DK157170B - Koncentrat af den anti-haemofile faktor viii samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 157170 B

Den foreliggende opfindelse angir et koncentrat af den anti-hæmofile Faktor VIII, ogsâ kaldet AHF, som er af den i krav l's indledning angivne art samt en fremgangs-mâde til fremstilling af et sâdant koncentrat.

5 Det er kendt, at blodets evne til at koagulere styres af et system af koagulationsproteiner, hvoraf AHF eller Faktor VIII er en vigtig komponent.

Personer med hæmofili-A eller bledersygdom har helt eller delvis mistet evnen til at producere AHF. Til 10 behandling af denne sygdom injiceres AHF-holdige præpa- rater, og det har derfor betydning at rade over præpara-ter indeholdende passende heje koncentrationer af AHF og med lavest muligt indhold af andre proteiner, sâsom fibrinogen og immunglobuliner.

15 Især ved behandling af inhibitorpatienter, d.v.s. patien ter, der producerer antistoffer mod AHF, og som derfor skal hâve præparatet tilfert i overskud, med heje doser af AHF, er det vigtigt, at den specifikke aktivitet (enh. AHF/mg protein) er hej, idet en tilfarsel af "andre 20 proteiner" i sterre mængder kan fremkalde uenskede bivirk- ninger. Ved 1 AHF enhed forstâs faktor VIII aktiviteten af 1 ml normalt blodplasma. Bivirkninger ved AHF-behand-ling forârsaget af immunglobuliner er f.eks. beskrevet af Tilsner et al., Münch. Med. Wschr. 124 (1982) nr.

25 22, p. 553-557.

AHF udvindes normalt af det sâkaldte kryopræcipitat, der hovedsageligt bestâr af fibrinogen, albumin, IgG og IgM, mens AHF udgor mindre end 1¾ af den totale pro-teinmængde. Den specifikke aktivitet af et kryopræcipitat 30 er typisk 0,1 - 0,3 enh. AHF/mg protein.

Det er kendt, at man kan fjerne en del af det unedvendige 2

DK 15 717 0 B

protein ved fældning med glycin eller polyethylenglycol (PEG). Eventuelt kan fældning udferes flere gange, ferst med det ene og derefter med det andet fældningsmiddel.

Det har sâledes lange været kendt at fælde AHF med ca.

5 2 M glycin ved lav temperatur, jfr. Webster et al., se Amer. J. Med. Sc. 250, nr. 6, p. 643-650 (1965).

Webster anvendte et kryopræcipitat, som oplostes i vand og fraktioneredes ved lav temperatur (< 10°C) med stigende koncentrationer af glycin indtil 2,3 molær. Ved denne 10 type fældning udnyttes, at AHF i kulden udfældes sammen med fibrinogen ved tilsætning af glycin. Herved opnâs ^ en specifik aktivitet pâ 0,3 - 0,5 enh. AHF/mg protein.

Fra beskrivfilsen til E'P ip.ate,ntskrift nr. 32655, er det 15 kendt, at mam ved .at gaanmeinfare fraktioneringen af genop- lest kryopræcipitat med 2M glycin som fældningsmiddel ved hejere temperaturer, sasom 30-45°C, ferst far udfældet en stor del af de andre proteiner, sâsom fibrinogen, sâledes at AHF forbliver i supernatanten, hvorfra det 20 kan tidvindes.

Nâr PEG anvendes som fældningsmiddel, foretages hyppigst en fraktioneret PEG-fældning, hvor hovedparten af fibrino-genet og noget IgM fjernes ved fældning med lav PEG-koncentration ( 2—6?ô), hvorefter AHF udfældes fra den 25 albuminholdige supernatant med haj PEG-koncentration (5-15?ô). Sâdanntp PEG/PEG-fældninger er beskrevet af bl.a. Newman et' al., Brit,J,Haematology 2_1, 1972, p.

1; US patentskrift nr. 3.652.530; DK patentskrift. nr.

146 895, FR patentskrift nr. 2.460.305, DK patentansogning 30 nr. 3602/81. Ved disse metoder opnâs et AHF-koncentrat med en specifik aktivitet pâ 1 - 3 enh./mg protein.

Ifolge US patentskrift nr. 4 027 013 (Bick et al.) befries en blanding indeholdende koagulerbart fibrinogen og Faktor VIII, der ud fra eksemplerne mâ antages at være genoplost

DK 157170 B

3 kryopræcipitat, for 90 % af fibrinogenindholdet ved fældning med en blokcopolymer af "Pluronic" typen, idet man i en mindre foretrukken udforelsesform, der forer til væsentligt lavere udbytter, ogsâ kan anvende PEG.

5 Supernatanten fra den forste f ibrinogenfældning behandles derpâ med hojere koncentrationer af "Pluronic"^) til udfældning af faktor VIII og residualt fibrinogen.

Det faktor VlII-holdige bundfald genoploses i mere koncen-treret form og behandles derpâ med et thrombinmimetisk 10 enzym, der angiveligt specifikt koagulerer den totale mængde residual fibrinogen, men ikke i væsentlig grad pâvirker faktor VIII's biologiske aktivitet. Dette sidste er dog ikke nærmere dokumenteret.

Det er vigtigt at bemærke, at Bick for at stabilisere 15 faktor VIII under den efterfolgende lyofilisering tilsæt- ter albumin, hvilket ikke er tilfældet ved lyofilisering af koncentratet ifolge opfindelsen.

Processer med flertrinsfældninger, hvor mere end et fældningsmiddel anvendes, er ligeledes kendt. F.eks.

20 kan glycinfældning ved lav temperatur udfores for eller efter PEG/PEG-fældninger, evt. kan glycinfældninger udfores bâde for og efter PEG/PEG-fældningerne. Dette er beskrevet i US patentskrift nr. 3 682 881 og US pa-tentskrift 3.631.018. Almindeligvis opnâs herved præpa-25 rater med en specifik aktivitet pâ 1 - 3 enh./mg protein.

Nâr der i denne sammenhæng fældes med glycin ved lav temperatur, udnyttes det AHF-holdige bundfald, d.v.s. at der ved efterfolgende PEG-fældninger pâ genoplost AHF-holdigt præcipitat kun er en lav koncentration af 30 glycin i oplosningen.

DK 157170 B

4

Anvendes glycin ved hej temperatur i forbindelse med PEG-fældning, udf0res forst en glycinfældning, der efter-lader AHF i supernatanten, hvor koncentrationen af glycin er hoj, og derefter fældes AHF derfra med en PEG-fældning 5 ved ‘hej PEG-koncentration. Herved kan opnâs en specifik a.ktivitet pâ 1 - 3 enh./mg protein.

Det ved denne type glycin/PEG-fældning opnâede koncentrat ligner et koncentrat opnâet ved PEG/PEG-fældning. Som det fremgâr af tabel 1, indeholder 1. fældningssuperna-10 tant mere IgM og IgG efter en varm fældning med 2 M

glycin end efter en fældning med lav PEG-koncentration (4%)· Efter slutfældningen med hoj PEG-koncentration (9¾) indeholder koncentratet fra glycin/PEG-fældningen imidlertid mindre IgM og IgG end koncentratet fra PEG/-15 PEG-fældningen.

TABEL 1

Sammenliqninq mellem PEG/PEG- og varm qlycin/REG-fældninq af AHF fra qenoplest kryopræcipitat

Fraktion_% AHF_% IgM % IgG

Kryopræcipitat 100 100 100 1. "FEG, 4%, supernatant 72" 38 55 PEG/PEG, 4/i, 9¾ koncentrat 40 24 15 2M glycin supernatant 68 76 79 2M qlycin/PEG, 9%, koncentrat 36 18 8 Ârsagen hertil er ikke tidligere erkendt, men det ma antages, at den polære aminosyre i glycinsupernatanten virker indsaltende, især pâ basiske proteiner, sâledes at IgM og IgG ikke sa let udfældes med PEG alene. Det 20 ved glycin/PEG-fældningen opnâede koncentrat har dog stadig et uansket hajt indhold af fibrinogen, IgG og IgM, jfr. tabel 2 nedenfor.

DK 157170 B

5

Formâlet med den foreliggende opfindelse er at tilveje-bringe et hajrent, direkte lyofiliserbart AHF-koncentrat, 5 der har en sa haj oplaselighed og specifik aktivitet, at det kan indgives intravenast i injektionsdoser pâ 1000 enheder oplast i 2-5 ml injektionsmedium, og som indeholder faktor VlII-kompleksets anden bestanddel faktor VIII: RP, der virker stabiliserende pâ'den koagu-lationsaktive faktor V111 :C- 10

Dette opnâs ved AHF-koncentratet ifalge opfindelsen, der er ejendommeligt ved det i krav 1' kendetegnende del anfarte. Et sâdant koncentrat kan ifalge opfindelsen fremstilles som angivet i krav 2's kendetegnende del.

15 Det bemærkes, at der ikke er en entydig sammenhæng mellem et AHF-koncentrats specifikke aktivitet og dets oplaselig-hed, idet sidstnævnte afhænger af arten af avrige prote-iner, især fibrinogen, men at en haj specifik aktivitet ait andet lige ogsâ vil indebære en haj oplaselighed.

20 Fra US patentskrift nr. 4 361 509 (Zimmermann et al.) kendes ganske vist et faktor VIII:C præparat, fremstillet ud fra plasma eller kommercielle faktor VIII koncentrater og som er befriet for faktor VIIIîRP ved direkte immun-adsorption pâ en sajle af agarosegel, hvortil der er 25 koblet monoclonale antistoffer, der udviser haj affini- tet over for faktor VIII:RP, men dog binder sâvel faktor V111 : C som VIIIîRP, og efterfalgende desorption af faktor VIII.-C med en calciumholdig buffer. Zimmermann's Faktor V111 :C koncentrat udviser en meget haj specifik aktivi- 30 tet (ca. 2300 enh./mg) og en meget haj oplaselighed (545-1172 enh./mg) i vandige injektionsmedier, men er som nævnt til forskel fra koncentratet ifalge opfindelsen ogsâ befriet for faktor VIIIîRP.

DK 157170B

6

Opfindelsen er baseret pâ den overraskende erkendelse, at man kan opnâ et særlig rent AHF-præparat, indeholden-de sâvel faktor VIIIïC som VIIIîRP, men sam i det væsent-lige er befriet for andre proteiner, især immunglobuli-5 ner, ved at fraktionere et kryopræcipitat med PEG pâ en sèdan mâde, at der farst udfældes en væsentlig del, fortrinsvis mindst 80 %, af fibrinogenet, og at der i et efterfalgeade trin fældes med mere PEG i nærværel-se af et indsaltningsmiddel. Tilsætningen af indsalt-10 ningsmidle.t medfarer ikke i sig selv udfældninger, men pâ gxund af t i 1 s t ed e v æ r e1 s e n af indsaltningsmldlet modi-ficexies betiin.ge'lsexrue umdex den e.fierf algemde 'P'EG-fæld-ning, 3.81^4¾¾ at der opnâs en skarpere fraktionering, dvs. et renexe AHF-koncentrat med en haj specifik aktivi-15 tet, jfr. Tabel 2 nedenfor. Den haje renhed bevirker at .præparatet har en oplaselighed pâ 200-500 enheder faktor VIIIîC (AHF) pr. ml. Da en normal injektionsdo-sis er 1000 enheder, kan man sâledes najes med ca. 2-5 *nl injektionsmedium. Da oplaseligheden af de bedste 20 pâ markedet værende AHF-præparater angines at være 40- 50 enheder pr. ml svarende til et in jektionsv/olumen pâ 25-20 ml, medfarer præparatet ifalge opfindelsen sâledes en meget betydelig lettelse for patienten.

DK 157170 B

7 TABEL 2

Effekt af qlycintilsætninq under PEG/PEG-fældninq fra qenoplast kryopræcipitat

Procès_AHF enh./mq % IgG % IgM % Fibr.

Kryopræcipitat 0,32 100 100 100 4% PEG/9% PEG 2,53 15 24 1 2M glycin/9/°ô PEG 2,27 8 18 2 4K PEG/12 % PEG + 2M glycin 4,36 4 13 0,5

Ved fældningen ifalge opfindelsen er glycin sâledes anvendt som indsaltningsmiddel, idet det stabiliserer de uanskede proteiner ved at holde dem i oplasning, hvorimod de hidtil kendte metoder udnytter glycins udsal-5 tende effekt pâ fibrinogen/AHF. Ved anvendelse af ind saltningsmiddel under en PEG/PEG-fældning i henhold til krav 2 opnâs altsa en mere selektiv udfældning af AHF.

Uden at ville være bundet til nogen bestemt teori antages 10 det, at indsaltningsmidlets virkning beror pâ, at det forager forskellen i overfladeladning mellem Faktor VIII og de avrige proteiner, navnlig IgG.

Det er vigtigt at fjerne hovedparten af fibrinogenet i farste trin, fordi AHF-præparatet ellers ville være 15 stærkt forurenet med fibrinogen, og fordi tilstedeværelsen af fibrinogen i andet trin vil modvirke indsaltnings-effekten og hindre en selektiv udfældning af Faktor VIII.

Som indsaltningsmiddel ved fremgangsmâden ifalge opfin-20 delsen benyttes hensigtsmæssigt en aminosyre, især basiske aminosyrer, fortrinsvis lysin eller arginin tilsat i form af hydrochloridet. André anvendelige aminosyrer er f.eks. histidin, samt polære aminosyrer, sâsom serin, glutaminsyre, glycin og £-aminohexansyre. André anvendelige

DK 157170 B

8 indsaltningsmidler er kulhydrater, fortrinsvis mono-eller disaccharider f.eks. glucose, og saccharose, men ogsâ oligosaccharider samt sukkeralkoholer, f.eks. sor-bitol og glycerol.

5 En oversigt er givet i Tabel 3.

TABEL 3

Effekt af indsaltningsmidler pâ PEG/PEG-fældninq af AHF fra qenoplest kryopræcipitat

Indsaltningsmiddel Spec. aktivitet % udbytte af _enh. /mq_AHF fra plasma

Intet 2,53 18 2M glycin 4,36 17 0,5M lysin, HCl 8,4 18 0,5M arginin, HCl 7,0 14 l,OH £. -aminohexansyre 5,0 10 1,5M glucose 3,85 18 1,0M saccharose 5,35 20

Det foretrukne indsaltningsmiddel er lysin-HCl. Pâ teg-ningen er^vist lysins indflydelse pâ PEG/PEG-fældning af AHF udtrykt som henholdsvis enh. AHF/mg protein (fig.

1) og “ή udbytte i forhold til kryopræcipitatet ved for-10 skellige lysinkoncentrationer (fig. 2). Lysin tilsættes fortri-n.3-v.is i koncentrationer pâ Q,.l - 0,9, især 0,..3 - 0,8, helst 0,5 - 0,7 tnol/1.

Som det fremgâr af fig. 1 er der proportionalitet mellem tilsa’t" lysinmængde og specifik aktivitet af slutprod-uk-15 tet, men selv smâ lysinmængder har en klar effekt. Som det ses af fig. 2 falder udbyttet af AHF ved den anvendte PEG-koncentration imidlertid, hvis der anvendes mere end 0,75M lysin, idet denne mængde lysin ogsâ virker indsaltende pâ AHF.

DK 157170 B

9

Et andet foretrukket indsaltningsmiddel er arginin-HCl h vis indflydelse pê PEG/PEG-fældningen af AHF fremgâr af nedenstâende tabel 4, hvoraf det ses, at tilfreds-stillende udbytter opnâs ved koncentrationer pâ 0,2 5 - 0,8. Under hensyn til udbyttet er den foretrukne mængde 0,3 - 0,5, især 0,4 mol/1.

TABEL 4

Arqinins indflydelse pâ PEG/PEG-fældninq af AHF Mol arqinin/1 % udbytte fra plasma enh. AHF/mq protein 0 20 2,3 0,2 20 4,9 0,4 17 6,4 0,6 14 6,1 0,8 4 4,6

De anvendte koncentrationer af PEG og indsaltningsmiddel samt pH under fældningen afhænger især af det anvendte indsaltningsmiddel, idet det som generel regel kan siges, 10 at de mere ladede indsaltningsmidler kan anvendes i mindre koncentrationer. Den valgte indsaltningsmiddelkon-centration hviler pâ et kompromis, idet man ved haje koncentrationer kan reducere IgG-mængden næsten fuldstæn-digt, men samtidig indsaltes ogsâ en del Faktor VIII, 15 hvorved udbyttet reduceres.

Ved fremgangsmâden ifalge opfindelsen anvendes PEG med en molekylvægt pâ 200-20.000, fortrinsvis 2.000-12.000, især 3.000-6.000, men PEG 3000 foretrækkes. PEG-koncen-trationen i det farste fældningstrin er 2-6 vægt-%, 20 fortrinsvis ca. 4 vægt-% og i det andet trin 6-20 vægt-%, fortrinsvis ca. 12 vægt-%. pH under farste fældningstrin kan være 6,0 - 8,5, fortrinsvis 6,2 - 6,6, især ca.

6,4, og under andet trin 5,0 - 8,5, fortrinsvis 6,0 - 6,6, især ca. 6,3.

DK 15 717 0 B

ίο

Temperaturen i det farste fældningstrin kan være 6 -22 °C, fortrinsvis 18 - 22 °C. I andet fældningstrin er temperaturen ogsâ fortrinsvis 18 - 22 °C (stuetempera-tur ).

5 Ved udvindingen af det omhandlede Faktor VIII koncentrat kan man anvende kryopræcipitat fra humant blodplasma eller andre Faktor VlII-holdige blodfraktioner, ligesom man kan anvende plasmafraktioner fra dyrearter, eksempel-vis svin.

10 Fremgangsmâden ifalge opfindelsen skal i det falgende fiorklaries nærmere ved hjælp af nogle eksempler, der fogsâ illustrerer ©ipairibejdningen af koncentratet. Til præparatfremstililng kan MF-opliBS’ningBn om ansket under-kastes en varmebehandling i 10 timer ved 6ΐΡ0 i .nærværelse 15 af en passende stabilisator sâsom en blanding af glycin og saccharose for at opnâ en hepatitissikring og/eller om ansfiet lyofiliseres. .

EKSEMPEL 1

Kryopræcipitat fra 600 ml human blodplasma indeholdende 20 240 enheder Faktor VIII:C genoplases i 28 ml citrat/glu- cosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorp-tion med^ftl^O^. Derefter tilsættes 4 vægt-% PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HCl, og blandingen inkube-res 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein 25 fjernes ved centrifugering, og lysin-HCl tilsættes til en kanc-entration pa-0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-?ô· PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genoplases 30 i citrat/glucose-NaCl, pH 7,8. Det genoplaste bundfald, der i.ndeholdt 112 enheder faktor VIII :C og 9 mg total-protein, har sâledes en specifik aktivitet pâ 12 enheder Faktor VIII:C (A H F) pr. mg protein, og udbyttet af Faktor

DK 157170 B

11 fra plasma er 20%. Der blev ikke foretaget oploselig-hedsbestemmelse, men det ma antages at oploseligheden er mindst 200 enheder Faktor VIII:C/ml,, jvf. eksempel 5 og 6.

5 Disse resultater er optaget i nedenstâende tabel 5 sam- men med resulater fra sammenligningsforspg uden lysintil-sætning. Tabellen viser, at der ved fremgangsmâden ifal-ge opfindelsen kan opnâs en væsentlig forogelse i specifik aktivitet og en reduktion af indholdet af immunglobulin 10 G i forhald til PEG/PEG fældninger uden tilstedeværelse af indsaltningsmiddel.

EKSEMPEL 2 30 ml kryooplesning opnâet analogt med eksempel 1 og adsorberet med M^Q^, tilsættes 4 vægtprocent PEG 3000.

15 p'M iadstilles til 6,4_med 0,5 M HCl, og blandingen inku-ber-es 30 imimutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og "indsaltningsmiddel" tilsættes. Herefter tilsættes yderligere 8 vægt-% PEG 3000, og pH justeres til 6,3- med 0,1 M NaOH. Efter inkiu-20 bation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genoploses i citrat/glucose-NaCl, pH 7,8.

Tabel 6 angiver de opnâede resultater for forskellige indsaltningsmidler. Der blev ikke foretaget opleselig-25 hedsbestemmelser, men det antages at oploseligheden er mindst 200 enheder Faktor VIII:C/ml,, jvf. eksempel 5 og 6.

DK 157170 B

12 c c

-P -H -P -H

po 0 \ 0 po 0 \ 0 ri -P P -P Ή+) h+l

Cp ri 0 O U- -H 0 O

•H Ta "Ό P ·Η Ta "O P

O ri 0 Q NO O <t CJ ri 0 Q.

0- pjt oo <t <f 0-px: □ on o cm <r q. -Y c σ ^ ·> ·> ο. po c cr *>».·> ^ en 0 0 e cm ri cm en CO 0 e ri o <t mt

ri CM

0 0

E E

P 0 P 0 O 0 O 0

•P U H P U H

PO ·· a po ·· a 0 ri 0 1—1 L H (0 LH® H h ON 00 Ο i—IP On 00 On CMOn

è?P=CP iHr-ICM o?>CP ri ri CM H

CD CD

en en 1— 1 ri

Cp Cp 0 ΙΛ C0

P ·> P

œ o ooo 0cn n ri en

TT E rri ΙΛ TT E CM

Cl Cl

m -H OJ! -H OX

0 P 0 P

_J +J Q.-P —I -P Ω.-Ρ

LJ ΟΡΡΟ Ll! O -P PO

CO U ZI O CD PCD en <C Q.I—I TT Q.'—I TT *>

1—00 ri- 0 O 00 CM

cnpoo<noN cnpOrH on i'' e -h o. tn i~~ e ·η ο. ή cm cm ri

CJ -P CJ -P

·· Zi ·· PO

i—i TT 1—1 O

PI TT l-ri TT

H O H O

> P > P

pq. a pq.

0 P -P l-ri 0 P -P

TT O TT TT O 3 0 -P Ή II 0 -P Ή _C PC 0 On <j* CM -CPO0 00 CM ri ΙΛ00 C0 ο o ri c 0 oom cmo

Ld Li_ ri ri ri i—I O Ld Li_ ri i—I <—I H H

o? en

-H CM

LJ

m

*p CD 1—1 O

CO Ld CJ CO Ή Û_ 31 CM 0

Ή CD CD 1 Q TJ

® ô? LJ Ld C O TT 0

-Pp^ CM 0l Q- ri -H CO

HO) \ 0 TT E OC

DS ri S? à? > 0 0 -h P ri

TT 0 CM CM ri Ta CT 1 0 C

TT P 00 ri I—I C C -Cri •ho s: -p -Η cri ο σ

E cp lllenE C ri 0 OP

p-· efN0 -P O >. 00 0 CD CD CD ·· -P ri <—I 0 m 0 LJ LU Ld O 0 0 ri -P I—I ΞΖ O Q_ Q_ CL 0 0 \ 0 en ΞΤ S! en

Il O TT jO TT ri -P en ΟΙΛ p è?o?o?0 co es:- ~

Cû. <t <t E X ri£ ri CM ri ri O

DK 157170 B

13 EKSEMPEL 3

Kryopræcipitat fra 2,5 1 plasma genoploses i 100 ml citrat/glucosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-% PEG 5 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HCl, og blandingen inkuberes 30 mlnutter ved stuetemperatur. Udfældet pro-tein fjernes ved centrifugering, og arginin-HCl tilsættes til en koncentration pà 0,40 mol/1. Yderligere 8 vægt-S PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1M 10 NaOH. Efter inkubation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved. oentrifugering og genopleses i 20 ml citrat/saccharose/NaCl, pH 7,8. Koncentratet indeholder 360 enheder Faktor VIII:C og 52 mg protein (specifik aktivitet 7 enh./mg). Der blev ikke foretaget 15 bestemmelse af oploseligheden af koncentratet, men der antages at være mindst 200 enheder/ml jvf. eksempel 5 og 6.

EKSEMPEL 4

Kryopræcipitat fra 2,5 1 plasma genoplases i 100 ml 20 citrat/glucosepuffer jpg befries for prothrombinkomplex ved adsorption med A^O^. Der tilsættes 4 vægt-?ô PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HCl, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin-HCl tilsættes til 25 en koncentration pâ 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-?i PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1M NaOH. Eftei inkubation 45 min. ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genoploses i 5 ml ci-trat/saccharose/NaCl, pH 7,8. Koncentratet indeholder 30 460 enh. Faktor VIII:C og 30 mg protein (specifik aktivi tet 15 enh./mg). Der blev ikke foretaget bestemmelse af oploseligheden af koncentratet, men der antages at være mindst 200 enheder/ml jvf. eksempel 5 og 6.

DK 157170B

14 EK5EMPEL 5

Kryopræcipitat fra 80 kg plasma genopleses i 2500 ml citrat-puffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med A^O^· Der tilsættes 4 vægt-% PEG 3000.

5 pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HCl, og blandingen inku-berer 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin- HCl tilsættes til en koncentration pâ 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-% PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M 10 NaOH. Efter inkubation pâ 45 min. ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genoploses i 60 ml citrat/saccharose/NaCl. Oplssningen sterilfil-treres og dispenseres i 15 hætteglas. Efter frysning og frysetorring indeholder hvert hætteglas 1000 enh.

15 AHF, med en specifik aktivitet pâ 37 enh./mg protein.

Da de i ait 15.000 enheder AHF er udvundet af 60 ml oplosning, kan det fastslâs, at oploseligheden er mindst 250 enheder/ml.

EKSEMPEL 6 20 Kryopræcipitat fra 13 1 plasma genoploses i 525 ml ci- trat/glucosebuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med A^O^. Der tilsættes 4 vægt-% PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HCl og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur.Udfældet protein 25 fjernes ved centr’ifugering og lysin-HCl tilsættes til en koncentration pâ 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-% PEG 3000 tilsættes og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation 45 min ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genoploses i 2,1 ml 30 citrat/saccharose/NaCl, pH 7,8. Koncentratet, som er pâ 3,1 ml, indeholder 2180 enh. FVIIIîC og 81 mg protein oploseligheden er sâledes 703 enh/ml og den specifikke

DK 157170 B

15 aktivitet 27 enh/mg.

EKSEMPEL 7 I dette eksempel undersoges det, hvorvidt den indsalte-de virkning af glycin kunne forbedres ved tilsætning 5 af NaCl, der hæver ionstyrken, og hvorvidt NaCl, der er et kendt indsaltningsmiddel, alene har tilstrækkelig indsaltende virkning under en PEG-fældning til at fore til et koncentrat ifolge opfindelsen.

For yderligere at variere procesbetingelserne valgtes 10 det at gennemfore fældningen ved lav temperatur (6-9 °C).

50 g kryopræcipitat genoploses i 200 ml dest. t^O ved stuetemperatur. 12,3 ml 1,3 % A^0^ og 7,9 g PEG 3000 (3 % ) tilsættes. pH justeres til 6,7 med IM HAc ag blan-dingen nedkoles til 9 °C. Efter nedkoling fjernes bundfald 15 ved centrifugering 15 min ved 9 °C. Yderligere 8¾ PEG, 2M glycin (13 %) og 14 % NaCl tilsættes, hvorefter pH justeres til 5,7 ôg”’b landingen nedkoles til 6 °C. Burad-faldet isoleres ved centrifugering i 15 min ved 6 °C og genoploses i 50 ml (1/5 kryo vol.) 5mM citrat, 0,13 20 M NaCl, 0,1 M glycin pH 7,3.

FV111 og proteinindholdet i det genoploste koncentrat var lav. Derfor blev det med varierende NaCl- og glycin-koncentrationer undersogt, om indsaltningen som forven-tet skyldes glycin. Som det fremgâr af nedenstâende DK 157170 B '; 16 tabel, udfældes FVIII kun i ringe grad uden NaCl. NaCl tilsætning alene medfarer imidlertid ikke eget protein-udfældning (som PEG tilsætning). Tværtimod virker NaCl i haj grad indsaltende. Ved den lave temperatur medvir-5 ker glycin til at fælde FVIII, men den heje specifikke aktivitet kan ikke opnâs uden NaCl tilsætning.

Effekt af glycin og varierende NaCl koncentration % + 13 % glycin -glycin

NaCl__ mg* » FVIII :C Spec. akt. mg* % FVIII :C spec.akt.

protein udbytte enh/mg protein udbytte enh/mg 0 5,86 5 0,22 6,50 14,4 0,58 5 3,96 26 1,74 10 2,26 58 6,73 3,89 15,9 1,07 12 2,18 41 4,90 14 0,88 17 5,02 2,82 5,2 0,49

Kryopræc. 100 0,58 38 PEG/

Al^O^ super natant 73 0,77 * bestemt som E^qq EKSEMPEL 8 (Bestemmelse af faktor VIII :RP-indholdet)

Det fremgâr af Zimmermann, US patentskrift nr. 4 361 509 10 at der for at opnâ en adskillelse af de to komponenter 1 Faktor VIII komplexet ma tages tilflugt til specifikke rensningsmetoder, sâsom immunadsorption eller ion-bytningskromatografi.

I de foregâende eksempler hvor der som udgangsmateriale 15 anvendes (oplast) kryopræcipitat, der sâledes indeholder 17

DK 157170 B

—r * i

Faktor Vlll-komplexet, foretages der pâ intet tidspunkt sâdanne rensninger, og det er derfor ev/ident for gennem-snitsfagmanden, at de i eksemplerne opnâede Faktor VIII koncentrater stadig indeholder sâvel koagulationsaktivt 5 Faktor VIII:C som von Willebrand-faktoren Faktor VIII:RP.

Imidlertid blev der ikke gennemfort mâlinger af Faktor VIΓΙ:RP-indholdet og det er derfor ikke muligt at ind-foje talværdier herfor i de eksisterende eksempler.

Der er imidlertid gennemfort Faktor VIII:C og Faktor 10 VIIIrRP bestemmelse pâ en række AHF-præparater ifelge opfindelsen, der forhandles under betegnelsen ''NORDIOCTif^ og som er fremstillet analogt med eksempel 5, altsâ i enhedsdoser pâ 1000 enheder Faktor VIII:C (+ 20?ô).

Der opnâedes felgende resultater:

Præparat FVIII:RP, Enh/dosis FVIIIîC, Enh/dosis 44102 727 847 44203 936 1028 44301 82'5 1161 44302 942 1109 44401 566 909 44402 808 1034 15 FVIII-RP er bestemt ved raketimmunelektroforese med antistof fra DAKO (A 082). Som standard er anvendt en pool af normal plasma (<bl Enh FVIII-RP/-ml).

FVIIIîC er bestemt ved et-trinskoagulationsassay. Som standard er anvendt en pool af normal .plasma (yi Enh 20 FVIIIîC/ml).

Claims (9)

1. Koncentrat af den antihæmofîle faktor VIII (AHF) i det væsentlige fri for denatueret AHF og andre i ud-gangsmaterialet for koncentratet tilstedeværende plas-maproteiner, men ikke for faktor VIII:RP, k e n d e-5 t e g n e t ved, at det udviser en opleselighed i et vandigt injektionsmedium pâ 200 - 500 enheder AHF/ml og en speeifik aktivitet pâ 3,85 - 50 enheder AHF/mg protein stammende fra udgangsmaterialet for koncentratet og at det kan fremstilles ved rensning af en oplesning 10 af et kryopræcipitat fra blodplasma eller en anden faktor VlII-holdig blodfraktion, til fjernelse af prothrombin og pâfolgende fraktionering med polyethylenglycol, PEG, omfattende et trin til udfældning af hovedparten af fibrinogen ved hjælp af 2-6 vægt-% PEG 200-20.000 og 15 et efterfolgende trin, ved hvilket supernatanten fra den ferstnævnte PEG-fældning fældes med 6-20 vægt-% PEG 20-20.000 i nærværelse af et indsaltningsmiddel valgt blandt aminosyrer, fortrinsvis basiske, kulhydrater og sukkeralkoholer, hvorpâ det udskilte bundfald med 20 koncentre.ret indhold af AHF udvindes.

2. Fremgangsmâde til fremstilling af et AHF-koncentrat ifolge krav 1 eller 2 hvorved en oplosning af et kryopræcipitat fra blodplasma eller en anden faktor VIII-holdig blodfraktion renses til fjernelse af prothrombin 25 og dernæst fraktioneres med polyethylenglycol, PEG, omfattende et trin til udfældning af hovedparten af fibrinogen ved hjælp af 2-6 vægt-% PEG 200-20.000 og et efterfolgende trin til udfældning af AHF, kende-t e g n e t ved, at supernatanten fra den forstnævnte 30 PEG-fældning fældes med 6-20 vægt-% PEG 200-20.000 i nærværelse af et indsaltningsmiddel valgt blandt aminosyrer, fortrinsvis basiske, kulhydrater og sukkeralkoholer, hvorpâ det udskilte bundfald med koncentreret indhold af AHF udvindes. DK 157170B

3. Fremgangsmâde ifelge krav 3, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes lysin-HCl eller arginin-HCl.

4. Fremgangsmâde ifalge krav 3, kendetegnet 5 ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes et kulhydrat, fortrinsvis et mono- eller disaccharid.

5. Fremgangsmâde ifalge krav 5, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes saccharose.

6. Fremgangsmâde ifalge krav 3-6, kendeteg- 10 net ved, at der ved fældningen i farste trin tilsættes PEG til en koncentration pâ ca. 4 vægt-?i af oplasningen.

7. Fremgangsmâde ifalge krav 3-7, kendetegnet ved, at der i andet fældningstrin tilsættes PEG svarende til en totalkoncentration pâ ca. 12 vægt-?ô.

8. Fremgangsmâde ifalge krav 4, kendetegnet ved, at der tilsættes lysin-HCl eller arginin-HCl i en mængde svarende til en lysin- eller arginin-koncen-tration pâ 0,1 - 0,9, fortrinsvis '0,3 - 0,8 mol/1.

9. Fremgangsmâde ifalge krav 3-9, kendeteg-20 net ved, at pH under farste fæMningstrin er 6,0 - 8,5, fortrinsvis 6,2 - 6,6, især ca. 6,4, og under andet fældningstrin er 5,0 - 8,5, fortrinsvis 6,0 - 6,6 især ca. 6,3.