelser (Schlenk, Enzymologia 29, 283 (1965), behandles med ethylacetat og dernæst med svovlsyre med en normalitet på 0,1 - 0,5, fortrinsvis 0,35 N,ved stuetemperatur, hvorved der iværksættes en lysis af cellerne, hvorved praktisk taget 100 pct. af det tilstedeværende SAM går i opløsning. Fortrinsvis anvendes mængder af vand og acetat imellem 1/20 og l/5 af vægten af fugtige celler, og behandlingen foretages i 15 -45 minutter, fortrinsvis 30 minutter.

Svovlsyre tilsættes, og lysen udføres yderligere i 1-2 timer, fortrinsvis 1,5 timer. Det må bemærkes, at lysen af gærcellerne, der udføres med en blanding af et organisk opløsningsmiddel og fortyndet svovlsyre, er mere bekvemt end den behandling, man normalt udfører med perchlorsyre ved stuetemperatur eller med myresyre og eddikesyre ved 60° C og lignende, idet behandlingen ikke a-1 ene finder sted ved stuetemperatur, der er meget favorabel for stabiliteten af SAM, men Også udføres under sådanne betingelser, at opløsningen nemt kan filtreres fra den cellulære remanens og ikke indeholder nogen urenheder, der er til stede i de andre reagenser, der anvendes. Disse uienheder er vanskelige at f.lerne ved kendte metoder til fremstilling af rent SAM. ifølge et andet alternativ udføres trin (a) ved at fremstille SAM ved enzymatisk 8 U4946 syntese ved indvirkning af enzym et ATP-methionin-adenosyltransfe-ras.e (E.C. 2.4.2.12)på en inkubationsblanding bestående af. adenosyltriphosphat (ATP) og methionin.

De væsentligste betingelser for den industrielle udførelse af denne metode er, at enzymet er rent og i en form, der nemt kan isoleres, både fra den oprindelige inkubationsblanding og fra det fremstillede SAM.

Ansøgeren har imidlertid fundet en fremgangsmåde til rensning af enzymet ATP-methionin-adenosyltransferase ved affinitetskromatografi og en kolonnereaktionsmetode, der gør det muligt at opnå de ovennævnte mål.

Affinitetskromatografi af det specifikke enzym udføres ved percolation af en opløsning indeholdende en rå ekstrakt af gær eller "Escherichia coli", igennem en kolonne fyldt med et fast bærer s tof, hvortil en gruppe, der virker som en konkurrerende inhibitor på enzymet, er blevet bundet kovalent.

Det har overraskende vist sig, at et særdeles fremragende fyldstof til en sådan oprensningskolonne består af en aktiveret gel af polysaccharider, hvortil L-lysin er kovalent bundet. Affiniteten af det specifikke enzym for lysin-remanensen bundet til den faste matrix forårsager en forsinkelse af elueringen af enzymet i kolonnen, og det er således muligt at opnå adskillelse fra andre proteiner i meget ren form.

Imidlertid har adskillelse af enzymet fra det eluat, der indeholder det med henblik på anvendelse i den påfølgende enzymatiske syntese, givet fuldstændig utilfredsstillende resultater, fordi enzymet, når det en gang er adskilt, taber stabilitet, og herudover blev det efter anvendelse kun én gang i syntesen af SAM ødelagt ved den påfølgende SAM-isolering.

Ansøgeren har imidlertid fundet, at glimrende resultater opnås ved derimod at absorbere eluatet indeholdende det specifikke enzym på et egnet fast bærerstof og ved at udføre en katalytisk reaktion mellem methionin og ATP i kolonnen, hvilket fører til dan- 9 144946 nelsen af SAM. En egnet fast bærer består i et polysaccharid aktiveret ved et reagens, der er egnet til at binde proteiner til faste bærerstoffer, såsom oyanbromid.

Ved percolering af en opløsning af ATP og methionin i en egnet Pufferopløsning igennem kolonnen opnås et eluat, der indeholder SAM forneden i kolonnen.

Trin (b) i den omhandlede proces gør det muligt at fremstille SAM i meget ren tilstand. Faktisk er den eneste forbindelse, der fældes af picrolonsyre i sure omgivelser, .SAM, hvilket vises ved tyndtlagskromatografi ifølge Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971).

Picrolonsyre har således en ekstrem og overraskende selektiv virkning. De andre bundfældende midler, der har været tilsat indtil dato, såsom picrinsyre, Reinecke-salt eller borsyre, giver meget urene bundfald, der altid kræver påfølgende oprensning af SAM ved ionbytningskolonnekromatografi, en proces, der er ekstremt kostbar og vanskelig at udføre industrielt. Det er også vanskeligt at opnå et produkt med den nødvendige renhedsgrad.

Anvendelsen af vandige opløsninger af picrolonsyre eller opløsninger af denne syre i førnævnte organiske opløsningsmidler, frembyder ikke nogen særlige problemer, og er en operation, der udføres ved stuetemperatur.

Trin (c) udføres fortrinsvis med opløsninger indeholdende en af ovennævnte sulfonsyrer i koncentrationer på 0,25 - 1»5 N, fortrinsvis IN, og med en af de anførte alkoholer. Nedbrydningen af SAM-pi-crolonatet er fuldstænding, hvilket den totale opløsning af det faste stof viser.

Trin (d) i processen udføres ved fortrinsvis at anvende 4-10 volumen (med hensyn til volumenet af den alkoholiske opløsning) af et opløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående af benzen, toluen, diethylether, diisopropvlether. acetone, methylisobutyl-keton, methyl- eller ethylacetat eller tetrahydrofuran.

10 144946

Trin (e) i processen danner med det påfølgende trin (f) den endelige tilberedning for at opnå det krævede SAM-salt. Dette salt, der kommer fra det tidligere trin (d), opløses i en opløsning med en normalitet på 0,1 - 0,5, fortrinsvis 0,2 N, af syren, der anvendtes i det tidligere trin (c), i et opløsningsmiddel valgt fra alkoholerne indeholdende 1-4 carbonatomer, 2-itiethoxyethanol og 2-ethoxyethanol.

Det påfølgende trin (f) udføres ved fortrinsvis at anvende 4-8 volumen (med hensyn til volumenet af den alkoholiske opløsning) af et organisk opløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående af benzen, toluen, diethylether, diisopropylether, acetone, methyl-ethylketon, methylisobutylketon, methylacetat, ethylacetat, tetra-hydrofuran og chloroform.

De simple SAM-salte opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opbevares næsten uendelig lang tid i tør tilstand uden ændring .af aktiviteten som allerede anført. Den omhandlede fremgangsmåde udelukker vand i alle trin før fældningen med picrolon-.syre, hvilket sikrer en fuldstændig udelukkelse af minimale spor af urenheder, der er opløselige i vand.

Dobbeltsalte af SAM med svovlsyre og en af de førnævnte sulfonsyrer opnås ved fortrinsvis at udføre trin (c·) med vandige opløsninger indeholdende en af førnævnte sulfonsyrer og svovlsyrer i koncentrationer af begge på mellem 0,05 og 0,2 N, fortrinsvis 0,1 N, i et organisk opløsningsmiddel, der delvis er blandbart med vand, såsom methylethylketon eller n-butanol. Anvendelsen af det or-'ganiske opløsningsmiddel gør det muligt at reducere den vandige syreopløsning meget, og i praksis kan man herved eliminere al pi-crolonsyren. Trin (d1) i fremgangsmåden udføres ved fortrinsvis at anvende 4-8 volumen (med hensyn til volumenet af den vandige opløsning) af et opløsningsmiddel udvalgt blandt acetone, methylalkohol, ethylalkohol og propylalkohol.

Det har også overraskende vist sig, at hvis der i trin (e1) anvendes den minimale mængde alkohol, der er nødvendig for at opløse bundfaldet fra trin (d'), udfældes dobbeltsaltet SAM+.HS0^”.H2S0^.2RS03H i det påfølgende udfaldningstrin (f).

11 144946

Hvis der derimod anvendes et volumen alkohol, der er mindst dobbelt så stort som det nødvendige volumen i trin (e')f udfældes dobbeltsaltet SAM^HSO^.^SO^. RS03H i det påfølgende udfældningstrin (f)·

Anvendelsen af mængder af alkohol imellem disse to yderpunkter fører til dannelse af blandinger af de to salte.

RSO^H indikerer enhver af de foregående sulfonsyrer eller den ækvivalente syre, når det drejer sig om ethandisulfonsyre eller chondroitin. svovlsyre.

Den endelige udfældning af et af de hidtil ukendte salte ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (trin f) kræver anvendelsen af et organisk opløsningsmiddel udvalgt blandt benzen, toluen, diethyl-ether, diisopropylether, chloroform, acetone, methylethylketon, methylisobutylketon, methyl eller ethylacetat, isoamylalkohol eller tetrahydrofuran.

Som anført kan dobbeltsaltene af SAM opnået ifølge den foreliggende opfindelse holde sig i ubegrænset tid i tør tilstand praktisk taget uden ændring.

Fremstilling af dobbeltsalte af SAM med svovlsyre og en af de førnævnte sulfonsyrer ifølge den anden variation består i at genopløse (trin e") saltet opnået i trin (d) i en opløsning, af lige normaliteter, sædvanligvis mellem 0,5 og 0,2 N og fortrinsvis 0,1 N af svovlsyre og syren anvendt i det foregående trin (c) i en alkohol indeholdende 1-4 carbonatomer eller i 2-methoxyethanol eller 2-ethoxyethanol.

Det har også vist sig, at hvis der i trin (e1') anvendes den minimale mængde alkohol, som er nødvendig til at opløse bundfaldet fra trin (d), udfældes dobbeltsaltet SAM+.HS04_.H2S04.2RS03H (hvor RSO^H angiver enhver af sulfonsyreme eller repræsenterer den ækvivalente syre, nemlig ethandisulfonsyre eller chondroi-tinsvovlsyre) i det påfølgende udfældningstrin (f").

Hvis der derimod i trin (e") anvendes et volumen methanol, der er mindst dobbelt så stort som det nødvendige volumen, udfældes SAM** 12 144946 HSO^.HgSO^.RSO^H i det påfølgende udfældningstrin (f")·

Anvendelsen af mængder alkohol imellem disse to yderpunkter fører til dannelse af blandinger af de to salte.

Den endelige udfældning af et af dobbeltsaltene (trin f’1) kræver anvendelsen af et organisk opløsningsmiddel udvalgt blandt benzen, toluen, diethylether, diisopropylether, chloroform, alkoholer med 4-5 carbonatomer, ethyl- og methylacetat, tetrahydro-furan, acetone, methylethylketon og methylisobutylketon.

Følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de omhandlede salte.

EKSEMPEL 1

Til 90 kg gær beriget med SAM (6,88 g/kg) ifølge Schlenk (Enzymolo-gia 29, 283 (1965)) sattes 11 liter ethylacetat og 11 liter vand ved stuetemperatur. Efter energisk omrøring i 30 minutter tilsattes 50 liter 0,35 N svovlsyre, og omrøringen fortsattes yderligere 1,5 timer. Efter filtrering og vask med vand opnåedes 140 liter opløsning indeholdende 4,40 g/l af SAM svarende til 99j5 pct. af den mængde, der var til stede i udgangsmaterialet.

En opløsning af 2,3 kg picrolonsyre i 25 liter methylethylketon sættes til den første opløsning under omrøring. Efter henstand 'natten over frasepareres bundfaldet ved centrifugering og vask med vand.

Bundfaldet opløses under omrøring ved stuetemperatur i 6,2 liter IN opløsning af methansulfonsyre i methanol. Efter filtrering af spor af uopløseligt materiale tilsættes 50 liter acetone til opløsningen. Efter fuldstændig sedimentation af bundfaldet dekanteres det ovenstående væskelag, og den uopløselige rest vaskes med en lille smule acetone. Bundfaldet opløses i 25 liter 0,,25 N opløsning af methansulfonsyre i methanol, der tilsættes aktivt kul, og opløsningen filtreres. Der tilsættes 125 1 methylisobutylketon til filtratet.

13 144946

Der udfældes 1089 g af et krystallinsk let filtrerbart salt, der har en opløselighed på mere end 20 pct. i vand under dannelse af en farveløs opløsning. Saltet er kun opløseligt i ringe grad i de sædvanlige organiske opløsningsmidler. Fra tyndtlagskromato-grafi ifølge Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) vises produktet at være frit for nogen urenheder. De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer overens med en forbindelse med formlen: C15H23N605S.4CH403S.

Den nye forbindelse a· også identificeret ved en enzymatisk metode, baseret på enzymatisk methylering af nicotinamid og guanidinoed-dikesyre med SAM (G.L. Cantoni, J. Biol. Chem. 189, 745 (1951)i G. De La Hoba, B.A. Jamieson, S.H. Mudd and H.H. Richards, J.

Am. Chem. Soc. 81 3975 (1959))·

Ved at gentage fremgangsmåden, men under anvendelse af n-dodecan-sulfonsyre og 1-n-octadecansulfonsyresalte opnås salte med følgende formler: C15H23N6°5S*Z|'C14H2603S c15H23N6°5S· ^18¾^ og de analytiske data, der er anført i tabel 1.

EKSEMPEL 2 1,15 kg picrolonsyre opløstes i 10 liter isobutylalkohol og sattes til 70 1 af en opløsning bestående af lyserede gærceller opnået under anvendelse af samme råmateriale og samme metode som i eksempel 1.

Efter henstand natten over blev bundfaldet separeret fra ved centrifugering .

Bundfaldet blev opløst ved stuetemperatur under omrøring i 3,1 liter IN opløsning af ethansulfonsyre i ethanol. Efter filtrering af en lille mængde af uopløseligt stof tilsattes 25 1 diethyl-ether til opløsningen. Efter henstand filtreredes blandingen og 14 144946 det faste stof vaskedes med en lille smule ether. Det faste stof blev opløst i 12,5 1 af en 0,25N opløsning af ethansulfon-syre i ethanol, der tilsattes aktivkul, og blandingen filtreredes. 63 liter benzen blev sat til filtratet.

Der udfældedes 585 g salt, som blev frafiltreret og tørret. Opløseligheden af forbindelsen i vand er mindst 20 pct., og den er kun en lille smule opløselig i de sædvanlige organiske opløsningsmidler. Ved tyndtlagskromatografi som i eksempel 1 viste forbindelsen sig at være fri for nogen urenheder. De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer med et produkt med formlen: C15H23W6°5S* 4C2H6°3S-

Den nye forbindelse blev også identificeret ved enzymatiske metoder anført i eksempel 1.

Ved at gentage fremgangsmåden på samme måde, men under anvendelse af 2-bromethansulfonsyre og 2-chlorethansulfonsyre, opnåedes salte med følgende formler henholdsvis: ^15^23^6^5^ *4^2^5^3®r °g ^15^23^6^5^ * 4^2^5^3^ 'hvis analytiske data er givet i tabel 1.

EKSEMPEL 5 1,15 kg picrolonsyre opløst i 12 liter n-butanol sattes til 70 liter af en opløsning, der kom fra lyserede gærceller opnået ved samme metode som råmaterialet i eksempel 1. Efter henstand natten over blev bundfaldet separeret fra ved centrifugering. Bundfaldet blev opløst ved stuetemperatur under omrøring i 3,1 liter af en IN opløsning af d,1-10-camphersulfonsyre i 1-propanol.

25 liter benzen tilsattes. Det fraseparerede faste stof opløstes i 12,5 liter 0,25N opløsning af camphersulfonsyre i 1-propanol, og efter tilsætning af aktivkul og filtrering sattes 63 liter acetone til filtratet. Der opnåedes 928 g salt. Opløseligeheden af forbindelsen i vand er mindst 20 pct., og den er kun opløselig 15 U4946 i de sædvanlige organiske opløsningsmidler i ringe grad. Fra tyndtlagskromatografi viste forbindelsen sig at være fri for nogen urenheder.

De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer overens med et produkt med formlen: c15H23N6°5S* ^C10H16°4S· '

Den nye forbindelse blev også identificeret ved enzymatisk metode som anført i eksempel 1.

Ved at gentage fremgangsmåden på samme måde under anvendelse af d-3-bromcampher-10-sulfonsyre opnåedes et salt med formlen; 015H23N605S-4C10%504SBr hvis analytiske data er givet i tabel 1.

EKSEMPEL 4

Oprensning_af_det_sgecifikke_enzYm 50 ml Sepharose"(polysaccharid fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) suspenderet i vand, behandles med cyanbromid ifølge kendte metoder til binding af substanser, der indeholder aminogrupper, til matricer bestående af poly-saccharidgel. Et overskud af L-lysin tilsættes til den således fremstillede gel. Efter reaktionen vaskes gentagne gange med destilleret vand, med en pH 8,5 puffer-blanding og med en pH 4,5-pufferblanding. Gelen anvendes derefter til pakning af en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en højde på 30 cm. En bufferblanding af 0,05M triethanolamin og 0,1N svovlsyre med et pH 8,0 ledes igennem kolonnen,indtil fuldstændig ligevægt er opnået.

2 ml gærekstrakt indeholdende det specifikke enzym opnået ved sonificering eller homogenisering med tøris og om muligt efter berigning med det specifikke enzym, anbringes i kolonnen. Kolonnen elueres derefter med den samme bufferblanding som anvendt ved ligevægtsindstillingen, hvorefter fordelingen af proteinerne 16 144946 vurderes ved ultraviolet spektrofotometrisk måling. Samtidig hermed måltes synthetasisaktiviteten i de forskellige fraktioner ifølge J.A. Stekol, Methods in Enzymology, vol. 6, page 566 (1963). De fraktioner, der udviste en relevant synthetasisakti-vitet, blandes sammen, og opløsningen viser en specifik aktivitet, der er mindst er tyve gange større end rå ekstrakt.

Enzymet kan yderligere koncentreres i denne opløsning ved ufældning med salte, med organiske opløsningsmidler eller ifølge andre kendte metoder til koncentrering af proteinopløsninger.

Fremstilling_af_SAM

30 ml "Sepharose-gel aktiveres med cyanibromid eller ved en anden kendt metode til binding af proteiner til polysaccharid-gelmatricer. 4 ml af en opløsning af det specifikke enzym opren-.ses som ovenfor og indeholdende 100 mg af protein sættes til den aktiverede gel. Den aktiverede gelsuspension og enzymopløsningen omrøres ved 4° C i 18 timer. Harpiksen vaskes med vand. Denne vaskevæske indeholder 70 pot. af den totale enzymatiske aktivitet, der oprindelig var til stede i opløsningen. Ved at inkubere Sepharosen præpareret som ovenfor ved førnævnte metode til bestemmelse af synthetasis-aktiviteten, observeres det, at cirka 20 pct. af den totale aktivitet bindes til polysaccharidet.

Sepharosen fremstillet som ovenfor anvendes til pakning af kolonnen med en diameter på 1,5 cm og en'højde på 20 cm. En opløsning • indeholdende 0,675 M triethanolamin, 0,15 M magnesiumsulfat, 0,05 M ATP, 0,05 M M-methionin og 0,01 M kaliumchlorid ledes igennem kolonnen med en hastighed på 5 ml pr. time og ved en temperatur på 25-27° G.

Eluatetfra kolonnen analyseres for SAM-indhold, og det viser sig, at omsætningen er-30 pct..

Fremstilling af SAM-p-chlorbenzensulfonat 103 ml af eluatet indeholdende 6 g/1 SAM gøres surt med svovlsyre, til et pH 3 nås, og til denne opløsning sættes under omrøring en opløsning af 2-3 g picrolonsyre i 25 ml methylethylketon. Efter henstand natten over filtreres'bundfaldet fra og vaskes med vand.

17 144946

Bundfaldet genopløses i 6,2 ml IN opløsning af p-chlorbenzensul-fonsyre 1 2-methoxyethanol.

50 ml toluen tilsættes herefter. Det fraseparerede faste stof opløses i 12,5 ml af en 0,25 N opløsning af p-chlorbenzensulfon-syre i 2-methoxyethanol, og efter tilsætning af aktivkul og filtrering tilsættes 60 ml chloroform til filtratet.

Der opnås 1,45 g af saltet. Forbindelsen har en opløselighed på mindst 20 pct. i vand og er kun opløselig i ringe grad i de sædvanlige organiske opløsningsmidler. Fra tyndtlagskromatografi vises det, at saltet er frit for nogen urenheder.

De analytiske data er givet i tabel 5 og stemmer overens med en forbindelse med formlen: ^15^23^6^5^’ 30gH^C10^S.

Den nye forbindelse blev identificeret ved enzymatisk metoder beskrevet i eksempel 1.

Ved at gentage fremgangsmåden på samme måde under anvendelse af p-acetylbenzensulfonsyre, o-benzendisulfonsyre, 4-bipheny1sulfonsyre, 2-mesitylensulfonsyre og 5-sulfosalicylsyre opnås salte med følgende formler: C15H23N6°5S· 3Q8H8°4S * C15H23N6°5S*1·5 C6H6°6S2 C15H23N6°5S· 3C12%0°3S ' ’ Cl5H23N605S-3CA2°3S i C15H23N6°5S* og de analytiske data er givet i tabel 1» EKSEMPEL 5

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 70 liter af en opløsning som i eksempel 1 opløstes ved stuetemperatur 18 144946 under omrøring i 3,1 liter af en IN opløsning af 1,2-ethandisul-fonsyre i methanol.

Der tilsattes 25 liter acetone. Det fraseparerede faste stof opløstes i 12,5 liter af en 0,25N opløsning af 1,2-ethandisul-fonsyre i methanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering tilsættes 60 liter methylisobutylketon til filtratet.

Der opnås 546 g salt. Opløseligheden er mindst 20 pot. i vand, og der er kun en ringe opløselighed i de organiske opløsningsmidler. Af tyndtlagskromatogrammet ses, at forbindelsen er fri for urenheder,

De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer med en forbindelse med formlen: C15H23H6°5S· ZtyjgOgS,,.

Den nye forbindelse blev også identificeret ved enzymatisk metode beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 6

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 70 liter opløsning som i eksempel 1 opløstes ved stuetemperatur under omrøring i 3,1 liter af en IN opløsning af 2-hydroxyethansulfon-syre i ethanol.

Der tilsattes 25 m methylisobutylketon. Det fraseparerede faste stof opløstes i 12,5 liter af en 0,25N opløsning af 2-hydroxy-ethansulfonsyre i ethanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering sattes 80 liter tetrahydrofuran til filtratet. Der opnås 632 g af saltet. Forbindelsen er opløselig i vand i mere end 20 pct. og kun en lille smule opløselig i de sædvanlige organiske opløsningsmidler. Af tyndtlagskromatogrammet fremgår det, at forbindelsen er fri for urenheder.

19 144946

De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer med en forbindelse med formlen: C15H23N6°5S-4C2W· ·

Den nye forbindelse blev også identificeret ved den enzymatiske metode angivet i eksempel 1.

Ved gentagelse af fremgangsmåden på samme måde, men under anvendelse af 3-hydroxypropansulfonsyre, opnåedes et salt med formlen:

C15H23N6°5S· “jW

og de analytiske date er givet i tabel 1.

EKSEMPEL 7

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 70 liter af en opløsning som i eksempel 1 opløstes ved stuetemperatur under omrøring i 3,1 liter af en IN opløsning af 1-naphthalensulfonsyre i methanol.

25 liter af methylethylketon tilsattes. Det fraseparerede faste stof opløstes i 12,5 liter af en 0,25N opløsning af 1-naphtha.len-sulfonsyre i methanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering sattes 70 liter methylethylketon til filtratet. Der opnåedes 717 g salt. Opløseligheden var mere end 20 pct. i vand og kun ringe i organiske opløsningsmidler. Fra tyndtlagskromatogrammet kan ses, at forbindelsen er fri for urenheder. De analytiske data er givet i tabel 1 og svarer til et produkt med formlen: ci5h23n6°5s. sepoys.

Den nye forbindelse blev også identificeret ved den enzymatiske metode beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 8 20 υ Η4946

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 70 liter af en opløsning som i eksempel 1 opløstes ved stuetemperatur under omrøring i 3,1 liter af en IN opløsning af 2-naphthalen-sulfonsyre i 2-propanol.

Der tilsattes 25 liter diisopropylether. Det fraseparerede faste stof opløstes i 12,5 liter af en 0,25N opløsning af 2-naphthalen-sulfonsyre i methanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering sattes 70 liter ethylacetat til filtratet. Der opnåedes 710 g salt. Forbindelsen havde en opløselighed i vand på merend end 20 pct., men kun en ringe opløselighed i organiske opløsningsmidler. Af tyndtlagskromatogrammet fremgik, at forbindelsen var fri for urenheder, og de analytiske data for forbindelsen er angivet i tabel 1, og de svarer til et produkt med formlen: c15H23N6°5S· 3C10%03S.

Den ny forbindelse blev også identificeret ved den enzymatiske metode beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 9

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 70 liter ' af en opløsning som i eksempel 1 opløstes ved stuetemperatur under omrøring i 3>1 liter af en IN opløsning af benzensulfonsyre i 2-butanol. 25 liter diisopropylether tilsattes. Det fraseparerede faste stof opløstes i 12,5 liter af en 0,25 N opløsning af benzensulfonsyre i methanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering tilsattes 65 liter ethylacetat til filtratet.

Der opnåedes 612 g salt, der havde en opløselighed på mere end 20 pct. i vand, men kun en ringe opløselighed i de sædvanlige organiske opløsningsmidler. Af tyndtlagskromatogrammet fremgik, at forbindelsen var fri for urenheder.

21 144946

De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer med et produkt med formlen: °15H23n6°5s· ^6¾¾3 ·

Den nye forbindelse blev også identificeret ved den enzymatiske metode beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 10

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 103 ml af en opløsning som i eksempel 4 opløstes ved stuetemperatur under omrøring i 6,2 ml af en IN opløsning af chondroitinsvovl-syre i methanol. 50 ml acetone tilsattes.

Det fraseparerede faste stof opløstes i 25 ml af en 0,25N opløsning af chondroitinsvovlsyre i methanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering t il-satte s 125 ml methylisobutylketon til filtratet. Der opnåedes 3>27 g af et salt med en opløselighed på mere end 20 pct. i vand, men kun en ringe opløselighed i de. sædvanlige organiske opløsningsmidler. Fra tyndtlagskromatogrammet fremgik, at forbindelsen var fri for urenheder. De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer med et produkt med formlen: C15H23N6°5S- 4C14H21N014S*

Den nye forbindelse blev også identificeret ved den enzymatiske metode beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 11

Bundfaldet opnået efter tilsætning af picrolonsyre til 103 ml af en opløsning som i eksempel 4 opløstes ved stuetempratur under omrøring i 6,2 ml af en IN opløsning af cysteinsyre i 2-ethoxy-ethanol. 50 ml dimethylacetat tilsattes. Det fraseparerede faste stof opløstes i 25 ml af en 0,25N opløsning af cysteinsyre 22 144946 i 2-ethoxyethanol, og efter tilsætning af carbon og filtrering tilsattes 125 ml methylacetat til filtratet. Der opnåedes 1,53 g af saltet, der havde en opløselighed på mere end 20 pot. i vand, og som kun var opløseligt i ringe grad i de sædvanlige or-gasniske opløsningsmidler. Af tyndtlagskromatogrammet ses, at forbindelsen er fri for urenheder. De analytiske data er givet i tabel 1 og stemmer med et produkt med formlen; C15H23N6°5S- ^W°5S-

Den nye forbindelse blev også identificeret ved den enzymatiske metode beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 12

Fremstilling af dobbeltsalte af SAM med svovlsyre og methansulfonsyre 103 ml eluat indeholdende 6 g/l af SAM opnået som i eksempel 4 blev gjort surt med svovlsyre, indtil pH 3 var nået, og der tilsattes under omrøring en opløsning af 2,3 g picrolonsyre i 25 ml methylethylketon (opløsningsmiddel a).

Efter henstand natten over frafiltreres bundfaldet, og der vaskes med vand. Bundfaldet opløses i 18 ml af en 0,1 N vandig opløsning af svovlsyre og methansulfonsyre og i 18 ml methylethylketon (opløsningsmiddel a).

Efter omrøring og henstand skilles den organiske fase fra, og den vandige fase rystes med en lille mængde methylethylketon for at fjerne de sidste spor af picrolonsyre. Efter fraskillelse af det vandige lag tilsættes aktivkul, og blandingen filtreres. Der opnås 16,5 ml vandig farveløs opløsning, der indeholder 33,8 g/l af SAM svarende til 90 procent af den mængde SAM, der var i den oprindelige opløsning. Ved analyse ved tyndtlagskromatogra-fi viste opløsningen sig kun at indeholde SAM. De 16,5 ml opløsning hældes i 100 ml acetone (opløsningsmiddel b). Efter omrøring og 23 1449Λ6 henstand frasepareres væsken ved dekantering. Det faste stof opløses i 6,6 g af en 15 pct. opløsning af methansulfonsyre i methanol (opløsningsmiddel c).

Efter tilsætning af aktivkul og filtrering hældes opløsningen i 25 ml ethylether (opløsningsmiddel d). Der filtreres efter henstand, og der opnås et krystallinsk salt, der vejer 1,2 g og har følgende sammensætning: SAM+.HS04".H2S04.2CH3S03H.

De analytiske karakteristika er givet i tabel 2.

Ved gentagelse af fremgangsmåden på samme måde,men under anvendelse af sulfonsyrer og opløsningsmidler som anført i tabel 2, opnås dobbeltsalte som anført i tabel 2·med deres analytiske karakteristika.

Ved gentagelse af fremgangsmåden på sammé' måde* men under anvendelse af 3»3 g af en 15 pct. opløsning af methansulfonsyre i methanol og påfølgende udfældning med 25 ml ethylether (opløsningsmiddel d) opnås 1,05 g salt med sammensætningen: SAM+.HS04“.H2S04.CH3S03H, hvis analytiske karakteristika er givet i tabel 3.

Ved gentagelse af fremgangsmåden på samme måde, men under anvendelse af sulfonsyrer og opløsningsmidler som angivet i tabellen, opnås de dobbeltsalte, der er anført i tabel 3, med deres analytiske karakteristika.

EKSEMPEL 13

Fremstilling af dobbeltsalte af SAM med svovlsyre og 2-hydroxy-ethansulfonsyre__________________________________________

Saltet opnået fra første udfældning af SAM med 2-hydroxyethan- 144946 24 sulfonsyre som i eksempel 6 genopløses i 20 liter af en opløsning af 0,1N og 0,1N 2-hydroxyethansulfonsyre i methanol (opløsningsmiddel a). Der filtreres efter tilsætning af aktivkul, og 100 liter m e thy1is obutylketon (opløsningsmiddel b) sættes til filtratet. Blandingen filtreres efter henstand, og der opnås 587 g af et salt .med sammensætningen; SAM+.HS04“ H2S04.2C2Hg043 med de analytiske karakteristika angivet i tabel 4. Ved at gentage fremgangsmåden på samme måde, men under anvendelse af 10 liter af en opløsning af 0,1N svovlsyre og 0,1N 2-hydroxyethan-sulfonsyre i methanol (opløsningsmiddel a) og påfølgende udfældning med methylisobutyiketon (opløsningsmiddel b) opnås 505 g af saltet med sammensætningen:

SAM+.HS04“.H2S04.C2Hg04S

med de analytiske karakteristika givet i tabel 5· Ved at gentage fremgangsmåden på samme måde, men under anvendelse af simple SAM-salte, der indeholder anioner som angivet i tabel 5» og under anvendelse af opløsningsmidlerne angivet i tabel 5 opnås dobbeltsalte som anført i tabel 5 med deres analytiske karakteristika.

Ved at gentage metoden på samme måde, men under anvendelse af 3,3 g af en 15 pct. opløsning af p-toluensulfonsyre i methanol, opnås i det påfølgende udfældningstrin med 25 ml ethylether 1,18 g af saltet: SAM+.HS04“.H£S04.2CH3C6H4S0 H, der har samme karakteristika som dem, der er anført for produktet i eksempel 1.

25 144946 -j

a o 3 CO

CM

coco ir\ ιλ N η η ^ ^ S ^ it t 9 CM g (D W ® IS N m H CO MO 51 ^ 5 5 51

VO H HHHH HHHHHHHH

d

S^R

H

W

d vo co σ> m oo <r vo o o\ <r -j m <r o cm h &οσννο cti in in to o m H in vo cm os os cm vo m >*>·>·>·- ·- ·· ·>·-·· ·.·«*> ·> ~ *

U O VO CM IS- -ΐ Ο O IS- OM VO OS S- Η H

So mcMCM-ifn-d’mcM-crminmmmm-d·

< PP

co

"^."φ [^mCMt'-OSCMCMCMHinOHCOOOCM

ϋ m m is- h vo co in o oo m is- m h vo vo m Η Λ·*·*·»·»·*·***·*·** * * *“ * 3 ovo cm N <r o os <r m t> cm vo o is- ο h u* m cm cm <j· m <[ cm cm -j- m in m -ct m in <} d ino cm oo co os vo mmino-J-cMis-inp M 4 is CM o oo mo c~-ts-o OS VO 00 H in is Π) ««*·,·»·.·»·>·»·»» ·»·*·*·> (h oo os os m vo cm css is- cm vo h cm cm P ’5

Φ CM H HHHH HHHHHHCMH

W pq

^ Φ OH Ο CM 00 H mH in H VO CM IS- Η £S [A

Td m os in vo vo minoo cm o is- in vo o o m H §oocncomvoHcnls-cM'vOHCMC\ro5

J (¾ CM H HHHH HHHHHHCMH

PI

9 h dcMH-ct'Hooo^mHOOrømHCsopin m s vo coo cm inmn mosovo-d-osts-is- Λ) *»*. *s e> r. *» ·ν ·ν Λ ·,»>·% * ·ν

U Ο ΙΓ\ <ί* Ο ISCQVQ \Γ\ (J\ ϊ> Η IS 03 Ν Ο 0D

φ Η Η Η Η S pq _ρ φ η in CM CM ΙΑ CO ts- -d· H ino OS ° os r—l Os τι m in s to m m os h os^H-d'inosmis- H rv *v ·» ·* ·ν ·* ^ λ * *v ΛΛ·* »» ·ν 3 o in <f cn is- co minoo fr- Η tscots-ρ oo

£ Η Η H

st <r <f

pH H pH

m pq o pq in to mmmmmmm-c}--i<f'i<t-in in co c^- co co co co CO co co co CO CO CO CO co co

h— H S-NISIS-H Η H H<r<J-<3-mC--H HO HHHHCMCMCMCM Η Η H CM H CM

OVOOO O O O O O O O o o o o o Vfl 2 VOVOVOVOVDVOVOVO VO VO VO VO VD vo s t— sk a a a s s a a aas a a H os cm in n-mm c·» m t- t- w mosH mm m mn co G0-ct-<f· mm in -»}· jn jn

g K K ffi ffi ffi ffi ffi tx3 X ffi ffi W K W W S

S (T>H[--mmmmmmcn'iHCMvoosls- o hs- ® cm cm cm m m cm m cm rn-im h cm

PmOOOOOOOOOOOOOOOO

, -P i .> i i i i i i d i 3 H cd h Hd.ft33iioHHd aj d d -p d 3 Jj S -P cd <d H HH !>i0 ft d o ra d ra ϊ d -Red ^NddHorao o«Hd d s 5 3 c3-p 3 ra rad HH Ph hh§ od S u So CD -P Φ -p H HCQ H'P P<-p

Hdo ηΛ "S m π P Is cd P cd d >ϊΗ edd 3 m φ HH p ^ |η«3Η33 3!>> m d X d ra d O-Pd φ -p S -P o, -P n3 oo is ° © -p cd-p-p o il-P po d d ddra adocas£t(2CQP(;H-P<^yS>5S'H,-,5j

d d O -PdS ofi Η β 5 P n I dH Hrj dp H

o ,d cd ood PnOr;Ooo'iCDt>>dod<DOHO0)dd i o Η Η τ) ΟΗΛ ^5'HocHr(PfnHi!cQdcQHH1o'Ha3ra cmH^J« dmoi-Plio I 1 I I II l-l CSQHpqCMcN 2 Ό CM ftO-d-CMmHm 26 U4946

<]· s o 3 CO

CM

O 33 co h u) tn η -3- cms ns co co us <t· -4· CO Η Η Η Η r-1

Ni w

CO

a>R

rH

pq

CM CO OS IS- O O &D H 00 CO CO O O

ø Λ *V *v *V ·Κ Λ

Sh is is in o os os 5 cd ns h -d· <r ns ns pq to -μ

^ CD CM H 00 NS NS CM

Ti OS CM H US IS- US

C~j t\ rv c* ** »v «c 3 cd is m o co co

6 NS H <1- <f NS NS

✓—n S3 O IS- CM CM CM

• h0 OS i—I CO i—I CCS CCS

CQ CD *v******«*«s

-μ (3 -3" IS- -3- NS CM CM

Sh <D iH Η Η H rH

o to pq

tH

^ -μ

Φ 00 <f CM CM NS LCS

Ti CO CO CM IS- O OS

I-I S3 Λ Λ ft »V *\ ·*

;3 -ci· CO -3" CM CM H

i_3 pq Η Η Η Η H

pq g

EH S3 CM CO CM O O O

fao o CM CO CO CM CM

0 Λ Λ *V ·» *c p. ks co os go co ω

(D H

s pq -μ

° 0) O NS -3" O NS NS

Ti CCS CD NS H O CO

S3 λ λ »v ·» S3 CM ICS os ω CO IS-

h H

NS

CCS r-l irs to o co h <r <f- <f· LCS co co co co co CM O -3" -3" <1·

O O Η Η Η H

O H O O O O

H S CO CO CO CO

a is- a a a s Η Η O H CO IS- IS- 0) US H 3 ΙΛ -d- -3" aHrl H-4 H-f »-1H *-r* *T*

HM H-i HM l-M HH l-M

Pi IS- H NS NS US US

O CM S NS NS -3- -3- a o o o u o o η -μ i

3 cd Pi i I

ra S3 ω S3 S3 S3 o n ω <d •η <+-ι s3 -μ η -μ Η·μ -μ η ω cd cd cd (tied h s3i2<3as3 a s3 -μ ο rapio-μο -μο

co Sh 3 0^1 λή a'H

S3 CD Tf +3 CD Η H ftH PiH

ο -μ pi cd n a 3 cd 3 eel a •H CQ ol·) 3 CM 3 to S3 to

S3 !>> rS3 CD I I I

<3 O O pq (¾ H CM

27 144946 TABEL 2

Opløsningsmidler

Anion a b c

Methansulfonat Methylethylketon Acetone Methanol 10- caraphersulfonat Isobutanol Methanol n-butanol 2-bromethansulfonat n-butanol ethanol isobutanol

Chondroitinsulfat Methylisobutylketon Acetone Methanol p-chlorbenzensulfonat Methylethylketon 1-propanol 2-methoethanol 4-biphenylsulfonat Methylethylketon Methanol 2-ethoxyethanol 28 144946

SAM+.HS04".H2S04. 2RS0^H

E10/o # N * S * SAM ved°260 rm d Formel Ber. Fund. Ber. Fund. Ber. Fund. (H^SO^ 6N)

Ethylether C17H34N6OigS5 10,6810,8120,3720,0250,7751,10 187

Benzen C35H58N6°21S5 7,96 8>12 15,19 15,01 37,84 37,51 140

Methylethyl- 8iqH3gNg0^gS,-Br2 8,64 8,75 16,48 16,10 4l,06 41,30 151

Ethylacetat c43H68N8°4lS5 7,40 7,13 10,59 10,72 26,39 25,95 97

Ethylether C27H36N6°19S5C12 8,57 8,62 16,36 16,54 40,77 41,01 150

Diisopropyl- C3gH46N60lgS5 7,91 8,12 15,08 15,20 37,57 37,82 139 ether y 29 144946 TABEL 5

Opløsningsmidler

Anion a b c

Methansulfonat Methylethylketon Acetone Methanol

Dodecansulfonat Methylisobutylketon Methanol 2-methoxyethanol 1,2-ethandisulfonat n-butanol ethanol methanol p-acetylbenzensulfonat Isobutanol Methanol n-butanol 5-sulfosalicylat Methylisobutylketon Acetone Methanol 30 144946 SAM+.HS04". H2S04. rso^h

El0/ * » *s ***« ved°260 nm d Formel Ber. Fund. Ber. Fund. Ber. Fund. (H2S04 6N)

Ethylether Cl6H30N60l6S4 12,7 11,95 18,57 18,71 57,83 57,62 213

Ethylether C29H52N60l6S4 9,67 9,83 14,76 14,54 45,96 45,99 170

Benzen C16H29N6°16S4 11,17 11,01 17,04 17,25 53,07 53,22 196

Toluen C23H34N6°17S4 10*16 10,28 15,51 15,08 48,31 48,06 178

Chloroform C28H38N60l6S4 9,97 9,65 15,21 15,37 47,39 47,11 175

Methyliso- C,XX01QS, 10,34 10,08 15,78 15,45 49,19 49,00 181 butylketon 22 32 b 19 4 31 U4946 S'''"

Iz;

OID M3 H 00 S S- '•D

VO <f IS 00 ΙΠ Η M3 -d"

Q CM O Η Η Η H H H

O CO ti ΛΙ HH «Hl PH i>^ • tn co m cn vo o xl <r cm in cm tn in r{ «i ·> ^ »v «·» - ·» S3 is 03 cm h m σι [El <p <f <f tn -d- m co . .

CM cm cm H o is co O CO M3 CM -d· JLj «V *1 «Ν Λ ' ' ' ' * φ s <j\ cm h m σ» pq <f· <C -d· tn <f tn • m in cm 03 cm —d- xi cm tn O m M3 d ·> ·> ·> ·> *> ·* 3 03 03 C'- cm cd in

co S Η Η Η HHH

H IS 00 00 —d; dt

• H CD H VO H CD

Μ »V Λ*·» φ 03 03 s cm cd in

pq Η H HHH H

• in Η M3 o (O s x) h o cm -d- m o rj w *k λ ·> *% ·» jXj 30 O CM M3 03 00

tn S É H H H

§ CMHHinHO

p£j · O tn o M3 m tn CM ρ······»······

φ O O CM M3 03 CD

• PQ Η Η H

•d- Mt H CO ™

kj CM H

HK m o 3 . in in in co in in fi I CO CO C0 03 co co -d- HH 03 tn _H 03 03

O φ CM H CM O HH

CO a O O O M3 O O

K S M) M3 CD K M3 M3

* O K K K OM K K

+ Eli 00 00 O O M3 CM

s tn tn -d· h m -d-

3 K K K K K K

CO - 03 03 Η H 03 in η h cm in h tn O O O O o u id o a ?h 0 O d d Φ

CO P X) OH

k ·Η Φ Φ >1 I Ή +3

φ κ hk d κhp p P

Η ϊ>*Η O d d S Cd in H

Xl K !>, P d cd KP O >3

•Η P P Φ P d P Φ Η K

a Φ 3 O φ 3 O O K P

ra SK < BVI S cd o PH

UD ,

d H

H 1 2

d t>>H d IH

w h κ o d έ?2 d s o od ft K d h o h d Λ S o o d o d ft d cd PK d KK d d

o K Φ P ft P P d K

P a φ O φ φ Κ P

Φ i co I P Φ

S cm M cm PH S

£

cd P i I

K d I d d p d d cd φ

Φ P O cdP KP HP

isd *n ocd Pd dd x d h φ d φ d K d O O 3 p x) o d o P o d P ra d d9h . oSh ίΉ

d xl Η d Φ PH rlH ftH

o >>3 d P 03 Kd d 3 h Kra K ra ora ora dra di p >» i i i

-¾ CM PH O H CM CM

32 144948 pis' <i- Η tn m M3 M3 M3 <J- O O M3 00 <33 o

SCVJO C\J C\J Η Η H CM

O CO

HH HM

(X] >W

. LO O H CM m m

Tj H IO 03 M3 Η M3

Cj ·* ·* *v *v 231Λ <1* to 03 to tn <| p5 m tn <r -5* to tn

w CM M3 o in M3 IN

. a- ro H Ν o 03 £_| »V *v ·* 0 tn <j- <f 03 to tn pq to in <f <j- in in . to h o cm m cm

03 O CM i—I 03 VQ

Cj *v c* *3 ^ ^

E— O- -cf M3 M3 EN

pD Η Η Η Η Η H

03 03 in M3 03 to IN

^..tS <f" H 03 O 03 £_j »V Λ *S *>· ·* o) en in -i tn in in

pq Η Η Η Η Η H

. m cm co En cm ro

Tj -4- M3 O to CM tn £}«.·»·> " ~ ~ 0 Η H 03 O Η Η

S h Η Η Η Η H

^ΪΟ M3 <1" 00 IN CO 00

0 · M3 <f CM «i H IN

CO £-i *» +> Λ

Di ø Η H 03 OHH

pq Η Η Η Η H

in ι-ί <f m o £

pq co W

2¾ -3" PH. to co go co co co + C— IN- !N M3 M3 M3

S r-1 Η Η Η Η Η H

3 ωοοο ooo cq θ M3 M3 M3 M3 M3 M3 ag a s s a a O CM 2" H 2" CM 03 a m m <r tn to cm w a e a a m in a m in h a

h h a CM CM H

CJ C3 O O CJ O

I S Pi a a IS

000 Ph ø ο o ca-p a O a ra-p H 03 -P a a Η 0 p, a na ω o 0 na a 0 ΝΗ H Ph Η NH 0

h a n n o n a>>N

a h° a a h a +3+5 Pi η o a a a -p >25® a gam 0 a gam ra

bO

Pi J

Η I H H NH

c* η N O O X O

[Q O X ø in H H O 0 s Pi 000 0 0 a 0 h co 0 aa -p pi 0 -pa p, a -p -p a 0 0 0 -p 0 a 00a a a a ø Φ 1 1 a a 1 g cm 0 a a m a 1 -p 0 i a h 1 0 a 0010 a a a a a a ω ω ο ι 0a ao 01 na a aa nø Na 00 00 h a 0 xa xh sh aa a ga 00 oa o 1 a a o ra o o aa ara 0.0 aa a n a a an aa a ft 0 p.h ø an o N-a Nø 1 So øa n øa a ara a pH tn-5 a ara a ara a 1 1 1 u i 0 1 <; cm ro t} H m o 33 U4946

En del år har man kendt fra den biokemiske forskning, at SAM er den eneste specifikke donor af methyler i levende organismer til biokemiske reaktioner, hvor CH^-grupper overføres, der er fundamentale reaktioner inden for den lipidiske, protidiske og glucidiske metabolisme. Eksempelvis gives nedenfor nogle af de mest vigtige SAM-afhængige transmethyleringsreaktioner: (a) N-transmethylering: adenin, carnitin, camosin, creatin, 2,6-diaminopurin, adrenalin, guanin, hordenin, Ν'-nicotinamid, phosphatidylcolin, ricinin; (b) O-transmethylering: N-acetylserotonin, dopamin, epinin,. d-adrenalin, 1-adrenalin, ergosterol, 1-noradrenalin, pectin, ubiquinon; (c) S-transmethylering: 2,3-dimercaptopropanol, H2S, methionin, methylmercaptan, S-mercaptopropionsyre, S-mercaptoethanol, thiopyrimidin, thiouracylj (d) C-transmethylering: cytosin, thymin.

Dette betyder, idet der især refereres til den menneskelige organisme, at SAM virker i følgende metaboliske processer:

Biosyntese af cholin, biosynthese af phosphatidylcolin, aktiviteten af enzymer, der kræver SH-grupper, metabolisme af cate-cholaminer, metabolisme af biogene centroencephaliske aminer, metabolisme af serotonin, metabolisme af histamin, metabolisme af vitamin B12 og f.olinsyre, metabolisme af creatin, metabolisme af myosin, metabolisme af histoner, metabolisme af RNA, metabolisme af DNA, metabolisme af proteinforbindelser, metabolisme af nogle hormoner af cyclopentan-perhydrophenantrenkerner, hvor af de vigtigste er østrogener, metabolisme af triglyce-rider. Det har også været kendt i nogen tid, at SAM, når·den en gang er .demethyleret ved methyltransferas eenzymer, omdannes til S-adenosylhomocystein (SAO), der er en indirekte donor af hydrosulfidgrupper Og derfor har en afgørende betydning i metabolismen af alle forbindelser, der kræver SH-grupper, til udførelse af den biologiske aktivitet. Særlig vigtige blandt disse er nogle thioenzymer og sulfaterede aminosyrer.

34 144946 SAO decarboxyleres herefter i organismen, og det carboxylerede produkt er den principielle donor af aminopropylgrupper, der er uundværlige ifølge den seneste biokemiske forskning, for biosyntesen af polyaminer. Processen katalyseres af forskellige enzymer, omfattende den specifikke aminopropyltransferasis.

Sammenfattende kan man sige, at det er kendt, at SAM i den menneskelige organisme er tæt forbundet med alle biokemiske reaktioner af: A - transmethylering (der især giver CH^-grupper) B - transsulphurering (der især giver SH-grupper) C - transaminopropylering (der især giver aminopropylgrupper).

Summen af denne viden kunne føre en til at tro, at SAM ville have nogen terapeutisk virkning ved behandling af pathologiske tilstande forbundet med mangel eller andre deficiente forbindelser i organismen med hensyn til nogle af de mange produkter nævnt ovenfor.

Den extreme instabilitet af SAM og den mangel indtil dato på en metode til at fremstille et stabilt produkt, der er stabilt i tilstrækkelig lang tid under normale betingelser, har gjort det umuligt at underkaste dette produkt nogen pharmakologiske eller kliniske forsøg, hvorved enhver praktisk anvendelse af dette produkt inden for den humane terapi har været forhindret.

Kun efter fremstilling af de hidtil ukendte SAM-salte ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilke salte som ovenfor nævnt i praksis er fuldstændig stabile ved normale temperaturer, har det været muligt at udføre et systematisk farmakologisk og klinisk studium, der har ført til den opdagelse, at saltene har terapeutiske egenskaber og er fuldstændig overraskende med hensyn til kvalitet og intensitet.

Fra den enorme mængde af ^farmakologiske og kliniske data, der er indsamlet for disse nye produkter, vil der herefter blive givet kun nogle få tal, der er tilstrækkelige til klart at indicere for eksperter inden for området de væsentligste karakteristika for det nye produkt og dets hovedanvendelser inden for den humane terapi.

35 144946

Af hensyn til overskueligheden vil de nye salte fremstillet ifølge opfindelsen blive angivet som SAM-salt, idet deres anvendelse er identisk.

I de farmakologiske og kliniske data er det indgivne salt altid anført som SAM, og mængden af salt indgivet er udtrykt i mængden af SAM, der er indeholdt i produktet, således at det er klart, at tallene refererer identisk til det ene eller det andet salt ifølge opfindelsen.

Toxicitet SAM-saltene fremstillet ifølge opfindelsen har vist sig at være fuldstændig uden akut toxicietet, kronisk toxicitet, lokal intolerance eller sekundære virkninger.

Specielt kan nævnes, at DL^q i muser større end 2,5 g pr. kg pr. os og 1,00 g/kg/i.p.

Forsøgene til afprøvning af tolerancen og den kroniske toxicitet blev udført på rotter af Wistar og Sprague-Dawley-typen, der i 12 måneder blev indgivet 4-8 mg/kg pr. dag af produktet: efter behandlingen viste organerne ingen patalogiske ændringer. Teratogenesis-forsøg blev udført på kaniner og rotter: selv om der blev indgivet en dosis SAM cirka 10 gange den maksimale terapeutiske dosis, kunne ingen teratogenetiske virkninger ses eller nogen misdannelser i embryonerne eller det endelige foster. Tilsætningen af doser i op til 0,05 - 0,10 mg/ml produkt i overlevende kulturer af human lymphocyter eller hepatitiske celler fra mus frembringer ikke nogen ændring i det blasticise-rende indeks for de cellulære elementer.

Intravenøs indgivelse af doser op til 16 mg/kg giver ikke nogen pyrogen manifestation i kaniner. Venøs indgivelse i kaniner og katte i en mængde på 16 mg/kg giver ikke nogen ændring af det carotide tryk eller i den cardiale eller respiratoriske frekvens eller det elektrocardiale spor.

Den lokale tolerance af intramusculær injektion, selv efter ind givelse gentaget i 180 dage, og den intravenøse injektion i den 36 144946 marginale vene er glimrende.

I unge, frivillige mennesker af begge køn, der bliver udsat for en indgivelse ved den hurtige intravenøse metode eller ved phleboclysis i en mængde på SAM lig med 5-150 mg (gennemsnitsvægt 70 kg) viste den samtidige undersøgelse af minimale og maksimale tryk og af pulsen og respirationsfrekvensen på tidspunkter 1, 5, 15, 20, 30, 60 minutter og 2, 3, 6, 8, 10, 12, 24 timer fra indgivelsen ingen variation fra den normale værdi.

Elektrocardiogramsporene viser ikke nogen variation i PQ-inter-vallet i ST-sektionen og ingen synlig påvisning af extrasistol eller andre ændringer 30 sekunder, 1, 2, 3, 5, 10 og 20 minutter fra indgivelsen. I det hæmopøtiske apparat og i hæpatitiske og renale operationer var der ikke nogen variationer fra normal-tilstanden, hvilket viste sig at være statistisk signifikant .

Farmakologi

Det må endnu en gang bemærkes, at når der herefter tales om indgivelse af SAM, menes der ethvert af de simple eller dobbeltsaltene ifølge opfindelsen, idet aktiviteten af disse er fuldstændig ens. For at opnå en enkelt referenceparameter er referencen altid givet til SAM-indholdet af de forskellige salte.

For at bestemme, hvordan SAM er fordelt i vævet, fremstilledes S-adenosylmethionin (methyl- 'C). Fordelingen af dette produkt i rotter blev studeret ved indgivelse af en dosis på 4,2 mg/kg/e.v., der svarer til cirka 10 mikrocurie af det radioaktive produkt.

Den specifikke aktivitet af produktet var 68 millicurie/milli-mol. Parallelt med dette blev der udført autoradiografiske studier på musen. Resultaterne af disse to eksperimenter viser, at SAM fordeles meget hurtigt i alle væv.

Nedenfor er eksempelvis givet data for nogle af de organer, der er betragtet:

Fordeling af SAM i nogle rottevæg.

Værdierne er udtrykt som pg/g.

37 U4946 Væv 15 min. 1 time 4 timer 8 timer 24 timer

Lever 1,7 3,0 5,5 5,6 5,7

Suprarenale kirtler 1,9 3,4 4,8 4,5 4,4

Milt 1,3 1,2 3,5 2,6 2,8

Hypofyse 2,3 2,5 8,0 4,5 4,2

Hypothalamus 0,3 0,65 1,0 1,3 1,3

Svær 0,25 0,45 0,75 8,5 9,4

Plasma 7,5 2,1 2,3 2,0 1,1

Det blev derfor konkluderet, at de nye salte fremstillet ifølge opfindelsen giver CH^-gruppen til alle de væv, der er forsynet med methyl-transferase-aktivitet.

Dette blev bekræftet af påfølgende farmakologiske undersøgelser.

En hel serie forsøg blev udført på rotter, og disse har vist, at de nye forbindelser udviser en betragtelig protektiv og opløsende virkning på hepatisk steatosis ved hyperlipidisk-hyper-proteinisk diæt ifølge Handler, på steatosis ved akut alkoholisk intoxication og ved andre toxiske midler (carbontetrachlorid, brombenzen etc.) ved indgivelse i en mængde på kun 6 mg/kg/i.p..

Både fra et morphohistokemisk og et analytisk synspunkt reducerer SAM i betydelig grad akkumulationen af lipider på hepa-tocidt niveau, medens det favoriserer bevaringen af det normale niveau af phospholipider, der reduceres efter intoxication med carbontetrachlorid.

Af følgende tabel fremgår hepatiske phospholipider i rotter efter intoxioation med carbontetrachlorid og behandling med SAM.

Behandling Total ipider fysiologisk opløsning 30,57 ± 1,18 CC14 18,87 ±1,06 CC14 + SAM 15 mg/kg/i.p. 27,20 ± 1,25 CC14 + SAM 150 mg/kg/i.p. 20,87 ± 0,42 CC14 + Ad+Met 15 mg/kg/i.p. 19,9 ±0,92 144946 38 Værdierne er gennemsnit - standardafvigelsen af 10 værdier for hver gruppe. Ved undersøgelsen af den hepatoprotektive virkning er der anvendt et eksperimentelt udstyr, der i rotter fremkalder den såkaldte hæpatiske cholesterol-degenerering (Ridout and Coll., Biochem. J.52, 99, 1952). Veddenne metode opnås ved hjælp af en passende diæt en tydelig forøgelse af det totale indhold af hepatisk fedstof og hepatisk cholesterol. Forbindelser, der virker på lipidmetalbolismen, reducerer eller-annullerer denne forøgelse.

Dyrene blev delt i seks grupper. Den første gruppe blev indgivet en diæt, der blev varieret med vilje. Den anden gruppe blev indgivet en basisdiæt af typen Ridout (20 gram pr. rotte pr. dag). Andre grupper blev indgivet samme diæt i samme dosis, men forøget med cholesterol i en udstrækning på 0,2 g/rotte/dag. Behandlingen varede i tre uger.

Grupperne 4, 5, 6 blev indgivet SAM i følgende doser: 0,4, 0,8, 2 mg/kg/i.p. pr. dag.

Efter denne tre ugers periode blev alle dyrene dræbt, og leverne blev udtaget, og det totale fedtstof (Best and Coll., Biochem.

J.40, 368, 1966) og cholesterol (Sperry and Brand, J. Biol.

Chem. 150, 315, 1943) blev bestemt.

Resultaterne viste, at dyrene underkastet behandling med SAM i doser på 0,4 - 0,8 mg/kg/i.p. kun blev beskyttet i ringe omfang, medens dyrene behandlet med 2 mg/kg/i.p. blev beskyttet fuldstændigt .

Af følgende tabel fremgår det hepatiske cholesterol og total fedtstof ved slutningen af forsøget (i gennemsnit pr. gruppe).

p Frisk lever fedtstof cholesterol vægt g g % mg % I 15 1,41 9,4 40 2,6 II 18 1,93 10,6 68 3,7 III 16 3,84 24,0 92 5,7 IV 17 3,70 21,6- 90 5,2 V 16 3,5 21,9 67 4,1 VI 16 2,0 12,5 61 3,8 39 144946

Et andet farmakologisk aspekt, der blev undersøgt, var den anti-inflammatoriske og analgetiske virkning af SAM.

Blandt de forskellige forsøg skal nævnes det mest klassiske, nemlig ødemet ved carrageenin og ved æggehvide, som en prøve for akut inflammation og granuloma ved bomuldskugler og arthritis ved hjælpemidler som test for kronisk inflammation. I alle tilfælde viste SAM sig aktivt, både når det blev indgivet oralt (en dosis mellem 8 og 40 mg/kg) og parenteralt (en dosis mellem 4 og 8 mg/kg) i sammenligning med andre kendte midler (Ebupro-fen - Indometacin). Analgesia-forsøgene blev udført som varm-pladeforsøget og strækning med eddikesyre, og Randal og Selit-to-forsøget på rotter. Forbindelserne viste også aktivitet ved disse forsøg i sammenligning med de kendte forbindelser.

Et andet aspekt, der blev betragtet, var den mulige virkning af SAM på sovetiden med barbiturater.

Til dette formål udførtes et forsøg, hvori grupper af mus modtog hexobartial i doser på 80 mg/kg/i.p. ifølge metoden beskrevet i Acta Pharmacol. Toxicol. 1956, 12, 346. En gruppe var kontrolgruppen, og den anden modtog SAM i en dosis på 4 mg/kg/i.p.

(se tabellen).

Kontrol Sovetid (min.) 24,4 - 2,7 SAM 4 mg/kg/i.p. 41,2 - 5,8

Af tabellen fremgår det, at SAM er aktivt til at forlænge sovetiden induceret af hexobarbital.

Kliniske_forsøg

Efter de informationer, der blev opnået fra de farmakologiske forsøg, blev de kliniske forsøg orienteret på sygelige tilstande, hvori følgende blev påvirket primært eller sekundært: 40 U4946 1 - metabolismen af lipider 2 - metabolismen af protider og glucider 3 - metabolismen af catecholaminer og de biogene aminer.

Ad 1. Fra forsøg udført klinisk på hundreder af individer, hvor der anvendtes doser af SAM, der varierede over et meget bredt interval, blev det fundet, at de hidtil ukendte forbindelser inducerer et hurtigt fald i de hepatiske lipider ved hepatostea-tosis af den mest varierede pathogenesis, hvilket kunne identificeres ved en bioptisk undersøgelse, gentaget efter afslutningen af.behandlingscyklusen selv 60 dage efter behandlingens afslutning.

Indgivelsen af produktet medførte også et markant fald i de høje værdier af total cholesterolæmia, af hypertriglyceridæmia og normaliserede det ændrede p/α lipoproteinforhold hos individerne med hyperdislipidæmia i det ukompenserede stadium.

Denne hypocholesterolæmiserende og hypolipæmiserende virkning blev påvist, selv i doser på 8 - 15 mg indgivet 2-3 gange pr. dag, og virkningen er proportional med dosen.

Ved klar arteriosclerosis med kliniske manifestationer af den psycho-affektive spfære, med turbemnesi og sekundær centro-encephali (ødelæggelse ved arteriosclerotisk encephalopathia) og cerebral hypoxia, har indgivelse af SAM ved intramusculær ogi de alvorligere tilfælde ved intravenøs injektion i doser på 8 - 16 mg 3-4 gange pr. dag vist en meget gunstig modifikation af symptomerne. Især ved klare hypoxydotiske tilstande var genvinding af funktionerne, der angår livsforhold, meget hurtig og statistisk signifikant.

Ved post-apoplektiske syndromer fandtes en større hurtighed i forbedring af det kliniske billede.

Ad 2. Hundreder af individer, der led af: sekundær hypoprotidæmia og disprotidæmia, persistent og aggressiv kronisk hepatopathia, 41 144946 præcyrrotiske og cyrrotiske tilstande, malabsorptionssyndromer og protiddispergeringssyndromer, blev behandlet klinisk. Indgivelsen af doser på 20-80 mg SAM pr. dag ved intramuscular eller intravenøs injektion eller oralt, alt efter tilfældets sværhedsgrad, gav en statistisk signifikant forøgelse i den totale protidæmia, en forøgelse i albumin-niveauet og en tendens til at normalisere de ændrede procentforhold mellem serummets elektrophoretiske fraktioner. Denne protein-anabolise-rende aktivitet blev fulgt af en ofte meget vigtig forbedring i den subjektive symptomologi og de generelle objektive betingelser, og af normalisering af alle prøvningerne af hepatisk funk-tionalitet.

Ad 3. Særlig overraskende resultater opnåedes ved kliniske anvendelser af nye enzymatiske salte fremstillet ifølge opfindelsen, hvor der eksisterede sygdomsbilleder, der klart kunne korreleres med modifikationer i udvekslingen af biogene aminer, f.eks. : (a) pathologiske billeder af neuropsychiatrisk pertinens; (b) Parkinsons sygdom og parkinsonisme af forskellige ezio-pathogeneser; (c) antiphlogistisk og analgetisk virkning ved behandling af osteoarthritis og analgetisk virkning ved visse neurologiske manifestationer; (d) forstyrrelser i sove-vågne-rytmen.

Med hensyn til punkt (a) har en omfattende klinisk kasuistik gennemført ved undersøgelse af den kliniske adfærd og ved prøvninger ifølge Hamilton og Wittenberg klart vist, at indgivelsen af doser på 8-20 mg SAM 3-4 gange pr. dag i en periode på 5-15 dage, under udelukkelse af enhver anden form for terapi, inducerer en signifikant remission af hovedparametrene, der betragtes for diagnose af depressive former.

144946 42

Med hensyn til punkt (b) har det med hensyn til behandling af Parkinsons sygdom og parkinsonisme, vist sig at - indgivelsen af SAM i doser på 4-16 mg/dag ved intramuscular eller intravenøs injektion eller oralt, alt efter tilfældets alvor, i forbindelse med den habituelle terapi med Levodopa giver anledning til en statistisk mere signifikant forbedring i akinesien og stivheden i sammenligning med det, der sker hos patienter, der kun behandles med Levodopa. Gunstige modifikationer er også fundet i graden af Parkinson-tremoren, der ikke kan modificeres af Levopoda alene; - indgivelsen af SAM forbedrer klart Levodopa-afhængige psykiske forstyrrelser, især med hensyn til depressive tilstande og psykiske manifestationer af irritativ type; -indgivelsen af SAM i de førnævnte doser blokerer signifikant rækken af Levodopa-bivirkninger i de forskellige organer og apparater, især med hensyn til kvalme, opkastning, manglende appetit, hypotension, asthenia, cephalea, hypersudoration og søvnløshed.

Med hensyn til punkt (c) har SAM, der ved farmakologiske undersøgelser har vist sig at have intens antiphlogistisk og anal-getisk aktivitet, vist sig at være aktiv over for alle osteo-arthritiske former behandlet med en dosis på 13 mg to gange om dagen ved intramusculær eller intravenøs injektion og 13-20 mg oralt 4 gange pr. dag.

Efter kun 7 dages behandling blev den musculære spasme, bevægelsesbegrænsningen, lokaliseret smerte og rigiditet påvirket på statistisk signifikant måde, i forhold til en placebo.

Der observeredes intet tilfælde af gastrisk pyrosis hos de 90 behandlede tilfælde. Eftersøgningen for skjult blod i afføringen viste ingen ændring under behandlingen.

Sammenlignet med en almindeligt anvendt ikke-steroid antiphlogistisk medicin i et dobbelt blindforsøg, viser SAM sig at besidde en terapeutisk virkning svarende til indomethacin.

Den antalgiske aktivitet af SAM blev også prøvet hos forskellige individer med forskellige neurologiske billeder: neuritis, 43 144946 polyneuritis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torticollis.

Den terapeutiske virkning viste sig og var effektiv fra den første dag med indgivning af en dosis på 6 mg to gange om dagen ved intramuscular injektion eller 13-20 mg 3-4 gange om dagen ved oral indgivelse. Analoge resultater blev opnået hos individer med tilbagevendende og resistent cephalalgia ved indgivning af stoffet oralt i tyggetablet.

Med hensyn til punkt (d) dvs. forstyrrelser i sove-vågne-ryt-men og med særlig henblik på insomnia, er det nye produkt fremstillet ifølge opfindelsen i stand til i en dosis på 4-13 mg oralt i betragtelig grad at forbedre de ændrede sove-vågne-forhold ved at inducere en physiologisk søvn uden behov for at anvende barbiturater eller andre stoffer med cortical og centroencephalisk depressiv virkning.

Af den ovenstående sammenfatning fremgår, at anvendelsen af . de hidtil ukendte forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen inden for den humane terapi er evident. Sammenfattende kan man sige, at de anvendelsesområder, som allerede er fastslået, er følgende: behandling af hepatopia, hyperdislipidæmia, generaliseret eller lokal arteriosclerosis, psychiatriske manifestationer af depressiv og neurologisk type, degenerativ arthropathia, neuralgiske manifestationer og forstyrrelser af sove-vågne-rytmen, medens mange andre anvendelsesområder fort- sat er tilbage at undersøge og fastslå. De omhandlede SAM-salte indgives fortrinsvis ved intramusculær eller intravenøs injektion eller i orale eller sublinguale tabletter eller i kapsler.

Som konklusion kan det siges, at de terapeutiske doser af SAM ligger mellem 2 og 125 mg pr. dag, afhængigt af den bestemte type og alvoren af den behandlede lidelse.

Større doser kan om nødvendigt anvendes i betragtning af det fuldstændige fravær af toxicitet hos saltene fremstillet ifølge opfindelsen.

Claims (4)

144946 44

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af sulfonater af S-adenosyl-L-methionin (SAM) eller blandede salte af SAM, sulfonsyrer og svovlsyre, hvorved der fremstilles en koncentreret vandig opløsning af SAM, og det i opløsningen tilstedeværende SAM udfældes med en mættet opløsning af picrolonsyre i vand eller i et organisk opløsningsmiddel, som er opløseligt i vand, kendetegnet ved, at det udfældede picrolonat opløses i en opløsning af en sulfonsyre, udvalgt blandt methan-sulfonsyre, ethansulfonsyre, 1-n-dodecansulfonsyre, 1-n-octade-cansulfonsyre, 2-chlorethansulfonsyre, 2-bromethansulfonsyre, 2-hydroxyethansulfonsyre, 3-hydroxypropansulfonsyre, d-, 1- og d,l-10-camphersulfonsyre, d-, 1- og d,1-3-bromcampher-10-sulfonsyre, cysteinsyre, benzensulfonsyre, p-chlorbenzensulfonsyre, 2-mesitylbenzensulfonsyre, 4-biphenylsulf onsyre, 1-naphthalensul-fonsyre, 2-naphthalensulfonsyre, 5-sulfosalicylsyre, p-acetyl-benzensulfonsyre, 1,2-ethandisulf onsyre, o-benzendisulfonsyre og chondroitinsvovlsyre, eller i en opløsning af den nævnte sulfonsyre og svovlsyre, hvorpå sulfonsyresaltet eller dobbeltsaltet med sulfonsyre og svovlsyre udfældes ved tilsætning af et organisk opløsningsmiddel, som er totalt blandbart med det i sulfonsyreopløsningen anvendte opløsningsmiddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et udfældet simpelt sulfonat omdannes til et dobbeltsalt med svovlsyre ved opløsning i en vandig opløsning med lige store normaliteter (mellem 0,05 og 0,2 N) af svovlsyre og den sulfonsyre, som er til stede i det behandlede sulfonat, og udfældning af dobbeltsaltet ved tilsætning af et keton-baseret eller alkoholisk opløsningsmiddel, som er fuldstændigt opløseligt i vand.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved,· at et udfældet dobbeltsalt af sulfonsyre og svovlsyre genopløses i en.alkoholisk opløsning med lige store normaliteter (mellem 0,05 og 0,2 N) af sulfonsyre og svovlsyre og genudfældes med et organisk opløsningsmiddel, som er totalt blandbart med den anvendte alkohol.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at