DK160997B

DK160997B - Immobiliseret, enzymatisk aktiv substans og fremgangsmaade til fremstilling af samme

Info

Publication number: DK160997B
Application number: DK006082A
Authority: DK
Inventors: Ichiro Chibata; Tetsuya Tosa; Isao Takata
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co
Priority date: 1981-01-09
Filing date: 1982-01-08
Publication date: 1991-05-13
Also published as: DE3162995D1; EP0056111A1; DK6082A; EP0056111B1; DK160997C; JPS57115179A; US4433054A; JPH0160235B2

Description

i

DK 160997 B

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt, immobil i seret, enzymatisk aktiv substans og en fremgangsmåde til fremstilling af samme.

Enzymatiske reaktioner er blevet benyttet ved fremstilling af forskellige værdifulde materialer og ved dekomponer!ng af forskellige uøn-5 skede materialer eller stofskifteprodukter, der er skadelige for mennesker og husdyr, og for effektivt at udføre enzymatiske reaktioner er der ved reaktionerne blevet anvendt immobil i serede, enzymatisk aktive substanser såsom enzymer eller mikrobielle celler.

Der kendes forskellige fremgangsmåder til fremstilling af immobili-10 serede, enzymatisk aktive substanser. Ved én sådan fremgangsmåde indespærres en enzymatisk aktiv substans i en gelmatrix af et polysaccharid såsom agar eller carragenan ved afkøling af en vandig blanding af substansen og polysaccharidet til opnåelse af et immobiliseret præparat. Et sådant immobiliseret præparat har imidlertid nogle ulemper. Fx. er det 15 immobil i serede præparat, der opnås ved anvendelse af agar, tilbøjeligt til at miste sin netværkstruktur og blive omdannet til sol inden for et kort tidsrum, når det anvendes i en enzymatisk reaktion ved høj temperatur. Når der anvendes carragenan, er gelmatrixen i det resulterende præparat ustabil og forårsager udsivning af den enzymatisk aktive substans 20 fra præparatet, hvilket resulterer i en sænkning af den enzymatiske aktivitet under anvendelse af præparatet.

Opfinderne har tidligere fundet ud af, at en immobiliseret, enzymatisk aktiv substans med udmærkede egenskaber uden de ovenfor nævnte ulemper kan opnås ved at indespærre en enzymatisk aktiv substans i en 25 gelmatrix af et polysaccharid med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest (-SOjH) i molekylet under specielle betingelser, bl.a. ved tilstedeværelse af ammoniumioner eller en vandopløselig amin under gelatineringen, og har indleveret patentansøgninger, der angår den immobil i serede substans og dens fremstilling (US patentskrift nr. 4.138.292 svarende til 30 japansk offentliggørelsesskrift nr. 6483/1978).

Som et resultat af yderligere intensive studier har nærværende opfindere nu fundet ud af, at stabiliteten af immobil i serede substansers enzymatiske aktivitet kan forøges bemærkelsesværdigt ved som gelmatrix for disse at anvende et polysaccharid med mindst 10 vægt/vægt % sulfat-35 rest i molekylet, til hvilket der covalent er bundet eventuelt substituerede aminogrupper.

I overensstemmelse hermed tilvejebringer opfindelsen en immobiliseret, enzymatisk aktiv substans, hvor en enzymatisk aktiv substans er

DK 160997 B

2 indespærret i en gelmatrix af et polysaccharid med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet, hvilken immobil i serede, enzymatisk aktive substans er ejendommelig ved, at der covalent er bundet eventuelt substitu- ..... \ erede aminogrupper til polysaccharidet.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man sam menblander en enzymatisk aktiv substans og en vandig opløsning af et polysaccharid, hvortil der er bundet en eventuelt substitueret aminogrup-pe, og med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet, og derefter lader polysaccharidet danne gel i blandingen, således at den enzymatisk 10 aktive substans indespærres i den resulterende gelmatrix.

Den ifølge opfindelsen anvendte gelbasis er et polysaccharid med mindst 10 vægt/vægt %, sædvanligvis ca. 10 til 65 vægt/vægt % sulfatrest (-SOgH) i molekylet, hvortil der er bundet en aminogruppe eller substitueret aminogruppe. Eksempler på polysaccharider med mindst 10 vægt/vægt 15 % sulfatrest i molekylet indbefatter carragenan, furcellaran og cellulosesulfat. Carragenan er et polysaccharid med 20 til 30 vægt/vægt % sulfatrest, som opnås ved raffinering af en ekstrakt af alger tilhørende Rhodophyceae såsom Gigartinaceae og Solievianceae. I forbindelse med nærværende opfindelse kan der anvendes kommercielt tilgængelig carrage-20 nan, fx. "GENU® GEL WG", "GENU® GEL CWG" og "GENU® VISCO J" (dette er handelsbetegnelser for carragenan fremstillet af Københavns Pektinfabrik A/S). Furcellaran er et polysaccharid med 12 til 16 vægt/vægt % sulfatrest, som opnås ved at ekstrahere en type alger, der tilhører Rhodophy-cease, dvs. Furcellaria fastigiata, og der kan fx. anvendes furcellaran 25 fremstillet af Litex Co., Danmark. Et eksempel på cel!ulosesul fat er "KELC0 SCS" fremstillet af Kelco Co.

Den substituerede aminogruppe, der bindes til polysaccharidet med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet, kan fx. være en monoal kyl-aminogruppe med 1 til 12 carbonatomer i al kyldel en såsom en monomethyl-30 aminogruppe, en monoethylaminogruppe, en monopropylaminogruppe eller en monobutylaminogruppe, og en dial kylaminogruppe med 1 til 12 carbonatomer i alkyldelen såsom en dimethylaminogruppe, en diethylaminogruppe, en di-propylaminogruppe eller en dibutylaminogruppe.

Aminogruppen eller den substituerede aminogruppe kan fx. bindes til 35 polysaccharidet med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet, ved aktivering af polysaccharidet med en epoxyforbindelse (fx. epichlorhy-drin) eller et cyanhalogenid (fx. cyanbromid) og omsætning af det aktiverede polysaccharid med ammoniumhydroxid, en monoal kylamin eller en di-

DK 160997 B

3 al kyl amin. Hvis man anvender en epoxyforbindelse, gennemføres indføringen fortrinsvis ved fx. omsætning af polysaccharidet med en epoxyforbindelse ved pH ca. 7 til 14 ved 5 til 85°C i ca. 10 minutter til 48 timer og efterfølgende omsætning af det resulterende aktiverede polysaccharid 5 med ammoniumhydroxid, en monoalkylamin eller en dialkylamin ved pH ca. 7 til 14 ved 5 til 85°C i ca. 10 minutter til 72 timer. Hvis der anvendes et cyanhalogenid, gennemføres indføringen fortrinsvis ved fx. at indstille pH af en vandig opløsning af polysaccharidet til ca. 8 til 12, tilsætte en passende mængde af et cyanhalogenid, yderligere indstille pH 10 af den resulterende blanding til ca. 8 til 12 og dernæst omsætte blandingen med ammoniumhydroxid, en monoalkylamin eller en dialkylamin ved ca. 5 til 30°C i ca. 1 til 24 timer.

Indholdet af aminogruppen eller den substituerede aminogruppe i det resulterende polysaccharid med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i mole-15 kylet, hvori der er indført en sådan gruppe, er normalt således, at mængden af nitrogen pr. 1 g (tør vægt) af polysaccharidet er 0,1 til 20 mg, fortrinsvis 1 til 10 mg.

Den ifølge opfindelsen anvendte enzymatisk aktive substans kan være enzymer, mikrobielle celler o.l.

20 Enzymerne, der anvendes ifølge opfindelsen, er ikke specificerede og omfatter fx. oxidoreduktaser (fx. aminosyreoxidase, uricase, catalase, etc.), transferaser (fx. aspartatacetyltransferase, glycinamino-transferase, aminosyretransferase, etc.), hydrolaser (fx. asparaginase, acetylcholinesterase, aminoacylase, etc.), lyaser (fx. fumarase, aspar-25 tatdecarboxylase, aspartase, citratlyase, etc.), isomeraser (alaninrace-mase, glucoseisomerase, glutamatracemase, etc.) og lygaser (fx. aspara-ginsyntetase, glutathionsyntetase, glutaminsyntetase, etc.).

De mikrobielle celler, der anvendes ifølge opfindelsen, er heller ikke specifierede, for så vidt de kan anvendes som enzymkilder. Eksemp-30 ler på mikrobielle celler omfatter mikrobielle celler af bakterier, gær, skimmelsvampe, lav og protozoer indeholdende de ovenfor nævnte enzymer.

De mikrobielle celler kan være levende celler, frysetørrede celler eller celler opnået ved nedfrysning og optøning af levende celler, ved behandling af levende celler med acetone eller ved opvarmning af levende cel-35 ler.

Den enzymatisk aktive substans, der anvendes ifølge opfindelsen, kan have et enkelt enzymsystem eller et multipelt enzymsystem. Ydermere kan der anvendes to eller flere enzymatisk aktive substanser på samme

DK 160997 B

4 | tid.

Ved udførelsen af fremgangsmåden til fremstilling af de immobil i serede, enzymatisk aktive substanser ifølge opfindelsen fremstilles fx. t først en vandig opløsning af polysaccharidet, hvortil der er bundet en 5 eventuelt substitueret aminogruppe, og med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet. Fremstillingen af den vandige opløsning kan let gennemføres ved tilsætning af polysaccharidet til varmt vand ved 30 til 90°C. Polysaccharidets koncentration i opløsningen er fortrinsvis 0,1 til 20 vægt/vægt %, især ca. 1 til 10 vægt/vægt %. Den enzymatisk aktive 10 substans sættes så til den resulterende vandige opløsning af polysaccharidet til opnåelse af en blanding. Det foretrækkes at fremstille blandingen ved at opløse eller suspendere den enzymatisk aktive substans i vand, en fysiologisk saltvandsopløsning eller en passende pufferopløsning (pH 1 til 13, fortrinsvis 5 til 9) og blande den resulterende op-15 løsning eller suspension med den vandige opløsning af polysaccharidet.

Mængden af den enzymatisk aktive substans, der skal anvendes, afhænger af den specielle substans, der vælges, det specielle substrat, der skal behandles o.l., men generelt kan det ønskede resultat opnås ved at anvende substansen i en mængde på 0,001 til 50 g pr. 1 g polysaccharid.

20 Dernæst får polysaccharidet i den ovenfor opnåede blanding lov til at danne en gel, således at den enzymatisk aktive substans indespærres i den resulterende gelmatrix af polysaccharidet. Denne geldannelse kan let gennemføres ved at afkøle blandingen af polysaccharidet og den enzymatisk aktive substans. Fx. danner polysaccharidet gel, når blandingen får 25 lov til at henstå ved ca. 0 til 10°C i ca. 30 minutter til 4 timer, og den enzymatisk aktive substans indespærres samtidig i den resulterende gelmatrix af polysaccharidet. Den således opnåede gel kan udformes i en passende form.

løvrigt kan gel danne!sen også gennemføres ved, at man bringer 30 blandingen af polysaccharidet og den enzymatisk aktive substans i kontakt med en metalion med et atomvægt på mindst 24, såsom en kaliumion, magnesiumion, calciumion, aluminiumion o.l., ved at man bringer blandingen i kontakt med en forbindelse med to eller flere basisk funktionelle grupper i molekylet, såsom methylendiamin, ethylendiamin, p-phenylen-35 diamin o.l., eller ved at man bringer blandingen i kontakt med et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol, ethanol, propanol, dioxan, tetrahydrofuran, dimethyl sul foxid o.l.

Den således opnåede immobil i serede, enzymatisk aktiv substans i føl -

DK 160997 B

5 ge opfindelsen kan anvendes ved forskellige enzymatiske reaktioner med substrater på samme måde som konventionelle immobil i serede præparater.

Det immobil i serede præparat ifølge opfindelsen udviser et forøget højt niveau af enzymatisk aktivitet i sammenligning med konventionelle immo-5 bi li serede præparater, da den enzymatisk aktive substans næsten ikke siver ud fra gelmatrixen af polysaccharidet, når den anvendes ved en enzymatisk reaktion. Yderligere kan den immobil i serede, enzymatisk aktive substans ifølge opfindelsen vedblivende anvendes over et langt tidsrum i en enzymatisk reaktion, da den overgår konventionelle immobil i serede 10 præparater med hensyn til formbestandighed, styrke, elasticitet o.l.

Især kan den immobil i serede, enzymatisk aktive substans ifølge opfindelsen, endda i fravær af et gel formbevaringsmiddel såsom kaliumion, opfylde sin normale funktion uden at gelstrukturen går i stykker, da dens gel-sol transformationstemperatur bliver ekstremt høj. Ydermere kan den 15 immobil i serede, enzymatisk aktive substans ifølge opfindelsen anvendes selv under sådanne betingelser, hvor det er nødvendigt at gennemføre en enzymatisk reaktion i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel såsom ethanol eller acetone, som denaturerer den enzymatisk aktive substans, da stabiliteten af det immobil i serede præparat over for det organiske 20 opløsningsmiddel er høj. Desuden har den immobil iserede, enzymatisk aktive substans ifølge opfindelsen en høj stabilitet over for et proteindenaturerende middel såsom urinstof, guanidinhydrochlorid eller lignende. Desuden kan en enzymatisk reaktion gennemføres ved forhøjet temperatur, da den immobil iserede, enzymatisk aktive substans ifølge opfinde!-25 sen selv ved forhøjet temperatur har en enzymatisk aktivitet af høj stabilitet, og derved kan produktiviteten af det ønskede produkt per timeenhed forøges.

Opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler og forsøg.

30

Eksempel 1 (1) Fremstilling af carraqenan, hvortil der er bundet aminoqrupper "GENU® GEL WG" (carragenan fremstillet af København Pektinfabrik 35 A/S) (5,0 g) suspenderedes i 1 N kaliumhydroxid (50 ml). Epichlorhydrin (185 mg) sattes til den resulterende suspension, og blandingen rystedes ved 60°C i 30 minutter. Efter afkøling af reaktionsblandingen til 5°C sattes afkølet (5°C) ethanol (50 ml) til blandingen. Det resulterende

DK 160997 B

6 bundfald frafiltreredes og vaskedes med afkølet (5°C) ethanol (20 ml x 3) til opnåelse af en epoxyaktiveret carragenan. Den epoxyakti verede carragenan suspenderedes i 0,9 M ammoniumhydroxid (40 ml), og suspensio- ^ nen rystedes ved 60°C i 2 timer. Ethanol (50 ml) sattes til reaktions.^ 5 blandingen, og det resulterende bundfald frafiltreredes. Bundfaldet vaskedes med ethanol indeholdende 0,1 N natriumhydroxid (20 ml x 2) og ethanol (flere gange) til opnåelse af carragenan, hvortil der er bundet aminogrupper (4,3 g, tør vægt).

10 (2) Fremstilling af immobil i seret Brevibacterium flavum cellepræparat Brevi bacterium flavum ATCC 14067 podedes i et medium (pH 7,0, 500 ml) indeholdende majsstøbevæske (2,0 %), malonsyre (2,0 %), diammonium-citrat (0,5%), monokaliumphosphat (0,2 %) og magnesiumsulfatheptahydrat (0,05 %) og inkuberedes under rystning ved 30°C i 48 timer. Dernæst op-15 samledes de mikrobielle celler ved centrifugering. Cellerne (8,0 g, våd vægt) suspenderedes i en fysiologisk saltvandsopløsning (8 ml), og suspensionen tilsattes 5% vandig opløsning af den ovenfor i (1) (34 ml) opnåede carragenan, som forinden var opvarmet til 50°C. Blandingen omrør-tes grundigt og henstilledes ved 4°C i 30 minutter. Den således opnåede 20 gel udformedes som terninger med en kantlængde på 3 mm. Terningerne dyppedes i 1 M vandig natriumfumaratopløsning (120 ml) indeholdende 0,6 % galdepulver og henstilledes ved 37°C i 24 timer. Terningerne vaskedes med 2% vandig kaliumchloridopløsning til opnåelse af et immobiliseret Brevibacterium flavum cellepræparat med fumaraseaktivitet (50,0 g, våd 25 vægt).

1 M vandig natriumfumaratopløsning (pH 7,0, 40 ml) sattes til det ovenfor opnåede immobil i serede Brevibacterium flavum cellepræparat (6,35 g) og fik lov til at reagere ved 37°C under rystning. 15 og 30 minutter efter påbegyndelse af reaktionen opsamledes en 1 ml prøve af reaktions-30 blandingen. Saltsyre sattes til prøven for at udfælde uomsat fumarsyre, og L-malonsyre-indholdet i den resulterende supernatant bestemtes kolo-rimetrisk ved at omsætte den med 2,7-naphthalendiol. Når fumaraseaktivi-teten beregnedes på basis af en forøgelse i mængden af L-æblesyre i reaktionsblandingen i løbet af et tidsrum på 15 minutter, var den 1140 μ 35 mol/h/ml gel. Dette svarede til 63% af den enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

DK 160997 B

Eksempel 2 7 1) Fremstilling af carragenan, hvortil der er bundet monoethylamino-grupper 5 Ved at følge samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 (1) op nåedes den ønskede carragenan, hvortil der er bundet monoethylaminogrup-per (4,0 g, tør vægt) ved anvendelse af "GENU® GEL VIG" (5,0 g), epi-chlorhydrin (247,5 mg) og monoethylamin (1,62 g).

10 (2) Fremstilling af immobil i seret Brevi bacterium flavum cellepræparat Den samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 (2) blev gentaget, med undtagelse af, at 5% vandig opløsning af den ovenfor opnåede carragenan, hvortil der er bundet monoethylaminogrupper, (34 ml) anvendes i stedet for 5% vandig opløsning carragenan, hvortil der er bundet 15 aminogrupper, (34 ml) til opnåelse af et immobiliseret Brevibacterium flavum cellepræparat med fumaraseaktivitet (50,2 g, våd vægt). Dets fu-maraseaktivitet var 909 μ mol/h/ml gel, og dette svarede til 50% af den enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

20 Eksempel 3 (1) Fremstilling af carragenan, hvortil der er bundet diethyl-aminogrupper

Ved at følge samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 (1) op-25 nåedes den ønskede carragenan, hvortil der er bundet diethylaminogrupper, (4,4 g, tør vægt) ved at anvende "GENU® GEL WG" (5,0 g), epichlor-hydrin (247,5 mg) og diethylamin (2,63 g).

(2) Fremstilling af immobil i seret Brevibacterium flavum cellepræparat 30 Samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 (2) blev gentaget med undtagelse af, at 5% vandig opløsning af den ovenfor opnåede carragenan, hvortil der er bundet diethylaminogrupper, (34 ml) anvendtes i stedet for 5% vandig opløsning af carragenan, hvortil der er bundet aminogrupper, (34 ml) til opnåelse af et immobiliseret Brevibacterium fla-35 vum cellepræparat med fumaraseaktivitet (50,3 g, våd vægt). Fumaraseak-tiviteten var 956 μ mol/h/ml gel, og dette svarede til 53% af den enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

Eksempel 4

DK 160997 B

8 (1) Fremstilling af immobil i seret Brevibacterium ammoniågenes - cel1epræparat 5 Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 podedes i et medium (pH 7,0, 500 ml) indeholdende glukose (2,0 %), fumarsyre (0,5 %), urinstof (0,2 %), monokaliumphosphat (0,2 %), magnesiumsulfatheptahydrat (0,05 %) og majsstøbevæske (1,0 %) og inkuberedes under rystning ved 30°C i 48 timer. Dernæst opsamledes de mikrobielle celler ved centrifugering. Cel-10 lerne (8,0 g, våd vægt) suspenderedes i en fysiologisk saltvandsopløsning (8 ml), og til suspensionen sattes 5% vandig opløsning (34 ml) af den i eksempel 2 (1) opnåede carragenan, hvortil der er bundet mono-ethylaminogrupper, hvilken forinden var opvarmet til 50°C. Blandingen omrørtes grundigt og hensti11edes ved 4°C i 30 minutter. Den således op-15 nåede gel udformedes som terninger med en kantlængde på 3 mm. Terningerne vaskedes med 2% vandig kaliumchloridopløsning til opnåelse af et immobil i seret Brevibacterium ammoniagenes cellepræparat med fumaraseakti-vitet (50,0 g, våd vægt). L-æblesyreproduktiviteten af det immobilise-rede præparat var 525 β mol/h/ml gel, og dette svarede til 60% af den 20 enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

Forsøg 1

De efterfølgende tests A til E gennemførtes under anvendelse af det i eksempel 1 (2) opnåede immobil i serede Brevibacterium flavum cellepræ-25 parat (herefter kaldet præparat A), det i eksempel 2 (2) opnåede immobi-1 i serede Brevibacterium flavum cellepræparat (herefter kaldet præparat B), det i eksempel 3 (2) opnåede immobil i serede Brevibacterium flavum cellepræparat (herefter kaldet præparat C) og, som kontrol, et immobili-seret Brevibacterium flavum cellepræparat opnået ved anvendelse af en 30 carragenan uden indføring af en aminogruppe eller substitueret amino-gruppe (herefter kaldet præparat D).

Det som kontrol anvendte præparat D fremstilledes som følger:

De mikrobielle celler, der var opnået på samme måde som beskrevet i eksempel 1 (2) (8,0 g, våd vægt) suspenderedes i en fysiologisk salt-35 vandsopløsning (8 ml), og til suspensionen sattes 5% vandig opløsning af "GENU® GEL WG" (34 ml), der forinden var opvarmet til 50°C. Blandingen omrørtes grundigt og henstilledes ved 4°C i 30 minutter. Den således opnåede gel udformedes som terninger med en kantlængde på 3 mm. Terninger- 9

DK 160997 B

ne dyppedes i 1 M vandig natriumfumaratopløsning (120 ml) indeholdende 0. 6 % galdepulver og henstilledes ved 37°C i 24 timer. Terningerne vaskedes med 2% vandig kaliumchloridopløsning til opnåelse af præparat D (50,0 g, våd vægt). Når fumaraseaktiviteten af præparat D bestemtes på 5 samme måde som beskrevet i eksempel 1 (2), var den 900 μ mol/h/ml gel, og dette svarede til 49% af den enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

Test A

10 Stabilitet ved kontinuert enzymatisk reaktion

Præparater A til D underkastedes en kontinuert enzymatisk reaktion ved at pakke hver enkelt præparat (6,3 g) i en søjle (1,6 cm x 12 cm) med kappe og kontinuert lede 1 M vandig natriumfumaratopløsning (pH 7,0) gennem søjlen ved 37°C med en strømningshastighed på 6 ml/h i nogle 15 døgn. Eluatet opsamledes lejlighedsvis, og præparatets fumaraseaktivitet bestemtes i.h.t. den ovenfor nævnte fremgangsmåde. Ydermere beregnedes det antal dage, der var nødvendigt for at reducere præparatets enzymatiske aktivitet til 50% af dets begyndelsesaktivitet (halveringstid) 1. h.t. følgende formel: 20 K = løg t, = d t n * Kd 25 hvori er forringelseshastighedskonstanten (dag"*), t er reak tionstiden (dage), nQ er den indledende enzymatiske aktivitet, n er den enzymatiske aktivitet efter t dage, og t^ er halveringstiden (dage). Resultaterne er vist i tabel I.

30 35

Tabel I

DK 160997 B

10

Præparater · Den foreliggende opfindelse Kontrol i;

ABC D

5 _

Gruppe bundet til amino monoethyl- diethyl- ingen carragenan amino amino 1 1140 909 956 900 10 9 1095 899 928 873 15 1095 895 908 844

Fumarase- Kon- 21 1050 887 898 .820 aktivitet tinuert 30 1015 850 870 791 (it mol/ drifts- 42 969 828 833 745 15 h/ml gel) periode 50 946 801 800 723 (dage) 64 901 780 771 674 80 855 760 735 620 100 798 712 692 584 20 Halveringstid af fumaraseaktivitet (dage) 194 241 216 160

Test B

25 Varmestabilitet

Præparater A til D (2,0 g af hvert) dyppedes hver især i 0,1 M kali umphosphatpuf feropløsning (pH 7,0, 2 ml) og opvarmedes til 60°C i 15 timer. Efter opvarmning bestemtes fumaraseaktivi teten af hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes i.h.t. følgende 30 formel:

Grad af Fumaraseaktivitet resterende ^ = efter opvarmning χ jqq fumarase- fumaraseaktivitet 35 aktivitet før opvarmning

Resultaterne er vist i tabel II.

DK 160997 B

11

Tabel II

Præparater Gruppe bundet Grad af resterende til carragenan fumaraseaktivitet (%) 5 _ A amino 30

Den foreliggende B monoethyl amino 47 opfindelse C di ethyl amino 26 10 Kontrol D ingen 12

Test C

Stabilitet i opløsning med pH 4,5 15 Præparaterne A til D (2,0 g af hvert) dyppedes hver især i 0,5 M acetatpufferopløsning (pH 4,5, 5 ml) og henstilledes ved 37°C i 1 time.

Efter behandling med pufferopløsningen bestemtes fumaraseaktiviteten af hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes i.h.t. følgende formel: 20

Fumaraseaktivitet Grad af resterende efter behandling fumarase ^ = med pufferopløsninq x ioo aktivitet fumaraseaktivitet 25 før behandling med pufferopløsning

Resultaterne er vist i tabel III.

30 35

Tabel III

DK 160997 B

12

Præparater · Gruppe bundet Grad af resterende til carragenan fumaraseaktivitet (%) 5 _ A amino 100

Den foreliggende B monoethyl amino 93 opfindelse C diethyl amino 83 10 Kontrol D ingen 3

Test D

Stabilitet i ethanolholdig opløsning 15 Præparaterne A til D (2,0 g af hvert) dyppedes hver især i 2% vandig kaliumchloridopløsning (2,0 ml) indeholdende ethanol (0,46 g) og henstilledes ved 37°C i 30 minutter. Efter behandling med den ethanol-holdige opløsning bestemtes fumaraseaktiviteten af hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes i.h.t. følgende for-20 mel:

Fumaraseaktivitet

Grad af resterende efter behandling med fumarase ^ _ ethanolholdig ορ-løsning χ jqq 25 aktivitet fumaraseaktivitet før behandling med ethanolholdig opløsning

Resultaterne er vist i tabel IV.

30 35

DK 160997 B

13

Tabel IV

Præparater Gruppe bundet Grad af resterende til carragenan fumaraseaktivitet (%) 5__ A ami no 88

Den foreliggende B monoethyl amino 83 opfindelse C di ethyl amino 85 10 Kontrol D ingen 73

Test E

Stabilitet i urinstofholdig opløsning 15 Præparaterne A til D (2,0 g af hvert) dyppedes hver især i 2% van dig kaliumchloridopløsning (2,0 ml) indeholdende urinstof (0,36 g) og henstilledes ved 37°C i 30 minutter. Efter behandling med den urinstof-holdige opløsning bestemtes fumaraseaktiviteten af hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes 20 i.h.t. følgende formel:

Fumaraseaktivitet

Grad af resterende efter behandling med fumarase ^ _ urinstofholdig opløsning χ 1Qg 25 aktivitet fumaraseaktivitet før behandling med urinstofholdig opløsning

Resultaterne er vist i tabel V.

30 35

Tabel V

DK 160997 B

14

Præparater Gruppe bundet Grad af resterende * til carragenan fumaraseaktivitet (%) 5 _ A amino 70

Den foreliggende B monoethyl amino 93 opfindelse C diethyl amino 65 10 Kontrol D ingen 56

Forsøg 2

De følgende tests F til I gennemførtes under anvendelse af det i 15 eksempel 4 (1) opnåede, immobil i serede Brevibacterium ammoniagenes cellepræparat (herefter kaldet præparat E) og som kontrol et immobiliseret Brevibacterium ammoniagenes cellepræparat opnået under anvendelse af carragenan uden indføring af en aminogruppe eller substitueret amino-gruppe (herefter kaldet præparat F).

20 Det som kontrol anvendte præparat F fremstilledes som følger:

De mikrobielle celler, der blev opnået på samme måde som beskrevet i eksempel 4 (1), (8,0 g våd vægt) suspenderedes i en fysiologisk saltvandsopløsning (8 ml) og oparbejdedes på samme måde som præparat D i forsøg 1 til opnåelse af præparat F (49,7 g, våd vægt). L-æblesyre-pro-25 duktiviteten af præparat F var 509 μ mol/h/ml gel, og dette svarede til 58% af den enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

Test F

Stabilitet ved kontinuert enzymatisk reaktion 30 På samme måde som beskrevet i forsøg 1, Test A, underkastedes hvert af præparaterne E og F (6,3 g af hvert) en kontinuert enzymatisk reaktion. Fumaraseaktivitet og halveringstid af hvert præparat bestemtes som i forsøg 1, Test A.

Resultaterne er vist i tabel VI.

35

DK 160997 B

15

Tabel VI

Præparater Opfindelsen Kontrol

5 E F

Gruppe bundet Monoethyl amino Ingen til carragenan 10 1 525 509 9 499 477 15 478 441

Fumarase- Kontinuert 21 458 418 aktivitet drifts- 30 437 383 15 (/i mol/h/ periode 42 410 344 ml gel) (dage) 50 401 308 64 366 266 80 341 231 100 303 198 20 _

Halveringstid for fumaraseaktivitet (dage) 127 75

25 Test G

Stabilitet i opløsning med pH 4,5

Præparaterne E og F (2,0 g af hvert) dyppedes hver især i 0,5 M acetatpufferopløsning (pH 4,5, 5 ml) og henstilledes ved 37°C i 1 time.

Efter behandling med pufferopløsningen bestemtes fumaraseaktivi teten af 30 hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes i.h.t. samme formel som i forsøg 1, Test C. Resultaterne er vist i tabel VII.

35

Tabel VII

DK 160997 B

16

Præparater Gruppe bundet Grad af resterende ^ » til carragenan fumaraseaktivitet (%) 5 _

Den foreliggende E monoethylamino 47 opfindelse

Kontrol F ingen 12 10 _

Test H

Stabilitet i ethanolholdig opløsning

Præparaterne E og F (2,0 g af hvert) dyppedes hver især i 2% vandig 15 kaliumchloridopløsning (2,0 ml) indeholdende ethanol (0,46 g) og henstilledes ved 37°C i 30 minutter. Efter behandling med den ethanol holdige opløsning bestemtes fumaraseaktiviteten af hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes i.h.t. samme formel som i forsøg 1, Test D. Resultaterne er vist i tabel VIII.

20

Tabel VIII

Præparater Gruppe bundet Grad af resterende til carragenan fumaraseaktivitet (%) 25 _

Den foreliggende E monoethylamino 28 opfindelse

Kontrol F ingen 3 30

Test I

Stabilitet i urinstofholdig opløsning

Præparaterne E og F (2,0 g af hvert) dyppedes i 2% vandig kalium-35 chloridopløsning (2,0 ml) indeholdende urinstof (0,36 g) og hensti 11 edes ved 37°C i 30 minutter. Efter behandling med den urinstofhol -dige opløsning bestemtes fumaraseaktiviteten af hvert præparat, og graden af resterende fumaraseaktivitet beregnedes i.h.t. samme formel som i

DK 160997 B

17 forsøg 1, Test E. Resultaterne er vist i tabel IX.

Tabel IX

5 Præparater Gruppe bundet Grad af resterende til carragenan fumaraseaktivitet (%)

Den foreliggende E monoethylamino 81 opfindelse 10 _

Kontrol F ingen 13

Forsøg 3 15 De følgende tests A til C udførtes under anvendelse af det i eksempel 1 (2) opnåede immobil i serede Brevibacterium flavum cellepræparat (gelbasis: carragenan, hvortil der er bundet aminogrupper, i det følgende kaldet præparat A), det i eksempel 2 (2) opnåede immobil iserede Bre-vibacterium flavum cellepræparat (gelbasis: carragenan, hvortil der er 20 bundet monoethylaminogrupper, i det følgende kaldet præparat B), det i eksempel 3 (2) opnåede immobil i serede Brevibacterium flavum cellepræparat (gel basis: carragenan, hvortil der er bundet di ethylaminogrupper, i det følgende kaldet præparat C), og som kontrol de ved fremgangsmåden beskrevet i US patentskrift nr. 4.138.292 opnåede immobil i serede Brevi- 25 bacterium flavum cellepræparater (gelbasis: carragenan uden indføring af aminogruppe eller substitueret aminogruppe, i det følgende kaldet præparat G, Η, I og J).

De som kontrol anvendte præparater G til J fremstilledes som følger: 30 De mikrobielle celler, der var opnået på samme måde som beskrevet i eksempel 1 (2) (8,0 g, våd vægt), suspenderedes i en fysiologisk saltvandsopløsning (8 ml), og til suspensionen sattes 5% vandig opløsning af "GENU® GEL WG" (34 ml), der forinden var opvarmet til 50°C. Blandingen omrørtes godt og sattes dråbevis til en vandig 0,3 M ammoniumchloridop- 35 løsning (præparat G), ethylendiaminopløsning (præparat H), N-ethyl-ethy-lendiaminopløsning (præparat I) eller N,N-diethyl-ethylendiaminopløsning (præparat J). De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamledes ved filtrering. Perlerne dyppedes i 1 M vandig natriumfumaratop-

DK 160997 B

18 løsning (120 ml) indeholdende 0,6% gallepulver og henstilledes ved 37°C i 24 timer. Perlerne vaskedes med 2% vandig kaliumchloridopløsning til opnåelse af de respektive præparater G til J (50 g, våd vægt). Når fuma-raseaktiviteten af præparat G til J bestemtes på samme måde som beskre-5 vet i eksempel 1 (2), var den hhv. 803 (G), 760 (H), 765 (I) og 755 (J) piol/h/ml gel, og dette svarede til hhv. 47% (G), 41% (H), 42% (I) og 42% (J) af den enzymatiske aktivitet af de anvendte mikrobielle celler.

Test A

10 Stabilitet ved kontinuert enzymatisk reaktion

Præparaterne A til C og G til J underkastedes en kontinuert enzymatisk reaktion som beskrevet under Forsøg 1, Test A.

Resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel (X).

15 Test B

Varmestabilitet

Præparat A til C og G til J underkastedes en test for varmestabilitet som beskrevet under Forsøg 1, Test B.

Resultaterne fremgår af tabel (XI).

20

Test C

Stabilitet i opløsning med pH 4,5

Præparaterne A til C og G til J underkastede en test for stabilitet i opløsning med pH 4,5 som beskrevet under Forsøg 1, Test C.

25 Resultaterne fremgår af tabel (XII).

DK 160997 B

19 - Γ ' >>

x) I

ir\r\j—«v^coOco^sO^ ^ i —( i (-irvrNjOC^^rvJco-^O1^ -i *-d I Q r-> r~- r-- νονονο^Λ^^^ —· • S c , "z. s: ·\7 - u —» , £ .2 o *o o -------

•Η I

P c

Ai u ns -< Φ £ S-4 j3 ν^ΟίΜαοΟΟί'-'Ο'**·-*—»rvl

1) VOr-iCTvu^mONiAO^'H —J

y Μ j i |--,ίν.\0\0\0υΛυΛ\Αί1·4ί ·—i tfl —s 1 -* •Η rH iH JT* 5 *P Φ O ^ g nj Φ M iu r« 5 .p >1 H C 2-0 _;_____

N E O

β \ £4 I

Φ X! c

r—j O C

P '“j w I "xE ocoovocrjoco^-s· O

Η O JC ri VOOCMO-^O'f^—I » CM <M

Φ E jj .„I —· 3 A UJ T> C -" ---—------—- M -P -P O' β QJ O I + j. r^^-OCTiCMO'nf^tO'^ m

, I Q +J I d-X 003-tf—Ictju-ilMcomo} '’I

Qjjj^ ^^r.cor^rj.r'vovo'omiriif -c λ > __.___Ξ_r: — --- ni Ό Ή i E-ι Q) -P Ό *

> Al -G rA

ilt *r-l >1 * ,. mill -CO vorococoomo-tincM u>

P “ ^ U xJC I miMomi-m-Of^ncn H

vU tOi-q <υ -Η σν cv cn co co co co r>. r- vo rN

-p nj o e Η M Om . ____ .η m Q)--;-- H g T3 ’ Λ 3 fi t (ti fe Φ x\ P tJ1 v I οϊσϊΐηι-»οοο.-!οο·-ΓΊ ,-ι 03 m 4)0 ocno\couiMO(»vD^-i tj· >rj OC cn cp co co co co co oj . C ·Λ ^ . o ε S__li___:---- o IW o C I ou-iinoincn\o,-|inco -e·.

_i < -H -a·· cn cn in —1 \u ->r o m cn tn " P noooocncncnrot'- ,-ι Φ 3 · rH r-| ,η _.JSJ----------- ------- —.:_ i-' ........ —Txr=r • I I Hcnirir-lor'i -OTrooic'm Ό I W >-l (N n n· in to - cd o -Η I &> s-i q u ft ....._j=l +> o ra Φ 3 (0 “} -- , ......... tfi CQ —'

•P -p Φ ^ . tr> nj -P

(0 ,_J c S i c Μ Φ H ajd^SH 3iJi ·,η3·ρ

8 &JjcSS d 03^^-. Py-H

cl S^a-SH -H -P o φ φ3> B- 3§ i’ Il I s a φ i s s 1_smp_I ^¾¾ i

DK 160997 B

20

Tabel XI Varmestabilitet

Præparater Gruppe bundet Geldannelses- Grad af reste- % „ til carragenan midler rende fumarase- ^ 5 aktivitet (%)

Den A amino --- 30 foreliggende B monoethyl- opfindelse amino --- 47 10 C diethyl amino -- 26 G — NH4+(NH4C1) 13 H --- ethylendiamin 10

Kontrol I --- N-ethylethylen- 15 diamin 12 J — N,N-diethyl- ethylendiamin 10

20 Tabel XII

Stabilitet i opløsning med pH 4,5

Præparater Gruppe bundet Gel danne!ses- Grad af reste- til carragenan midler rende fumarase- aktivitet (%) 25 _

Den A amino --- 100 foreliggende B monoethyl- opfindelse amino --- 93 30 C di ethyl amino — 83 G — NH4+(NH4C1) 8 H --- ethylendiamin 4

Kontrol I --- N-ethylethylen- 35 diamin 3 J --- N,N-diethyl- ethylendiamin 4

DK 160997 B

21

Som det fremgår af resultaterne af ovenstående forsøg er præparaterne A til C ifølge opfindelsen 1,34 til 2,15 gange bedre end præparaterne G til J opnået ved fremgangsmåden beskrevet i US patentskrift nr.

4.138.292 hvad stabiliteten ved kontinuert enzymatisk reaktion angår, 5 2,3 til 4,7 gange bedre hvad varmestabiliteten angår, og 10,3 til 33,3 gange bedre hvad stabiliteten i opløsning med pH 4,5 angår. Endvidere har præparaterne A til C højere begyndelsesaktivitet (909 til 1140 /tmol/h/ml gel) end præparaterne G til J (755 til 803 /tmol/h/ml gel).

Claims

1. Immobil iseret, enzymatisk aktiv substans, hvor en enzymatisk ak- ^ tiv substans er indespærret i en gelmatrix af et polysaccharid med 5 mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet, KENDETEGNET ved, at der covalent er bundet eventuelt substituerede aminogrupper til polysaccha-ridet.

2. Immobil i seret, enzymatisk aktiv substans ifølge krav 1, KENDE-10 TEGNET ved, at indholdet af eventuelt substituerede aminogrupper i poly- saccharidet er således, at mængden af nitrogen per 1 g (tør vægt) poly-saccharid er 0,1 til 20 mg.

3. Immobil i seret, enzymatisk aktiv substans ifølge krav 1, KENDE-15 TEGNET ved, at den til polysaccharidet bundne, eventuelt substituerede aminogruppe er amino, monoal kyl amino eller di al kyl ami no, hvor hver al-kyldel indeholder 1 til 12 carbonatomer.

4. Immobil i seret, enzymatisk aktiv substans ifølge krav 1, KENDE-20 TEGNET ved, at polysaccharidet er carragenan, hvortil der er bundet en amino-, monoal kyl amino- eller di al kylaminogruppe, hvor hver alkyldel har 1 til 12 carbonatomer.

5. Immobil i seret, enzymatisk aktiv substans ifølge krav 1, 2, 3 el-25 ler 4, KENDETEGNET ved, at den enzymatisk aktive substans er mikrobielle celler.

6. Immobil iseret, enzymatisk aktiv substans ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at polysaccharidet er carragenan, hvortil der er bundet en 30 aminogruppe, en monoethylaminogruppe eller en diethylaminogruppe.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en immobil i seret, enzymatisk aktiv substans ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man sammenblander en enzymatisk aktiv substans og en vandig opløsning af et polysaccharid, 35 hvortil der er bundet en eventuelt substitueret aminogruppe, og med mindst 10 vægt/vægt % sulfatrest i molekylet og derefter lader polysaccharidet danne gel i blandingen, således at den enzymatisk aktive substans indespærres i den resulterende gelmatrix. DK 160997 B 23

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at den vandige opløsning af polysaccharidet fremstilles ved, at man sætter polysacchari-det til varmt vand ved 30 til 90°C til opnåelse af en opløsning inde- 5 holdende 0,1 til 20 vægt/vægt % af polysaccharidet.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at man opløser eller suspenderer den enzymatisk aktive substans i vand, en fysiologisk saltvandsopløsning eller pufferopløsning og så blander den med den van- 10 dige opløsning af polysaccharidet.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at geldannelsen gennemføres ved, at man lader blandingen af den enzymatisk aktive substans og polysaccharidet henstå ved ca. 0 til 10°C i ca. 30 minutter til 15. timer.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at den til polysaccharidet bundne, eventuelt substituerede aminogruppe er amino, monoal kyl ami no eller di al kyl amino, hvor hver al kyldel indeholder 1 til 12 20 carbonatomer.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at polysaccharidet er carragenan, hvortil der er bundet en amino-, monoal kyl amino- eller dial kylaminogruppe, hvor hver al kyl del indeholder 1 til 12 carbon- 25 atomer.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 7, 8, 9, 10, 11 eller 12, KENDETEGNET ved, at den enzymatisk aktive substans er mikrobielle celler. 30 35