DK158384B - Fremgangsmaade til ekstraktion af lactoferrin og immunoglobulin fra en vaeske hidroerende fra maelk - Google Patents

Description

DK 158384 B

i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til ekstraktion af lactoferrin og immunoglobulin fra en væske hidrørende fra mælk, hvilken væske i alt væsentligt er udtømtefor casein, ved hvilken fremgangsmåde proteinerne adsorberes på et fast bærermateriale, hvorefter de adsorberede 5 proteiner elueres med en sur opløsning.

De forskellige proteiner, der foruden casein findes i pattedyrs mælk, har tiltrukket talrige industriers og forskeres opmærksomhed. Ligeledes har det arbejde, som man har foretaget med henblik på 10 separation af de forskellige proteiner, navnlig de proteiner, som befinder sig i vallen, dvs. i lactoserum, efter separation af casein, tiltrukket sig opmærksomhed. Blandt meget interessante stoffer, der tilhører denne kategori, er a-lactalbumin, transferrin, lactoferrin, lysozym, serumalbumin, immunoglobuliner osv. Lactofer-15 rinet har farmakologisk interesse: man ved, at dette protein, som fixerer jern, udgør en vigtig beskyttelse mod forskellige bakterieinfektioner. Denne betydning forklares netop ved dette proteins chelaterende virkning overfor jern, hvorved dette element fjernes fra miljøet, hvilket således forhindrer udviklingen af bakterier, 20 for hvilke dette element er absolut nødvendigt. Denne bakteriostatiske egenskab udgør klart en vigtig fordel. Hvad angår immunoglo-bulinerne IgA, IgM og IgG stiger deres betydning hver dag med den fantastiske udvikling af immunologien. Man kender andetsteds fra nytten og anvendelsen af 1 acta!bumi ner, serumalbumin, lysozym og 25 visse andre proteiner og ligeledes proteiner, der fikserer vitaminet Bj2 eller ceruloplasmin, som har den egenskab at kombinere med kobber. Man forstår, at der har været udført arbejder med henblik på separationen af forskellige proteiner hidrørende fra mælkeprodukter og navnlig fra valle, som indeholder proteinerne i opløst tilstand 30 og som almindeligvis udgør et restprodukt i mælkeindustrien. Den største del af de anvendte fremgangsmåder er baseret på anvendelsen af ionbyttere eller på kromatografi på Sephadex ved pH-værdi er, som ikke overstiger 7, og som oftest er under 6,3. En sådan fremgangsmåde omtales f.eks. i beskrivelserne til US patenterne nr. 3.234.199 35 og nr. 3.969.337. Man har ligeledes anvendt elektroforese eller præcipitation via salte og centrifugering, denne sidste metode er blevet beskrevet af Montreuil og Mullet C.R. 250, 1736-7 (1960). Senere er arbejdet til separation af proteiner fra mælk blevet omtalt i beskrivelsen til FR patenter nr. 2.390.906 og nr.

2

DK 158384B

2.399.214, hvor alle andre proteiner end casein først ekstraheres med en harpiksanionbytter og dernæst med silicium, eller omvendt; ekstraktionen finder sted ved en pH-førdi mellem 4 og 7,5.

5 Selv om de forskellige kendte fremgangsmåder egner sig godt til separationen af proteiner, såsom lactalbuminer eller serumalbumin, gør ingen af disse metoder det muligt på effektiv og praktisk måde at opnå proteiner, som fikserer jern, dvs. transferri ner og lacto-ferriner. Skønt lactoserum er et lidet dyrt materiale, indeholder 10 det kun ca. 6,5 g proteiner pr. liter, hvoraf en lille del er lactoferriner: man skal derfor behandle meget store volumener af dette udgangsmateriale for at ekstrahere en lille vægtdel af interessante proteiner. Det er derfor vigtigt at have en fremgangsmåde, der gør det muligt at gennemføre denne ekstraktion med et så godt 15 udbytte som muligt. Det er dette formål, der opnås med den forelig gende opfindelse. Den nye fremgangsmåde ifølge opfindelsen angår navnlig udvindingen af ferrochelaterende proteiner, navnlig lacto-ferrin og transferrin, og desuden immunoglobulinerne fra mælkeserum, der bliver tilbage efter separation af casein.

20 I den efterfølgende del af beskrivelsen omtales af forenklingshensyn kun lactoferrin, men det skal forstås, at dette udtryk også omfatter transferrin og eventuelt andre ferrochelaterende proteiner af samme type, som kan forekomme i mælk fra forskellige pattedyr.

25

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er et resultat af påvisningen af, at i modsætning til den kendte teknik foregår separationen ved adsorption af de ovenfor anførte proteiner bedst i et svagt basisk miljø.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen med de indledningsvis angivne karakteristika er således ejendommelig ved, at adsorptionen finder sted i et svagt basisk miljø ved en pH-værdi over 7,5, og at elue-ringen efterfølges af en behandling med en basisk opløsning, og at 35 de herved frigjorte immunoglobuliner og lactoferrin indvindes. Miljøets pH-værdi ligger fortrinsvis mellem 7,7 og 8,8 og mere fortrinsvis mellem 7,9 og 8,5.

Det miljø, der skal behandles ifølge den foreliggende opfindelse,

DK 158384B

3 kan bestå af en vandig væske omfattende de forskellige mælkeproteiner, befriet for i det mindste hovedparten af casein; den mest praktiske kilde er valle, evt. koncentreret eller allerede behandlet til ekstraktion af andre proteiner end lactoferrin.

5

Efter adsorptionen i svagt basisk miljø og eliminering af væsken, der flyder ovenpå, elueres de proteiner, der er bundet til adsor-benset, ved at sænke pH-værdi en til under 7 og fortrinsvis til omkring 4; en foretrukket udførelsesform omfatter udnyttelse af et 10 surt elueringsmiddel, hvis ionstyrke er blevet forøget ved tilsætning af et opløseligt salt.

Som adsorbens kan man med fordel anvende kisel med et gramoverflade- 2 areal på fra 5 til 150 m /g, repræsenterende en porediameter på fra 15 25 til 250 nm (250 til 2500 A). Kiselen kan anvendes i pulverform med tilstrækkelig stor kornstørrelse, f.eks. mellem 5 /zm og 5 mm.

Til anvendelse i en søjle foretrækkes det at anvende sfæriske kugler med en diameter af en størrelsesorden på fra 10 til 500 μχα.

20 Skønt kisel udgør et udmærket bærermateriale til præferentiel binding af lactoferrin kan andre bærermaterialer anvendes, navnlig forskellige naturlige eller syntetiske silicater, såsom bentonit såvel som aktiveret aluminiumoxid.

25 Bindingen i et svagt basisk miljø giver den fordel, at der er en stor selektivitet overfor lactoferrin, som kun ledsages af en del af immunoglobulinerne. De andre proteiner, navnlig lactalbuminer, lactoglobuliner, serumalbumin og resten af immunoglobulinerne bliver tilbage i opløsning i den væske, der flyder ovenpå.

30

Efter udvindingen af lactoferrin'et og immunoglobulinerne bringes bærermaterialet, navnlig kiselen, i kontakt med en svagt basisk opløsning med f.eks. en pH-værdi på fra 8 til 9, hvilket gør den egnet til at blive anvendt til en ny ekstraktion fra et mælke-35 produkt. Det fremgår, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen er meget mere simpel end de kendte fremgangsmåder; i forhold til de ovenfor omtalte FR patentskrifter er det således tilstrækkeligt med ét mineralsk bærermateriale i stedet for 2 bærermaterialer, hvoraf det ene er en ionbytter. Desuden finder bindingen sted i et basisk miljø 4

DK 158384B

i stedet for at blive udført ved pH-værdier under 7,5 og navnlig under 7, som det er tilfældet med alle de tidligere metoder.

Efter eluering af bærermaterialet med en sur opløsning vaskes dette 5 bærermateriale i en variation af fremgangsmåden ifølge opfindelsen med en basisk opløsning, hvilket tillader ekstraktion af immu-noglobul i nfraktionen, som ikke er blevet elueret i surt miljø; i dette tilfælde kan den basiske opløsning også gøre det muligt at udvinde en rest af lactoferrin. Vasken i denne udførelsesform kan 10 udføres ved f.eks. en pH-værdi mellem 8 og 10. Et kisel bærermateriales kapacitet overfor lactoferrin påvirkes imidlertid ikke af en sådan vask; vasken kan derfor udelades, når man kun forsøger at ekstrahere lactoferrin.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes på lactoserum, lige meget hvilken elimineringsmåde af casein, som har ført til denne lactoserum: med andre ord ligegyldigt om caseinet er blevet præcipi-teret ved forsyrning af den oprindelige mælk eller ved indvirkning af et enzym. Fremgangsmåden kan anvendes på valle som sådan, såvel 20 som på væsker, der er opnået ved at opløse faste stoffer fra lactoserum, opnået på kendt måde, f.eks. ved ultrafiltrering eller tørring.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til ekstraktion af 25 lactoferriner fra forskellige mælkekilder, navnlig mælk fra får eller køer såvel som human mælk. Da de førstnævnte indeholder meget mindre lactoferrin end den anden, er behandlingen af dem mindre effektiv med de kendte metoder, og det er her, at anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør sig specielt bemærket.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres under de betingelser, der er beskrevet af Gordon, Ziegler & Basch, Biochem. Biophys. Acta 60, 410-411 (1962): i denne variation udføres bindingen til et adsorberende materiale i svagt basisk miljø med en væske omfattende 35 lactoferinet, til hvilket man i forvejen har tilsat en jernforbindelse på en sådan måde, at det tilstedeværende lactoferrin mættes.

Ekstraktionsprocenten af lactoferrin er forøget ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Hvad angår sammensætningen af de

c DK 158384B

proteiner, der opnås ved denne fremgangsmåde, efter elueringen fra det adsorberende materiale ved hjælp af en sur opløsning, omfatter den mere end 50% lactoferrin, idet resten hovedsagelig udgøres af immunoglobuliner. Renheden af lactoferrinet, der hovedsageligt 5 anvendes som bakterostatisk middel, er helt tilfredsstillende, og det er ikke nødvendigt at adskille det fra immunoglobulinerne; det har faktisk in vitro vist sig, at lactoferrins evne til at inhibere væksten af patogene bakterier forøges med tilstedeværelsen af immunoglobuliner.

10 I de industrielt vigtige tilfælde, hvor bærermaterialet består af kisel, finder man en kapacitet overfor lactoferrin på mere end 20 mg pr. g kisel, hvilket fuldstændigt berettiger den industrielle anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

15

Ved de betingelser, der hersker under fremgangsmåden ifølge opfindelsen, undergår de immunoglobuliner, som ledsager lactoferrinet, ingen denaturering, og kan derfor anvendes i den farmaceutiske industri og den veterinære industri, eftersom de bibeholder alle 20 deres egenskaber.

De forskellige proteiner, som kan separeres med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan identificeres med kendte metoder, og navnlig de metoder, der er blevet beskrevet af J. Garnier i Ann. Biol. anim.

25 Bioch. Biophys. 1964, 4 (2) 163-187. De efterfølgende eksempler illustrerer den foreliggende opfindelse.

EKSEMPEL 1 30 I en søjle med en indre diameter på 1 cm anbragtes 5 g kisel korn med en kornstørrelse på fra 100 til 200 /zm; denne kisel havde et gram-overfladeareal på 20 m /g og en porediameter på 80 nm. Kiselen vaskedes med en 0,005M dinatriumphosphatopløsning ^ΗΡΟ^. I en liter af denne phosphatopløsning opløstes 10 g af et pulver opnået 35 ved tørring af det opsamlede faste materiale (resten) ved ultracen-trifugeringen af en lactoserum; dette pulver indeholdt 6,5 g proteiner. pH-Værdien af den opnåede opløsning indstilledes til 8,2. Opløsningen førtes derefter gennem kisel materi al et i den ovenfor anførte søjle med en hastighed på 60 ml/time; søjlen vaskedes

DK 158384B

6 derefter med en 0,005 M dinatriumphosphatopløsning med en pH-værdi på 8,2 for at fjerne alle de proteiner, der ikke er bundet til kiselen. Den bundne lactoferrin elueres derefter med en 0,1 N eddikesyreopløsning tilsat NaCl til en koncentration på 0,5 M. Der 5 opnåedes således en fraktion på 25 ml af en rosafarvet væske indeholdende 40 mg proteiner omfattende 66% lactoferrin, idet resten er immunoglobuliner. Efter en vask af kiselmateri ale ved en passage af en opløsning af 0,005 M dinatriumphosphatopløsning er søjlen parat til en ny adsorptionscyklus.

10 EKSEMPEL 2 På lignende måde som i eksempel 1 vaskedes søjlens materiale med en stødpufferopløsning af tris-HCl, pH-9, tilsat 0,5 M NaCl efter 15 eluering med eddikesyre og udvinding af lactoferrinfraktionen. Dette gav en ny 20 ml fraktion indeholdende 30 mg proteiner, som hovedsageligt bestod af immunoglobuliner, lactoperoxidase og en meget lille mængde lactoferrin. Efter vask af kiselmateri al et i søjlen med en 0,005 M dinatriumphosphatopløsning var søjlen påny parat til 20 brug.

EKSEMPEL 3

Den i eksempel 1 anvendte fremgangsmåde gentoges, men lactoferrin-25 kilden var 1 liter valle, der direkte er opnået ved fremstilling af ost, denne væske tilsattes uden koncentrering 0,005 M dinatriumphosphatopløsning pr. liter. Der opnåedes samme resultater som i eksempel 1.

30 EKSEMPEL 4

Den alkaliske vask i eksempel 2 anvendtes ved en fremgangsmåde, hvor der anvendtes valle ifølge eksempel 3. Dette førte til lignende resultater som i eksempel 2.

35 EKSEMPEL 5

Den i eksempel 1 anvendte fremgangsmåde blev gentaget under anvendelse af 6,5 g bentonit, der forudgående var blevet behandlet med

DK 158384B

7 en vandig N HC1-opløsning, derpå vasket med destilleret vand og tørret. Denne bentonit, som erstatter de 5 g kisel i eksempel 1, har en kornstørrelse på fra 85 til 220 øm. Phosphatopløsningen, som omfatter 10 g faststof af 1actoserumekstrakt per liter, blev jus -5 teret til pH 8,4 før den førtes gennem bentonitten med henblik på adsorption. Eluering med syre gav en proteinfraktion omfattende 53% lactoferrin.

EKSEMPEL 6 10

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget, idet kiselen blev erstattet med 5 g aktiveret aluminiumoxid med en kornstørrelse på fra 105 til 250 øm. Opløsningen, der underkastedes adsorption, havde et pH på 8,06. Efter adsorption til aluminiumet gav syreeluering en 15 proteinfraktion omfattende 57% lactoferrin.

20 25 30 35

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til ekstraktion af lactoferrin og immunoglobulin fra en væske hidrørende fra mælk, hvilken væske i alt væsentligt er 5 udtømt for casein, ved hvilken fremgangsmåde proteinerne adsorberes på et fast bærermateriale, hvorefter de adsorberede proteiner elueres med en sur opløsning, kendetegnet ved, at adsorptionen finder sted i et svagt basisk miljø ved en pH-værdi over 7,5, og at elueringen efterfølges af en behandling med en basisk opløs-10 ning, og at de herved frigjorte immunoglobuliner og lactoferrin indvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pH-værdien i det miljø, der udsættes for adsorptionen, ligger mellem 15 7,7 og 8,8, og fortrinsvis mellem 7,9 og 8,5.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at elueringen finder sted ved en pH-værdi, der ligger under ca. 4. og at elueringsmidlet fortrinsvis indeholder et opløseligt salt, 20 der forøger ionstyrken.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at adsorptionsmidlet er kisel med et p gramoverfladeareal mellem 5 og 150 m /g og en porediameter mellem 25 25 og 250 nm.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at kiselen foreligger i pulverform med en kornstørrelse på fra 5 /zm til 5 mm og fortrinsvis fra 10 til 500 30 /jm.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at adsorptionsmidlet er et naturligt eller syntetisk silicat og/eller et aktiveret aluminiumoxid. 35