【発明の詳細な説明】
2-ケト-L-グロン酸産生のための発酵プロセスにおける
新規な細菌株およびその使用
発明の分野
本発明は、L-ソルボースおよび／またはD-ソルビトールの発酵転化による、2-
ケト-L-グロン酸の産生のためのプロセスに関する。本発明はさらに、このプロ
セスに有用な新規な細菌株に関する。
発明の背景
2-ケト-L-グロン酸（2-Keto-L-gulonic acid）（「2-KLG」）は、L-アスコル
ビン酸（ビタミンＣ）（必須栄養素）の調製における、重要な中間体である。2-
KLGは、Reichstein法を用いて、工業的な規模で過去に合成されている（Helveti
ca Chimica Acta 17:311(1934)）。しかし、この方法は、大量の溶媒の使用およ
び多数の複合反応工程の関与を含む、商業的適用についての多数の不利な点を有
する。
従って、Reichstein法に対する代替として、１つ以上の微生物を使用する多数
のプロセスが、発酵による2-KLGを産生するために開発されている。米国特許第2
,421,611号は、例えば、D-グルコースから5-ケト-D-グルコン酸への微生物酸化
に続くL-イドン酸（L-idonic acid）への化学的または微生物還元、そして続く2
-KLGへの微生物酸化を含む方法を開示する。特許公報第39-14493号、同第53-250
33号、同第56-15877号、および同第59-35290号は、例えば、D-グルコースの2,5-
ジケト-D-グルコン酸への微生物酸化、続く2-KLGへの微生物または化学的還元を
含む類似のプロセスを開示する。
しかし、これらの方法はまた、2-KLGの商業的産生におけるそれらの有用性を
減少する多数の不利な点を被っている。例えば、これらの方法における化学的還
元工程（すなわち、5-ケト-D-グルコン酸からL-イドン酸および2,5-ジケト-D-グ
ルコン酸から2-KLGへの還元）は、順に2-KLGの収量を減少する還元の立体化学を
制御する（従って、副産物として、それぞれ、D-グルコン酸および2-ケト-D-グ
ルコン酸を産生する）問題に付随して起こる。あるいは、この還元が１つ以上の
微生物によって行われる場合、過剰の糖が、還元のためのエネルギー源を提供す
るのに必要であり、これもまた、2-KLGの収量を減少する。
これらの問題を考慮して、代替の経路が2-KLGの発酵産生について使用されて
おり、これはソルボゾン(sorbosone)中間体を介する、L-ソルボースの2-KLGへの
酸化のみを含む。多数のプロセスが、Gluconobacter oxydans（米国特許第4,935
,359号；同第4,960,695号；同第5,312,741号；および同第5,541,108号）のよう
なGluconobacter属、Pseudogluconobacter saccharoketogenes（米国特許第4,87
7,735号；欧州特許第221707号）のようなPseudogluconobacter属からの広範な微
生物、Pseudomonas sorbosoxidans（米国特許第4,933,289号および同第4,892,82
3号）のようなPseudomonas属、そしてこれらならびにAcetobacter、Bacillus、S
erratia、Mycobacterium、およびStreptomyces（米国特許第3,912,592号；同第3
,907,639号；および同第3,234,105号）のような他の属からの微生物の混合を使
用するこの経路を用いて開発されている。
しかし、これらのプロセスは、2-KLGの商業的産生についてのそれらの有用性
を限定する特定の不利な点を被っている。例えば、G.oxydansを使用する上記に
参照したプロセスはまた、商業的使用のために十分に高レベルの2-KLGを産生す
るために、さらなる「ヘルパー(helper)」微生物株（例えば、Bacillus megater
ium）、または商業的に魅力的ではない量の酵母もしくは酵母に由来する増殖成
分の存在を必要とする。同様に、Pseudogluconobacterを使用するプロセスは、
商業的に適切な2-KLG濃度およびソルボース基質の効率的な使用を達成するため
に、高価で珍しい土塩類（earth salt）を補充した培地、またはヘルパー株（例
えば、B.megaterium）の存在、および／または酵母の存在を必要とし得る。Pseu
domonas sorbosoxidansを使用する他のプロセスもまた、培地中に商業的に魅力
的ではない量の酵母または酵母抽出物を含む。
従って、当該分野において、2-KLGを効率的に産生するが、当該分野の状態に
関連する多くの問題を伴わない微生物株の必要性が存在する。
発明の要旨
それゆえ、本発明の目的は、2-KLGを効率的に産生する微生物株を提供するこ
とである。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の好ましい実施態様の
詳細な説明において示され、そして部分的に説明から明らかになるか、または本
発明の実施によって理解され得る。本発明のこれらの目的および利点は、記載の
説明および本明細書中の請求の範囲に特に示される方法によって、理解されそし
て達成される。
これらおよび他の目的は、本発明の方法によって達成され、これは、第１の実
施態様において、L-ソルボースから2-KLGを産生するプロセスに関し、培地にお
いて、NRRL B-21627（ADM X6L）株またはその変異体もしくは改変体の微生物を
、単独または１つ以上のヘルパー株との混合培養によって培養する工程、次いで
、蓄積した2-KLGを回収する工程を含む。本発明の別の実施態様は、NRRL B-2162
7株またはその変異体（例えば、NRRL B-21630（ADM86-96）の微生物の培養に指
向される。
前述の一般的な記載および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明のため
のみであり、そして本願発明のさらなる説明を提供することが意図されることが
理解される。
図面の簡単な説明
養寄託DSM 4027、米国特許第4,935,359号）の小コロニー成分株の再単離物（rei
nobacter saccharoketogenes株IFO14484から得られた。
発明の好ましい実施態様の詳細な説明
第１の実施態様において、本発明は、2-ケト-L-グロン酸のL-ソルボースから
の産生のための発酵プロセスに関し、これは、微生物をL-ソルボースに十分な時
間接触させる工程、次いで蓄積した2-KLGを単離する工程を含む。好ましくは、
本発明の発酵プロセスは、微生物を、L-ソルボースを含む合成または天然の培養
培地において十分な時間培養する工程、次いで蓄積した2-KLGを、培養培地およ
び／または微生物の細胞から単離する工程を含む。
本発明のプロセスに使用される微生物株は、好ましくは、細菌株NRRL B-21627
（ADM X6L）またはその変異体もしくは改変体であり、これは、純粋培養におけ
る（すなわち、１つ以上のさらなる微生物株（単数または複数）の非存在下にお
ける）発酵によって、L-ソルボースから少なくとも約40g/Lの2-KLGを産生し得る
。
NRRL B-21627（ADM X6L）株は、Agricultural Research Service Culture Col
lection（NRRL）（1815 North University Street，Peoria，IllinoiS 61604，U
SA）に、1996年10月１日に、ブタペスト条約の下に寄託され、そして受託番号NR
RL B-21627を割り当てられた。NRRL B-21627（ADM X6L）株の特徴は以下を含む
：
（１）細胞形態−グラム陰性；より古い培養においてグラム可変であり得る；多
態性（pleiomorphic）；短桿菌(short rod)または球菌；細胞は１つずつまたは
対を示す；短鎖またはフィラメントを形成し得る；芽胞を形成しない；
（２）コロニー形態−点状、凸状、完全、平滑、液状、および半透明；同じ培地
上のより古いコロニーにおいて、ベージュまたは薄茶色の呈色；
（３）運動性：液体培養または２％寒天プレート培養物から調製した湿潤マウン
トにおいて運動性は観察されない；0.3％〜0.4％寒天を用いて部分的に凝固され
ているBUGMTM培地（Biolog,Inc.，Cat.#70001から入手可能）のプレートの新鮮
な培養物を穿刺することによって、運動性は観察される；細胞は運動性を観察す
るために使用した条件下で鞭毛を生成する；
（４）温度範囲：４℃、37℃、または41℃では、増殖は観察されないが、25℃お
よび30℃で良好な増殖が観察された；
（５）pH範囲：pH4.5では増殖は観察されなかった；pH6.2で増殖が観察された；
pH7.2で良好な増殖が観察された；
（６）生理学的特徴：
（a）カタラーゼ：ポジティブ；
（b）オキシダーゼ；ポジティブ
（c）ゼラチナーゼ；ネガティブ；
（d）好気性、嫌気性条件下では増殖せず；
（e）フルクトースから形成される茶色素；
（f）酸はエタノールから産生される；
（g）ジヒドロキシアセトンはグリセロールから産生されない；
（h）4.0〜5.0の範囲のpHでは、静置グルコースまたはマンニトールブロス培
養において24時間以内で薄膜または環を形成しない；
および
（i）ストレプトマイシンに感受性；ならびに
（７）構造特徴：
（a）３％NaClにおける増殖：ポジティブ；
（b）ペプトン-酵母抽出物-マンニトール寒天：増殖；
（c）Marine寒天：低増殖；
（d）BUGMTMおよびBUGM-GTM；増殖；および
（e）Brain Heart Infusion寒天：増殖。
のハイブリダイゼーション、続くゲル電気泳動を用いる標識化二本鎖ハイブ
リッドの検出を含む。この方法によって得られるパターンは、異なる種の生
物間のみでなく、同じ種の異なる株間の分化に有用である。NRRL B-21627
から2-KLGを産生し得ることが公知の多数の比較株は、図１に示される。
天然に存在するNRRL B-21627（ADM X6L）株に加えて、その変異体および改変
体もまた本発明のプロセスに使用され得、ただしこれは、これらの変異体および
改変体もまた、単培養において、L-ソルボースから少なくとも40g/Lの2-KLGを産
生し得る。
本発明の微生物の変異体および改変体を調製するための適切な方法の例示的な
例は、以下を含むがこれらに限定されない：紫外線またはＸ線での照射、または
ニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）、メチルメ
タンスルホン酸、ナイトロジェンマスタードなどのような化学変異源での処理に
よる変異誘発；遺伝子組込み技術、例えば、挿入エレメントまたはトランスポゾ
ン、あるいは形質転換線状または環状DNA分子の同種組換えによって媒介される
もの；およびP1のようなバクテリオファージによって媒介される形質導入。これ
らの方法は当該分野で周知であり、そして例えば、J.H.Miller，Experiments in
Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Ha
rbor New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，C
old Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1992)；
M.SingerおよびP.Berg，Genes & Genomes，University Science Books，Mill Va
lley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.FritschおよびT.Maniatis，Molecul
ar Cloning：A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory P
ress，Cold Spring Harbor New York（1989）；P.B.Kaufmanら、Handbook of Mo
lecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，CRC Press，Boca Ra
ton，Florida(1995)；Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology
，B.R.GlickおよびJ.E.Thompson編、CRC Press，Boca Raton，Florida（1993）
；ならびにP.F.Smith-Keary，Molecular Genetics of Escherichi a coli，The
Guilford Press，New York，NY（1989）に記載される。
次いで、公知の方法を用いて本発明の生物NRRL B-21627（ADM X6L）から誘導
した変異株は、好ましくは、改良された2-KLG産生能について、またはL-ソルボ
ースから2-KLGを産生することにおけるそれらの有用性に関連する他の所望の特
性について、選択されるかまたはスクリーニングされる。株の改良に対する変異
誘発およびスクリーニングアプローチの特に好ましい実施態様において、変異誘
発した細胞は、増殖阻害濃度の部分的に誘導体化または分解した2-KLG（例えば
、オートクレーブまたは熱に対する他の暴露によって作製された2-KLG誘導体）
に対するそれらの耐性に基づいて選択される。代替の実施態様において、選択因
子は、2-KLGの化学改変の他の手段（以下を含むがこれらに限定されない：2-ア
ミノ-L-グロン酸または2-アミノ-L-イドン酸を作製するアミノ置換；5-ケト-グ
ル
カル酸を作製するC6位での酸化；2-KLGの種々のチオールもしくはデオキシ誘導
体または種々の不飽和誘導体を導く改変）；あるいは当業者に明らかである任意
の他の手段によって作製され得る。
NRRL B-21627（ADM X6L）株の特に好ましい変異体（ADM89-96）は、Agricultu
ral Research Service Culture Collection（NRRL）(1815 North University St
reet，Peoria，Illinois 61604，USA）に、1996年10月15日に、ブタペスト条約
の下に寄託され、そして受託番号NRRL B-21630を割り当てられた。
本発明に従って、本発明の微生物またはその変異体もしくは改変体は、十分な
時間L-ソルボースと接触され、次いで、蓄積した2-KLGは単離される。好ましく
は、微生物株は、L-ソルボースを含む天然または合成培地において、2-KLGが産
生される十分な時間培養され、そして蓄積した2-KLGは続いて単離される。ある
いは、微生物株の細胞に由来する調製物は、十分な時間L-ソルボースと接触され
得、次いで、蓄積した2-KLGは単離され得る。
本明細書中で用いられるように、「細胞に由来する調製物」は、本発明の株ま
たはその変異体もしくは改変体、アセトン乾燥細胞、支持体（例えば、ポリアク
リルアミドゲル、κカラゲナンなど）上の固定化細胞、および類似の調製物の培
養ブロスからの細胞の任意および全ての抽出物を意味することが意図される。
このような手順の例示的な例は、適切な水性緩衝液（例えば、2-(N-メチルモ
ルホリノ)エタンスルホン酸（pH6.5；0.5M））中のL-ソルビトールおよびCaCO3
を、振盪フラスコ中の微生物株の水性抽出物に添加することを含む。この反応は
、好ましくは、5.0〜8.0の範囲のpHで、20℃〜40℃の範囲の温度にて、約1〜100
時間進行する。L-ソルボースの濃度は、約0.1〜10％w/v、より好ましくは約0.3
〜６％（w/v）であるべきであり、そしてNRRL B-21627（ADM X6L）株またはその
変異体もしくは改変体（例えば、NRRL B-21630（ADM86-96））の細胞に由来する
調製物の量は、約１〜30mg/mlであるべきである。2-KLG収率を最大化することが
経験的に決定された温度およびpH条件下で、十分な時間振盪した後、蓄積した2-
KLGは、従来の方法によって単離され得る。
本明細書中で用いられる培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）ま
たは天然であり得、そして本発明の微生物株の培養に十分な栄養素を含む。好ま
しくは、使用される培地は、液体培地、より好ましくは合成液体培地である。
本発明のプロセスの種々の実施態様において、開始物質（L-ソルボース）は、
本発明の微生物株の導入前に培地中に存在し得るか、あるいは株の導入後に、開
始と同時に、または培養の経過にわたって連続してもしくは分割してのいずれか
で全てを培地に添加され得るか、あるいはD-ソルビトールの発酵転化によってイ
ンサイチュで作製され得る。使用されるL-ソルボースの量は、当業者によって経
験的に決定され得るが、微生物株が少なくとも約40g/Lの2-KLGを産生するに少な
くとも十分である。好ましくは、L-ソルボースは、培養培地の３〜30％（w/v）
、より好ましくは５〜20％を含む。
本発明の好ましい実施態様において、L-ソルボース開始物質は、適切な微生物
または微生物の混合を用いるD-ソルビトールの発酵転化によって、インサイチュ
で作製される。NRRL B-21627（ADM X6L）またはその変異体もしくは改変体の存
在下でD-ソルビトールからL-ソルボースに転化し得るが、L-ソルボースを2-KLG
に転化するその能力に悪影響を及ぼさない、任意の微生物または微生物の混合物
が使用され得る。好ましくは、使用される微生物は、Gluconobacter oxydansの
株、より好ましくはG.oxydans株ATCC 621またはG.oxydans株IFO 3293である。本
発明の好ましい実施態様によって、D-ソルビトール開始物質は、１つ以上の微生
物の導入の前に培地中に存在し得るか、あるいは１つ以上の微生物の導入後に、
開始と同時に、または培養の経過にわたって連続してもしくは分割してのいずれ
かで全てを培地に添加され得る。
L-ソルボースおよび／またはD-ソルビトールに加えて、天然または合成培養培
地はまた、窒索源、適切な無機塩、および適切には、種々の微量栄養素、微生物
株の培養に適した増殖因子などを含み、そしてまた、少なくとも１つの補充炭素
源を含み得る。使用されるこれらのさらなる成分の各々の量は、好ましくは、2-
KLG産生を最大にするために選択される。このような量は、当該分野で公知の種
々の方法および技術に従って、当業者によって経験的に決定され得る。本発明の
特に好ましい実施態様において、培養培地は、約10％（w/v）のL-ソルボース、
約３％（wt、乾燥固体／v）のコーンスティープリカー（corn steep liquor）、
および約0.2％（w/v）のMgSO4・7H2Oを含み、NH4OH、Ca(OH)2またはCaCO3を用い
て
制御したpHを有する。種菌を調製する際に用いるための培地は、適切には、さら
なる成分（例えば、ペプトンまたはN-Zアミン）、補充炭素源、および／または
種々のビタミンを含み得る。
適切な補充炭素源の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない
：他の炭化水素（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプン
またはデンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物、および糖蜜）；有機酸
（例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマ
ル酸）；ならびにアルコール（例えば、グリセロール）。
適切な窒素源の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：ア
ンモニア（アンモニアガスおよび水性アンモニアを含む）；無機酸または有機酸
のアンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム）；尿素；硝酸塩または
亜硝酸塩、ならびに他の窒素含有物質（純粋または粗調製物のようなアミノ酸、
肉抽出物、ペプトン、魚肉、魚加水分解産物、コーンスティープリカー、カゼイ
ン加水分解産物、大豆固形物(cake)加水分解産物、酵母抽出物、乾燥酵母、エタ
ノール-酵母蒸留液、大豆粉末、綿実粕など）。
適切な無機塩の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：カ
リウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜
鉛、銅および他の微量エレメントの塩、ならびにリン酸塩。
適切な微量栄養素、増殖因子などの例示な例としては、以下を含むがこれらに
限定されない：補酵素Ａ、パントテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビン、
フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、他のビタミン、
システインのようなアミノ酸、チオ硫酸ナトリウム、p-アミノ安息香酸、ニコチ
ンアミドなど。これらは純粋または部分的に精製した化学化合物または天然物質
に存在するかのいずれかである。本発明の微生物株の培養は、当業者に公知の任
意の液内発酵技術（例えば、エアーリフト(airlift)、伝統的な散布-撹拌設計、
または振盪培養において）を用いて達成され得る。
使用される培養条件（温度、pH、通気速度、撹拌速度、培養期間などを含む）
は、当業者によって、2-KLG産生を最大にするように経験的に決定され得る。特
定の培養条件の選択は、使用される特定の本発明の微生物株、培地組成物および
型、培養技術、ならびに同様の考慮に依存する。NRRL B-21627（ADM X6L）株ま
たはその変異体もしくは改変体（例えば、NRRL B-21630（ADM 86-96））を使用
する場合、本発明の特に好ましい実施態様において、培養は、22℃〜35℃の範囲
の温度、好ましくは約30℃、そして5.0〜8.0の範囲、好ましくは5.5〜7.5の範囲
、より好ましくは約6.0〜6.8の範囲のpHで行われる。当然のことながら、使用さ
れる培養条件は、培養中の異なる時点で、適切に、2-KLG産生を最大にするよう
に、公知の方法によって変更され得る。
十分な時間（例えば、10〜150時間）の培養後、細胞および／または培養ブロ
ス中に蓄積した2-KLGは、任意の公知の方法に従って単離される。培養に使用さ
れる条件に適切な任意の方法が使用され得る；2-KLGを回収するための適切な方
法の例示的な例は、米国特許第5,474,924号；同第5,312,741号；同第4,960,695
号；同第4,935,359号；同第4,877,735号；同第4,933,289号；同第4,892,823号；
同第3,043,749号；同第3,912,592号；同第3,907,639号、および同第3,234,105号
に記載される。
１つのこのような方法によって、微生物は、公知の方法（例えば、遠心分離ま
たは濾過）によって培養ブロスから最初に除去され、そして得られた溶液は、減
圧下で濃縮される。次いで、結晶性の2-KLGは、濾過によって回収され、そして
所望される場合、再結晶化によって生成される。同様に、2-KLGは、イオン交換
樹脂、溶媒抽出、沈殿、塩析などの使用のような公知の方法を用いて回収され得
る。
2-KLGが遊離酸として回収される場合、従来の方法を用いて、所望のような、
ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、または同様のカチオンとの
塩に転換され得る。あるいは、2-KLGが塩として回収される場合、従来の方法を
用いて、その遊離形態または異なる塩に転換され得る。
本発明の代替の実施態様において、本発明の微生物は、１つ以上のヘルパー株
との混合培養において培養される。本明細書中で用いられるように、「ヘルパー
株」は、本発明のプロセスにおいて産生される2-KLGの量を増加させる微生物の
株を意味することが意図される。適切なヘルパー株は、当業者によって経験的に
決定され得る。適切なヘルパー株の例示的な例としては、以下を含むがこれらに
限定されない：Aureobacterium（好ましくは、A.liquefaciensまたはA.saperdae
）、Corynebacterium（好ましくは、C.ammoniagenesまたはC.glutamicum）、Bac
illus、Brevibacterium（好ましくは、B.linensまたはB.flavum）、Pseudomonas
、Proteus、Enterobacter、Citrobacter、Erwinia、Xanthomonas、およびFlavob
acterium。好ましくは、ヘルパー株は、Corynebacterium glutamicum ATCC 2154
4である。
ヘルパー株は、好ましくは、適切な培地中で、適切な条件下で、十分な時間、
十分な集団の培養物が得られるまで、インキュベートされる。次いで、このヘル
パー株種菌は、別々または本発明の微生物株と組み合わせて（すなわち、混合し
た種菌）のいずれかで、2-KLGを産生するための培養培地に導入され得る。好ま
しくは、NRRL B-21627（ADM X6L）の量に関連するヘルパー株の量の比は、10:1
〜1:10,000の範囲である。
本発明の別の実施態様は、上記の新規な微生物株に関し、これは2-KLGの産生
のための発酵プロセスにおいて有用である。
以下の実施例は例示するのみであり、そして添付の請求の範囲によって規定さ
れるような本発明の範囲を限定することを意図されない。当業者には、種々の改
変および変更が、本発明の方法において、本発明の精神および範囲を逸脱せずに
なされ得ることは明らかである。従って、本発明の改変および変更が、添付の請
求の範囲の範囲およびそれらの等価物内にあるならば、本発明がそれらを含むこ
とが意図される。
本明細書中に参照される全ての特許および刊行物は、参考として明白に援用さ
れる。
実施例
実施例１：NRRL B-21627（ADM X6L）株の単離
Ａ．土壌サンプルの起源、濃縮、およびスクリーニング
環境検体を振盪フラスコ中で微生物的濃縮に供した。得られた混合物培地をス
クリーニングして、L-ソルボースから2-KLGを産生し得る少なくとも１つ以上の
微生物を含むものを同定した。湿潤土壌、砂、堆積物、果物、液果、腐植、およ
び他の環境検体を、アメリカ合衆国の種々の地域から採集した。各検体を、冷却
換気湿潤容器中に即座に保存した。濃縮は、１グラムの土壌または検体を、250m
Lバッフル振盪フラスコ中の30mLの培地Ａ（表１）に添加し、続いて30℃にて230
rpm、49時間振盪インキュベーションすることによって開始した。
発酵による濃縮をスクリーニングするために、各濃縮物の0.5〜0.75mLを、30m
Lの新鮮な培地Ｂ（表１）を含む250mLバッフルフラスコに移した。混合した培地
発酵の一部を2-KLG含量について分析した後、これらのフラスコを、30℃にて230
rpm、68時間振盪し、低温保存した。保存のために、各培養物の2.0mLを、10mLの
40％滅菌グリセロール水と混合し、次いで-70℃で保存した。
フラスコを、Whatman LK5 Silica Gel 150プレート（250mm厚）（カタログ番
号4855-820）の薄層クロマトグラフィーを用いて、2-KLG産生についてスクリー
ニングした。プレートを、５μＬの遠心分離した培養液でスポットし、そして溶
媒中（157mLのn-プロパノール；39mLの脱イオン水；４mLの１％リン酸；0.4mLの
氷酢酸）で５〜６時間発色させた。プレートを風乾し、次いで25mLのメタノール
および25mLの６N水酸化ナトリウム中に溶解した0.125gの塩化テトラゾリウムブ
ルーをスプレーした。その後、それを60℃にて５分間焼いた。ソルボースおよび
2-KLGを、完成したプレート上の紫色のスポットとして可視化し、そして2-KLGお
よびL-ソルボースの各々10g/Lを含む標準との比較によって同定した。
2-KLGの産生を、HPLCによって定量した。試料を、移動相中の1:10希釈、続い
て0.45μｍ多孔性膜を通して濾過することによって調製した。移動相は、Mili-Q
水を用いて4.0Lに希釈した、1.1mLのACSグレードのスルホン酸を含む。100μＬ
のサンプルの各々を、600mmの全カラム長を提供するために一続きに配列した２
つの２mm×300mm×7.8mm Aminex HPX-87Hカラム（BioRad）（同じ樹脂のガード
カラムの前に）にロードした。カラムを、0.6mL/minの流速を用いて55℃にて実
行した。L-ソルボースおよび2-KLGを、Waters Model No.410示差屈折計を用いて
検出し、そして2-KLGおよびL-ソルボースを含む標準に対して比較することによ
って同定した。
33の混合した培養発酵は、1.8〜9.3g/Lの範囲の量の2-KLGを産生した。土壌サ
ンプル#2l6B（ここから、NRRL B-2167を後に単離した（実施例１Ｂ）からの混合
培養発酵は、6.3g/Lの2-KLGを産生した。
Ｂ．単培養の単離および試験
L-ソルボースから2-KLGを産生し得る微生物の純粋培養物（単培養または他の
微生物との混合培養のいずれかにおいて）を、上記の濃縮物から単離した。実施
例１Ａからの11の混合培養濃縮物を、それらの優位な2-KLG産生に基づいて選択
した。これらを解凍し、そして培地Ａを用いて10倍連続増分中に希釈し、その後
、各希釈の0.1mLを、培地Ａ寒天プレートの表面に広げた。プレートを、30℃に
て24時間インキュベートし、次いで8〜40倍の拡大率で試験した。最小の最遅増
殖コロニーは、希釈プレートから2-KLG産生株を回収するために必要であった。
各コロニーの型およびサイズのいくつかの例を選択し、そして新鮮な培地Ａで継
代培養し、その後、希釈プレートを24時間30℃に戻した。さらなる遅増殖コロニ
ーを、希釈プレートから選択し、そして二次インキュベーション期間の後継代培
養した。各株を、各培地ＡプレートまたはPYMプレート（10g/Lペプトン；10g/L
酵母抽出物；0.5g/Lグリセロール；30g/Lマンニトール；20g/L寒天）のいずれか
で１〜３周期間画線精製した。純粋な株を、20％グリセロールを含むPYM液体培
地中で、-70℃にて低温保存した。全118の純粋な株を、11の濃縮混合物から回収
した。
118の新しい株を、振盪フラスコにおいてL-ソルボースを2-KLGに転化するそれ
らの能力について、試験した。2-KLG産生が、２つ以上の微生物の合わせた活性
を要求し得る可能性について説明するために、各新しい単離物を、同じ濃縮物に
起源する全ての他の株との対の組合せにおいて、ならびに純粋培養において試験
した。種菌を調製するために、各株を、PYM寒天で24時間培養し、その後、細胞
の巨大なループを、50mMリン酸ナトリウム、0.4％塩化ナトリウム、および0.05
％マンニトールを含む滅菌緩衝液（pH7.2）に再懸濁した。各純粋株または対の
株の試験のために、30mLの培地Ｃ（表１）を含む250mLバッフルフラスコを、関
連株の各々の細胞懸濁物の0.2mLで接種した。これらのフラスコを、30℃にて230
rpm、24時間振盪し、その後、1.0mLを30mLの発酵培地Ｄ（表１）に移した。発酵
フラスコを、30℃にて230rpm、３日間振盪し、次いで培養液を2-KLGおよびソル
ボース含有量について、TLCおよびHPLCを用いて分析した。105のフラスコが、土
壌サンプル#216Bからの株を試験するのに必要であった。これらのうち18が、1.9
〜19.3g/Lの範囲の量の2-KLGを産生し、そのうち14が、単離体ADM X6Lで接種さ
れている（表２）。ADM X6L（NRRL B-21627）株が、純粋培養において14.9g/Lの
2-KLGを産生したという事実は、2-KLG産生株としてのその同一性を証明した。
表１：実施例１において使用した培地
*グルコース、コーンスティープリカー、硫酸鉄、および炭酸カルシウムをpH7.9
に調整し、次いで20分間オートクレーブした。残りの成分をpH6.3に調整し、次
いで濾過によって滅菌した。最終培地は、7.1〜7.4の範囲のpHを有した。酵母窒
素ベースは、Difco産物#0335-15-9であった。
表２：純粋培養および土壌サンプル#216-Bからの他の株との混合培養におけるAD
M X6L株による2-KLG産生 *％転化収率は、2-KLGとして見いだされた消費したL-ソルボースの重量％をいう
。
実施例２：振盪フラスコにおけるNRRL B-21627株によるL-ソルボースからの2-KL
Gの産生。
NRRL B-21627株を、BUGMTM固体寒天培地で30℃にて培養し、次いでコロニーを
、20mLの培地Ｅ（表３）を含む250mLバッフルフラスコに、滅菌した爪楊枝で移
した。種培養を、30℃にて240rpm、24時間インキュベートした。次いで、250mL
バッフルフラスコ中20mLの産生培地（培地Ｆ、培地Ｇ、または培地Ｈ；表３）を
、この種の２mLで接種した。培養を、30℃にて240rpm、72時間インキュベートし
た。培養液を続いて回収し、そしてHPLCによって分析した。2-KLG産生結果を、
表４
に示す。
表３：実施例２において使用した培地 a20分間のオートクレーブ前にpHを7.0に調整したb
L-ソルボースを20分間オートクレーブし、次いで残りの成分（これは最初にpH7
.2に調整されそして20分間オートクレーブされている）に添加した。c
ビタミンをpH7.0に調整し、そして濾過によって滅菌し、次いでL-ソルボースお
よびD-マンニトール（これらは20分間オートクレーブされている）に添加した。
次いで、この混合物を、残りの成分（これは最初にpH7.2に調整されそして20分
間オートクレーブされている）に添加した。
表４：フラスコにおけるNRRL B-21627による2-KLG産生
実施例３：NRRL B-2167株による純粋培養におけるL-ソルボースからの2-KLG産生
の他の株に関する比較
本発明の微生物株NRRL B-21627（ADM X6L）およびGluconobacter oxdans株402
5C（混合培養寄託DSM4027（米国特許第4,935,359号）の小コロニー構成株の再単
離体）を、Ｌ−ソルボースからの2-KLGの産生について、いくつかの異なる培地
（表５）およびプロトコルを用いて試験した。結果（表６）は、種々の培養培地
において、NRRL B-21627株による有意に高度な2-KLG産生を示した。さらに、２
つの株を、培地I/Jから培地k/Lへの切替によって別々に影響を及ぼした。
表５：実施例３に使用した培地
表６：純粋培養振盪フラスコにおけるNRRL B-21627および4025Cによる2-KLG産生
の比較
a培地C/D（表１）について、株を、PYM寒天ではなくBUGMTM寒天で最初に培養し
た以外は、実施例１Ｂの実験プロトコルを使用した。培地I/JおよびK/L（表５）
について、実施例２の実験プロトコルを使用した。b
C/D培地におけるADMについての2-KLG値は、９回の試行の平均である；4025Cに
ついての値は６回の試行の平均である。
実施例４：NRRL B-21627および第２の微生物を含む混合培養による振盪フラスコ
におけるL-ソルボースからの2-KLGの産生
20mLの培地Iを含むバッフル250mL振盪フラスコを、100μＬのNRRL B-21627の
凍結培養物および同様量の第２の株で接種した。フラスコを240rpm、30℃にて24
時間振盪した。次いで、この培養物の２mLを、25mLの培地Ｍ（表９）を含む250m
Lのバッフルフラスコに移した。240rpm、30℃にて65時間振盪した後、フラスコ
を、L-ソルボースからの2-KLGの形成についてHPLCによって分析した。結果を表
７に示す。
表７：フラスコにおけるNRRL B-21627株（ADM X6L）を含む混合培養によるL-ソ
ルボースからの2-KLGの産生
*ATCC 19354、ATCC 19391、ATCC 21544、ATCC 21529、NRRL B-14840、およびNRR
L B-43647株は、それぞれ、Corynebacterium ammoniagenes、Brevibacterium li
nens、Corynebacterium glutamicum、Brevibacterium flavum、Aureobacterium
saperdae、およびAureobacterium liquifaciensである。**
収率％は、2-KLGとして見いだされた消費したL-ソルボースの重量％をいう。
実施例５：NRRL B-21627株の改良された改変体についての変異誘発、スクリーニ
ング、および選択。
本発明の細菌株NRRL B-21627（ADM X6L）およびその変異体を変異誘発に供し
、
そして改良された2-KLG産生を示す改変体を回収した。細菌培養を、BUGMTMまた
はPYM培養液培地において、中間対数増殖期まで増殖させ、次いで遠心分離によ
ってペレット化し、そしてガラス管中２mLの濾過滅菌したTM緩衝液（Tris・HCl6
.0g/L、マレイン酸5.8g/L、(NH4)2SO41.0g/L、Ca(NO3)25.0mg/L、MgSO4・7H2O 0
.1g/L、FeSO4・7H2O0.25mg/L、KOHを用いてpH6.0に調整）に再懸濁した。2mLの
細胞懸濁物を、5.0mg/mLのN'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）溶液の2.5μ
Ｌと混合し、次いで30℃にて25分間インキュベートした。未処理の細胞懸濁物を
、殺傷速度を評価するためのコントロールとして、同様にインキュベートした。
インキュベーションの後、10mLのTM緩衝液を各管に添加し、次いで細胞を遠心分
離によってペレット化し、TM緩衝液中で２回洗浄し、次いでKOHを用いてpH7.2に
調整した4.0mLの0.1M NaH2PO4（リン酸緩衝液）に再懸濁した。洗浄した細胞懸
濁物を、リン酸緩衝液中にさらに希釈し、そしてアリコートを、BUGMTMまたはCM
2寒天培地のプレートに広げ、次いで30℃にてインキュベートした（BUGMTMはBio
log，Inc．から入手可能である,Cat#70001；CM2培地は、D-ソルビトール5.0g/L
、(NH4)2SO42.0g/L、KH2PO40.1g/L、KH2PO40.9g/L、FeCl3・6H2O５mg/L、MnSO4
・4H2O５mg/L、カザミノ酸2.0g/L、酵母抽出物2.0g/L、寒天15.0g/Lを含み、オ
ートクレーブの前にpHを7.0に調整した；以下のCM2成分を濾過によって滅菌した
：MgSO4・7H2O 0.25g/L、チアミン・HCl30mg/L、パントテン酸およびナイアシン
アミド10mg/L、ならびにρ-アミノ安息香酸5mg/L)。変異誘発していないコント
ロール細胞と比較して、NTG処置からの殺傷速度は60％〜80％であった。生存コ
ロニーをランダムに拾い上げ、そして振盪フラスコにおけるL-ソルボースからの
改良された2-KLG産生についてスクリーニングした。あるいは、変異誘発した細
胞懸濁物を希釈し、そして増殖阻害性CM2-S選択寒天培地のプレートに広げた（C
M2-Sは、オートクレーブ前に培地の熱安定性成分に添加された７〜８％の2-KLG
を含むCM2である）。CM2-S寒天上で増殖したコロニーを拾い上げ、そして振盪フ
ラスコにおけるL-ソルボースからの2-KLGを産生する改良された能力について試
験した。
Ａ．純粋培養振盪フラスコ発酵におけるNRRL B-21627および変異誘導体による
L-ソルボースからの2-KLGの産生。
各試験した株について、0.1mLの凍結培養物を、20mLの種培地Ｋ（表５）を含
む250mLバッフルフラスコに接種し、次いで30℃にて24時間240rpmにてインキュ
ベートした。2mLの種内容物を使用して、250mLバッフル振盪フラスコ中25mLの発
酵培地Ｍ（表９）を接種し、そしてフラスコを、72時間30℃にて240rpmで振盪し
た。2-KLG産物を、HPLCによってアッセイした（表８）。
表８：振盪フラスコにおける純粋培養によるL-ソルボースからの2-KLG産生
*株はCM2-S寒天培地上で選択した。
Ｂ：純粋培養発酵槽におけるNRRL B-21627および変異誘導体によるL-ソルボー
スからの2-KLGの産生。
各株について、35mLの種培地Ｎ（表９）を含む250mLバッフルフラスコを、0.2
mLの凍結培養物で接種し、次いで30℃にて240rpm、24時間インキュベートした。
35mLの種内容物を使用して、1.5L Applikon発酵槽中の700mLの発酵培地Ｏ（表９
）を接種した。発酵を、以下の制御条件下で72時間行った：32℃、1000rpm、21
％NH4OHを用いて調整したpH6.3、1500mL/分の通気。2-KLG産物を、HPLCによって
アッセイした（表10）。
表９：実施例４および５において使用した培地表10：発酵槽における純粋培養によるL-ソルボースからの2-KLG産生
＊モル収率％は、2-KLGとして見いだされた消費されたL-ソルボースのモル％を
いう。
実施例６：ADM 86-96（NRRL B-21630）および第２の微生物からなる混合培養に
よる発酵槽におけるD-ソルビトールからの2-KLG産生
ADM 86-96（NRRL B-21630）株（NRRL B-21627の変異改変体）を、D-ソルビト
ールからL-ソルボースに転化する能力を有する第２の生物の存在下で培養した。
50mLの種培地Ｐ（表12）を含む500mLバッフルフラスコを、0.2mLのADM 86-96株
の凍結培養物、および第２の微生物として同容量のADM 29-121（IFO 3293株の改
変体）またはATCC 621のいずれかで接種した。フラスコを、240rpm、30℃にて24
時間振盪した。種内容物を使用して、1.5L Applikon発酵槽中の700mLの発酵培地
Ｑ（表12）を接種した。発酵を、以下の制御条件下で43〜70時間行った：30℃、
800rpmの撹拌速度、1.8VVMの通気、17％NH4OHを用いて6.0でpHを維持した。結果
を表11に示す。
表11：発酵槽における混合株培養によるD-ソルビトールからの2-KLG産生
*g 2-KLG産生／（g D-ソルビトール-g残留L-ソルボース）
表12：実施例６に使用した培地
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ
，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，
ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 エディントン，ジョン エム.
アメリカ合衆国 イリノイ 62521―4137,
デカトゥール，ノーウッド ドライブ 36
(72)発明者 ヤン，ユーキン
アメリカ合衆国 イリノイ 62521，デカ
トゥール，ウィロウ ブルック レーン
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