DK155606B - Fremgangsmaade til rensning af heparin - Google Patents

Description

DK 155606B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af heparin med høj specifik aktivitet; fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne.

5 Heparin har været anvendt i lægekunsten i flere årtier. Det er et af de mest kendte antikoagulations-midler og anvendes i stort omfang bl.a. til at forhindre blodpropper. Heparin er et sulfateret polysakkarid som kan fremstilles ud fra animalsk tarmslim eller lunge ved 10 en forholdsvis kompliceret fremgangsmåde. De heparin- præparater som anvendes klinisk nu om stunder indeholder materiale af meget varierende molekylstørrelse, fra ca. 5000 op til ca. 35.000. Den specifikke aktivitet plejer at være ca. 130 enheder pr. mg. De for tiden til-15 gængelige kommercielle præparater er altså ganske heterogene. Hyppigheden af bivirkninger ved heparinterapi er ganske lav, men de tilfælde som forekommer giver problemer der er vanskelige at løse. En del af disse bivirkninger kan sandsynligvis henføres til forureninger i he-20 parinpræparatet.

Der er derfor gode grunde til at fremstille renere, mere specifikt virksomme heparinpræparater end de for tiden anvendte. I forbindelse med studier over anti-trombin, som er co-faktor til heparin, undersøgtes mu-25 ligheden for materixbinde proteinet. Det viste sig overraskende at matrixbundet (sakkarosebundet) antitrombin specifikt kunne binde den molekylfraktion i det som lægemiddel anvendte heparin, der er bærer af den klinisk værdifulde, tromboseprofylaktiske virkning af heparin.

30 Gennem passende valg af adsorptionsbetingelsr og de- sorptionsbetingelser kan der fremstilles et overordnet-ligt rent heparin. De specifikke aktiviteter, der vandtes, var 200-270 enheder/mg, der skal sammenlignes med ca. 130 enheder/mg i udgangsmaterialet. Molekylvægtfor-35 delingen i det rensede heparin var meget snævrere end hos udgangsmaterialet. Udover heparins cofaktor-anti-trombin kan der også anvendes et heparinbindende protein

DK 155606 B

2 såsom inter-a-trypsin-inhibitor med molekylvægt ca.

150.000, vundet under isolering af koagulationsfaktor IX (B-faktor). Det kvalitativt bedste heparin vandtes med matrixbundet antitrombin med specifikke aktiviteter 5 op til 270 enheder/mg.

Heparin med overordentlig høj renhed og specifik aktivitet kan altså fremstilles på den her angivne måde. Processen er simpel og industrielt anvendelig til at fremstille heparin med højere specifik aktivitet end 10 eksisterende præparater. Bestemmelse af heparins specifikke aktivitet er udført i henhold til Denson og Bonnar (1975, Brit J Haematol, 30, side 139).

Nogle eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

15

Eksempel 1

Rensning af heparin med matrixbundet antitrombin. Ko- lonnefremgangsmåde_ 2Q Geladsorbenset fremstilledes på følgende måde:

Aktivering 3 g BrCN opløstes i 30 ml destilleret vand. Der sattes 50 ml agarose ("Sepharose'^ 4B) til BrCN-opløs-ningen. Blandingen afkøledes på et isbad under omrøring.

2^ Ved tilsætning af 4M NaOH hævedes pH til 11,2 og holdtes konstant der i 10 minutter. Derefter vaskedes gelen med koldt destilleret vand og 0,2M NaHCO^.

Kobling 2Q 200 mg antitrombin renset i henhold til Miller-

Andersson et al. (1974, Thromb Res 5, side 439-452) og opløst i 50 ml 0,2M NaHCO^, pH 9,0, sattes til gelen. Proteinopløsningen og gelen omrørtes ved stuetemperatur i en nat og vaskedes derefter omhyggeligt med puffere 2^ med høj ionstyrke, skiftevis høj og lav pH.

DK 155606B

3

Heparinrensning

Geladsorbenset indeholdende matrixbundet anti- trombin pakkedes på en kolonne og bragtes i ligevægt med 0,05M tris, 0,15M NaCl, pH 7,4. 300 mg heparin (Vitruro, specifik aktivitet 130E/mg) opløstes i 20 ml 0,05M tris, 0,15M NaCl, pH 7,4 puffer og pumpedes gennem kolonnen.

Gelen vaskedes med ovennævnte puffer og det adsorberede heparin desorberedes derefter med 0,05M tris, 1,0M NaCl, pH 7,4 puffer. Det eluerede heparin befriedes fra salt

ÆD

ved gelfiltrering på en kolonne pakket med "Sephadex"^ G-25 i destilleret vand og frysetørredes. Det rensede heparin havde en specifik aktivitet på 270 E/mg.

Undersøgelse af molekylvægtfordelingen for dette heparin viser at det har betydeligt snævrere molekylvægtfordeling end det som udgangsmateriale anvendte heparin.

Kulhydratanalyse ved gelfiltrering blev foretaget ved karbazol-^SO^-metoden.

Eksempel 2

Rensning af heparin på matrixbundet antitrombin. Batch- proces_

Antitrombinmatrixen fremstilledes som beskrevet i eksempel 1.

Heparinrensning 500 mg heparin (Vitrum, specifik aktivitet 130 E/mg) opløstes i 300 ml 0,05M tris, 0,15M NaCl, pH 7,4 puffer. 300 ml sedimenteret antitrombin indeholdende gelabsorbens ækvilibreredes i ovennævnte puffer og blev suget tørt. Gelen sattes til heparinopløsningen efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 1 time. Gelen blev suget tør på glasfilter og vaskedes med 10 x 200 ml 0,05M tris, 0,15 NaCl, pH 7,4 puffer. Det adsorberede heparin desorberedes derefter fra gelen med 3 x 200 ml 0,05M tris, 1,0M NaCl, pH 7,4. Det eluerede hepa-

DK 155606 B

4 rin koncentreredes ved frysetørring. Tilbageværende salt fjernedes ved gelfiltrering på nSephadex,,,iy G 25 i destilleret vand efterfulgt af frysetørring. Det rensede heparins specifikke aktivitet var 250 E/mg.

5

Eksempel 3

Rensning af heparin på geladsorbens indeholdende matrix- bundet inter-a-trypsin-inhibitor_ 1q Fremstilling af geladsorbens I forbindelse med rensning af koagulationsfaktor IX (B-faktor) (L.-O. Andersson et al., 1975, Thromb Res, 7, side 451-459) vandtes det heparinbindende protein in-ter-a-trypsin-inhibitor. Dets molekylvægt er ca. 150.000.

250 mg af dette protein opløstes i 200 ml 0,2M NaHCO^, pH 9,0 puffer og sattes derefter til 50 ml sedimenteret "Sepharose"® 4B som var aktiveret med BrCN som beskrevet i eksempel 1. Proteinopløsningen og gelen omrørtes ved stuetemperatur natten over. Gelen vaskedes derefter ana-2Q logt med gelen i eksempel 1.

Heparinrensning

Geladsorbenset indeholdende det matrixbundet protein pakkedes på en kolonne. 300 mg heparin (Vitrum) op-2^ løst i 20 ml 0,05M tris, 0,15M NaCl, pH 7,4 puffer pumpedes ind i kolonnen. Gelen vaskedes med ovennævnte puffer og det adsorberede heparin desorberedes derefter med 0,05M tris, 1,OM NaCl, pH 7,4 puffer. Heparinet befrie-des fra salt ved gelfiltrering på "Sephadex,wy G 25 30 (tværbundet dextran) i destilleret vand og frysetørredes derefter. Det rensede heparins specifikke aktivitet var 230 E/mg.

35

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af heparin med høj specifik aktivitet, kendetegnet ved at der anvendes en vanduopløselig'. gelmatrix, til· hvilken 5 der er bundet antitrombin eller inter-a-trypsin-inhi-bitor med en molekylvægt på ca. 150.000, til at adsor-bere en heparinfraktion med specifik antitrombincofak-tor-aktivitet, hvorefter den gelbundne heparinfaktor desorberes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved at der anvendes en agarosegel som gelmatrix. 15 20 25 30 35