DK157887B - Fremgangsmaade til fremstilling af biokompatible produkter ved immobilisering af apyrase - Google Patents

Description

DK 15 7 8 8 7 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af biokompatible produkter, især protetiske artikler, sonder, slanger, nåle og membraner, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at apyrase immobiliseres 5 på polymere bæremidler, CM-cellulose undtaget, eller metalbæremidler.

Apyrase er et enzym, der er i stand til at katalysere omdannelsen af adenosin-diphosphat (ADP) til adenosinmonophosphat (AMP) efterfulgt af omdannelsen 10 af denne sidste til adenosin.

Muligheden af at bibringe biokompatible egenskaber til forskellige materialer er for tiden af enorm praktisk betydning. I denne henseende eksisterer der materialer, der på grund af deres gode mekaniske forar-15 bejdnings- og styrkeegenskaber og i fravær af toxicitet,ville finde umiddelbar anvendelse ved fremstillingen af proteser med middel eller lang varighed til implantering eller ved konstruktion af elementer til hjælpemaskineri til anvendelse‘ved ekstra-20 korporal cirkulation, såsom nyredialyseapparatur eller hjerte-lungemaskiner.

Til dette formål kunne der anvendes materialer, der ligger inden for et meget bredt område fra alifatiske eller aromatiske polyamidpolymere, polyeste-25 re, polycarbonater, polyurethaner og PVC til specielle metallegeringer. Uheldigvis er anvendelsen af disse materialer stærkt begrænset af deres i almindelighed dårlige biokompatibilitet. Dette skyldes, at så snart et fremmed materiale indføres i blodcirkulationen, giver 30 det øjeblikkelig anledning til dannelsen af thromber ved initieringen af en yderst kompliceret proces.

Det menes, at der først sker en vedhæftning af blodplader til materialets overflade med efterfølgende frigivelse af ADP og serotonin fra blodpladerne, hvilket 35 derpå forårsager pladeaggregation. Pladeaggregationen er i sig selv et fundamentalt trin i dannelsen af thromber. Dette skyldes, at det giver anledning til

DK 157887 B

2 frigivelse af phosphorlipider, der er nødvendige ved blodkoagulationsprocessen ved at fremme omdannelsen af fibrinogen til fibrin. ADP's rolle som blodplade-aggregeringsinducer og således som initiator til throm-5 bedannelsesprocessen er velkendt. Se f.eks. det grundlæggende arbejde af Ά. Gaarder og A. Hellem i Nature, vol. 192, side 531 (1961). Det er derfor nærliggende, at immobilisering af et enzym såsom apyrase, der er i stand til at omdanne det ADP, der frembringes ved vedhæftnin-10 gen af pladerne til overfladen af det materiale, der anbringes i kontakt med blodet,til AMP og adenosin, kan forhindre efterfølgende pladeaggregation og således blokere dannelsen af thromber. I denne sammenhæng har det ifølge opfindelsen vist sig, at immobiliseringen 15 af apyrase på overfladen af thrombogene materialer giver disse sidste tilfredsstillende biokompatible egenskaber.

Disse egenskaber afhænger ikke af det system, der anvendes til immobilisering af enzymet.

Fra US-patentskrift nr. 3.865.615 er det kendt, 20 at plastmaterialer med forbedret biokompatibilitet kan fremstilles ved at immobilisere en plasminokinase derpå. Plastmaterialet angives fortrinsvis at være en polyolefin eller polyester. Der er kun anført udførelseseksempler mad polyethylen og polyethylenterephthalat, 25 som overflademodificeres ved fluorering under betingelser, der også frembringer reaktive carboxylgrupper til binding af plasminokinase-enzymet. På denne baggrund kan man ikke uden videre nå til fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

30 I tidsskriftet Chemtech Januar 1974 er der i kapitlet Enzyme Engineering på side 47-55 beskrevet immobilisering af forskellige enzymer, bl.a. også af apyrase, ved kovalent binding, I tabel 3 på side 48 er enzymet apyrase omtalt, som bærermatrix er der nævnt 35 CM-cellulose, og som bindemiddel er der nævnt Woodward’s Reagent K. På side 49, venstre spalte, er der tale om en metode til enzymimmobilisering, og på side 49,

DK 157887 B

3 højre spalte, i denne artikel er det endvidere anført, at immobilisering af enzymer via kovalent binding eller ved intermolekylær tværbinding kan eliminere forskellige vanskeligheder. Det er imidlertid også anført, at kova-5 lent binding ændrer enzymets struktur og kan ændre dets aktivitet. Det aktive sted på enzymet kan påvirkes, så det fører til et større tab i aktivitet.

På denne baggrund var det ikke nærliggende, men meget overraskende, at det ved fremgangsmåden 10 ifølge den foreliggende opfindelse er muligt at immo-bilisere apyrase uden aktivitetstab. Det er endvidere meget overraskende, at immobilisering af enzymet apyrase på overfladen af produkter eller redskaber, der skal anvendes medicinsk, gør disse biologisk kompatible.

15 Immobiliseringen kan udføres ved adsorption og påfølgende tværbinding på overfladen af polymermaterialer, eller endog på metaloverflader, f.eks. på overfladen af nåle, der anveandes til arterie-veneforbindelser i ekstrakorporal cirkulation.

20 Alternativt kan apyrase bindes kovalent til funktionelle grupper, der er til stede på overfladen af materialer, hvis biokompatabilitetskal forøges.

Det er endog om nødvendigt muligt forinden at aktivere materialet, således at der på dets overflade frigøres 25 reaktive grupper, der kan anvendes til immobilisering af apyrasen.

F.eks. kan enzymet bindes kovalent til amino-(eller carboxyl-)grupper i alifatiske eller aromatiske polyamider, der udsættes for mild overfladehydrolyse.

30 på samme måde kan carboxylgrupper på overflade- hydrolyserede polyestere anvendes.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

35 Eksempel 1

Der blev fremstillet nylon 6 ringe (længde 9 mm, indre diameter 4 mm, ydre diameter 5 mm),idet der under forarbejdning blevet draget omsorg for, at kan-

DK 157887 B

4 terne var blødt afrundede. Der blev udført en 0,25 mm dyb rille langs med midten af ringens yderside over hele dens omkreds. Ringene blev hydrolyseret i 3,5 N HC1 ved 37°C i 1 time. At overflade-5 hydrolyse af nylonet var blevet udført, blev bekræftet ved en colorimetrisk undersøgelse udført ved at nedsænke ringene,vaskede med vand,i en opløsning, der indeholdt 0,5% (vægt-rumfang) trinitrobenzensulfon-syre i mættet tetraborat.

10 Efter ca. 1 time bekræftede dannelsen af en orangefarvning på nylonoverfladen, at hydrolyse havde fundet sted. Ved dette punkt blev ringene nedsænket i en 2,5% glutaraldehydopløsning og blev holdt nedsænkede i 3 1/2 time ved 4°C. Ringene blev derpå 15 vasket hurtigt i isvand og nedsænket i en 0,01 M phos-phatpufferopløsning indeholdende 8 mg/ml apyrase (specifik aktivitet 3,4 I.E./mg under anvendelse af ADP som substrat). Reaktionsblandingen blev hensat ved 4°C i en dag og en nat. Ved reaktionens afslutning 20 blev ringene vasket i destilleret vand, og der blev udført en undersøgelse af enzymaktiviteten. En ring blev nedsænket i 50 ml 0,1 M tris HCl-pufferopløsning med pH 7,4, der indeholdt 0,25 mg/ml ADP og 0,5 mg/ml CaCl2.

25 Blandingen blev holdt under omrøring ved 25°C.

Der blev med 30 minutters intervaller udtaget 1 ml prøver, som blev analyseret, for at bestemme uorganiske phosphater, efter Fiske og Subbarrow's metode (C.H.

Fiske; Y. Subbarrow; J. Biol. Chem., 66, 375 (1925)).

30 Der blev målt e.n enzymaktivitét på 4,5 umol uorganiske phosphater frigjort ved 1 times omsætning på ringene.

Nylonringene med apyrase bundet kovalent til overfladeaminogrupper blev underkastet en "in vivo" biokompatibilitetsundersøgelse ved at indføre dem i 35 femoralvenen på hunde af middelstørrelse.

Indførelsen blev udført under total anaesthesi, og da ringen var blevet indført i venen, blev den fastgjort ved hjælp af en silketråd. Såret blev syet, og

DK 157887B

5 dyret fik antibiotika.

En lignende ubehandlet nylonring blev indført til sammenligning efter den samme procedure.

Efter etstidsrum på 15 dage blev ringene udtaget 5 og undersøgt.

Ringen med apyrase var fuldstændig åben, hvorimod referenceringen var fuldstændig tilstoppet af thromber.

En måling udført på ringen med apyrase, der var udtaget fra hunden, viste ca. 4 ymol uorganiske 10 phosphater frigjort på en time.

Eksempel 2

Der blev fremstillet nylon 6 ringe svarende til og hydrolyserede som de, der er beskrevet i eksempel 15 1, og de blev nedsænket i 0,01 M phosphatpufferopløsning med pH 7 indeholdende 8 mg/ml apyrase.

Efter 4 timer blev der tilsat et dobbelt rumfang 2,5% glutaraldehydopløsning i en 0,01 M phosphatpuf feropløsning med pH 7.

20 Blandingen blev hensat ved 4°C i en dag og en nat. Ringene blev derpå vasket og underkastet undersøgelsen for enzymaktivitet i overensstemmelse med proceduren beskrevet i eksempel 1. Enzymaktiviteten fandtes at være ca. 2 ymol uorganiske phosphater frigjort 25 på 1 time af en enkelt ring. "In vivo" hiokompatibili-tetsundersøgelsen blev udført ved at indsætte ringe med apyrase og kontrolringe i femoralvenen på hunde af middelstørrelse.

Den fulgte metode hertil var som anført i ek-30 sempel 1. Efter et tidsrum på 15 dage blev ringene ud-* taget. Ringen me.d apyrase fandtes at være helt åben, og den målte enzymaktivitet svarede til ca. 2 ymol uorganiske phosphater frigjort på 1 time.

Referencenylonringen var imidlertid fuldstændig 35 tilstoppet.

i Eksempel 3

Der blev fremstillet polyethylenterephthalatrin-

DK 157887B

6 ge svarende til de, der er beskrevet i eksempel 1. Ringene blev hydrolyseret i 1 M NaOH ved 50°C i 5 timer.

Ringene blev derpå vasket og nedsænket i 50 ml af en opløsning, der indeholdt 8 mg/ml apyrase og 10 mg/ml 5 N-ethyl-N'(3-dimethylaminopropylcarbodiimid) i en 0,1 M phosphatpuffer med pH 6,8. Omsætningen blev gennemført ved 4°C på en nat. På denne måde blev apyrasen bundet til underlaget ved dannelsen af en amidobinding mellem enzymets ε-aminolysingrupper og 10 carboxylgrupperne på den overfladehydrolyserede polyester. Enzymaktivitetsundersøgelsen på ringene,udført som angivet i eksempel l,gav værdier på ca. 4 μπιοί uorganiske phosphater frigjort på 1 time pr. ring. "In vivo" biokompatibilitetsundersøgelsen blev udført ved 15 at indføre polyesterringene med apyrase og ikke behandlede ringe i femoralvenen på eksperimentalhunde.

Den i eksempel 1 beskrevne metode blev fulgt. Efter 15 dage blev ringene udtaget. Kontrolringen var fuldstændigt tilstoppet, hvorimod ringen med apyrase var 20 aben med kun nogle sporadiske thromber.

Enzymaktivitetsundersøgelsen på ringen efter "in vivo" indsættelsen angav ca. 3 ymol uorganiske phosphater frigjort på 1 time.

Eksempel 4 25 Der blev’ fremstillet polyethylenterephthalat- ringe svarende til de, der er beskrevet i eksempel 1.

Ringene hydrolyseredes. Apyrase blev tværbundet til disse ringe efter proceduren, der er angivet i eksempel 2. Efter iltmobilisering fandtes enzymaktiviteten pr. ring at være ca. 3 ymol 30 uorganiske phosphater frigjort på 1 time. "In vi^o" biokompatibilitetsundersøgelsen på hunde udført efter metoden beskrevet i eksempel 1 gav positive resultater for ringene med tværbundet apyrase, der fandtes at være åbne og næsten fri for thromber, hvori- 35 mod kontrolringene fandtes at være tilstoppede. Den resterende enzymaktivitet på ringene var ca. 2,5 ymol uorganiske phosphater frigjort på 1 time.

Claims (4)

15 Den resterende aktivitet på ringene behandlet med apyrase efter indsættelse fandtes at være 0,9 umol uorganiske phosphater frigjort pr. time.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af biokompatib le produkter, især protetiske artikler, sonder, slanger, nåle og membraner, kendetegnet ved, at apyrase immobiliseres på polymere bæremidler, CM-cellulose undtaget, eller metalbæremidler.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at apyrase immobiliseres på bæremidlet ved en adsorptions- og tværbindingsmetode.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at apyrase immobiliseres på bæremidlet 30 ved dannelse af en kovalent binding mellem apyrase og funktionelle grupper, der findes på bæremidlet.

4. Fremgangsmåde ifølge det foregående krav, kendetegnet ved, at det polymere bæremiddel vælges blandt alifatiske og aromatiske polyamider, 35 polyestere og cellulosepolymere, der er mildt hydrolyserede.