JPH083197A - ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 - Google Patents
ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製Info
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- JPH083197A JPH083197A JP7023347A JP2334795A JPH083197A JP H083197 A JPH083197 A JP H083197A JP 7023347 A JP7023347 A JP 7023347A JP 2334795 A JP2334795 A JP 2334795A JP H083197 A JPH083197 A JP H083197A
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8128—Antithrombin III
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 所定の生物学的に活性な蛋白質源をウイルス
不活化工程、および得られた処理液から目的蛋白質とそ
の蛋白質の変性体を分離する工程、を含んでなる活性ウ
イルスを実質的に含まない活性蛋白質の製造方法。 【効果】 ウイルス不活化工程後に、変性蛋白質を除去
することにより、効率よく目的の蛋白質を得ることがで
きる。
不活化工程、および得られた処理液から目的蛋白質とそ
の蛋白質の変性体を分離する工程、を含んでなる活性ウ
イルスを実質的に含まない活性蛋白質の製造方法。 【効果】 ウイルス不活化工程後に、変性蛋白質を除去
することにより、効率よく目的の蛋白質を得ることがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルスの不活性化工
程を最後の活性蛋白質精製工程の前に実地する、安全な
効能の高い活性蛋白質生成物の精製に関する。
程を最後の活性蛋白質精製工程の前に実地する、安全な
効能の高い活性蛋白質生成物の精製に関する。
【０００２】精製および引続くウイルスの不活性化の普
通の順序を逆転することによつて、比較的過酷な条件の
ウイルスの不活性化工程から生ずる不活性または変性さ
れた蛋白質を除去することが可能である。本発明は、ア
ンチトロンビンとして知られている特定の活性蛋白質を
使用して例示する。しかしながら、後述するように、開
示する方法は他の生物学的に活性な蛋白質に適用するこ
とができる。
通の順序を逆転することによつて、比較的過酷な条件の
ウイルスの不活性化工程から生ずる不活性または変性さ
れた蛋白質を除去することが可能である。本発明は、ア
ンチトロンビンとして知られている特定の活性蛋白質を
使用して例示する。しかしながら、後述するように、開
示する方法は他の生物学的に活性な蛋白質に適用するこ
とができる。
【０００３】アンチトロンビンは、また、アンチトロン
ビンＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩまたはヘパリンコフアクター
として知られており、凝固プロセスを阻害する能力をも
つ血漿蛋白質である。アンチトロンビンは凝固プロテア
ーゼ類の阻害剤であり、その阻害活性はヘパリンの存在
下に顕著に増大される。ヘパリンは、臨床的に抗凝固剤
として広く使用されている動物起源の硫酸化グリコサミ
ノグリカンである。
ビンＩＩＩ、ＡＴ−ＩＩＩまたはヘパリンコフアクター
として知られており、凝固プロセスを阻害する能力をも
つ血漿蛋白質である。アンチトロンビンは凝固プロテア
ーゼ類の阻害剤であり、その阻害活性はヘパリンの存在
下に顕著に増大される。ヘパリンは、臨床的に抗凝固剤
として広く使用されている動物起源の硫酸化グリコサミ
ノグリカンである。
【０００４】血液血漿中のアンチトロンビンの正常の衝
撃レベルに欠ける個体は、血栓症の危険が増大している
ことが示された。欠乏した状態は先天性または後天性で
あることがある。プールした正常血漿のそれの７０％よ
り低いアンチトロンビンレベルは、血栓症の危険に関連
する。精製された血漿誘導アンチトロンビンを使用する
置換の治療は、このような欠乏を有する個体にとつて、
かなり有益であることがある。
撃レベルに欠ける個体は、血栓症の危険が増大している
ことが示された。欠乏した状態は先天性または後天性で
あることがある。プールした正常血漿のそれの７０％よ
り低いアンチトロンビンレベルは、血栓症の危険に関連
する。精製された血漿誘導アンチトロンビンを使用する
置換の治療は、このような欠乏を有する個体にとつて、
かなり有益であることがある。
【０００５】ヘパリンによるアンチトロンビン活性の増
強は、主としてヘパリンと阻害剤との間溶液の結合の相
互作用に起因する。この結合の相互作用の厳密な高度に
特異的な性質の認識は、生物学的流体からのアンチトロ
ンビンの吸着のための親和性支持体として、固定化され
たヘパリンを使用することを促した。アンダーソン（An
derson）らへの米国特許第３,８４２,０６１号参照。こ
の技術は、多数の研究者らによつて、アンチトロンビン
の十分な精製を達成するための高度に有効な工程である
ことが示された。したがつて、アンチトロンビンのため
の事実上大規模な分離方法は、固定化されたヘパリン上
への親和吸着を用いる。アンチトロンビン精製の他の例
はよく知られている。
強は、主としてヘパリンと阻害剤との間溶液の結合の相
互作用に起因する。この結合の相互作用の厳密な高度に
特異的な性質の認識は、生物学的流体からのアンチトロ
ンビンの吸着のための親和性支持体として、固定化され
たヘパリンを使用することを促した。アンダーソン（An
derson）らへの米国特許第３,８４２,０６１号参照。こ
の技術は、多数の研究者らによつて、アンチトロンビン
の十分な精製を達成するための高度に有効な工程である
ことが示された。したがつて、アンチトロンビンのため
の事実上大規模な分離方法は、固定化されたヘパリン上
への親和吸着を用いる。アンチトロンビン精製の他の例
はよく知られている。
【０００６】しかしながら、商業的コーン冷エタノール
法（Cohn cold ethanol process）における初期の時点
における血漿からのアンチトロンビンの直接吸着のため
のヘパリン親和クロマトグラフイーの使用は、いくつか
の理由で複雑である。血漿は蛋白質類とヘパリンに対す
る親和性を変化させる他の成分との高度に複雑な混合物
である。固定化されたヘパリン支持体を血漿と直接接触
させると、これらの成分の多くは吸着する。同一源の血
漿からいくつかの異なる蛋白質生成物が得られるので、
親和接触工程の結果として、これらの生成物における悪
い変化を導入する可能性に関して重要な調節の考慮がな
される。
法（Cohn cold ethanol process）における初期の時点
における血漿からのアンチトロンビンの直接吸着のため
のヘパリン親和クロマトグラフイーの使用は、いくつか
の理由で複雑である。血漿は蛋白質類とヘパリンに対す
る親和性を変化させる他の成分との高度に複雑な混合物
である。固定化されたヘパリン支持体を血漿と直接接触
させると、これらの成分の多くは吸着する。同一源の血
漿からいくつかの異なる蛋白質生成物が得られるので、
親和接触工程の結果として、これらの生成物における悪
い変化を導入する可能性に関して重要な調節の考慮がな
される。
【０００７】親和ゲルへの多数の血漿成分の吸着は、ま
た、アンチトロンビンそれ自体の溶離の前に、望ましく
ない汚染物質の選択的吸着を必要とする。これは単一の
親和クロマトグラフイー工程において達成することが非
常に困難であることが立証されそして、しばしば、これ
らの不純物を除去するための追加の精製工程を含めるこ
とを必要とする。あるいは、ヘパリンのゲルからアンチ
トロンビンを溶離する前に、広範な洗浄工程を含めるこ
とは、純度を許容されうるレベルに増加するが、アンチ
トロンビンの収量をかなり減少させるだけである。
た、アンチトロンビンそれ自体の溶離の前に、望ましく
ない汚染物質の選択的吸着を必要とする。これは単一の
親和クロマトグラフイー工程において達成することが非
常に困難であることが立証されそして、しばしば、これ
らの不純物を除去するための追加の精製工程を含めるこ
とを必要とする。あるいは、ヘパリンのゲルからアンチ
トロンビンを溶離する前に、広範な洗浄工程を含めるこ
とは、純度を許容されうるレベルに増加するが、アンチ
トロンビンの収量をかなり減少させるだけである。
【０００８】商業的血漿の分画の間に通常用いられる大
きい体積および処理の後の工程から誘導される生成物へ
のクロマトグラフイーの起こりうる衝撃のために、処理
の使用した廃棄分画はアンチトロンビン源として考慮さ
れてきた。とくに、アルブミンの精製前の中間工程から
誘導される、通常廃棄される沈殿である血漿源コーンフ
ラクシヨンＩＶ−１は、アンチトロンビンに富んだ源で
あることが発見された。参照、ウイツカーハウゼル（Wi
ckerhauser）ら、ボツクス・サング（Vox Sang.）３
６、２８１−２９３（１９７９）。しかしながら、この
ような源は多量のリポ蛋白質および他の変性された成分
のために、クロマトグラフイー（再懸濁後）のための理
想的な溶液ではない。収量を大量に犠牲にしないで、固
定化されたヘパリンのコーンフラクシヨンＩＶ−１の溶
液の直接クロマトグラフイーにより、高いレベルのアン
チトロンビンの純度を得ることは通常非常に困難であ
る。
きい体積および処理の後の工程から誘導される生成物へ
のクロマトグラフイーの起こりうる衝撃のために、処理
の使用した廃棄分画はアンチトロンビン源として考慮さ
れてきた。とくに、アルブミンの精製前の中間工程から
誘導される、通常廃棄される沈殿である血漿源コーンフ
ラクシヨンＩＶ−１は、アンチトロンビンに富んだ源で
あることが発見された。参照、ウイツカーハウゼル（Wi
ckerhauser）ら、ボツクス・サング（Vox Sang.）３
６、２８１−２９３（１９７９）。しかしながら、この
ような源は多量のリポ蛋白質および他の変性された成分
のために、クロマトグラフイー（再懸濁後）のための理
想的な溶液ではない。収量を大量に犠牲にしないで、固
定化されたヘパリンのコーンフラクシヨンＩＶ−１の溶
液の直接クロマトグラフイーにより、高いレベルのアン
チトロンビンの純度を得ることは通常非常に困難であ
る。
【０００９】プールした血漿または生物学的に活性な蛋
白質の他の源から蛋白質を精製するための追加の考慮
は、ウイルスの汚染の可能性である。肝炎Ｂ型ウイルス
およびエイズのウイルスがとくに考えられる。肝炎Ｂ型
ウイルスに関すると、０.５モルのクエン酸ナトリウム
の存在下に６０℃に１０時間加熱すると、ウイルスは完
全に不活性化することが示された。参照、テイバー（Ta
bor）ら、血栓症の研究（Thrombosis Research）２２，
２３３−２３８（１９８１）。アンチトロンビンの活性
の大部分はこの熱処理の間に維持されるが、有意なかつ
変化する量の不活性化が起こることが観測された。参
照、上のテイバー（Tabor）ら、およびバロウクリツフ
エ（Barrowcliffe）ら、Fr．J．Haematology）、５５、
３７−４６（１９８３）。こうして、ウイルスの汚染か
らの安全性を確保する必要は、アンチトロンビン自体の
不活性化を引き起こす危険を多少伴なう。この後者の可
能性は、熱変性された蛋白質の注射が、これらの物質の
潜在的に新しい抗原性のために、患者に応答を誘発する
ことがあるので、面倒である。
白質の他の源から蛋白質を精製するための追加の考慮
は、ウイルスの汚染の可能性である。肝炎Ｂ型ウイルス
およびエイズのウイルスがとくに考えられる。肝炎Ｂ型
ウイルスに関すると、０.５モルのクエン酸ナトリウム
の存在下に６０℃に１０時間加熱すると、ウイルスは完
全に不活性化することが示された。参照、テイバー（Ta
bor）ら、血栓症の研究（Thrombosis Research）２２，
２３３−２３８（１９８１）。アンチトロンビンの活性
の大部分はこの熱処理の間に維持されるが、有意なかつ
変化する量の不活性化が起こることが観測された。参
照、上のテイバー（Tabor）ら、およびバロウクリツフ
エ（Barrowcliffe）ら、Fr．J．Haematology）、５５、
３７−４６（１９８３）。こうして、ウイルスの汚染か
らの安全性を確保する必要は、アンチトロンビン自体の
不活性化を引き起こす危険を多少伴なう。この後者の可
能性は、熱変性された蛋白質の注射が、これらの物質の
潜在的に新しい抗原性のために、患者に応答を誘発する
ことがあるので、面倒である。
【００１０】現在まで、臨床的アンチトロンビン濃縮物
のための大規模な調製法は、固定化されたヘパリン上の
親和吸着工程に引続いて、低温殺菌工程を組込んだ。こ
うして、これらの生成物は、上のバロウクリツフエ（Ba
rrowcliffe）らが示すように、大量の変性されたアンチ
トロンビンを潜在的に含有する。われわれは、変性また
は不活性化された蛋白質および他の不純物をウイルスの
不活性化後に除去する、生物学的に活性な蛋白質生成物
を調製する方法を知らない。
のための大規模な調製法は、固定化されたヘパリン上の
親和吸着工程に引続いて、低温殺菌工程を組込んだ。こ
うして、これらの生成物は、上のバロウクリツフエ（Ba
rrowcliffe）らが示すように、大量の変性されたアンチ
トロンビンを潜在的に含有する。われわれは、変性また
は不活性化された蛋白質および他の不純物をウイルスの
不活性化後に除去する、生物学的に活性な蛋白質生成物
を調製する方法を知らない。
【００１１】
【発明の構成】上の問題の各々を処理する、生物学的に
活性な蛋白質の精製法を、ここに記載する。この方法
は、多くの活性な治療的蛋白質について適用可能である
と考えられる。後に例示するように、本発明の方法は、
血漿蛋白質の混合物、例えば、コーンフラクシヨンＩＶ
−１からアンチトロンビンを分離するためにとくに適す
る。この手順の必須の成分は、２つの工程を含む：初期
のウイルスの不活性化（例えば、低温殺菌）工程および
引続く生物学的に活性な蛋白質の調製工程。アンチトロ
ンビンの例示する場合において、部分的に精製されたア
ンチトロンビンの濃縮物をウイルスの不活性化工程（例
えば、テイバー（Tabor）らが前に記載したような、０.
５モルのクエン酸ナトリウムの存在下の低温殺菌）にか
ける。次いで、この熱処理したアンチトロンビン溶液
を、例えば、ヘパリン親和ゲル（固定化されたヘパリ
ン）の直接のクロマトグラフイーによつて、分離する。
この親和クロマトグラフイーは、最初の精製から誘導さ
れる汚染物質の大部分の除去ならびに、熱処理工程から
生ずる。不活性なアンチトロンビン自体を包含する変性
された蛋白質の大部分の除去を確実にする。次いで、ア
ンチトロンビンを溶離し、そして濃縮する。次いで、濃
縮物は、好ましくは、さらに処理して、例えば、所望の
賦形剤を含め、そして凍結乾燥する。得られる凍結乾燥
された蛋白質（アンチトロンビン）濃縮物は、非常に高
いレベルの純度、かなりの程度のウイルスの安全性、お
よび変性されたまたは不活性のアンチトロンビンの事実
上の不存在によつて特徴づけられる。活性蛋白質、例え
ば、アンチトロンビンのための血漿源はよく知られてい
る。本発明の好ましい源は、コーンフラクシヨンＩＶ−
１ペーストとして知られている現在廃棄される分画であ
る。血漿中に存在するか、あるいは遺伝子工学に付され
る微生物または細胞系から発現される、他の活性蛋白
質、例えば、血小板因子ＩＶ、凝固因子ＩＩ、Ｖ、ＶＩ
Ｉ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸ、プロテインＣおよびＳお
よび蛋白質（例えば、抗生物質、成長因子α１−ＰＩ、
および精製のために利用できる生物学的親和性を有する
事実上任意の蛋白質）を、同様に調製し、そして活性ウ
イルスを実質的に含有せずかつ不活性な形態の前記蛋白
質を実質的に含有しないようにすることができる。
活性な蛋白質の精製法を、ここに記載する。この方法
は、多くの活性な治療的蛋白質について適用可能である
と考えられる。後に例示するように、本発明の方法は、
血漿蛋白質の混合物、例えば、コーンフラクシヨンＩＶ
−１からアンチトロンビンを分離するためにとくに適す
る。この手順の必須の成分は、２つの工程を含む：初期
のウイルスの不活性化（例えば、低温殺菌）工程および
引続く生物学的に活性な蛋白質の調製工程。アンチトロ
ンビンの例示する場合において、部分的に精製されたア
ンチトロンビンの濃縮物をウイルスの不活性化工程（例
えば、テイバー（Tabor）らが前に記載したような、０.
５モルのクエン酸ナトリウムの存在下の低温殺菌）にか
ける。次いで、この熱処理したアンチトロンビン溶液
を、例えば、ヘパリン親和ゲル（固定化されたヘパリ
ン）の直接のクロマトグラフイーによつて、分離する。
この親和クロマトグラフイーは、最初の精製から誘導さ
れる汚染物質の大部分の除去ならびに、熱処理工程から
生ずる。不活性なアンチトロンビン自体を包含する変性
された蛋白質の大部分の除去を確実にする。次いで、ア
ンチトロンビンを溶離し、そして濃縮する。次いで、濃
縮物は、好ましくは、さらに処理して、例えば、所望の
賦形剤を含め、そして凍結乾燥する。得られる凍結乾燥
された蛋白質（アンチトロンビン）濃縮物は、非常に高
いレベルの純度、かなりの程度のウイルスの安全性、お
よび変性されたまたは不活性のアンチトロンビンの事実
上の不存在によつて特徴づけられる。活性蛋白質、例え
ば、アンチトロンビンのための血漿源はよく知られてい
る。本発明の好ましい源は、コーンフラクシヨンＩＶ−
１ペーストとして知られている現在廃棄される分画であ
る。血漿中に存在するか、あるいは遺伝子工学に付され
る微生物または細胞系から発現される、他の活性蛋白
質、例えば、血小板因子ＩＶ、凝固因子ＩＩ、Ｖ、ＶＩ
Ｉ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸ、プロテインＣおよびＳお
よび蛋白質（例えば、抗生物質、成長因子α１−ＰＩ、
および精製のために利用できる生物学的親和性を有する
事実上任意の蛋白質）を、同様に調製し、そして活性ウ
イルスを実質的に含有せずかつ不活性な形態の前記蛋白
質を実質的に含有しないようにすることができる。
【００１２】アンチトロンビンの精製の場合において、
本発明の好ましい分離工程は、炭水化物の支持体上に固
定化されたヘパリン（例えば、セフアロース（Sepharos
e）アガロースへ共有結合したヘパリン）を使用する。
この開示の方法を使用して、活性ウイルスを実質的に含
有せず、そして総アンチトロンビン蛋白質の１ｍｇにつ
き少なくとも約６国際単位の生物学的に活性なアンチト
ロンビンの活性を有する、精製されたアンチトロンビン
生成物を得ることができた。
本発明の好ましい分離工程は、炭水化物の支持体上に固
定化されたヘパリン（例えば、セフアロース（Sepharos
e）アガロースへ共有結合したヘパリン）を使用する。
この開示の方法を使用して、活性ウイルスを実質的に含
有せず、そして総アンチトロンビン蛋白質の１ｍｇにつ
き少なくとも約６国際単位の生物学的に活性なアンチト
ロンビンの活性を有する、精製されたアンチトロンビン
生成物を得ることができた。
【００１３】
【実施例】実施例Ｉ （アンチトロンビンの精製）コーンフラクシヨンＩＶ−
１ペースト、６ｋｇ（プールした血漿から集め、そして
−３０℃に凍結して貯蔵したもの）を、０.１モル濃度
のトリス、０.０２モル濃度の塩化ナトリウムから成る
緩衝液、ｐＨ８.２、の合計５０リツトル中に溶解し
た。５℃において１時間撹拌した後、この溶液を４０℃
に加温し、そしてさらに１時間撹拌した。この溶液を２
０℃に冷却した。次いで、０.０２モル濃度のトリス、
０.１５モル濃度のＮａＣｌ、ｐＨ７.８中で前もつて平
衡化した。ヘパリン−セフアロースゲル（固定化された
ヘパリン）、６ｋｇを、コーンフラクシヨンＩＶ−１の
溶液に添加し、そして２０分間撹拌した。この懸濁液を
フイルター付漏斗に移し、そして濾液のコーンフラクシ
ヨンＩＶ−１の溶液を集め、保存した。次いで、ゲルを
０.０２モル濃度のトリス、０.３モル濃度のＮａＣｌか
ら成る緩衝液、ｐＨ７.５、で、溶離液の吸収（２８０
ｎｍ）が０.３６に到達するまで、よく洗浄した。次い
で、０.０２モル濃度のトリス、２モル濃度のＮａＣｌ
から成る緩衝液、ｐＨ７.５、でゲルを洗浄することに
よつて、アンチトロンビンを溶離した。０.２（２８０
ｎｍ）より大きい吸収で溶離される物質のすべてを、さ
ら処理するために、プールとして集めた。
１ペースト、６ｋｇ（プールした血漿から集め、そして
−３０℃に凍結して貯蔵したもの）を、０.１モル濃度
のトリス、０.０２モル濃度の塩化ナトリウムから成る
緩衝液、ｐＨ８.２、の合計５０リツトル中に溶解し
た。５℃において１時間撹拌した後、この溶液を４０℃
に加温し、そしてさらに１時間撹拌した。この溶液を２
０℃に冷却した。次いで、０.０２モル濃度のトリス、
０.１５モル濃度のＮａＣｌ、ｐＨ７.８中で前もつて平
衡化した。ヘパリン−セフアロースゲル（固定化された
ヘパリン）、６ｋｇを、コーンフラクシヨンＩＶ−１の
溶液に添加し、そして２０分間撹拌した。この懸濁液を
フイルター付漏斗に移し、そして濾液のコーンフラクシ
ヨンＩＶ−１の溶液を集め、保存した。次いで、ゲルを
０.０２モル濃度のトリス、０.３モル濃度のＮａＣｌか
ら成る緩衝液、ｐＨ７.５、で、溶離液の吸収（２８０
ｎｍ）が０.３６に到達するまで、よく洗浄した。次い
で、０.０２モル濃度のトリス、２モル濃度のＮａＣｌ
から成る緩衝液、ｐＨ７.５、でゲルを洗浄することに
よつて、アンチトロンビンを溶離した。０.２（２８０
ｎｍ）より大きい吸収で溶離される物質のすべてを、さ
ら処理するために、プールとして集めた。
【００１４】次いで、バツチのヘパリン−セフアロース
吸着からプールした溶離液を、中空繊維の限外濾過装置
（ロミコン（Romicon））で４.０リツトルの最終体積に
濃縮し、そして０.０２モル濃度のリン酸ナトリウム０.
１５モル濃度のＮａＣｌ、０.５モル濃度のクエン酸ナ
トリウムから成る最終緩衝液、ｐＨ７.５、に対して透
析した。次いで、この溶液を、ウイルスの不活性化を確
実にするために十分な条件下に加熱した（例えば、６０
℃±０.５℃の溶液温度に１０時間）。
吸着からプールした溶離液を、中空繊維の限外濾過装置
（ロミコン（Romicon））で４.０リツトルの最終体積に
濃縮し、そして０.０２モル濃度のリン酸ナトリウム０.
１５モル濃度のＮａＣｌ、０.５モル濃度のクエン酸ナ
トリウムから成る最終緩衝液、ｐＨ７.５、に対して透
析した。次いで、この溶液を、ウイルスの不活性化を確
実にするために十分な条件下に加熱した（例えば、６０
℃±０.５℃の溶液温度に１０時間）。
【００１５】この熱処理後、溶液を２０℃に冷却し、そ
して０.２ミクロンのフイルターで濾過して、低温殺菌
から生じたかも知れない粒状物質を除去した。次いで、
濾過装置の洗浄液を含む、濾過した溶液を、０.０２モ
ル濃度のリン酸ナトリウム、０.１５モル濃度のＮａＣ
ｌ、ｐＨ７.５、中で前もつて平衡化した、ヘパリン−
セフアロースのカラム（１４×２１ｃｍ）上に直接適用
し、そしてこのカラムを試料の適用後同一緩衝液で洗浄
した。基線の水準に到達するまで、溶離した溶液の吸収
を監視し（２８０ｎｍ）、次いでこのカラムを２モル濃
度のＮａＣｌを含有するリン酸塩緩衝液で溶離した。
０.０４より大きい吸収で溶離する物質のすべてを、合
計の体積が３.０５リツトルのプールとして集めた。ア
ンチトリンビンの回収の要約を、下表に表わす。
して０.２ミクロンのフイルターで濾過して、低温殺菌
から生じたかも知れない粒状物質を除去した。次いで、
濾過装置の洗浄液を含む、濾過した溶液を、０.０２モ
ル濃度のリン酸ナトリウム、０.１５モル濃度のＮａＣ
ｌ、ｐＨ７.５、中で前もつて平衡化した、ヘパリン−
セフアロースのカラム（１４×２１ｃｍ）上に直接適用
し、そしてこのカラムを試料の適用後同一緩衝液で洗浄
した。基線の水準に到達するまで、溶離した溶液の吸収
を監視し（２８０ｎｍ）、次いでこのカラムを２モル濃
度のＮａＣｌを含有するリン酸塩緩衝液で溶離した。
０.０４より大きい吸収で溶離する物質のすべてを、合
計の体積が３.０５リツトルのプールとして集めた。ア
ンチトリンビンの回収の要約を、下表に表わす。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例ＩＩ 実施例Ｉの工程を反復したが、ただし最終の低温殺菌し
たアンチトロンビン生成物を引続いて安定剤としてアミ
ノ酸（０.１モル濃度のアラニン）と一緒に凍結乾燥し
た。
たアンチトロンビン生成物を引続いて安定剤としてアミ
ノ酸（０.１モル濃度のアラニン）と一緒に凍結乾燥し
た。
【００１８】実施例ＩＩＩ 実施例Ｉの工程を反復したが、ただしコーンフラクシヨ
ンＩＶ−１の溶液のバツチ式接触後に、０.０２モル濃
度のトリス、０.１５モル濃度のＮａＣｌおよび１〜２
ｇ／ｌの硫酸デキストランを含有する衝撃液で、ヘパリ
ン−アガロースゲルをさらに洗浄した。
ンＩＶ−１の溶液のバツチ式接触後に、０.０２モル濃
度のトリス、０.１５モル濃度のＮａＣｌおよび１〜２
ｇ／ｌの硫酸デキストランを含有する衝撃液で、ヘパリ
ン−アガロースゲルをさらに洗浄した。
【００１９】上の実施例はウイルスの不活性化および非
常に特定の活性蛋白質の精製を記載するが、当業者は理
解するように、開示した技術は種々の源（例えば、動物
またはヒトの血漿、遺伝子工学された微生物または細胞
系など）から得られる非常に広範な種類の活性蛋白質に
適用することができる。開示した技術を使用するための
主な要件は、２つの組み合わせにある：（１）生成学的
に活性な蛋白質生成物中のウイルスの不活性化、および
（２）変性されたまたは不活性な形態の活性蛋白質が、
存在する場合、最小である、活性蛋白質生成物。
常に特定の活性蛋白質の精製を記載するが、当業者は理
解するように、開示した技術は種々の源（例えば、動物
またはヒトの血漿、遺伝子工学された微生物または細胞
系など）から得られる非常に広範な種類の活性蛋白質に
適用することができる。開示した技術を使用するための
主な要件は、２つの組み合わせにある：（１）生成学的
に活性な蛋白質生成物中のウイルスの不活性化、および
（２）変性されたまたは不活性な形態の活性蛋白質が、
存在する場合、最小である、活性蛋白質生成物。
【００２０】使用できる生物学的に不活性な技術は、低
温殺菌、化学的処理（薬剤、例えば、米国特許第４,５
３４,９７２号などに記載されているよう銅フタロシア
ニンの使用）および照射である。活性蛋白質の分離技術
の例は、活性な形態と不活性な形態とを識別するよう
に、蛋白質の生物学的活性に基づく分離を可能とする方
法（例えば、親和クロマトグラフイーまたは適用結合因
子、例えば、生物学的に活性な形態の蛋白質を認識する
抗体の使用）を包含する。
温殺菌、化学的処理（薬剤、例えば、米国特許第４,５
３４,９７２号などに記載されているよう銅フタロシア
ニンの使用）および照射である。活性蛋白質の分離技術
の例は、活性な形態と不活性な形態とを識別するよう
に、蛋白質の生物学的活性に基づく分離を可能とする方
法（例えば、親和クロマトグラフイーまたは適用結合因
子、例えば、生物学的に活性な形態の蛋白質を認識する
抗体の使用）を包含する。
【００２１】本明細書で使用するとき、用語「生物学的
に活性」は、蛋白質に適用するとき、（不活性な、変性
されたまたは無用の状態の同一蛋白質と反対に）蛋白質
がその意図する機能を示すか、あるいは意図する結果に
有用である蛋白質の形態または形状を意味する。所定の
蛋白質がその意図する機能を示すか、あるいは意図する
結果を達成するための生物学的活性を有するかどうか
は、当業者に知られた手段（例えば、簡単な機能的活性
のアツセイ、免疫学的手段など）によつて決定すること
ができる。
に活性」は、蛋白質に適用するとき、（不活性な、変性
されたまたは無用の状態の同一蛋白質と反対に）蛋白質
がその意図する機能を示すか、あるいは意図する結果に
有用である蛋白質の形態または形状を意味する。所定の
蛋白質がその意図する機能を示すか、あるいは意図する
結果を達成するための生物学的活性を有するかどうか
は、当業者に知られた手段（例えば、簡単な機能的活性
のアツセイ、免疫学的手段など）によつて決定すること
ができる。
【００２２】「ウイルスの不活性化または活性ウイルス
を実質的に含有しない」は、存在するウイルスを除去ま
たは不活性化して、供されうるレベルまたは菌株不可能
なレベルに安全にすることを意味する。所定の活性蛋白
質の調製物の「低温殺菌した形態」は、存在するかも知
れないウイルスを不活性化するために十分な低温殺菌ま
たは熱処理（例えば、６０℃における少なくとも１０時
間の加熱）にかけた調製物を意味する。所定の蛋白質の
「変性されたまたは不活性な形態を含まない」は、所定
の蛋白質生成物が生物学的に活性な蛋白質から主として
含み、かつ変性されたまたは不活性な形態が存在しない
か、あるいは検出できない少量で存在する（例えば、交
差免疫電気泳動により決定して、一般に約１０重量％よ
り少ないか、あるいは、アンチトロンビンの割合におい
て、アンチトロンビンの不活性種が約１０重量％より少
ない）ことを意味する。
を実質的に含有しない」は、存在するウイルスを除去ま
たは不活性化して、供されうるレベルまたは菌株不可能
なレベルに安全にすることを意味する。所定の活性蛋白
質の調製物の「低温殺菌した形態」は、存在するかも知
れないウイルスを不活性化するために十分な低温殺菌ま
たは熱処理（例えば、６０℃における少なくとも１０時
間の加熱）にかけた調製物を意味する。所定の蛋白質の
「変性されたまたは不活性な形態を含まない」は、所定
の蛋白質生成物が生物学的に活性な蛋白質から主として
含み、かつ変性されたまたは不活性な形態が存在しない
か、あるいは検出できない少量で存在する（例えば、交
差免疫電気泳動により決定して、一般に約１０重量％よ
り少ないか、あるいは、アンチトロンビンの割合におい
て、アンチトロンビンの不活性種が約１０重量％より少
ない）ことを意味する。
【００２３】上に与えた開示から種々の形態が、当業者
にとつて明らかであろう。したがつて、上の実施例は例
示をのみ目的とし、そして本発明の範囲は特許請求の範
囲によつてのみ限定される。
にとつて明らかであろう。したがつて、上の実施例は例
示をのみ目的とし、そして本発明の範囲は特許請求の範
囲によつてのみ限定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/22
Claims (4)
- 【請求項１】 （ａ）所定の生物学的に活性な蛋白質の
ための源を、存在するすべてのウイルスを不活性化する
ために十分な条件下で処理するウイルス不活性化工程、
および（ｂ）工程（ａ）の生成物を、生物学的に不活性
な形態の前記蛋白質が総蛋白質の約１０重量％より少な
くなるようにそれらの不活性な形態の蛋白質を除去する
のに十分な条件下で、蛋白質分離工程にかける工程、を
含んでなるが、前記活性な蛋白質がアンチトロンビン以
外であることを特徴とする活性ウイルスを実質的に含有
しない生物学的に活性な治療用蛋白質生成物を製造する
方法。 - 【請求項２】 生物学的に活性な蛋白質が、血漿蛋白質
および前記蛋白質を発現することのできる微生物または
細胞系から誘導された蛋白質から選択される請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 工程（ａ）の生成物が、溶液中に存在す
るすべてのウイルスの不活性化を確実にするために十分
な条件下に、低温殺菌される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 低温殺菌工程が、少なくとも約６０℃の
温度において少なくとも約１０時間、溶液を加熱するこ
とを含む請求項３記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US884446 | 1986-07-11 | ||
| US06/884,446 US4749783A (en) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | Viral inactivation and purification of active proteins |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP62171330A Division JPH0768275B2 (ja) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH083197A true JPH083197A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=25384645
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62171330A Expired - Lifetime JPH0768275B2 (ja) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
| JP6119509A Expired - Lifetime JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
| JP7023347A Pending JPH083197A (ja) | 1986-07-11 | 1995-01-19 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62171330A Expired - Lifetime JPH0768275B2 (ja) | 1986-07-11 | 1987-07-10 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
| JP6119509A Expired - Lifetime JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4749783A (ja) |
| EP (1) | EP0252392B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0768275B2 (ja) |
| AU (1) | AU589868B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341269C (ja) |
| DE (1) | DE3751576T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA1341379C (en) | 1988-04-28 | 2002-07-23 | Welfide Corporation | Purified antithrombin-iii and methods of producing the same |
| JPH03215430A (ja) * | 1990-01-19 | 1991-09-20 | Kita Kiyoshi | 関節腔抗凝固剤 |
| WO1991001367A1 (en) * | 1989-07-20 | 1991-02-07 | Bioeng, Inc. | Supercritical fluid disruption of and extraction from microbial cells |
| FR2679251B1 (fr) * | 1991-07-18 | 1993-11-12 | Nord Assoc Essor Transfusion San | Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique. |
| US5610285A (en) | 1994-08-24 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
| ES2094701B1 (es) * | 1995-07-12 | 1997-09-01 | Grifols Grupo Sa | Procedimiento para la produccion de antitrombina iii |
| US6632648B1 (en) * | 1996-05-14 | 2003-10-14 | Elan Drug Delivery Limited | Methods of terminal sterilization of fibrinogen |
| AT405739B (de) | 1997-09-19 | 1999-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur reinigung von antithrombin iii |
| US6093804A (en) * | 1998-09-24 | 2000-07-25 | American National Red Cross | Method for purification of alpha-1 proteinase inhibitor |
| DE19923027C2 (de) * | 1999-05-19 | 2002-09-19 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Inaktivierung von Viren |
| ES2543829T5 (es) | 2000-12-14 | 2023-07-13 | Grifols Therapeutics Inc | Procedimiento para la preparación del inhibidor de proteinasa alfa 1 |
| US7777006B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| PL1664123T5 (pl) * | 2003-09-22 | 2012-04-30 | Kamada Ltd | Wytwarzanie w dużej skali inhibitora proteinazy alfa-1 i jego zastosowanie |
| WO2005121163A2 (en) * | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Upfront Chromatography A/S | Isolation of plasma or serum proteins |
| ES2294976B1 (es) * | 2007-11-12 | 2008-12-16 | Grifols, S.A. | "procedimiento de obtencion de albumina humana de alta eficacia para su uso en terapia de detoxificacion". |
| EP3446710A1 (en) | 2017-08-25 | 2019-02-27 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Methods of inactivating viral contaminants |
| EP4408876A1 (en) | 2021-09-30 | 2024-08-07 | Ichnos Sciences SA | Methods of inactivating viral contaminants with a mixture of solvent and detergent |
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| CH630243A5 (fr) * | 1978-05-11 | 1982-06-15 | Nestle Sa | Procede de recuperation des proteines du lactoserum. |
| DE2916711A1 (de) * | 1979-04-25 | 1980-11-06 | Behringwerke Ag | Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung |
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| JPS5874617A (ja) * | 1981-10-28 | 1983-05-06 | Green Cross Corp:The | 人由来血液凝固第７因子含有水溶液の加熱処理方法 |
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| US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
| ES2053606T3 (es) * | 1987-04-27 | 1994-08-01 | Miles Inc | Metodo de preparacion de un inhibidor de alfa-1-proteinasa de alta pureza. |
-
1986
- 1986-07-11 US US06/884,446 patent/US4749783A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
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- 1987-06-27 EP EP87109274A patent/EP0252392B1/en not_active Revoked
- 1987-06-30 AU AU74975/87A patent/AU589868B2/en not_active Expired
- 1987-07-10 JP JP62171330A patent/JPH0768275B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 CA CA000541758A patent/CA1341269C/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-09 JP JP6119509A patent/JPH07116236B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-19 JP JP7023347A patent/JPH083197A/ja active Pending
Patent Citations (2)
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