DK155750B - Fremgangsmaade til paavisning af okkult humanblod - Google Patents

Description

DK 155750B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning af okkult humanblod i humanfæcesprøver.

Påvisning af okkult blod i fæces er en anerkendt metode til tidlig konstatering af carcinoma i colon. En gammel, pålidelig og simpel 5 undersøgelsesmetode er kemisk påvisning af okkult blod i fæces. Her beror testprincippet på hæmoglobins peroxidasevirkning, idet indikatoren (benzidin, o-toluidin eller guajak) oxideres i nærværelse af hydrogenperoxid, og der sker en blåfarvning. Ganske vist er der her tale om en uspecifik reaktion, da også andre fæces komponenter end 10 hæmoglobin har peroxidaseaktivitet, fx næringsmidler, først og fremmest blodpølse, råt kød samt plantebestanddele og tarmbakterier. I de kommercialiserede tests til påvisning af okkult blod i fæces, hvilke tests kan fås i form af testsæt, bliver patienten da også bedt om i 3 dage før testens art og i testperioden at holde sig fra at indtage råt 15 og halvråt kød samt pølsevarer (fx tartar, bøffer, lever, salami og blodpølse).

Disse forsigtighedsforanstaltninger er besværlige for patienten og kan ikke helt udelukke falske positive resultater, hvilket gør det nødvendigt med tidsrøvende og kostbare efterundersøgelser såsom coloskopi 20 eller rektoskopi.

Af denne grund har det været foreslået (Songster, C.L. et al. i American Cancer Society 1099ff, 1980) ud over et sædvanligt, med guajak imprægneret testsæt at anvende en yderligere prøve, som ikke er imprægneret med guajak, og i tilfælde af en positiv guajakprøve 25 undersøge denne ved hjælp af en immunologisk metode for tilstedeværelse af humant hæmoglobin.

Denne metode har imidlertid den ulempe, at denne yderligere fæcesprøve ikke ubetinget er identisk med de fæcesprøver, der underkastes guajaktesten, idet den fx er udtaget fra en anden fæcesudtømning 30 eller fra andet sted i fæces, hvilket igen kan føre til usikkerhed.

Der er derfor et behov for at undersøge fæcesprøver, der er blevet underkastet peroxidasetesten, for tilstedeværelse af komponenter af human oprindelse, der normalt ikke forekommer i humanfæces.

DK 155750B

2

Da den peroxidatiske metode udføres ved hjælp af en ethanolisk peroxidopløsning, har man tidligere haft den opfattelse, at denne metode ødelægger de immunologiske egenskaber i sådanne komponenter.

5 Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse har det i modsætning hertil overraskende nok vist sig, at dette ikke er tilfældet, men at det uden videre er muligt i en fæcesprøve, som i forvejen er undersøgt ved peroxidasemetoden, at udføre en immunologisk påvisning af komponenter af human oprindelse, som normalt ikke forekommer i 10 humanfæces.

Den foreliggende opfindelse bygger på denne erkendelse og angår en fremgangsmåde til påvisning af okkult humanblod i humanfæcesprøver efter peroxidasemetoden med benzidin, o-toluidin eller guajak som indikator, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der i 15 tilslutning til udførelsen af denne metode i samme fæcesprøve foretages en immunologisk påvisning af human hæmoglobin, human albumin eller en human globulin.

Som ovenfor omtalt anvendes der ved peroxidasemetoden benzidin, o-toluidin eller guajak som indikator.

20 Som human globulin kan nævnes immunoglobulin G, immunoglobulin. M eller immunoglobulin A.

Den immunologiske påvisning af disse komponervter kan foretages på enhver, inden for immunologien kendt måde. Sandwich-teknikken har vist sig at være en særlig foretrukken metode. Ved denne fremgangs-25 måde bestemmes den komponent, der skal påvises, ved hjælp af to specifikke antistoffer, af hvilke det ene er bundet til en fast fase, og det andet er forsynet med en mærkning. De anvendte antistoffer kan isoleres fra forskellige dyresera, men der kan også anvendes forskellige monoklonale antistoffer. Som fast fase har det vist sig særlig 30 velegnet at anvende kunststofsmåkugler. Som mærkning kan alle i immunologien kendte mærkningsmidler anvendes, hvorhos enzymer dog er særlig velegnede. Som enzym anvendes peroxidase.

DK 155750B

3

Den immunologiske påvisning af disse komponenter kan imidlertid også foretages ved hjælp af en latex-agglutinationstest.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler: 5 EKSEMPEL 1

Til humanfæces sættes 0, 1, 2, 4, 8 og 16 ml humanblod pr. 100 g frisk fæces, og der homogeniseres. Fra hver af disse fæcesprøver lægges en spatelspids i de to fordybninger i et testsæt "Colo-Rectal -Roche-Test®"*, og testsættene lukkes og opbevares i 2 dage ved 10 stuetemperatur.

Til påvisning af okkult blod i fæces fjernes nu snippen "Nur vom Arzt zu offnen", og der hældes først 1 dråbe af en opløsning af 0,7M citratpuffer med 20% ethanol (pH-værdi 5) og derefter 1 dråbe af en 3%'s ^C^-opløsning i ethanol på begge fæcesprøver, og efter 30 15 sekunder vurderes den resulterende farveintensitet (0-4+).

Til den påfølgende enzym-immunologiske påvisning af humanglobulin i fæces afskæres en 9 mm bred strimmel indeholdende de to fæcespletter i testsættet, og denne strimmel inkuberes i 5 ml 0,1M NaHCOg med pH-værdi 9,5 i 30 minutter ved 37°C. Efter grundig blanding afpi-20 petteres fra den klare, lugtløse, brun-gulfarvede ekstrakt 0,1 ml i et kunststof-reagensglas (0 = 1 cm), 0,1 ml 0,2M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,5 iblandes, en med (fåre)-anti-human-globulin sensibiliseret polystyrenkugle (0 = 6,35 mm) tilsættes, og der inkuberes i 1 time ved 37°C.

25 * Leverandør: Hoffmann-La Roche AG, Diagnostica, D-7889 Grenz- ach-Wyhlen.

Efter fraskillelse af det ikke-bundne materiale inkuberes kuglen igen i 1 time ved 37°C med 0,2 ml (gede)anti-human-globulin-peroxidase, opløst i 0,2M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,5 med 20% gede-

DK 155750B

4 serum og 2 g/liter kvægserumalbumin. Efter tre ganges vask med destilleret vand inkuberes kuglen til påvisning af den immunologisk bundne peroxidase i 30 minutter ved stuetemperatur i 0,5 ml substratpuffer (0,1M citratpuffer med pH-værdi 5,0 med 6 millimol 5 og 40 millimol o-phenylendiamin). Efter standsning af den enzymatiske reaktion ved tilsætning af 2 ml IN HCI bestemmes absorptionsdifferencen fotometrisk ved bølgelængde 492 nm (AA4g2 nm/RT/30 minutter3 til konstatering af indholdet af humanglobulin. Resultaterne er sammenfattet i nedenstående tabel 1: 10 TABEL 1

Testsæt Okkultblod-test Enzym-immunolo gisk test (farveintensitet) (ΔΑ492 nm/RT/30 15 minutter)

Uden fæcesprøve (reagensblindprøve) 0 0,000 Fæcesprøve uden humanblod 0 0,080' 20 Fæcesprøve med 1 ml human- blod/100 g fæces 0 0,300 Fæcesprøve med 2 ml human- blod/100 g fæces 0 0,410 Fæcesprøve med 4 ml human- 25 blod/100 g fæces 2 + 0,680 Fæcesprøve med 8 ml human- blod/100 g fæces 4 + 0,950 Fæcesprøve med 16 ml human- blod/100 g fæces 4 + 1,530 30 Af tabel 1 fremgår den enzym-immunologiske okkultblod-tests sensivi-tet, da absorptionsdifferencen stiger signifikant afhængigt af koncentrationen af humanblod.

DK 155750B

5 EKSEMPEL 2

Til 6 ens prøver humanfæces sættes 4 ml af hver af følgende reagenser: a) humanblod, b) gedeblod, c) kvægblod, d) kaninblod, e) hesteblod samt f) 10 mg peberrods-peroxidase pr. 100 g frisk fæces, 5 og der homogeniseres. Fra hver af disse fæcesprøver anbringes en spatelspids i de to fordybninger i et testsæt "Colo-Rectal-Roche-Test®", og testsættene lukkes og hensættes i 1 dag ved stuetemperatur.

Til påvisning af okkult blod i fæces fjernes nu snippen "Nur vom 10 Arzt zu offnen", og på fæcesprøven hældes først 1 dråbe af en op løsning af 0,1M citratpuffer med 20% ethanol (pH-værdi 5) og derefter 1 dråbe af en 3%'s F^C^-opløsning i ethanol, og efter 30 sekunder vurderes den resulterende farveintensitet (0-4+).

Til den påfølgende enzym-immunologiske påvisning af humanglobulin i 15 fæcesprøverne afskæres en 9 mm bred strimmel med de to fæcespletter i testsættet, og denne strimmel inkuberes i 5 ml 0,1M NaHCOg med pH-værdi 9,5 i 30 minutter ved 37°C. Efter grunding blanding afpi-petteres 0,1 ml af den klare, rød-brunfarvede ekstrakt ned i et reagensglas, 0,1 ml 0,2M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,5 20 iblandes, en med Cfåre)-anti-human-globulin sensibiliseret polystyrenkugle tilsættes, og der inkuberes i 1 time ved 37°C. Efter fra-skillelse af det ikke-bundne materiale inkuberes kuglen med (ge-de)-anti-human-globulin-peroxidase, opløst i 0,2M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,5 med 20% gedeserum og 2. g/liter kvægserum-al-25 bumin, i 1 time ved 37°C. Det ikke-bundne materiale fraskilles, og kuglen vaskes tre gange med destilleret vand og inkuberes derefter i 30 minutter ved stuetemperatur i 0,5 ml substratpuffer (0,1M citratpuffer med pH-værdi 5,0 med 6 millimol og 40 millimol o-pheny- lendiamin) til kvantitativ bestemmelse af den immunologisk bundne 30 peroxidase. Efter standsning af den enzymatiske reaktion ved tilsætning af 2 ml IN HCI måles absorptionsdifferencen fotometrisk ved bølgelængde 492 nm til konstatering af humanglobulinindholdet. Resultaterne er sammenfattet i nedenstående tabel 2.

6

DK 155750 B

TABEL 2

Testsæt Ok kultblod-test Enzym-immunolo gisk test 5 (farveintensitet) (ΔΑ492 nm/RT/30 minutter)

Uden fæcesprøve (reagensblindprøve) 0 0,000 10 Fæcesprøve uden tilsætning af blod 0 0,070 Fæcesprøve med 4 ml human- blod/100 g fæces 2 + 0,650 Fæcesprøve med 4 ml gede- 15 blod/100 g fæces 2 + 0,050 Fæcesprøve med 4 ml heste- blod/100 g fæces 2 + 0,080 Fæcesprøve med 4 ml kanin- blod/100 g fæces 2 + 0,080 20 Fæcesprøve med 4 ml kvæg- blod/100 g fæces 2 * 0,110 Fæcesprøve med 10 mg per- oxidase/100 g fæces 4 + 0,050

Af tabel 2 fremgår den enzym-immunologiske okkultblod-tests specifici-25 tet, da kun prøver med et indhold af humanblod viser en signifikant stigning i absorptionsdifferencen, hvorimod prøver med animalsk blod eller med peroxidase (men uden humanblod) ikke viser en sådan stigning, men nok en farven intensitet.

Claims (1)

1. DK 155750B Fremgangsmåde til påvisning af okkult humanblod i humanfæcesprøver efter peroxidasemetoden med benzidin, o-toluidin eller guajak som indikator, 5 kendetegnet ved, at der i tilslutning til udførelsen af denne metode i samme fæcesprøve foretages en immunologisk påvisning af human hæmoglobin, human albumin eller en human globulin.