DK159122B

DK159122B - Fremgangsmaade til fremstilling af 2-keto-l-gulonsyre

Info

Publication number: DK159122B
Application number: DK103683A
Authority: DK
Inventors: Takayasu Sonoyama; Shigeo Yagi; Bunji Kageyama
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1983-02-28
Publication date: 1990-09-03
Also published as: ES8404410A1; EP0088409B1; HU191202B; US4696897A; GB2116968B; KR900009050B1; DK103683A; IE54703B1; CA1186650A; AU1205183A; KR840003696A; DE3365389D1; GB8306230D0; DK103683D0; GB2116968A; AU560187B2; ES520322A0; EP0088409A2; JPH0346118B2; DK159122C

Description

DK 159122 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra D-glukose ved dyrkning af en første mikroorganisme (1), som er i stand til at producere 2,5-diketo-D-gluconsyre ud fra D-glukose, og en anden mikroorganisme (2), som er i stand til at 5 omdanne 2,5-diketo-D-gluconsyren til 2-keto-L-gulonsyre, i et medium indeholdende D-glukose, i hvilket begge mikroorganismerne er til stede samtidig, i det mindste under en senere del af dyrkningen, og hvor den anden mikroorganisme (2) tilhører slægten Brevibacterium eller slægten Corynebacterium, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den før-10 ste mikroorganisme (1) tilhører slægten Erwinia.

Opfinderne af den foreliggende opfindelse, som har beskæftiget sig med undersøgelse af mikrobiel fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, har tidligere fundet forskellige mikroorganismer, der er i stand til at fremstille 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre og har op-15 fundet fremgangsmåder til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre eller salte deraf ved mikrobiel omdannelse af 2,5-diketo-D-gluconsyre, der fås ved oxidativ fermentering af D-glukose (se fx. USA-patentskrifterne nr.

3.922.194 (RE 30.872), nr. 3.959.076 og nr. 3.963.574).

Det er velkendt, at 2,5-diketo-D-gluconsyre, prækursoren for 2-ke-20 to-L-gulonsyre ved fremgangsmåderne ifølge førnævnte opfindelser, kan fås ud fra D-glukose i højt udbytte ved den oxidative virkning af en mikroorganisme tilhørende slægten Gluconobacter (iht. den i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, givne definition, og slægten Gluconobacter indbefatter derfor slægterne Acetobacter, Acetomo-25 nas og Gluconobacter, der er beskrevet i Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology, 7. udgave). Til forskel herfra har opfinderne af den foreliggende opfindelse for nylig fundet ud af, at adskillige mikroorganismer tilhørende slægten Erwinia effektivt kan fremstille 2,5-diketo-D-gluconsyre ud fra D-glukose i højt udbytte (se fx. europæisk 30 patentoffenti igøre!sesskrift nr. 0 046 284).

Ud over dette har opfinderne af den foreliggende opfindelse tidligere konstateret følgende (se fx. USA-patentskrift nr. 3.998.697): (a) Selv hvis både en 2,5-diketo-D-gluconsyre producerende mikroor-ganime og en 2-keto-L-gulonsyre producerende mikroorganisme får lov til 35 at være til stede på én gang i fermenteringsmediet, kan den af den 2,5-diketo-D-gluconsyre producerende stamme fremstillede 2,5-diketo-D-gluconsyre omdannes til 2-keto-L-gulonsyre uden vanskeligheder.

(b) Når den 2,5-diketo-D-gluconsyre producerende mikroorganisme og

DK 159122 B

2 den 2-keto-L-gulonsyre producerende mikroorganisme forefindes på én gang i dyrkningsmediet, akkumuleres en uønsket optisk isomer, 2-keto-D-glu-consyre, som ellers fremstilles af den 2-keto-L-gulonsyre producerende mikroorgansime, ikke i dyrkningsmediet.

5 (c) Hovedårsagen til, at der ikke akkumuleres 2-keto-D-gluconsyre i dyrkningsmediet er, at 2-keto-D-gluconsyren, når den først er fremstillet af den 2-keto-L-gluconsyre producerende stamme, igen omdannes til 2,5-diketo-D-gluconsyre af den 2,5-diketo-D-gluconsyre producerende mikroorganisme, og 2,5-diketo-D-gluconsyren omdannes derefter til 2-keto-10 L-gulonsyre.

Opfinderne har tidligere vist (USA-patentskrift nr. 3.998.697), at en mikroorganisme, der tilhører slægten Gluconobacter, kan anvendes som den 2,5-diketo-D-gluconsyre producerende mikroorganisme, mens en mikroorganisme, der tilhører slægten Brevibacterium eller Corynebacterium, 15 kan anvendes som den 2-keto-L-gulonsyre producerende mikroorganisme, og at ledsagende fremstilling af 2-keto-D-gluconsyre kan elimineres ved kombineret anvendelse af begge mikroorganismer.

Imidlertid er virkningen af at kombinere og kompatibiliteten af en mikroorganisme tilhørende slægten Erwinia med en mikroorganisme tilhø-20 rende slægten Brevibacterium eller slægten Corynebacterium ikke tidligere blevet fastslået.

Den foreliggende opfindelse.er baseret på den erkendelse, at en mi^-= kroorganisme tilhørende slægten Erwinia er kompatibel med en mikroorganisme tilhørende slægten Brevibacterium eller slægten Corynebacterium 25 ved en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, samt at det ved den kombinerede anvendelse af-disse mikroorganismer ved fremgangsmå"-den ifølge opfindelsen er muligt at opnå en væsentlig reduktion af den krævede inkubationstid med deraf følgende væsentlige reduktioner af apparaturbehov og driftsomkostninger. Ved den beskrevne fremgangsmåde an-30 vendes inkubation af mikroorganismerne i et medium, der indeholder D-glukose. Bifremstilling af 2-keto-D-gluconsyre, den uønskede isomer af det ønskede produkt, forebygges effektivt ved anvendelse af den blandede dyrkning p.g.a. koeksistensen af begge mikroorganismerne i mediet under i det mindste en del af dyrkningen. 2-Keto-D-gluconsyren, der fremstil-35 les af den anden mikroorganisme, udnyttes nemlig af den første mikroorganisme til at fremstille 2,5-diketo-D-gluconsyre, som derefter omdannes til 2-keto-L-gulonsyre af den anden mikroorganisme.

Ved udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan de kendte 3

DK 159122 B

konventionelle betingelser, som anvendes ved "blandet dyrkning" og i de efterfølgende trin som beskrevet i fx. USA-patentskrift nr. 3.998.697 også anvendes med nogle indlysende modifikationer og tilpasninger.

Den "blandede dyrkning" indebærer følgende tre fremgangsmåder (a), 5 (b) og (c): (a) en fremgangsmåde, ved hvilken begge typer mikroorganisme samtidig inokuleres i mediet ved dyrkningens påbegyndelse, (b) en fremgangsmåde, ved hvilken mediet inokuleres med den første mikroorganisme, og den anden mikroorganisme inokuleres i mediet efter en inkubationsperiode og (c) en fremgangsmåde, ved hvilken begge mikrororganismer inoku-10 leres separat i de respektive medier, og det ene af disse derefter sættes til det andet på én gang, portionsvis eller kontinuert efter en vis inkubationsperiode efterfulgt af en yderligere inkubationsperiode.

For at gøre det muligt for mikroorganismerne at fremstille slutproduktet, 2-keto-L-gulonsyre, mest effektivt, bør forholdet mellem inoku-15 lumstørrelsen af hver af mikroorganismerne og inokuleringstidsfølgen bestemmes under hensyntagen til begge mikroorganismernes væksthastighed, den første mikroorganismes aktivitet ved fremstilling af 2,5-diketo-D-gluconsyre, den anden mikroorganismes aktivitet ved omdannelse af 2,5-diketo-D-gluconsyre til 2-keto-L-gulonsyre og mediernes egenskaber.

20 Eksempler på mikroorganismer, der kan anvendes som den første og den anden mikroorganisme (herefter omtalt som stamme (I) og stamme (II) ved udøvelse af opfindelsen, er anført i hhv. tabel 1 og 2 nedenfor.

Tabel 1 25 2,5-diketo-D-gluconsyre producerende mikroorganisme

(stamme (I)) FERM-P ATCC

Erwinia citreus 5449 31623

Erwinia punctata 5452 31626 30 Erwinia punctata var. 5450 31624

Erwinia punctata var. 5451 31625

Erwinia punctata var. 5453 31627

Erwinia terreus 5454 31628

Erwinia terreus var. 5455 31629 35 Erwinia terreus var. 5456 31630

Erwinia terreus var. 5457 31631

DK 159122 B

4

Tabel 2 2-keto-L-gulonsyre producerende mikroorganisme

(stamme (II)) FERM-P ATCC

5 Brevibacterium ketosoredictum nov. sp. 1905 21914

Brevibacterium nov. sp. 2686 31083

Brevibacterium sp. 2685 31082

Brevibacterium testaceum IFO 12675 ---- -----

Corynebacterium sp. 2687 31081 10 Corynebacterium sp. 2771 31089

Corynebacterium sp. 2769 31088

Corynebacterium sp. 2770 31090

Disse mikroorganismer er deponeret ved Fermentation Research 15 Institute, Yatabe, Japan under FERM-P-numre og ved American Type Culture Collection, Maryland, USA under ATCC-numre, og prøver af dem kan fås fra disse depoter iht. Budapest-traktatens bestemmelser.

Detaljerede taksonomiske beskrivelser af mikroorganismerne er givet i europæisk patentoffentliggørelsesskrift nr. 0 046 284 og USA-patent-20 skrifterne nr. 3.922.194, 3.959.076 og 3.963.574. Mikroorganismen med IF0-nr. kan fås fra Institute of Fermentation, Osaka, Japan og er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,, 8. udgave.

Mutanter afledt af de ovenfor beskrevne stammer (I) og (II) ved mu-tering af stammerne ved bestråling med ultraviolette stråler eller rønt-25 genstråler eller ved behandling med kemikalier kan anvendes på lignende måde til en mere effektiv udøvelse af opfindelsen.

I forbindelse med opfindelsen bør der ikke lægges nogen særlige begrænsninger på sammensætningen af det næringsmedium, der anvendes til dyrkningen af stamme (I) og (II), selvom det er ønskeligt, at det inde-30 holder kilder for carbon og nitrogen, andre uorganiske salte og spormængder af andre faktorer, som kan assimileres af stammerne. Som carbon-kilde kan der, sammen med D-glukose, også anvendes vilkårlige konventionelt anvendte carbonkilder såsom saccharose, glycerol, melasse o.l. Som eksempler på nitrogenkilder kan nævnes majsstøbevæske, pepton, kødeks-35 trakt, gær, gærekstrakt, soyabønnemel, hvedegluten, vilkårlige nitrogenforbindelser såsom urinstof o.l.

Som uorganiske salte kan anvendes calciumsalte, magnesiumsalte, kaliumsalte, zinksalte, jernsalte og salte af andre metaller, som er es- 5

DK 159122 B

sentielle for væksten. Endvidere kan der til mediet også, om nødvendigt, sættes faktorer til fremme af mikroorganismens vækst og dens fremstilling af slutproduktet. Blandingsforholdet mellem disse forskellige næringsstoffer og faktorer varierer med karakteren af de anvendte stammer, 5 den tidligere beskrevne inokuleringsmåde, mængden af substrat-D-glukose, der skal anvendes, og de ledsagende betingelser og kan derfor passende udvælges og bestemmes i overensstemmelse med disse betingelser i de respektive tilfælde.

Selvom koncentrationen af substrat-D-glukosen i fermenteringsmediet 10 kan variere med stammernes art, anvendes der sædvanligvis en koncentration på 10 til 300 g/1.

Dyrkningsbetingelserne kan variere med stammernes art, mediets sammensætning, den tidligere beskrevne inokuleringsmåde for hver af stammerne, forholdet mellem inokulumstørrelsen af hver af stammerne, tids-15 følgen af inokuleringen og andre ledsagende betingelser, selvom det sædvanligvis er ønskeligt at holde dyrkningstemperaturen på 20 til 35°C og holde mediets pH på 4 til 9. Til dette formål kan en passende sur eller basisk substans sættes til mediet på et passende tidspunkt under dyrkningen, eller der kan fra start sættes et puffermiddel til udgangsmediet 20 i passende mængde. Dyrkningstiden kan sædvanligvis strække sig fra 10 til 100 timer.

Den ved dyrkning af stamme (I) fremstillede 2,5-diketo-D-gluconsyre omdannes direkte til 2-keto-L-gulonsyre af stamme (II) uden at blive isoleret fra mediet. Den uønskede 2-keto-D-gluconsyre, der fremstilles 25 af stamme (II), omdannes af stamme (I) til 2,5-diketo-D-gluconsyre, som igen omdannes til 2-keto-L-gulonsyre af stamme (II).

2-Keto-L-gulonsyren, der på denne måde fremstilles og akkumuleres i dyrkningsmediet, kan isoleres fra mediet og renses på konventionel måde.

Identifikationen af den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnå-30 ede 2-keto-L-gulonsyre kan foretages ved grundstofanalyse og måling af fysisk-kemi ske egenskaber såsom smeltepunkt, infrarødt absorptionsspektrum, optisk drejning o.l.

Som beskrevet ovenfor frembyder fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fordele ved fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, idet 35 den for det første kan fremstille 2-keto-L-gulonsyre ud fra D-glukose i en ét-trins proces, for det andet kan eliminere behovet for fraskillelse af et mellemprodukt og for det tredje ikke giver nogen ledsagende produktion af den uønskede isomer, og for det fjerde muliggør en væsentlig

DK 159122 B

6 reduktion af den krævede inkubationstid. Disse fordele vil bevirke fremragende resultater ved anvendelse i kommerciel skala.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de efterfølgende eksempler, hvori procentangivelser for sammensætningen er vægt/vol-%.

5

Eksempel 1 1) Fremstilling af 2,5-diketo-D-gluconsyre med stamme (I)

Erwinia punctata FERM-P 5452 anvendtes som mikroorganisme i dette eksempel.

10 (i) Podemedium:

En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 1,0%

Majsstøbevæske (CSL) 5,0% 15 Primært kal iumphosphat (KHgPO^) 0,1%

Magnesiumsulfat (MgSO^^O) 0,002% og~

Calciumcarbonat (CaC03) 0,5% indstilledes til pH 6,8-7,0 med 10% NaOH opløsning, og portioner på 20 50 ml hældtes i koniske kolber på 500 ml, som derefter steriliseredes ved 120°C i 20 minutter.

(ii) Podekultur:

Podemediet i en kolbe som ovenfor inokuleredes med en 25 løkkefuld FERM-P 5452 (tabel 3) og inkuberedes ved 28°C i 8-11 timer under omrøring (amplitude 71 mm, 270 opm). Da den optiske densitet (O.D.) af kulturen blev ca. 8, afsluttedes podekulturen (slutpunkt).» (i i i) Fermenteringsmedium: 30 En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 20% CSL 3% kh2po4 0,1%

CaCO^ 6,3% og 35 Polypropylenglycol 2000 (P-2000) 0,01% indstilledes til pH 6,8-7,0 som beskrevet ovenfor og steriliseredes ved 120°C i 20 minutter. Hver portion på 455 ml hældtes i en sterilise- 7

DK 159122 B

ret fermenteringsbeholder på 1 1 og inokuleredes med 45 ml af ovenstående podekultur.

(iv) Fermenteri nqsbeti nqelser:

5 Temperatur 25°C

Omrøring 1740 opm

Luftning 600 Nml/min.

Tid 17-31 timer 10 (v) Analyse:

Produkterne i fermenteringssubstratet analyseredes ved opstigende papirkromatografi med detaljer som anført nedenfor og bestemtes kvantitativt ved densitometri.

(a) Bærer: "Toyo Roshi nr. 50", 15 (b) Fremkaldelsesopløsningsmiddel: phenol:myresyre:vand = 75:4:25, (c) Farvefremkaldelse: sprøjtning med AHF opløsning (fremstillet ved at opløse 0,93 g anilin og 1,66 g phthalsyre i 100 ml vand-mættet n-butanol) og opvarmning til 105°C i 20 2 minutter.

Udover dette udførtes der parallelt dermed en tyndtlagskromatografi på en bærer "TLC alumisheet cellulose" med fremkaldelsesopløsningsmiddel og farvefremkaldelsesbetingelser som beskrevet ovenfor. I dette tilfælde 25 foretoges den kvantitative bestemmelse imidlertid ved sammenligning med en autentisk prøve.

(vi) Slutpunkt:

Fermenteringen afsluttedes, når en lyserød plet af 2-ke-30 to-D-gluconsyre forsvandt fra det ovenfor beskrevne tyndtlagskromato-gram.

2) Fremstilling af 2,5-diketo-D-glucons.yreopløsninqer:

For at bekræfte fordelene ved den blandede dyrkning fremstilledes 35 følgende tre typer 2,5-diketo-D-gluconsyreholdige opløsninger.

DK 159122 B

8 (i) Det 2,5-diketo-D-gluconsyreholdige fermenteringssubstrat fremstillet med stamme (I) under betingelserne fra 1) (iv) ovenfor og fortyndet ca. firefold med steriliseret

O 1Q

vand (indeholdende 10 -10 levedygtige celler af stamme 5 (I)/ml).

(ii) (i), centrifugeret og steriliseret ved filtrering (kontrol prøve 1).

(i i i) En vandig opløsning indeholdende 5% calcium-2,5-diketo-10 D-gluconat, steriliseret ved filtrering (kontrolprøve 2).

3) Fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-qluconsyre med stamme (II) 15 (i) Podemedium;

En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 1,0% "Bacto"-gærekstrakt 0,5% "Bacto"-pepton 0,5% 20 KH2P04 0,1% og

MgS04.7H20 0,02% indstilledes til pH 7,0-7,2 med 10% NaOH, og portioner på 50 ml hældtes i koniske kolber på 500'mT, som dereffer steriliseredes ved 25 115°C i 15 minutter.

(ii) Podekultur:

Hvert af podemedierne (i) i en kolbe som ovenfor inokuleredes med en løkkefuld af de i tabel 2 opførte stammer (II) og 30 inkuberedes ved 28°C i 16-24 timer under omrøring (amplitude 71 mm, 270 opm).

(iii) Fermenterinqsmedium:

En vandig opløsning indeholdende: 35 D-glukose 1,0% CSL 3,0% KH2P04 0,1% og

MgS04.7H20 0,02% 9

DK 1S9122B

indstilledes til pH 7,0-7,2 med 10% NaOH, og hver portion på 30 ml hældtes i en konisk kolbe på 500 ml, som så steriliseredes ved 115°C i 20 minutter.

5 (iv) Fermentering:

Hvert af ovenstående fermenteringsmedier inokuleredes i kolben med 5 ml af podekulturen af stamme (II). De tidligere fremstillede 2,5-diketo-D-gluconsyreopløsninger (2), (i), (ii) og (iii) sattes in-10 di viduelt til fermenteringsmediet ved fermenteringens begyndelse eller 16 timer efter fermenteringens begyndelse (omrøring: amplitude 71 mm, 270 opm ved 28°C), hvorved der opnåedes en 2,5-diketo-D-gluconsyrekon-centration på 2,5%. 2,5-Diketo-B-gluconsyrefermenteringssubstratet (i) indeholder levedygtige celler af stamme (II). Dyrkningerne fortsattes 15 derefter i yderligere 48 timer.

(v) Kvantitativ analyse:

Gas-væskekromatografi (søjle: SE 52 (5%); prøve: trime-thylsilyleret; temperatur: 160-210°C; bæregas: helium).

20 Resultaterne af fermenteringen er summeret i tabel 3 og 4.

Som det fremgår af disse tabeller iagttoges der ingen ledsagende fremstilling af 2-keto-D-gluconsyre ved den blandede dyrkning af stamme (I) og (II), mens der iagttoges fremstilling af 2-keto-D-gluconsyre med akkumulering af 2-keto-L-gulonsyre i begge tilfælde af ren dyrkning af 25 stamme (II) i kontrolgrupperne.

DK 159122 B

4J

CD C3 i— s_ i ' q e omoDtoiNio

I q_ CJJ O) (D \ IMNCMCVJOIDOO

Q. Ιβ Q 1Λ S- Dl

,— o ϋ -i- +J N E OOOOOOOO

ε s- σιο i— i— \ 3 Dl C ·>- -Γ-

Dl +J -i— -I— on S- CJ3 i— _

C i— Ό CN ffl D> _I ε tOWCOmCOlOSO

3 cm +J-OC ^ \ oø cm«-Η »-i f-* o <-* ·. ^ ιβ isne μ α T σι --------

C_TJ > I— O---’ > s_ CM ε Οι—lOCMOl—I O O

Q C

i«£ CD

o£ cn

CM ·<-> H-> C

ro Q) *r— O r— _ i. i.s-S- q ε in m in λ r-i 03 n <X)

φ CM +J CD O ^ \ tONriCOCMlOOO

i— ld i oo oo s- cn - - - - - - *- /-

I— M- (UO-I-+J CM ε OOOOOOOO

<D lfl-P 3i— i— CM·!- *r- — CS i 0) 00 S- 4- O i— _

_j r ε oio j e niflininimnoON

V Qi S- C-ΡΌ V \ IM03(0OtJ-01O-H

LU φ *r— CO CD O — — — — — — — — +-3

CM u_ 0+- i. --— > CM ε Or-tr-orOOi—lOO CO

C

4- C O

io s. i o £2 3 00 CT> = DO -t-3 σι C 03 r— I— C i— CM Ε ·Γ— Q ε

•r- 3 LO -Γ- —' y \ I

s_ «tf- S- cn O

CU [il O f) I CM ε OOOOOOOO I

,— +J +J CO -I- —- O

3 CD Q. C S- i— c ε Ό i CD -Μ ·ι- O - 0) 3 C £ Ε (Λ S- r- Dr- ^ to cc s.3 o +3 i ε r—icomoi— orom -i— ν' ,— LU O) 3 +j to ^ \ M-M-IDM-M-CO·—(I—I Ό

(O < CD 1L<I- U Μ M Dl -------- I

CM ε O r-t o CM O 1-H O O on

φ CM

X) on i.

(O CM O *- 1— 4> S— M— r- 0 * CD ·— q- oo — cu

Dl S- C CD

+) c o o w oioomoiooio o v/ >r— g Qlj— r—I i—I i—I . i—t C C -I- C CD >> 3 -M +J -i— XJ «2

O Q. fy1—' C C C O

r-t MM JC >1 OJUJ-

Ό i— O S- Dl _ U S- >J

-r- -i- M >2 CD ε 3 >> 00

I— +ιη-π3 · 3 i— 00 C

i CL CD Dl C O

O C/l U I O CJ

Μ M CO O i— 3 I i—i O · +> I 3 i— Q) O ·—»· +-3 > · CO O Dl Dl £_ς_ CD · O Q. CD +-3 I i

S_ -*i O. £= 00 +-> CD —I O

c/)··— 01 Wl i i c ε ε ε ε ε ε ·>- o o οε 3 · 3 3 3 -o +J +->

r- CD CO -r- > -r- -r- -i— I CD CD

3-a+j s-oms-oos-ons- lilies

Dl C CO CDCOCDC0CDC0CD -il

1 Qj (D +j Dl+JCO+JOO+Jon CMCMCM

_J s- ε ϋ £h ucm un un I O) to fO 3 CO <0 <0 OO ......

ου·»— ja+JO-jao-joo-jacM cststs

u 3 c -r O I ·γ— i -r- I -i— I—I ^ U O

ωυ co > 3Σ >ς >ς > oicn:

^ O Dl CDT3Q£ CD Di CD QC CU O

i s_ 5_ S-CDLUS-UJ&.LUS-U- OOCMCM

(M ao CD S-Ll_CDU_COU_CQi—I CM

o Ln o on o

Ln i—l '—I cm cm co

DK 159122. B

p

<D

S- i I 4— CJ3 <D 4> CJ3 i—

η,ιβη »i 1. QE I— to I— inSWr-i CO

, o -i- +j <i-co·—'CNjor^-co'S· e s_ DiQ i— i— CD -- — — «...λ*«

\ 3 cn c ·γ··ι- cm E ooooooo-H

CJ1 4-1 -i— -r- LO i- 4- r—s ε I— T) CM 01 05 rs C CO 4-1 "O C CJ3 i—

- ^ ni a ιβ t/ι a) -r- j E untooDroi^vDiOfO

trj >1—o·—->s- Μκιηοσιοοοο qc σι ·.·>·>·.·>···>·» 2 φ «VI B OOOl-HOCvJi—1·^- a£.

CM 4-5 4-> (TJ Φ c s- S- I 43 I— _ S cu -p φ o Q E rHtoMfsLnooi^

j I M M S- V t—1 00 CM O f-H i—I CO

r— Tj· Φ -O ·ι- -P O) -------- φ 10 4J 3i— I— CM £ OOOOOOO·—< E CO -i— T- U5 1 0) CO S- 4— <—< _1 S E OHI) Dl O i— .

ν' rv- c- (- o-ι -n e i £ ιηοίΛΝ^ιοηπ lu o .r (Λ o) -i- Ni \ rOLncocMCOM-cMLn 4->

r\j li 4— S- '—^ > S- OT »i«·*·*·»«*·»·' fO

CM £ OOO^HOtNJr-H'd- d

4— C O

Ttt s- ·- o--- - - ^ σι σι (= o α E oooooooo r-

Cr-csjc -·>- D5 •r- σ in -r- w+j σι

S_ j»£ S- ns cm £ Q

O) LO 01 4-4 to · r— 4J 4J ns ·ι- 3 Φ O- C 1- i— " "tj g -7—f I rt) -1-¾ i|M f Π f I w § c 2: E to S- 1 £ owoHOCOinioco -s^ v (¾ Qi 5__O <1) Ni \ CO 00 00 CO CD CO <d" CO ·!— \S P— LU 0) 3 +5 CD ------ - - Ό

«4- CQ U_ 4_ CO 10 CM £ 1—1'—1Ο1—lOCMr—<«a- I

^ LO

Φ jo m s- - (O CM d) £ I— 4-5 ® S- 4- 4- ·~ o ns φ ΓΠ 4— co.—n -=.

4-> c ω φ to o co o co o co o co φ ·— p oi,— —· —· ·—* ·—* ζ- C C *r- C CU -5» 3 4-> 4-> ·Γ- T3 »--c Q.«—-C C g ω ?

rH (O CO -Si >> R £ C

Or-tS C D) ^ζ·^> r- ·ι— Ni >1 CL) = £ l-^Q-O-Q §

I O U

dr Q I— 3 1 „ .... 1 31—

m o ___ Q.Q-Q.O. O CD CD

ί" r" CO CO CO CO 4-5 I I

C b Φ —1 Q

Φ E E E E '

C f= C 3333 -I- OO

S *= ! .r- .r- "0 4-5 4-5 ® ω S s- s- s- s- · ω Φ ΟΝ Φ φσΐΦΟΐΛ-iiJ^

Ρ) C to PCOPN+JCOPN ~ I I

Yam ΟΦΟΝΟΝΟΝ OJCCICM

_I t. e: (ϋ CM CO CM Π3 CM «S CM

"1 Φ CO -Q -Q -Q JO

Au-P ΦΟ-ΦΟ-ΦΟ-ΦΟ- 43 C3 C3

η —- c i c c 1 c 1 -i —) Q

ω-i £ Qyy

^ PP OUOUJOLUOllI CO CM CM

Q_ O OU_OU.OLL.OU_ CM

o cn 0 m

LO '—I 1—I CM CM

DK 159122 B

12

Eksempel 2 I dette eksempel anvendtes Erwinia punctata FERM-P 5452 som stamme (I).og Brevi bacterium ketosoreductum FERM-P 1905 og Corynebacterium sp.

FERM-P 2770 som stamme (II).

5 Podekulturer af stammerne (I) og (II) fremstilledes på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Som en anden præparation fremstilledes et fermenteringsmedium ved at indstille pH af en vandig opløsning indeholdende 3% D-glukose, 3% CSL, 0,2% "Bacto"-gærekstrakt, 0,1% KHgPO^, 0,02%

MgSO^, 7H2O og 1,0% CaCOg til 7,0-7,2 med 10% NaOH opløsning, og portio-10 ner på 50 ml hældtes i koniske kolber på 500 ml, som derefter steriliseredes ved 115°C i 20 minutter. Hvert af fermenteringsmedierne inokulere-des med 1 ml af podekulturen af stamme (I) og med 4,0 ml af en af pode-kulturerene af stamme (II) og dyrkedes under omrøring (amplitude 71 mm, 270 opm) ved 28°C i 48 timer.

15 Efter dyrkningen analyseredes de dyrkede substrater på samme måde som beskrevet i eksempel 1, og resultaterne er summeret i tabel 5. Som det fremgår af tabel 5 iagttoges der ingen akkumulering af 2-keto-D-glu-consyre, selvom der iagttoges en akkumulering af 2-keto-L-gulonsyre.

20 Tabel 5 2-Keto-L-gulonsyre producerende Akkumulering af 2-keto-L- mikroorganismestamme (II) gulonsyre, mg/ml 25 Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. 0,37 FERM-P 1905

Corynebacterium sp. FERM-P 2770 1,28

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra D-glukose ved dyrkning af en første mikroorganisme (1), som er i stand til at producere 2,5-diketo-D-gluconsyre ud fra D-glukose, og en anden mi- 5 kroorganisme (2), som er i stand til at omdanne 2,5-diketo-D-gluconsyren til 2-keto-L-gulonsyre, i et medium indeholdende D-glukose, i hvilket begge mikroorganismerne er til stede samtidig, i det mindste under en senere del af dyrkningen, og hvor den anden mikroorganisme (2) tilhører slægten Brevibacterium eller slægten Corynebacterium, KENDETEGNET ved, 10 at den første mikroorganisme (1) tilhører slægten Erwinia.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den første mikroorganisme tilhører slægten Erwinia, og at den anden mikroorganisme tilhører slægten Brevibacterium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den første mi-15 kroorganisme tilhører sTægten Erwinia, og at den anden mikroorganisme tilhører slægten Corynebacterium.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, KENDETEGNET ved, at den første mikroorganisme er stammen Erwinia citreus ATCC 31623.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, KENDETEGNET ved, at den 20 første mikroorganisme er en af stammerne Erwinia punctata ATCC 31626, Erwinia punctata var. ATCC 31624, Erwinia punctata var. ATCC 31625 og Erwinia punctata var- ATCC 31627.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, KENDETEGNET ved, at den første mikroorganisme er en af stammerne Erwinia terreus ATCC 31628, Er- 25 winia terreus var. ATCC 31629, Erwinia terreus var. ATCC 31630 og Erwinia terreus var. ATCC 31631.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den anden mikroorganisme er stammen Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. ATCC 21914.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den anden mi kroorganisme er stammen Brevibacterium nov. sp. ATCC 31083.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den anden mikroorganisme er stammen Brevibacterium sp. ATCC 31082.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den anden mi-35 kroorganisme er stammen Brevibacterium testaceum IFO 12675.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at den anden mikroorganisme er stammen Corynebacterium sp. ATCC 31081.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at den anden mi- DK 159122 B kroorganisme er stammen Corynebacterium sp. ATCC 31089.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at den anden mikroorganisme er stammen Corynebacterium sp. ATCC 31088.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at den anden mi-5 kroorganisme er stammen Corynebacterium sp. ATCC 31090. 10 15