DK163105B - Fremgangsmaade til fremstilling af stabile plurilamellare vesikler - Google Patents

Description

i

DK 163105 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer og deres anvendelse som bærere i afgivelsessystemer. Mere specifikt angår den en ny type lipidvesikler med enestående egenskaber, som giver sær-5 lige fordele, såsom forøget stabilitet og høj indeslutningseffektivitet eller indfangningseffektivitet.

De midler og fremgangsmåder, der er beskrevet i den foreliggende beskrivelse, har et bredt anvendelsesspektrum 10 inden for områder såsom bærersystemer og målrettede afgivelsessystemer. Opfindelsen belyses her ved hjælp af eksempler til behandling af lymfocytiske menigitisvirus-infektioner.

15 Liposomer er fuldstændigt lukkede tolagsmembraner, der indeholder en indesluttet vandig fase. Liposomer kan være en hvilken som helst varietet af enlamellare vesikler (med et enkelt membrandobbeltlag) eller multilamellare vesikler (løglignende strukturer, der er karakteriseret 20 ved koncentriske membrandobbeltlag adskilt fra hinanden af et lag af vand).

De oprindelige liposompræparationer beskrevet af Bangham m.fl. i J. Mol. Biol. 13, 238-252 (1965) omfattede sus-25 pendering af phospholipider i et organisk opløsningsmiddel, som derpå inddampedes til tørhed, hvilket efterlod en voksagtig aflejring af phospholipid på reaktionsbeholderen. Derpå tilsattes en passende mængde vandig fase, blandingen fik lov at "kvælde", og de herved fremkomne 30 liposomer, der bestod af multilamellare vesikler (herefter betegnet MLV'er) blev dispergeret mekanisk. Strukturen af det herved fremkomne membrandobbeltlag er således, at de hydrofobe (ikke-polære) "haler" på lipidet orienteres mod midten af dobbeltlaget, medens de hydro-35 file (polære)"hoveder" orienteres mod den vandige fase.

Denne teknik udgjorde grundlaget for udviklingen af små lydbølgebehandlede enlamellare vesikler (herefter kaldet

DK 163105B

2 SUV'er), der beskrives af Paphadjapoulos og Miller i Biochim. Biophys. Acta. 135, 624-638 (1967). Disse "klassiske liposomer" havde imidlertid en række ulemper, hvoraf en af de større er det ringe volumen af det 5 omsluttede vandige rum pr. mol lipid og en begrænset evne til at indkapsle store makromolekyler.

Bestræbelser på at forøge det indesluttede volumen gik ud på først at danne inverterede miceller eller liposom-10 forstadier, dvs. vesikler indeholdende en vandig fase omgivet af et enkeltlag af lipidmolekyler orienteret således, at de polære hovedgrupper peger mod den vandige fase. Liposomforstadier dannes ved at sætte den vandige opløsning, der skal indesluttes, til en opløsning af 15 polært lipid i et organisk opløsningsmiddel og behandle med lydbølger. Liposomforstadierne inddampes derpå i nærvær af overskud af lipid. De fremkomne liposomer, der består af en vandig fase indesluttet af et lipid-dobbelt-lag, dispergeres i vandig fase (jfr. USA patentskrift nr.

20 4 224 179).

Et andet forsøg på at gøre effektiviteten af indeslutningen maksimal beskrives af Paphadjapoulos (USA patentskrift nr. 4 235 871) som en "omvendt-fase-inddampnings-25 metode" til fremstilling af oligolamellare lipidvesikler, der også er kendt som omvendt-fase-inddampnings-vesikler (herefter kaldet REV'er). Ifølge denne metode sættes det vandige materiale, der skal indesluttes, til en blanding af polært lipid i et organisk opløsningsmiddel. Derpå 30 dannes en homogen emulsion af typen vand-i-olie, og det organiske opløsningsmiddel afdampes, indtil der dannes en gel. Gelen omdannes derpå til en suspension ved at dispergere den gel-lignende blanding i et vandigt medium.

De fremstillede REV'er består for størstedelens vedkom-35 mende af enlamellare vesikler og nogle oligolamellare vesikler, der er kendetegnet ved kun at have få koncentriske dobbeltlag med store indvendige vandige rum. Visse

DK 163105 B

3 permeabilitetsegenskaber hos REV'er rapporteredes at ligne dem for MLV'er og SUV'er (jfr. Szoka og Paphadja-poulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198 (1978)), der er rapporteret i C.A. vol 90 (1979) nr, 18722e.

5

Der kan fremstilles liposomer, der indeslutter flere forskellige forbindelser, men liposomernes stabilitet under opbevaring er altid begrænset. Dette tab af stabilitet resulterer i, at den indesluttede forbindelse lækker ud 10 fra liposomerne i det omgivende medium, og kan også resultere i en forurening af liposomindholdet ved indtrængning af materialer fra det omgivende medium ind i selve liposomerne. Følgeligt er lagerlevetiden for traditionelle liposomer meget begrænset. Forsøg på at forbedre 15 stabiliteten indebar inkorporering i liposommembranen af visse stoffer (herefter kaldet "stabilisatorer"), der påvirker lipiddobbeltlagenes fysiske egenskaber (f.eks. steroidgrupper). Imidlertid er mange af disse stoffer forholdsvis kostbare, og produktionen af sådanne liposo-20 mer er ikke lønsom.

Foruden opbevaringsproblemerne med traditionelle liposomer er der en række forbindelser, der ikke kan inkorporeres i disse vesikler. MLV'er kan kun fremstilles under 25 betingelser over fase-overgangstemperaturen for lipidmem- branen. Dette udelukker inkorporering af varmelabile molekyler i liposomer, der er sammensat af phospholider, der udviser ønskelige egenskaber, men har lange og stærkt mættede sidekæder.

30

Anvendelse af liposomer til terapeutisk brug er beskrevet i Liposomes: From Physical Structures to Therapeutic

Applications, Knight, udg. Elsevier, North-Holland Biomedical Press, 1981. Meget er blevet skrevet vedrørende 35 muligheder ved anvendelse af disse membranvesikler til præparatafgivelsessystemer, men der er stadig en række problemer forbundet med sådanne systemer. Jfr. f.eks. USA

DK 163105B

4 · patentskrifterne nr. 3 993 754 og 4 145 410. I et lipo-sompræparatafgivelsessystem er medikamentet indesluttet under liposomdannelse og indgives derpå til patienten, der skal behandles. Medikamentet kan være opløseligt i 5 vand eller i et ikke-polært opløsningsmiddel. Typisk kendt teknik findes beskrevet i USA patentskrifterne nr.

4 235 871 og 4 224 179.

Nogle af de ønskelige træk ved præparatafgivelsessystemer 10 er modstanden mod en hurtig udtømning af præparatet ledsaget af forsinket frigørelse af medikamentet, hvilket forlænger præparatets virkning. Dette forøger præparatets effektivitet og medvirker til, at der kræves færre indgivelser. Nogle af de problemer, der opstår ved anven-15 delse af liposompræparater in vivo, er følgende: (1) Materialer indesluttet i liposom lækker ud, når liposomerne inkuberes i kropsvæsker. Dette er blevet forklaret ved fjernelsen af liposomale phospholipider ved 20 hjælp af plasmalipoproteiner med høj densitet (HDL) eller ved nedbrydning af den liposomale membran ved hjælp af phospholipaser, blandt andre årsager. Et resultat af nedbrydningen af liposomerne in vivo er, at næsten hele det liposomale indhold frigives inden for et kort 25 tidsrum, og derfor opnås ingen protraheret frigivelse og modstandsevne mod udtømning af præparatet.

(2) På den anden side, hvis der anvendes et meget stabilt liposom in vivo (dvs. liposomer, der ikke lækker, når de 30 inkuberes i kropsvæsker), vil det liposomale indhold ikke blive frigjort efter behov. Følgelig er disse stabile liposomer ineffektive som bærer af terapeutiske stoffer in vivo, fordi den protraherede frigørelse eller evnen til at frigøre det liposomale indhold, når det er nødven-35 digt, ikke finder sted. Hvis man imidlertid behandler en intracellulær infektion, er opretholdelsen af stabilitet i biologiske væsker indtil det punkt, hvor liposomet gen- 5

DK 163105 B

nemtrænges af den inficerede celle, kritisk.

(3) Forholdet mellem omkostninger og effektivitet hos liposombærere, der anvendes i afgivelsessystemer. F.eks.

5 er der rapporteret en bedre metode til kemoterapi af Leishman-infektioner med et anti-Leishman-præparat indkapslet i liposomer i USA patentskrift nr. 4 186 183. De liposomer, der anvendes i kemoterapien, indeholder en række stabilisatorer, som forøger liposomernes stabilitet 10 in vivo. Som tidligere omtalt er disse stabilisatorer imidlertid dyre og produktionen af liposomer indeholdende disse stabilisatorer er ikke omkostningseffektiv.

(4) Endelig møder man det problem ved anvendelse af 15 liposomer som bærere i præparatafgivelsessystemer, at de ikke er i stand til at bevirke en helbredelse af den sygdom, der behandles. Udover den manglende evne til at modstå hurtig udtømning og bevirke protraheret frigørelse findes der en række andre mulige forklaringer på den 20 manglende evne til at helbrede sygdomme. Hvis liposomerne f.eks. internaliseres (dvs. indgår i) targetceller eller phagocytceller (f.eks. reticuloendoteliale celler), fjernes de hurtigt fra systemet, hvilket gør det indesluttede præparat stærkt ineffektivt over for sygdomme i involve-25 rede celler ud over det reticuloendoteliale RES. Efter phagocytose emballeres det liposomale indhold (pakket med lysosomer fra del-phagocytiske celler). Meget ofte vil de nedbrydende enzymer, der indeholdes i lysosomet, nedbryde den indesluttede forbindelse eller gøre denne inaktiv ved 30 at ændre dens struktur eller spalte forbindelsen på dens aktive sted. Desuden kan liposomerne ikke afgive en dosis, der er effektiv, på grund af den lave effektivitet ved indeslutning af den aktive forbindelse i vesiklerne under fremstillingen.

Liposomer har også af forskerne været anvendt som model-membransystemer og er blevet anvendt som "target cellen" 35

DK 163105B

6 i komplement-formidlede immunprøver. Når de anvendes i sådanne prøver, er det imidlertid vigtigt, at liposommem-branen ikke lækker, når den inkuberes i sera, fordi disse prøver måler frigørelsen af liposomindholdet som en 5 funktion af serumkomplementaktivering ved hjælp af immunokompleksdannelse, der omfatter visse immunglobulin-klasser (f.eks. IgM- og visse igG-molekyler).

Opfindelsen angår en ny og væsentlig forbedret type af 10 lipidvesikler, som herefter vil blive omtalt som stabile mangelamellare vesikler (SPLV'er). Foruden at være strukturelt forskellige fra multilamellare vesikler (MLV'er) fremstilles SPLV'er på en anden måde end MLV'er, har enestående egenskaber i sammenligning med MLV'er og 15 frembyder en række forskellige fordele ved sammenligning med sådanne MLV'er. Som følge af disse forskelle løser SPLV'er mange af de problemer, der er ved de gængse lipidvesikler, der hidtil har været til rådighed.

20 Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af stabile plurilamellare vesikler, af den i krav l's indledning nævnte art, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

25

En heterogen blanding af lipidvesikler er resultatet, når SPLV'er er syntetiseres. Det er påvist, at lipiderne i SPLV'erne er organiseret i en hidtil ukendt supra-molekylær struktur. Mange af lipidvesiklerne har et stort 30 antal dobbeltlag, undertiden helt op til 100 lag. Muligvis er det denne høje grad af lagdeling, der bidrager til mange af de overraskende egenskaber, som SPLV'erne har; men forklaringerne er teoretiske. 1 SPLVernes egenskaber omfatter: (1) evnen til at helbrede visse sygdomme, som andre metoder ikke kan helbrede; (2) SPLV'ernes stærkt forøgende stabilitet under opbevaring i

DK 163105B

7 puffer; (3) SPLV'ernes forøgede evne til at modstå ublide fysiologiske miljøer; (4) indeslutning af materialer med stor effektivitet; (5) evnen til at holde sig til væv og celler i længere tidsrum; (6) evnen til at frigive inde-5 sluttede materialer langsomt i kropsvæsker; (7) afgivelse og endelig spredning af det liposomale indhold i hele targetcellens cytosol; (8) bedre forhold mellem omkostning og effektivitet ved fremstilling og (9) frigørelse af forbindelser i deres bioaktive former in vivo.

10 På grund af SPLV'ers enestående egenskaber er de særlig anvendelige som bærere i afgivelsessystemer in vivo, fordi de er modstandsdygtige over for udtømning og er i stand til at give protraheret virkning. Der beskrives i 15 det følgende fremgangsmåder til anvendelse af SPLV'er til afgivelse af bioaktive forbindelser in vivo og behandling af patologier som infektioner.

Fig. 1 viser grafisk forskellen med hensyn til membran-20 stabilitet med varierende urinstofkoncentrationer eller NaCl-koncentrationer.

Fig. 2 viser grafisk grafisk retentionen af både lipid-og vandig fase af SPLV'er i øjelågsvæv på mus og den 25 protraherede frigørelse af gentamycin fra SPLV'er in vivo.

Fig. 3 viser elektronspinresonnansabsorptionsspektrum for SPLV'er (A) sammenlignet med MLV'er (B).

30

Fig. 4 viser grafisk forskellen med hensyn til ascorbats evne til nedbringe doxylspinindtrængen i SPLV'er i MLV'er. 1

Fig. 5 viser grafisk effektiviteten af en to-trinsbehand-ling af Brucella canis-infektioner hos mus ved hjælp af i SPLV-indesluttet streptomycin baseret på Brucella canis,

DK 163105B

8 der kan udvindes fra milten hos inficerede mus.

Fig. 6 viser grafisk effektiviteten af en to-trinsbehandling af Brucella canis-infektioner hos mus ved hjælp af i 5 SPLV indesluttet streptomycin baseret på Brucella canis, der kan udvindes fra organer i inficerede mus.

Fig. 7 viser grafisk effektiviteten af en to-trinsbehand-ling af Brucella abortus hos marsvin ved hjælp af i SPLV-10 indesluttet streptomycin.

SPLVer fremstilles ved en fremgangsmåde, der resulterer i et produkt, der er enestående i forhold til alle tidligere kendte liposomer.

15 SPLV'er er lipidvesikler, der har fra nogle få til mere end 100 lipiddobbeltlag. Membrandobbeltlaget er sammensat af et dobbeltmolekylært lag af et amfipatisk lipid, hvor de ikke-polære hydrofobe carbonhydrid-"haler" peger mod 20 dobbeltlagets midte, og de polære hydrofobe "hoveder” peger mod den vandige fase. Indelukket af dobbeltlagene findes et vandigt rum, hvoraf en del udgør vesiklens hulrum og en del ligger mellem op til hinanden liggende lag. Kompleks forbundet med lipiddobbeltlagene kan der være en 25 række forskellige proteiner, glycoproteiner, glycolipi-der, mucopolysaccharider og eventuelle andre hydrofobe og/eller amfipatiske stoffer.

SPLV'er fremstilles på følgende måde: et amfipatisk lipid 30 eller en blanding af sådanne lipider opløses i et organisk opløsningsmiddel. Mange organiske opløsningsmidler er egnede, men diethylether, fluorerede carbonhydrider og blandinger af fluorerede carbonhydrider og ethere foretrækkes. Til denne opløsning sættes en vandig fase og det 35 aktive stof, der skal indesluttes. Denne dobbeltfase-blanding omdannes til SPLV'er ved at emulgere det vandige materiale i opløsningsmidler, medens opløsningsmidlet af-

DK 163105 B

9 dampes. Afdampningen kan ske under eller efter lydbølgebehandling ved hjælp af en hvilken som helst afdampningsteknik, f.eks. afdampning ved at lede en strøm af inaktiv gas over blandingen, ved opvarmning eller ved hjælp af en 5 vakuum. Det volumen opløsningsmiddel, der anvendes, skal overstige det vandige volumen med en mængde, der er tilstrækkelig til, at det vandige materiale kan emulgeres fuldstændigt i blandingen. I praksis kan der anvendes et minimum på groft sagt 3 volumendele opløsningsmiddel til 10 1 volumendel vandig fase. I virkeligheden kan forholdet mellem opløsningsmiddel og vandig fase variere helt op til 100 eller flere volumendele vandig fase. Lipidmængden skal være tilstrækkelig til, at den overstiger den mængde, der er nødvendig til at overtrække de små emulsions-15 dråber (ca. 40 mg lipid pr. ml vandig fase). Den øvre grænse sættes kun af det praktiske spørgsmål om forholdet mellem omkostning og effektivitet, men SPLV'er kan fremstilles med 15 g lipid pr. ml vandig fase. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Fremgangsmåden giver lipidvesikler med en anden super 2 molekylær ordning end gængse liposomer. Ifølge den fore 3 liggende opfindelse kan hele fremgangsmåden udføres ved 4 et temperaturinterval på 4-60 °C uanset faseovergangstem 5 peraturen for det anvendte lipid. Fordelen ved dette 6 sidste træk er, at varmelabile produkter, der har ønske 7 lige egenskaber, f.eks. let denaturerbare proteiner, kan 8 inkorporeres i SPLV'er fremstillet ud fra phospholipid 9 såsom distearylphosphatidylcholin, der kun kan fremstil 10 les som gængse liposomer ved temperaturer over deres 11 faseovergangstemperatur. Fremgangsmåden tillader i reglen 12 mere end 20% af det til rådighed værende vandopløselige 13 materiale at blive indkapslet og mere end 40% af det til 14 rådighed værende lipidopløselige materiale at blive 15 indkapslet. Med MLV'er overstiger indeslutningen af van- 16 dig fase i reglen ikke 10%.

DK 163105B

10

De fleste amfipatiske lipider kan være bestanddele i SPLV'er. Egnede hydrofile grupper omfatter: phosphat-, carboxylsyre-, sulfat- og aminogrupper. Egnede hydrofobe grupper omfatter: mættede og umættede alifatiske carbon-5 hydridgrupper og alifatiske carbonhydridgrupper substi tueret med mindst én aromatisk og/eller cycloaliphatisk gruppe. De foretrukne amfipatiske forbindelser er phos-pholipider og dermed nært beslægtede kemiske strukturer. Eksempler herpå omfatter: lecithin, phosphatidylethanol-10 amin, lysolecithin, lysophatidylethanolamin, phosphati- dylserin, phosphatidylinositol, sphingomyelin, carioli-pin, phosphatidinsyre og cerebrosiderne. Særlige eksempler på egnede lipider, der kan anvendes til fremstillingen af SPLV'er, er phospholipider, der omfatter de 15 naturlige lecithiner (f.eks. æggelecithin eller sojabøn-nelecithin) og syntetiske lecithiner såsom mættede syntetiske lecithiner (f.eks. dimyristoylphosphatidylcholin eller dipalmitoyl-phosphatidylcholin eller distearyl-phosphatidylicholin) og umættede syntetiske lecithiner 20 (f.eks. dioloyl-phosphatidylycholin eller dilinoloylphos- phatidylcholin). SPLV-dobbeltlag kan indeholde en stero-idbestanddel såsom cholesterol, coprostanol, cholestanol, cholestan og lignende. Når der anvendes forbindelser med sure hydrofile grupper (phosphato, sulfato, etc.), vil de 25 fremstillede SPLV'er være anioniske; med basiske grupper, såsom amino, vil der fås kationiske liposomer, og med polyethylenoxy- eller glycolgrupper vil der fås neutrale liposomer. Størrelsen af SPLV'er varierer stærkt. Intervallet går fra ca. 500 nm til ca. 10.000 nm (10 u) 30 og i reglen ca. 1.000 nm til ca. 4.000 nm.

Praktisk taget en hvilken som helst bioaktiv forbindelse kan indesluttes i en SPLV ("indesluttes" defineres som. indeslutning inde i det vandige rum eller mellem mem-35 brandobbeltlaget). Sådanne forbindelser omfatter: nucle- insyrer, polynucleotider, antibakterielle forbindelser, antivirale forbindelser, tumoricide forbindelser, prote

DK 163105 B

11 iner, toksiner, enzymer, hormoner, neurotransmittere, glycoproteiner, immunoglobuliner, immunmodulatorer, farvestoffer, radiomærkestoffer, radiouigennemsigtige forbindelser, fluorescerende forbindelser, polysaccharider, 5 celle-receptor-bindingsmolekyler, anti-inflammatoriske forbindelser, antiglaucome midler, mydriatika, lokal anæstetika, etc.

Det følgende er et eksempel på de mængdeforhold, der kan 10 anvendes ved SPLV-syntese: SPLV'er kan dannes ved at tilsætte 50 /unol phospholipid til 5 ml diethylether indeholdende 5 ug BHT (butyleret hydroxytoluen) og derpå tilsætte 0,3 ml vandig fase indeholdende den aktive substans, der skal indkapsles. Den fremkomne opløsning, 15 der omfatter materialet, der skal indesluttes, og det indesluttende lipid, lydbølgebehandles, medens der strømmer inaktiv gas over blandingen, for således at fjerne det meste af opløsningsmidlet. Denne udførelsesform giver særligt stabile SPLV'er, delvis på grund af inkorpore-20 ringen af BHT i vesiklerne.

Se ligeledes Lenk. m.fl., Eur. J. Biochem. 121, 475-482, (1982), der beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af liposom-indkapslede antistoffer ved lydbølgebehandling 25 og inddampning af en opløsning af cholesterol og phos-phatidylcholin i en blanding af chloroform og ether med tilsat vandig fase, men som ikke anfører mængdeforholdene mellem lipid og vandig fase. 1 2 3 4 5 6 SPLV'er er klart skelnelige med hensyn til egenskaber fra 2 liposomer med en enkelt eller flere lameller (f.eks.

3 SUV'er og REV'er). Frysefraktur-elektronmikroskopi viser, 4 at SPLV-præparaterne hovedsageligt er uden SUV'er og 5 REV'er, dvs. mindre end 20% af vesiklerne er enlamellare.

6

De kan imidlertid ikke skelnes fra MLV'er ved hjælp af elektronmikroskopisk teknik, selv om mange af deres fysiske egenskaber er forskellige. Den nedenstående detal-

DK 163105B

12 jerede sammenligning fokuserer derfor på at skelne SPLV'er fra MLV'er.

En lipidvesikels stabilitet refererer til vesiklens evne 5 til at afsondre sit lukkede rum fra det ydre miljø over et langt tidsrum. For at en lipidvesikel skal være anvendelig, er det af største vigtighed, at den er stabil under opbevaring og håndtering. Til nogle anvendelsesformål er det imidlertid ønskeligt, at vesiklen langsomt 10 lækker sit indhold ud, når den anvendes. Til andre anvendelsesformål er det ønskeligt, at vesiklen forbliver intakt efter indgivelse, indtil den når frem til det ønskede virkested. Det vil fremgå, at SPLV'erne udviser disse ønskelige karakteristika, medens MLV’er ikke har 15 dem.

Der er to faktorer, der får vesikler til at lække. Den ene er auto-oxidation af lipiderne, hvorved carbonhydrid-kæderne danner peroxider, der afstabiliserer dobbelt-20 lagene. Denne oxidation kan nedsættes drastisk ved tilsætning af antioxidater såsom butyleret hydroxytoluen (BHT) til vesikelpræparatet. Vesiklerne kan også lække, fordi midler i det ydre miljø får lipidernes dobbeltlagsordning til at bryde sammen, så at lipiderne 25 forbliver intakte, men membranen udvikler en pore.

Lipidvesikelpræparater er hvide, når de lige er fremstillet. Efter auto-oxidation bliver præparatet misfarvet (brunligt). En sammenligning af MLV'er med SPLV’er f rem-30 stillet ved hjælp af samme lipid og vandige komponenter afslører, at MLV'er misfarves i løbet af 1-2 uger, hvorimod SPLV'er forbliver hvide i mindst 2 måneder. Dette understøttes af tyndtlagskromatografi af lipidkomponen-ten, der viser nedbrydning af lipiderne i MLV'erne, men 35 ikke af lipiderne i SPLV'erne. Når disse vesikler fremstilles ved tilsætning af BHT samt de andre bestanddele, fremstår MLV'er let misfarvede i løbet af en måned, hvor- 13

DK 163105 B

imod SPLV'er forbliver hvide og synes stabile i mindst 6 måneder eller længere.

Når de anbringes i en puffer, der indeholder isotonisk 5 saltvand ved neutralt pH, er SPLV'er, der indeholder et antibiotikum, stabile i mere end 4 måneder, som det vises i tabel I. Disse data viser, at intet af det antibiotikum, der oprindeligt er indkapslet i SPLV'erne, er læk-ket ud i forsøgsperioden.

10

Anden dokumentation viser, at SPLV'er er i stand til at sequestrere et indkapslet middel fra molekyler, der er så små som calciumioner, i mere end 6 måneder. "Arsenazo III" er et farvestof, der ændrer farve fra rød til blå, 15 når der er selv den mindste mængde divalent kation til stede. Ved at indkapsle farvestoffet i SPLV'er og tilsætte calciumchlorid til opbevaringspufferen, er det muligt at måle vesiklernes stabilitet ved at se efter en farveændring. Det kan ikke ses, at farven ændrer sig fra 20 den oprindelige i mindst 6,5 måneder, hvilket viser, at farvestoffet ikke er lækket ud, og at heller ikke ioner slipper ind.

Disse forsøg viser, at SPLV'er er tilstrækkeligt stabile 25 til at modstå opbevarings- og håndteringsproblemer. Selv om det er muligt at fremstille MLV'er, der er stabile så længe, skal de fremstilles af syntetiske lipider såsom DSPC og bliver således så kostbare, at fremstillingen forbyder sig selv.

30 35

» DK 163105 B

- w

^ +J

to , Μ H (0 Ό a ο)

u 8 A

o h 0) a ή

H

-P Q) df> IS Η* σ> I-Η C-· CO

<Da cn co co σ> σι σ> m P c m P « § 3 a w -η

<D (DP

U *0 0

(D C H

Ό Η J3 H 0 A 0)

A

i (D I kl

Ό IXJ C ι * O

Q) H >i H 111 ΟΉ X -Η H a Η ΉΛΌ x p m <o o u ki ki 3 H XJ° ID W Id

Η α)ο(0 OOOOOO !) raiDO

a a <d h <# u c . It CO >1 · & (0 H x φ a >0 ό aw p 8 > (D Ή (D Cifl ffl a j o -3 p > h a c (0 u Ό •h a a <d a Q) 2 a c a to s « w Η 3 η > ο u Ρ ρ

0 £ it ·Η (D (D

.α a > ^ « c ο. ‘ o) o) p c a

o axi C <D H

a a ω ό h

H , 8 o O >i C

kl H <D W

a) H W Ό P g ID

Pia O kl (D g CO

p wc ε id >ho ro h (D <D -H a Ό a (0 >

WC ID kl G “C

2J HP H OJ M CO 00 C dl ΦΡ a

Τη ID 3 rip » - * *· ·· *· CM Id P > <D

jj ό h i> in co o vo η g p o P C

Z C CO 00 CO CO H 3 H (0

j >i o) p in a a > X

[j a>d ® v w o -η

0 φ G ^ a P <D

9cqh a cc£ x S Η P Η H Id *

C 8 (D U O O H

® T)P (0A -ri XC P > Ό Λ m w ω α) c <d ίΗ Ό X) H ID Ό o) <d · a i ε ·

> P O > E E

> <a j cd 3 ki j ki ki id a p .¾ id <D(0kcnra-H3 co - ap o) p c

1 > 83 P A O <D

C Cl U 0) (0 H > •h a a c p λ h

H CO U kl Id H C

o H <D (D P

xc +> w o - a ki c h

o (0 0) E > C O Id H

h p HaJ-H‘hp >i HH H a Ό «Η >σ 3 OC H in CO C kl (d kl

H CD OH P CM i* ID <D

P CCHHCC W W P C kl kl (0 +> HH CO HH 6 a <D k 8 (D 0) χ}-^ 0) O O <D >i O N (DOHOHak

ΟΛ p & >ι X! O >i Id kl Η P a C ID

w ppeeaiosk η^ηφηη H Ok CtdOOEkiOlD ΟΛ HIHfl 0) JO 0) h kl P P (d P kl E k&tMDkC k h att co (0 a a k: ox; c ® w ό ·η m >i

0) (DO) 0)a<D 0) OPPH Qw(d>P4JO

X) ac tJ8klklH>i>iH

ίο a-κο ck4PP x:«}-i3 ~ c-

Eh f£ E HacOCOUOHCO (0 X3 15

DK 163105 B

At anbringe lipidvesikler i et medium, der indeholder membran-forstyrrende midler, er en vej til afprøvning af forskellige molekylære ordninger. Afhængigt af, hvorledes membranen er opbygget, vil forskellige vesikler reagere 5 forskelligt på sådanne midler.

Til de følgende forsøg fremstilles vesikler, der inde- 3 holder et radioaktivt spormolekyle ( H-inulin) i det aflukkede vandige rum. Inulin, der er et polysaccharid, 10 fordeles i den vandige fase, og når det således er radiomærket, kan det anvendes til at spore lipidvesiklernes vandige indhold. Efter i passende tid at have været udsat for et givet middel adskilles vesiklerne fra mediet ved centrifugering, og den relative mængde radioaktivitet, 15 der er sluppet ud fra vesiklerne i mediet, konstateres.

Disse værdier er anført i tabel II, hvor værdierne er udtrykt som procent lækage, hvilket betyder den andel radioaktivt materiale, der findes i det omgivende medium, i forhold til begyndelsesmængden, der er indkapslet i 20 vesiklerne.

25 1 35 16

DK 163105 B

Tabel il SPLV'ers stabilitet i andre miljøer 5 % lækage a ) 10 Inkuberingsmedium ’ MLV'er SPLV'er

Saltsyre 0,125 molær 90,5 55,2 15 Urinstof 1 molær 21,7 44,8

Guanidin 0,5 molær 5,7 7,4 20 1,0 molær 8,3 10,1

Ammoniumacetat 0,5 molær 27,0 67,0 1,0 molær 25,9 54,7-63,1 25

Serum 76,2 57,8 1 35 a) Inkubationstiden er 2-4 timer undtagen for inkubation i HC1, hvor den er en time.

DK 163105 B

17 SPLV'er er mere stabile end MLV'er i saltsyre. Tabel II viser, at både MLV'er og SPLV'er kan afstabiliseres, når de er fremstillet af æggelecithin, når de udsættes for 0,125N saltsyre i en time. Det er imidlertid bemærkel-5 sesværdigt, at SPLV'er er betydelig mindre følsomme over for syren end MLV'er. Formodentlig afspejler denne anderledes reaktion en iboende forskel i den måde, hvorpå lipiderne og omgivelserne gensidigt påvirker hinanden.

10 SPLV'er reagerer også anderledes end MLV'er, når de udsættes for urinstof (fig. 1 og tabel II). Urinstof er et molekyle med både en chaotrop virkning (opbryder vands struktur) og et stærkt dipol-moment. Det ses, at SPLV'er er langt mere følsomme for urinstof, end de er over for 15 et osmotisk middel såsom natriumchlorid ved samme koncentration (fig. 1). MLV'er lækker ikke bemærkelsesværdigt mere i urinstof, end de ville gøre i natriumchlorid. Selv om forklaringerne på denne forskellige adfærd er teoretiske, vil det fremgå, at reaktionen 20 skyldes dipolvirkningen snarere end en chaotrop egenskab, eftersom guanidin, et molekyle, der ligner urinstof, ikke afstabiliserer SPLV'er (tabel II). Selv om guanidin også er stærkt chaotropt, har det ikke noget stærkt dipolmoment .

25 SPLV'er er også følsomme over for ammoniumacetat, medens MLV'er ikke er det (tabel II). Imidlertid er hverken ammonium-ion (i ammoniumchlorid) eller acetat (i ammoniumacetat) særlig effektivt til at få SPLV'er afstabili-30 seret. Det fremgår således, at det ikke er ionen, men ammoniumacetats polaritet, der er ansvarlig for fremkaldt lækage.

Til at begynde med kan disse resultater synes overras-35 kende, fordi SPLV'er er meget mere stabile end MLV'er, når de inkuberes i kropsvæsker såsom sera eller blod.

DK 163105 B

18

Imidlertid kan en teoretisk forklaring på disse resultater fremsættes (naturligvis er andre forklaringer mulige). Hvis SPLV's stabilitet skyldes den enestående struktur i dens membrandobbeltlag, så at polære grupper i 5 membranlipideme hydratiseres af en sky af orienterede vandmolekyler eller hydratiseringsskal, er det muligt, at et hvilket som helst middel, der opbryder eller griber ind i sådanne hydratiseringsskaller, vil fremkalde ændringer i membranens strukturelle integritet og dermed 10 lækage.

Uanset om de teoretiske forklaringer på afstabiliseringen af SPLV’er i urinstof er korrekte, tjener resultaterne til at påvise karakteristiske forskelle mellem MLV'ers og 15 SPLV er s struktur. Forskellen tjener et meget nyttigt formål ved anvendelsen. Som beskrevet nedenfor bliver SPLV'er svagt lækkende, når de påføres øjet. Formodentlig skyldes denne ønskede langsomme frigørelse af indholdet en lignende afstabilisering af SPLV'erne, når de udsættes 20 for tårevæske.

SPLV'er er mere stabile i serum end MLV'er. Mange anvendelsesformål for lipidvesikler omfatter indgivelse af dem intraperitonealt, såsom ved behandling af brucel-25 lose. For at være effektive skal vesikleme overleve en tilstrækkelig tid, så at de når deres ønskede mål.

SPLV'er og MLV'er, der begge er fremstillet af æggeleci-thin, udsættes for kalvefosterserum, der indeholder aktiv komplement (tabel II). Efter udsættelse herfor i 48 timer 30 ved 37 "C er SPLV'er påviseligt mere stabile end MLV'er.

SPLV'er frembyder en række karakteristiska, der gør dem særligt egnede som bærere for afgivelsessystemer in vivo: 1 (A) SPLV'er er modstandsdygtige over for udtømning.

Når SPLV'er indgives til en organisme, tilbage- holdes både lipidkomponenten og det indesluttede aktive stof i vævene og cellerne, hvortil de ind gives ; 19

DK 163105 B

5 (B) SPLV'er kan konstrueres til at sørge for protra- heret frigørelse. SPLV'ers stabilitet er "indstillelig" derved, at SPLV'er er meget mere stabile under opbevaring og er stabile i nærvær af kropsvæsker, men når de indgives in vivo tillader 10 en langsom lækage af det aktive stof den protra- herede frigørelse af det aktive stof; (C) på grund af det høje indeslutningsniveau og store stabilitet, når de indgives, frigøres effektive 15 doser af det aktive stof, og (D) produktionen af SPLV'er er meget omkostningsef fektiv, fordi stabiliteten af vesiklerne opnås uden inkorporering af dyre stabilisatorer i dob- 20 beltlagene.

De følgende forsøg viser nogle af disse karakteristika hos SPLV'er, når de indgives topisk på forsøgsdyrs øjne.

De SPLV'er, der anvendes i disse forsøg, fremstilles som 25 tidligere beskrevet med undtagelse af, at lipiddobbeltla-get og det aktive stof hver radiomærkes, så at disse komponenter kan spores i øjevævet senere.

Der fremstilles SPLV'er ved hjælp af 100 mg æggephos-30 phatidylcholin (ECP) og 100 mg gentamycinsulfat. Lipidkomponenten radiomærkes ved inkorporering af spormængder af 3I-phosphatidylethanolamin ( °I-PE) i dobbeltlagene, hvorimod det aktive stof i den vandige fase radio-

1ΛΡ 1OC

mærkes ved tilsætning af 3I-gentamycinsulfat ( -I- 35 GS). SPLV'erne vaskes gentagne gange med puffer for effektivt at fjerne uinkorporerede eller uindkapslede materialer.

20

DK 163105 B

En alikvot mængde af SPLV-præparatet fjernes og ekstra- heres for at skille den organiske fase fra den vandige 5 fase. Hver fases radioaktivitet måles for at bestemme 125 125 begyndelsesforholdet -IPR: -IGS cpm (tællinger pr.

minut) i lipidfase: cpm i den vandige fase, der er inkorporeret i SPLV'erne.

10 Ekstraktionen foretages på følgende måde: 0,8 ml 0,4 molær vandigt NaCl, 1 ml chloroform og 2 ml methanol blandes til en homogen fase. Derpå tilsættes 4 ul af de radiomærkede SPLV'er, og der blandes; efterhånden som SPLV-komponenterne opløses i den organiske fase og i den 15 vandige fase, bliver behandlingen, der til at begynde med er uklar, klar. Faserne adskilles ved at tilsætte og blande 1 ml 0,4 molær vandigt NaCl og 1 ml chloroform, hvorpå centrifugeres ved 2.800 G i 5 minutter. En alikvot mængde (1 ml) af hver fase fjernes, og radioaktiviteten 20 (i cpm) måles. (Begyndelsesforholdet -IPE: -IGS er 1,55:1).

15 voksne Swiss Webster hunmus anæstetiseres og fastholdes (for at forhindre dem i at gnide deres øjne). Lige 25 store alikvote mængder (2 ul) af de radiomærkede SPLV’er i suspension påføres topisk på hvert øje. Derpå aflives grupper på tre dyr på hvert af følgende tidspunkter: 1, 2, 3, 18 og 24 timer. 9 Swiss Webster hunmus (kontroldyr) behandles identisk med undtagelse af, at der topisk 30 på hvert øje påføres lige store alikvote mængder (2 ul) af en vandig opløsning af radiomærket gentamycinsulfat. Grupper på 3 kontroldyr aflives, når der er gået 1, 4 og 8 timer. 1

Straks efter aflivningen fjernes øjelågene på dyrene, og der hakkes og ekstraheres (ved hjælp af den tidligere 21

DK 163105 B

beskrevne metode) for at skille de vandige komponenter fra lipidkomponenterne. Hver fases radioaktivitet måles (samt det samlede antal radioaktive tællinger, der opnås). Radioaktiviteten, der måles i lipidfasen, er et 5 mål for retentionen af SPLV-lipider i øjenvævet, hvorimod den radioaktivitet, der måles i den vandige fase, er et mål for retentionen af gentamycin i øjenvævet. Fig. 2 viser grafisk retentionen af hver komponent i øjenlågs-vævet (udtrykt som procent af det oprindelige antal cpm 10 påført øjet).

Fig. 2 viser klart retentionen af SPLV-lipidkomponenten i øjenlågsvævet i løbet af et tidsrum på 24 timer, og den protraherede frigivelse af gentamycin fra SPLV'erne i 15 løbet af et tidsrum på 24 timer (afspejlet i procent gentamycin, der forbliver i øjenlågsvævet i dette tidsrum). Fig. 2 viser også, at uindkapslet gentamycin (vandig gentamycin indgivet topisk) hurtigt fjernes fra øjenlågsvævet. Således er gentamycin i opløsning (kon-20 trol) fjernet fra øjenlågsvævet inden for 4 timer (mindre end 5% af gentamycinet er tilbage i øjenlågsvævet). Derimod er mere end 50% af det SPLV-indkapslede gentamycin tilbage i øjenlågsvævet i dette tidsrum på 4 timer; faktisk er der, når der er gået 24 timer, mere end 15% af 25 det SPLV-indkapslede gentamycin tilbage i øjenlågsvævet.

Dette viser klart, at ca. 85% af det SPLV-indkapslede gentamycin frigives i løbet af et tidsrum på 24 timer, hvorimod 95% af det uindkapslede gentamycinsulfat er fjernet i løbet af et tidsrum på 4 timer.

30 I tabel III sammenlignes forholdet mellem SPLV-lipidfase og vandig fase, der forbliver i øjenlågsvævet på hvert tidspunkt. En stigning i dette forhold betyder frigørelse af gentamycin fra SPLV'erne.

35

DK 163105B

·· Ό •Η Q) a Ο) •Η (0 C0 Η Λ Ο I Η Η

0) > ·Η I

3 Α μ ιη £ pL, <Ν 1Ν co Ο η in cs σι «η •Λ Μ ιη <η οο οο Οι μ <0 Ο) .· * * * *. D*· Φ μ °<ο η es es m

μ Ό Η W

ο) η en c a τη Ο ·Η Φ Η

S Α Ό ·η I

U C -©ιη -Η Ο <0 <Ν ti > ΉΗ Φ (0 Η Φ Μ •Θ· Ή 10 η χ (Π •ri a ο •μ

Lj Li

Φ Φ W

μ μ ·η μ caw φ φ ο ο C Η Ό c ο era es ·η a Φ Φ CS Ο Β τη m Ο ·Θ· Η <*> £ X Φ Η (0 I (0 Ό <Χ> <*> Α° <Λ° μ > μ β ΟΟΟ'ίΐη d ι4 <η >ι ο ο ο σι οο

φ a Ο) τ—i ι—I ι—I

a co μ φ

Φ A

μ φ ό φ η β μ Η (0 3 (0 ω μ > a ο 3 <*> (0 Ε-* 3 — λ; Ό

C

•Η > Α a co μ <α φ

W

Η Φ Φ μ ω •θ- η a φ •μ μ μ & S μ μ μ φ 01 ε ε ε ε Η μ μ ·Η -ri Ή ·γΙ η Φ Φ μ μ μ μ η a μ ίο μ ο η eo οο ^ Η μ Φ μ (Ν Φ μ Α ο ό φ μ ·η ε-< a εη

DK 163105 B

23

Bioaktiviteten af det SPLV-indkapslede gentamycinsulfat, der bibeholdes af øjenlågsvævet, bedømmes ligeledes.

Gentamycinsulfat udvindes fra øjenlågsvævet ved at fjerne en alikvot mængde fra øjenlågsekstrakternes vandige fase, 5 fremstillet 3 timer efter, at det SPLV-indkapslede genta-mycinsulfat er påført øjet. Den vandige fase fortyndes serievis, og 2 al alikvote mængder anbringes på Staphylococcus aureus-måtter på agarplader; efter 24 timers inkubation måles inhiberingszonerne. Gentamycinsulfat 10 udvundet af øjenlågsvævsekstrakter fra dyr behandlet med SPLV-indkapslet gentamycinsulfat bibeholder sin fulde bioaktivitet.

Selv om SPLV'er og MLV'er forekommer identiske ved elek-15 tronmikroskopi, afslører ESR-(elektronspinresonans)-spektroskop! forskelle i deres supramolekylære struktur. SPLV'er kan skelnes fra MLV'er på basis af deres molekylære opbygning, som kommer til udtryk i deres forøgende molekylære orden, forøgede molekylære bevægelse og større 20 gennemtrængelighed for ascorbat. Det er sandsynligt, at disse forskelle i den molekylære opbygning bidrager til deres forskellige biologiske virkninger.

Ved elektronspinresonans-spektroskopi inkorporeres en 25 spinprøve såsom 5-doxylstearat (5DS) i lipiddobbeltlaget. Doxylgruppens uparrede elektron absorberer mikrobølgeenergi, når prøven indføres i et magnetisk felt. Absorptionens spektrum tillader en måling af tre empiriske parametre: S ordensparameteren, Aq den hyperfine koblings-30 konstant, og (Tau) rotationskorrelationstiden. En typisk aflæsning er vist i fig. 3, hvor A er SPLV-signalet, og B er MLV-signalet, begge er angivet for 5-doxylstearat. Spektrene er taget ved stuetemperatur og feltets vidde er 100 Gauss. Ordensparameteren (S), der er afhængige af bå-35 de 2R^ og 21^, måler afledningen af det iagttagne ESR-signal fra tilfældet med en fuldstændig ensartet orientering af prøven. For en ensartet orienteret prøve S =

DK 163105B

24 1,00, en tilfældig prøve S = O. Den hyperfine koblingskonstant Aq, der kan beregnes ud fra 2R^ og 2R^ anses for at afspejle lokal polaritet og afspejler således spinprøvens stilling inde i membranen. Rotationskorrela-5 tionstiden (som er afhængig af WQ, hQ, h-1) kan betragtes som den tid, der er nødvendig, for at molekylerne "glemmer", hvorledes deres tidligere rumlige orienteringer er.

En typisk ERS-bestemmelse af forskellene mellem SPLV'er og MLV'er med 5-DS som spinprøve, er anført i tabel IV

10

Tabel IV

ERS-karakteristik af SPLV'er og MLV'er 15 (Tau) S Aq SPLV'er 2,65 x 10-9 sek. 0,614 14,9 MLV'er 3,65 x ICf9 sek. 0,595 14,9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2

Selv om en spinprøve i begge tilfælde rapporterer fra 3 samme dybde i dobbeltlaget, har SPLV'erne en betydelig 4 større grad af molekylær orden og molekylær bevægelse end 5 MLV'er.

6 7

En anden illustration af forskellene mellem SPLV'er og 8 MLV'er ligger i ascorbats evne til at reducere doxylspin- 9 prøven. Man har vidst i nogen tid, at ascorbat reducerer 10 doxylmolekyIdele, formodentlig til deres hydroxylaminana- 11 loge, der ikke absorberer mikrobølgeenergi i et magnetisk 12 felt. I vandige opløsninger sker reduktionen hurtigt med 13 et samtidigt tab af ERS-signal. Hvis spinprøven er i et 14 beskyttet miljø, såsom et lipiddobbeltlag, kan den 15 reduceres langsommere eller slet ikke af det hydrofobe 16 ascorbat. Således kan hastigheden af nitroxidreduktion anvendes til at undersøge gennemtrængningshastigheden for ascorbat ind i lipiddobbeltlag. Fig. 4 viser den procent-

DK 163105 B

25 del tilbageværende spin som funktion af tid for SPLV'er og MLV'er suspenderet i en ascorbatopløsning. Efter 90 minutter har ascorbatet reduceret 25% af prøverne indført i MLV'er, men 60% af prøverne indført i SPLV'er. SPLV'er 5 tillader en dramatisk større gennemtrængelighed for ascorbat end MLV'er.

Som endnu et vigtigt eksempel på SPLV'ers overlegenhed over traditionelle MLV'er indeslutter SPLV'er en større 10 procentdel af det til rådighed stående aktive materiale og sparer derved materiale (se tabel V)

Tabel V

15 Sammenligning mellem MLV'er og SPLV'er % af det til rådighed værende materiale indeslut.

20 Indkapsling af: MLV'er SPLV'er

Inulin (vandigt rummærkestof) 2-6% 20-30% 25 Okseserumalbumin 15% 20-50%

Streptomycin 12-15% 20-40%

Polyvinylpyrrolidon 30 (vand. rum) 5% 25-35%

Endnu en anden fordel ved SPLV'er er, at de vekselvirker med cellerne, så at den forholdsvis store mængde 35 materiale, der er indkapslet i vesiklen, dispergeres gennem hele cellens cytoplasma frem for at være begrænset til phagocytiske vesikler. Når SPLV'er blandes med 26

DK 163105 B

celler, synes de to dele af løbe sammen. Ved sammensmeltningen vekselvirker SPLV'er til forskel fra MLV'er med cellerne in vitro, så at alle cellerne indeholder i det mindste nogle af de materialer, der oprindeligt er 5 indesluttet i SPLV'erne. Dette materiale synes at blive fordelt over hele den enkelte celle og ikke-begrænset til netop de phagocytiske vesikler. Dette påvises ved at inkorporere ferritin i den vandige fase af et SPLV-præparat. Efter sammensmeltning med en dyrket celle 10 afslører ultrastrukturel analyse, at ferritinet er for delt over al cytosolen og ikke er bundet af intracellu-lære membraner. Selv om det kan påvises, at dette fænomen forekommer med MLV'er, kan en større mængde materialer overføres af SPLV'er.

15

Ydermere har SPLV'er en lavere flydedensitet end MLV'er.

Dette måles ved opdriftsforsøg under bånddannelse i ficolgradient (se tabel VI).

20 Tabel VI

Flydedensitet MLV'er SPLV'er 25 1 ficol lag over 1% lag over 1% I g/ml 1,071 1,0274 Når SPLV'er samles i en pellet ved centrifugering fra 30 1.000-100,000 G, danner de desuden en pellet, der er væsentligt større end med MLV'er under forudsætning af samme phospholipidkoncentration. Ved en kraft på 16.000 G danner SPLV'er en pellet, der er ca. en trediedel større end med MLV'er.

Eftersom phospholipiddobbeltlag er permeable for vand vil anbringelse af MLV'er i et hypertonisk miljø drive det 35

DK 163105 B

27 indelukkede vand ud på grund af osmotisk tryk. SPLV'er krymper mere end MLV'er. Efter krympning i 16 timer i en puffer, der er 20 gange kraftigere end den interne saltkoncentration, krymper SPLV'erne desuden ikke til 5 samme slutvolumen som MLV'er (SPLV-pellets forbliver 1/3 større end MLV-pellets). Dette viser, at forskellen i pelletsstørrelse ikke skyldes forskelle i det indesluttede vandige volumen.

10 SPLV'er er særlig anvendelige i systemer, hvor følgende træk er vigtige: stabilitet under opbevaring og kontakt med kropsvæsker, en forholdsvis høj indkapslingsgrad, god effektivitet i forhold til pris, og frigørelse af den indesluttede forbindelse i dens biologiske aktive form.

15

Afhængigt af indgivelsesmåden in vivo kan SPLV'er desuden være modstandsdygtige over for hurtig udtømning (f.eks. når protraheret afgivelse er af betydning) eller det kan afgives til cellerne i RES.

20 Følgelig anvendes SPLV'erne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen med udbytte i en lang række forskellige systemer. De kan anvendes til at forøge den terapeutiske effektivitet af medicinsk behandling, til at 25 helbrede infektion, til at forøge enzymudskiftning, til afgivelse af orale præparater, til afgivelse af topiske præparater, til indførelse af genetisk information til celler in vitro og in vivo, til fremstilling af vacciner, til indførelse af rekombinante deoxyribonucleinsyreseg-30 menter i celler eller som diagnostiske reagenser ved kliniske prøver efter frigørelse af indesluttede "reporter"-molekyler. SPLV'er kan også anvendes til indkapsling af kosmetiske præparater, pesticider, forbindelser til protraheret langsom frigørelse til fremme af vækst af plan-35 ter og lignende.

DK 163105 B

28

De fremgangsmåder, der følger, er, selv om de er blevet skrevet som anvendelse af SPLV'er, beregnet på anvendelse af SPLV'er eller andre liposom- eller lipidvesikler med funktionelle karakteristika, der ligner SPLV'ernes.

5

Afgivelse af forbindelser til celler in vitro (f.eks. dyreceller, planteceller, lavere stående organismer etc.) kræver i reglen, at SPLV'ernes, der indeholder forbindelsen, tilsættes til cellerne i kultur. SPLV'er kan 10 imidlertid også anvendes til at afgive forbindelser in vivo i mennesker, dyr, planter og lavere stående organismer. Afhængigt af formålet med afgivelse kan SPLV'er indgives ad en række veje: hos mennesker og dyr omfatter dette injektion (f.eks. intravenøs, intraperitoneal, 15 intramuskulær, subcutan, intraauriculær, intramammal, intrauterin etc.), topisk påføring (f.eks. på angrebne områder), og ved absorption gennem epitel eller slimhindelag (f.eks. ocular epitel, orga slimhinde, rectal og vaginal epitel, lag i luftvejene, slimholder i 20 næse/svælg, slimhinde i mave/tarmkanal etc.); hos planter og laverestående organismer omfatter dette, men er ikke begrænset til direkte påføring på organismer, spredning i organismens miljø, tilsætning til det omgivende miljø eller omgivende vand etc.

25 Påføringsmåden kan også afgøre de steder og celler i organismen, hvortil forbindelsen vil blive afgivet. Således kan afgivelse til et specifikt infektionssted lettest ske ved topisk påføring (hvis infektionen er udvendig).

30 Afgivelse til kredsløbssystemer (og derfra til retikulo-endoteliale celler) kan lettest ske ved intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær eller subcutan injektion.

Eftersom SPLV'er tillader protraheret frigørelse af 35 forbindelsen, kan benyttes doser, som ellers ville være toksiske for organismen, i en eller flere indgivelser til organismen.

DK 163105 B

29

De afsnit, der nu følger, beskriver nogle generelle systemer, hvor SPLV'er kan anvendes, og viser omfanget for anvendelsen af den foreliggende opfindelse.

5 En række patologiske tilstande, der forekommer hos mennesker, dyr og planter, kan behandles mere effektivt ved at indkapsle en eller flere passende forbindelser i SPLV'er.

Disse patologiske tilstande omfatter infektion (intra-cellulære og ekstracellulære), cyster, tumore og tumor-10 celler, allergier etc.).

Mange strategier er mulige ved anvendelse af SPLV’er til sådan sygdomsbehandling; nedenfor skal skitseres nogle få, der er særlig anvendelige, fordi de drager fordel af 15 den kendsgerning, at SPLV'er, når de indgives in vivo, indgår i makrofager.

Ved en metode anvendes SPLV'er til at afgive terapeutiske midler til steder med intracellulære infektioner. Visse 20 sygdomme indebærer en infektion af celler i det retikulo-endoteliale system, f.eks. brucellose. Disse intracellulære infektioner er vanskelige at helbrede af en række grunde: (1) fordi de infektiøse organismer findes inde i cellerne i det retikuloendoteliale system, er de afskåret 25 fra cirkulerende terapeutiske midler, der ikke kan overskride cellemembranen i terapeutisk tilstrækkelige koncentrationer og er derfor yderst resistente over for behandling; (2) ofte kræves indgivelse af toksiske niveauer af terapeutiske midler for at bekæmpe sådanne 30 infektioner; og (3) behandlingen skal være fuldstændig effektiv, fordi en eventuel residualinfektion efter behandling atter kan inficere værtsorganismen eller kan overføres til andre værter. 1

Ifølge en behandlingsform indgives SPLV'er, der indeholder en passende, biologisk aktiv forbindelse (fortrinsvis intraperitonealt eller intravenøst) til værtsorganismen

DK 163105B

30 eller den mulige værtsorganisme (f.eks. i dyreflokke kan ikke-inficerede dyr så vel som inficerede dyr behandles). Eftersom fagocytiske celler i sig selv optager SPLV'er, vil indgivelsen af et i SPLV indkapslet stof, dvs. biolo-5 gisk aktivt over for den inficerende organisme, resultere i, at det bioaktive stof dirigeres til infektionsstedet. Præparater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan således anvendes til at udrydde infektion forårsaget af en række forskellige mikroorga-10 nismer, bakterier, perasitter, svampe, mycoplasmaer og vira og omfatter: Brucella-arter, Mycobacterium-arter,

Salmonelle-arter, Listeria-arter, Francisella-arter, Histoplasma-arter, Corynebacterium-arter, Coccidiodes-arter og lymfocytere chroiomeningitisvirus.

15

Det terapeutiske middel, der vælges, vil afhænge af den organisme, der forårsager infektionen. Således kan bakterieinfektioner helbredes ved at indkapsle et antibiotikum. Antibiotiket kan indeholdes i den vandige væske i 20 SPLV og/eller indføres i vesikeldobbetlaget. Egnede antibiotika omfatter: penicillin, ampicillin, hetacillin, carbencillin, tetracyclin, tetracyclin-hydrochlorid, oxy-tetracyclin-hydrochlorid, chlortetracyclin-hydrochlorid, 7-chlor-6-dimethyltetracyclin, doxycyclin-monohydrat, 25 methacyclin-hydrochlorid, minocyclin-hydrochlorid, roli- tetracyclin, dihydrostreptomycin, streptomycin, gentamy-cin, kanamycin, neomycin, erythromycin, carbomycin, oleandomycin, troleandomycin, "Polymyxin B collistin", cephalotin-natrium, cephaloridin, cephaloglycin-dihydrat 30 og cephalexin-monohydrat.

Effektiviteten af sådanne behandlinger til helbredelse af brucellose er blevet påvist (se eksemplerne nedenfor).

Ved behandlingen forlænges effektiviteten og virkningens 35 varighed. Det er overraskende at dette system er effek tivt til behandling af infektioner, som ikke reagerer på kendte behandlinger såsom antibiotika indesluttet i

DK 163105 B

31 MLV'er. Den heldigt gennemførte behandling er overraskende, eftersom eventuelle små tilbageblevne infektioner vil spredes, og den infektiøse cyclus atter begynde forfra.

Og en heldigt gennemført behandling af lymfocyt chorio-5 meningitis-virusinfektion er påvist.

Naturligvis er behandlingen ikke begrænset til intracel-lulære infektioner. SPLV'erne kan dirigeres til en række forskellige infektionssteder, hvad enten de er intra-10 eller ekstraceilulære. Således anvendes ved en anden behandling makrofager til at medføre et aktivt stof til stedet for en systemisk ekstracellulær infektion. Ifølge denne metode anvendes SPLV'er til at afgive et terapeutisk stof til ikke-inficerede makrofager ved indgi-15 velse af SPLV'er in vivo (fortrinsvis intraperitonealt eller intravenøst). Makrofagerne vil smelte sammen med SPLV'erne og derefter blive "ladet" med det terapeutiske stof; almindeligvis vil makrofagerne bibeholde stoffet i ca. 3-5 dage. Når først de "lastede" makrofager når frem 20 til infektionsstedet, vil sygdomsfremkalderen blive optaget af makrofagerne. Følgelig vil sygdomsfremkalderen komme i berøring med det terapeutiske stof, der er indeholdt i makrofagen, og blive ødelagt. Denne behandling er særlig værdifuld til behandling af Staphylococcus 25 aureus mastitis hos mennesker og kvæg.

Dersom infektionsstedet eller angrebet er eksternt eller tilgængeligt, kan det i SPLV-indesluttede terapeutiske middel påføres topisk. Et særligt anvendeligt anvendel-30 sesområde er behandlingen af øjenlidelser. Når det drejer sig om øjenlidelser, kan SPLV'er indeholdende et eller flere passende aktive stoffer påføres topisk på det angrebne øje. En række organismer fremkalder øjeninfektioner hos dyr og mennesker. Sådanne organismer omfat-35 ter: Moraxella-arter, Clostridium-arter, Corynebacterium-arter, Diplococcus-arter, Flavobacterium-arter, Hemophi-lus-arter, Kelbsiella-arter, Leptospira-arter, Mycobacte-

DK 163105B

32 rium-arter, Neisserie-arter, Propionbacterium-arter, Pro-teus-arter, Pseudomonas-arter, Serratia-arter, Escheri-chia-arter, Staphylococcus-arter, Streptococcus-arter og bakterielignende organismer, herunder Mycoplasma-arter og 5 Rickettsia-arter. Disse infektioner er vanskelige at helbrede ved hjælp af gængse metoder, fordi en eventuel residualinfektion, der bliver tilbage efter behandling, kan geninficere gennem tåresekretioner. Det har vist sig, at anvendelse af SPLV'er kan helbrede øjeninfektioner 10 forårsaget af Moraxella bovis (se eksemplerne nedenfor).

Eftersom SPLV'er er modstandsdygtige over for udtømning og er i stand til protraheret frigørelse af deres indhold, er SPLV'er også anvendelige til behandling af en 15 hvilken som helst lidelse, der kræver længerevarende kontakt med det aktive behandlingsstof. Således er glaucom en lidelse, der er kendetegnet ved en gradvis stigning af det intraoculare tryk, hvilken bevirker et progressivt tab af det perifere syn, når der ikke gribes 20 ind, tab af centralt syn og til sidst blindhed. Præ parater, der anvendes til behandling af glaucom, kan påføres topisk som øjendråber. I nogle tilfælde kræver behandlingen imidlertid indgivelse af dråber hvert kvarter på grund af den hurtige udtømning af præparat fra 25 øjenhulen. Hvis en lidelse som glaucom skal behandles, kan terapeutiske stoffer som "Pilocarpin", "Floropryl", "Physostigmin", "Carcholin", "Acetazolamid", "Ethozol-amid", "Dichlorphenamid", "Carbachol", "Demecariumbro-mid", diisopropylphosphofluoridat, "Ecothioplat-iodid", 30 "Physostigmin" eller "Neostigmin" etc. indesluttes i SPLV'er, der derefter påføres det syge øje.

Andre midler, der kan indkapsles i SPLV'er og påføres topisk, omfatter (f.eks. epinephrin, phenylepiniphrin, 35 hydroxyamphetamin, ephedrin, atropin, homatropin, scopol-amin, cyclopentolat, tropicamid, encatropin etc.), lokale bedøvelsesmidler, antivirale midler (f.eks. "Idoxuridin",

DK 163105 B

33 adenin-arabinosid etc.), antimycotiske midler (f.eks. amphoteracin B, "Natamycin", "Pimaricin", "Flueytosin", "Nystantin", "Thimerosal", "Sulfameriazin", "Thiobenda-zol", "Tolnaftat", griseofulvin etc.); antiparasitiske 5 midler (f.eks. sulfonamider, pyrimethamin, clindamycin etc.) og anti-inflammatoriske midler (f.eks. corticoste-roider såsom ACTH, hydrocortisone, prednison, medryson, Ø-methason, desamethason, fluormethalin, triamcinalon etc.).

10

Nedenstående eksempler illustrerer opfindelsen.

EKSEMPEL 1 15 Fremstiling af SPLV'er

Som forklaret tidligere omfatter den grundlæggende fremgangsmåde til fremstilling af SPLV'er, at et lipid eller en blanding af lipider opløses i et organisk opløsnings-20 middel, at en vandig fase tilsættes tillige med det materiale, der skal indkapsles, og at blandingen lydbølgebehandles. Ved en foretrukket udførelsesform fjernes opløsningsmidlet under lydbehandlingen; det organiske opløsningsmiddel kan imidlertid fjernes under eller efter 25 lydbehandling ved hjælp af en hvilken som helst inddampningsteknik. De SPLV'er, der anvendes i alle de her anførte eksempler, fremstilles som beskrevet i de følgende underafsnit (men en hvilken som helst fremgangsmåde, der giver SPLV'er, kan benyttes).

30 SPLV'er indeholdende antibiotika

Der fremstilles en 5 ml diethyletheropløsning af 100 mg lecithin. Blandingen kommes i en rundbundet kolbe. Derpå 35 pipetteres 0,3 ml af en opløsning indeholdende 100 mg streptomycinsulfat ved pH 7,4 i 5 mmol HEPES (4-[2-hy-droxyethyl]piperazino-2-ethano-sulfonsyre)/0,0725 mol 34

DK 163105 B

NaCl/0,0725 mol KC1 i en glasbeholder, der indeholder diethyletheropløsning af lipid. Blandingen behandles i en bad-lydbølgebehandlingsapparat (Laboratory Supplies Co.,

Inc.) type 10536, i flere minutter (80 KHz frekvens, 5 ydelse 80 watt), medens den tørres til en viskos pasta ved, at der ledes en blid nitrogenstrøm over den.

Til den viskose pasta, der bliver tilbage, tilsættes 10 ml 5 mmolær HEPES. Det fremkomne SPLV-præparat, der 10 indeholder streptomycin, suspenderes i pufferopløsningen, rystes i flere minutter i en hvirvelblander og befries for ikke-indkapslet streptomycin ved centrifugering ved 12.000 G i 10 minutter ved 20 °C. Den fremkomne kage suspenderes i 0,5 ml 5 mmolær HEPES.

15

Den ovenfor beskrevne procedure med undtagelse af, at der i stedet for streptomycin anvendes en af følgende: dihydrostreptomycin, gentamycinsulfat, ampicillin, tetra-cyclin-hydrochlorid og kanamycin.

20 SPLV'er indeholdende andre membranbestanddele

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde følges med undtagelse af, at der til en hvilken som helst af følgende tilsættes 25 æggelecithin: (1) phosphatidinsyre, så at der fås et molforhold på 8:2 (lecithin:dicetylphosphat); (2) stearyl- amin, så at der fås et molforhold på 8:2 (leci thin: stearylamin); cholesterol og stearylamin, så at der fås et molforhold på 7:2:1 (lecithin:cholesterol:stearyl-30 amin) og (3) phosphatidinsyre og cholesterol, så at der fås et molforhold på 7:2:1 (lecithin:phosphatidinsy re; cholesterol ).

35

DK 163105 B

35 SPLV'er indeholdende "Pilocarpin"

Fremgangsmåden beskrevet ovenfor følges med undtagelse af, at antibiotiket streptomycin erstattes med "Pilocar-5 pin".

SPLV'er fremstillet med og uden BHT

Udestilleret ether indeholder en anti-oxidant, 1 ug/ml 10 butylhydroxytoluen (BHT) med henblik på opbevaring.

Metoden beskrevet i indledningen følges, idet der som opløsningsmiddel anvendes ikke-destilleret ether for at inkorporere BHT i SPLV-præparatet.

15 Når der skal fremstilles SPLV'er uden inkorporering af BHT, følges den ovenfor beskrevne metode, idet der som opløsningsmiddel anvendes destilleret ether.

EKSEMPEL 2 20 SPLV-formidlet afgivelse in vitro I det følgende eksempel vises SPLV-formidlet afgivelse af antibiotika til makrofager i kultur.

25

Der fås peritoneale makrofager ved hjælp af peritoneal-skylning af C^^BLK voksne hanmus, og makrofagerne suspenderes i minimalt nødvendigt medium (M.E.M.) pH 7,2, indeholdende 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum. Cel- g 30 ler suspenderes med en koncentration af 1 x 10 celler pr. ml i vævsdyrkningsskåle med 96 fordybninger. Til kulturer, der indeholder sammenhængende peritoneale makrofager, tilsættes Brucella canis med koncentrationer på 1 g x 10° CUF (kolonidannende enheder) pr. ml. Efter 12 timer 35 fjernes bakterier, der ikke er opslugt af peritoneale makrofager, ved gentagen vask med M.E.M. Efter vask af peritoneale makrofagkulturer opdeles disse i 5 grupper, 36

DK 163105 B

hver indeholdende 12 replikatkulturer pr. gruppe. Gruppe 1, der er betegnet som kontroller, får ingen behandling. Gruppe 2 får vandigt streptomycinsulfat med en koncentration på 1 mg/ml. Gruppe 3 får pufferfyldte SPLV'er.

5 Gruppe 4 får vandigt streptomycinsulfat (1 mg/ml) plus i forvejen fremstillede pufferfyldte SPLV’er. Gruppe 5 får SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (1 mg/ml). Efter 24 timer fjernes det ovenpå flydende lag ved gentagen vask, og de peritoneale makrofager splittes ved gentagen 10 frysning og optøning. Serievise fortyndinger af splittede makrofager anbringes på brucella-agar, og efter 4 dage bestemmes overlevende Brucella canis ved begrænsende fortyndingstrknik. Resultaterne i tabel VII viser, at i SPLV-indesluttet streptomycin er fuldstændig effektivt 15 til aflivning og eliminering af den intracellulære Brucella canis-infektion in vitro.

20 25 1 35

, DK 163105B

Ih

<D

Dl

D

UH

O ^ t, n 'i ^

X O O O O

(0 CQ rH H rH rH

ε -P X * * *

fll P

0 Η [> ΙΟ (N

φ Λ 00 rH (S ^ O

g} ^ θ' θ' O O

S ” +i +i +i +i

Uh '“I

g Q) rH CTi 00 CO

.□ ϋ -

C CO CS CO <N

ti i ΪΗ d «

Di g

H

H

Ό d

D

X! Φ

JO

P

Q) •μ d co co co co <h o o o o

φ 0) Η Η Η H

4J C « M * * 0) (0 μ 0 co o o o

S rH H ^ CM O

H (0 ' ~ «

o H rH O O O

-H Φ +l +l +l +I

^ (rtD CSHVO CO

H S VD CO rH Ο» H rø P CO

□ m .. d d 0) P

m C^CSCON S E ^ μ H o μ d oj d y m α) m rH η in

Ρ cd ό ο D UH

P HPOJiH

m Η HI D G Φ

φ h φ Φ DO

μ o tu o e p g

ffi 3 Η -H CG Φ Φ H

Hf-; λ ^ o ‘η o με ε 3 h 0 pmdH+loe >- rH r \ O *H Ή D *P D Dl

Hg, φ UH Φ H CO -Ρ E

q s - ~ d ~ Φ G <d co o § >o μμοτοα) h

pH J d ^ Φ Φ -P Ό Dl G

Hq, A tH fe -P DlH Η ·γ] -Η II

-P m CO U D D Η P EH > d 2 ^ ojdH® v φ d •Η Π (D E wH Ό Di D P 0

m p 0 HH CO P D · H

UH ” rc).ppO|.pD3UtEp.P

Dm Η a φ Φ P -P <D D

$ ^ J δμβ<Η μμφο h

L, g uh Ρ Φ P OtDOD-P

φ Φ P-PÆMtHDOPD'Pd rr-j rr\ p QJCOdHODtDPOQ) DH φ .ΐί φΗΰΗρμο

£j n - ~ uh -P UH D Φ D O U ^ G

Cr; >0 3 Φ DD-PEHWHp O

φ m J da-P'DGEHHUHE.Sii irt ft-H -P d Q D D Φ G d

mc wO + 3(l)W+,0'pHa)-H

in .5 & HdDWDPHO

d H φ e d w c +IP p q p p ^ 5 p •POHDDO^'CQ-PPqi

Sm ΡΌ-Ρ ϋΌΌΗ-Pfci D Φ C O

H C- Φ H OH £ G HOJWH H^OlO H

h m o Η {ρ Φ EH GO CQ DHH+J & r^rSj rH UH P 0 ΟΌΦΟ ΗΗΗΦ

2 ίν o Ρ ·Ρ -P > HH 01 W h (I'D P P

. d ft H m m a j os hu :οφηφ -p

% §“ p UH Φ ft ^wH-UPH&CO

o rH *D CHHPC0 φ o Φ 0 3 P -P - C' ~

EHjidE fccJfttuCOHD Λ O

DK 163105B

38

Forsøget gentages med Brucella abortus nøjagtig som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at de peritoneale makrofager fås ved peritonealskylning af voksne albino-hunmarsvin. Resultatet ses i tabel VII ovenfor.

5 EKSEMPEL 3

Behandling af intracellulære infektioner 10 De følgende eksempler viser, hvorledes SPLV'er kan anvendes til behandling af intracellulære infektioner. De anførte data viser: (1) effektiviteten ved at anvende antibiotika indkapslet i SPLV'er til sygdomsbehandling og (2) den større effektivitet, der opnås ved at indgive 15 flere doser af SPLV-præparatet. Der beskrives en sammenligning af MLV'er og SPLV'er som bærere anvendt i protokollerne.

Brucellose er verden over årsag til økonomiske og hel-20 bredsmæssige problemer. Brucellose forårsages af Brucel-la-arter. Den angriber pattedyrearter, herunder mennesker, husdyr og en række vilde dyr. Seks Brucella-arter forårsager brucellose hos dyr; det er Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella ovis og 25 Brucella suis. Både husdyr og vilde dyr fungere som reservoirer for mulig spredning af brucellose til andre dyr og mennesker.

Sådanne infektioner kan ikke bekæmpes med antibiotika, 30 fordi den infektiøse organisme befinder sig inde i cellerne i det retikuloendoteliale system og er yderst resistente over for antibiotikas baktericide virkninger.

Den mængde antibiotika, der kræves, og behandlingens varighed resulterer enten i toksiske virkninger på dyret 35 eller en uacceptabelt høj antibiotika-koncentration i dyrets væv. En yderligere vanskelighed ved behandlingen af denne sygdom er, at behandlingen skal være fuldstændig

DK 163105 B

39 effektiv, eftersom eventuel tilbageværende infektion ganske enkelt vil brede sig, og cyclen begynder forfra.

Den økonomiske virkninge af sådanne sygdomme fremgår af millioner dollars af værdifulrt kvæg, der hvert år går 5 tabt på grund af spontan abort. Den eneste mulige vej til at bekæmpe sådanne infektiøse udbrud er karantæne og derpå nedslagtning af dyrene.

Nedenstående eksempler omfatter inkorporering af et 10 antibiotikum i SPLV'er og derpå indgivning af det indkapslede aktive stof til dyrene ved at inokulere de inficerede dyr intraperitonealt.

Virkning af en enkelt behandling af Brucella canis infek-15 tion med SPLV-indesluttet antibiotikum 80 voksme Swiss hanmus inficeres intraperitonealt (I.P.) 7 med Brucella canis ATCC 23365 (1 x 10 CUF) og deles i 8 grupper på hver 10 mus. 7 dage efter inokulering med 20 Brucella canis behandles grupperne på følgende måde: gruppe 1, der skal være kontroldyr, får ingen behandling; gruppe 2 får pufferfyldte SPLV'er (0,2 ml I.P.); gruppe 3 får vandigt streptomycinsulfat (1 mg/kg legemsvægt i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P.); gruppe 4 får vandigt 25 streptomycinsulfat (5 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P.; gruppe 5 får vandigt streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P.; gruppe 6 får SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (1 mg/kg legemsvægt) i en samlet 30 indgivelse på 0,2 ml I.P.; gruppe 7 får SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (5 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P.; og gruppe 8 får SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P. På dag 14 efter 35 inokulering med Brucella canis aflives alle dyrene, og miltene udtages aseptisk. Miltene homogeniseres of fortyndes serievis på Brucella-agar for at konstatere antal- 40

DK 163105 B

let af overlevende Brucella canis i miltene efter behandling. Resultaterne efter 4 dages inkubation ses i tabel VIII.

5 10 15 20 25 30 35

„ DK 163105 B

φ c ο •Η £ Λ (0 .Q νΟ C0 ^ μ μ ο -P ο ο ο ρ Q) rH (1) «Η «Η Η β £ - Ρ 3 α) η> χ £ ·η * * κ ο ·η J 3 ο β Β On ΙΟ Η >s in 00 Ο ο CO VO CO 6 CS Η Ο ν' · »φΟ s * k μ £ ο Ό Ρ Ο Ο Η s a H +| -Η 0) +1 +1 +1 •η co >ι i μ η ·Η +1 νΟ > £ Η (S <Ν η βμ ο £ co ο in oo Q) (0 Φ h ft **·“ ν' o IH CO I-I Η Η

M Vjj X

μ · 3 ο CQ ft Η 4-1 s U Ί* ϋ ο| Q) Ό g φ £

CO c VO

-i Φ o 3 H vo in ^

κ Φ ft C Ο Ο O

m Ό 3 X -HHHH

g ΦΗ Γ" £ « * *

m β 3 CS O in rH CO

$ Id €0 P ^ c- VO

ρ Ό £ +1 £ £ Φ φ ο H CO C; >2 C Ώ VO 0) 5 Ο O £+1+1+1 c

m Ο Φ CS Ό β P

“ l^cn * i-ι m h vo r 3 ^ ' - - & , 51

H 5 HVOlX'HMCnHH'S

3 S <ςί ft (0 03 \ 0 £ i-4 _ rr\ CO C £ 0 10 Ό (0t)<h 1-1 β β H c (0 g CO Φ φ 5 > ο e £

0 p, £ CO Φ H

3 ^ H 3 Φ £j e (0 CO 3 £ rag CO Φ Φ £ Η μ di o Ή ry £ Φ Ό ίο S η £ e φ

Il η co ο μ -'Π μ £ C0 £

(Om Φ CO W

£ C to ftp to Ο Φ ft 5$ ~ η ρ η co μ Ό <3 Β Ή ^ Ο β 5 C £ +4 (Om es (0 Ό £ φ C '03· Φ rrt Ο Ο £ β -Η <0 ft ft Ξ £ £ Η Ο £ ι co ι-ι η μ Η Ε> μ (0 Φ £ >1 α) 2 ρ -Η ϋ £ Ό *ft 3 3 £ 3 co Q3 3 μ ε ο φ ο ο m £ β £ · β Η ο £ φ u μ Q) μ X X ΌΛΟ m 3 Φ 3 <Η £ Η ·ΗΗΐηο·ρΦ£ η (0 £ ϋ H5mu.s ι_ι η) Sn £ Φ Η ·

Η D1 φ 6 ι Η Φ Q

^β£ Ηθ · μ η · ^ .5 +; ο £ Ρη φ ο co Η 3 £ Hm ΗΟ-Η+Ι j) ^ ih £ Φ ΗΟΗ+Ι £ μ β μ _ _ % ·η £ 0 ρ C- ~ £π > (0 t£ C/3 (0 £

DK 163105B

42

Virkning af flertrinsbehandling af Brucella canis-infek-tion med i SPLV-indesluttet antibiotikum

80 voksne Swiss hanmus inficeres med Brucella canis ATCC

7 5 23365 (1 x 10 CUF, I.P.) og deles i 8 grupper på hver 10 mus. 7 dage og 10 dage efter inokulering med Brucella canis behandles grupperne på følgende måde: gruppe 1, der er kontroldyr, får ingen behandling; gruppe 2 får pufferfyldte SPLV'er (0,2 ml, I.P.); gruppe 3 får vandigt 10 streptomycinsulfat (1 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P.); gruppe 4 får vandigt streptomycinsulfat (5 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml I.P.; gruppe 5 får vandigt streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml 15 I.P.; gruppe 6 for SPLV'er indeholdende streptomycinsul fat (1 ml/kg legemsvægt) i en samlet indgivelse på 0,2 ml X.P.; gruppe 7 får SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (5 mg/kg legemsvægt) I.P.; og gruppe 8 får SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt) i 20 en samlet indgivelse på 0,2 ml, I.P. På dag 14 efter inokulering med Brucella canis aflives alle dyrene, og miltene udtages aseptisk. Miltene homogeniseres og fortyndes serievis på Brucella-agar for at bestemme antallet af overlevende Brucella canis i miltene efter behandling.

25 Resultaterne efter 4 dages inkubation vises i fig. 5.

Resultaterne af forskellige to-trins behandlingsskemaer på Brucella canis-infektioner in vivo, der ses i fig. 5, viser, at i grupper, der får vandigt streptomycin 7 og 10 30 dage efter-inokulering, blev iagttaget meget lille reduktion af overlevende Brucella canis i miltene. Kun grupper, der får i SPLV-indesluttet streptomycin i koncentrationer på 10 mg/kg legemsvægt indgivet dag 7 og dag 10 efter inokulering, viser at alle levedygtige bakterier 35 er elimineret fra miltene på inficerede dyr.

43

DK 163105 B

Foruden det ovenfor eksperiment prøves forskelligt væv fra med Brucella canis-inficerede mus efter to behandlinger med i SPLV-indesluttet streptomycin på følgende måde: 5

30 voksne Swiss hanmus inokuleres med Brucella canis ATCC

7 23365 (1 x 10 CFU; I.p.). 7 dage efter inokulering opdeles dyrene i 3 grupper på hver 10 mus. Gruppe 1, der er kontroldyr, får ingen behandling; gruppe 2 får (på dag 7 10 og 10 efter inokulering) vandigt streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt) i hver indgivelse på 0,2 ml I.P.; gruppe 3 får (på dag 7 og 10 efter inokulering ) SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt) i hver indgivelse på 0,2 ml, I.P. På dag 14-75 efter 15 inokulering med Brucella canis aflives alle dyrene, og følgende organer fjernes aseptisk, homogeniseres og fortyndes serievis på Brucella-agar til isolering af Brucella canis: hjerte, lunger, milt, lever, nyrer, teks-tikler. Efter 4 dages inkubation er resultaterne af 20 overlevende Brucella canis pr. organ som vist i fig. 6.

Resultaterne af prøvning af forskellige slags væv fra mus inficeret med Brucella canis efter skemaer med to behandlinger med streptomycin, der ses i fig. 6, viser, 25 at i dyr behandlet med i SPLV indesluttet streptomycin var alle vævsprøver fra 14 -75 dage efter inokulering med Brucella canis fuldstændig fri for nogen som helst levedygtige Brucella canis-organismer. Hos dyr, der er ubehandlede eller behandlede med vandigt streptomycin i 30 koncentrationer og med indgivelser, der er identiske med dem, der gjaldt for i SPLV-indesluttet streptomycin, kan der isoleres levedygtige Brucella canis-organismer i alle vævsprøver fra 14-75 dage efter inokulering med Brucella canis.

35 44

DK 163105B

Behandlingseffektivitet med MLV'er sammenlignet med SPLV'er

15 voskne Swiss hanmus inokuleres med Brucella canis ATCC

7 5 23365 (1 x 10 CUF, I.P.)· 7 dage efter inokulering deles dyrene i 3 grupper på hver 5 mus. Gruppe 1, der er kontroldyr, får ingen behandling; gruppe 2 får (på dag 7 og 10 efter inokulering) MLV'er indeholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt, I.P.). Der fremstilles 10 MLV'er ved gængs teknik, idet der anvendes 100 mg ægge-phosphatidylcholin (EPC) og 2 ml steril HEPES indeholdende streptomycinsulfat (100 mg/ml). Forholdet mellem lipid og streptomycinsulfat i de 2 ml MLV-slutsuspension er 100 mg EPC til 28 mg streptomycinsulfat; gruppe 3 får 15 (på dag 7 og 10 efter inokulering) SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg legemsvægt, I.P.) fremstillet som beskrevet i afsnit 6.1. med følgende modifikationer: Der anvendes 100 mg EPC og 0,3 ml HEPES indeholdende 100 mg streptomycinsulfat. Forholdet mellem lipidet og 20 streptomycinsulfat i SPLV'er er 100 mg EPC til 28 mg streptomycinsulfat i en 2 ml slutsuspension. På dag 14 efter inokulering med Brucella canis aflives alle dyrene, og miltene fjernes aseptisk, homogeniseres og fortyndes serievis på Brucella-agar til isolation af Brucella 25 canis. Resultaterne med hensyn til overlevende Brucella canis pr. organ efter 4 dages inkubation er vist i tabel IX. 1 35

Tabel IX

45

DK 163105 B

Sammenligning af MLV'er og SPLV'er indeholdende streptomycinsulfat med hensyn til udryddelse af Brucella canis a \ 5 in vivo efter 2 behandlinger

Koloni-dannende enheder u \

Brucella canis pr. milt0' 10 -

Kontroldyr 2,7 + 1,0 x 104 MLV'erC) 1,8 + 0,4 x 104 15 SPLV'er0J 0 a) Intraperitoneale injektioner, 10 mg/kg legemsvægt, med 20 3 dages mellemrum. Kontroldyr får ingen behandling.

b) Overlevende Brucella canis bestemmes som antallet af CUF isoleret pr. milt og udtrykkes som middelværdi + S.D. for 5 dyr pr. gruppe (duplikatmålinger pr. dyr).

25 c) Æggephosphatidylcholin:streptomycin-forhold er 100 mg lipid:28 mg streptomycinsulfat.

30 Virkning af forskellige SPLV-indesluttede antibiotika på behandling af infektion 1 voksne Swiss hanmus inokuleres med MLV ATCC 23365 (1 x 7 10 CUF; I.P.). 7 dage efter inokulering deles dyrene i 35 10 grupper på hver 5 mus. Gruppe 1, der er kontroldyr, får ingen behandling, gruppe 2 får pufferfyldte SPLV'er (0,2 ml I.P.b på dag 7 og 10 efter inokulering, grupperne 46

DK 163105 B

3, 4, 5 og 6 får vandige injektioner (0,2 ml I.P.) af dihydrostreptomycin, gentamycin, kanamycin eller streptomycin, 10 ml/legemsvægt I.P. på dag 7 og 10 efter inoku-lering (N.B. hvert af disse antibiotika har vist sig at 5 udrydde Brucella canis in vitro). Grupperne 7, 8, 9 og 10 får SPLV'er indeholdende dihydrostreptomycin, gentamycin, kanamycin eller streptomycin med 10 mg/kg legemsvægt på dag 7 og 10 efter inokulering. På dag 14 efter inoku-lering med Brucella canis aflives alle dyrene, og miltene 10 udtages aseptisk, homogeniseres og fortyndes serievis på Brucella-agar til isolering af Brucella canis. Resultaterne med hensyn til overlevende Brucella canis pr. organ efter 4 dages inkubation ses i tabel X.

15 20 25 1 35

Tabel X

47

DK 163105 B

Sammenligning af forskellige antibiotika med hensyn til udryddelse af Brucella canis in vivo efter 2 behandlin-5 ger1 2 3

Kolonidannende enheder B. canis pr. milt*3^ 10 -

Vandige I SPLV indeslutopløsninger tet antibiotikum

Ubehandlet 3,93+l,5xl06 4,66+0,87xl06 c) 15 Antibiotikum 5

Dihydrostreptomycin 1,13+0,30x10 0 5

Gentamycin 7,06+2,53x10 0 5

Kanamycin 2,72+0,91x10 0 5 20 Streptomycin 1,01+0,17x10 0 35

Intraperitoneale behandlinger, 10 mg/kg legemsvægt, med 25 2

Overlevende Brucella canis pr. organ bestemmes som antal CFU isoleret pr. milt og udtrykkes som middelværdien +S.D. for 5 dyr pr. gruppe (duplikatmålinger pr. dyr).

30 3

Antibiotika, der kan udrydde Brucella canis i suspensionskultur.

48

DK 163105 B

Resultaterne af forsøg med forskellige antibiotika på Brucella canis-inficerede mus i tabel X viser, at antibiotika, der er effektive med hensyn til udryddelse af Brucella canis in vitro (dvs. i suspensionskultur) også 5 er effektive til udryddelse af Brucella canis-infektion in vivo, men kun når de er indkapslet i SPLV'er. Dyr, der får enten vandige antibiotika, pufferfyldte SPLV'er eller ingen behandling, er i intet tilfælde uden overlevende Brucella canis i isoleret miltvæv.

10

Behandling af Brucella canis inficerede hunde

Voksne Beaglehunhunde inokuleres med Brucella canis ATCC 7 23365 /1 x 10 CFU) oralt og vaginalt. 7 dage efter 15 inokulation deles hundene i 3 grupper. Gruppe 1, der er kontroldyr, får ingen behandling; gruppe 2 får (på dag 7 og 10 efter inokulation) vandig streptomycinsulfat med 10 mg/kg legemsvægt (hver indgivelse er på 5,0 ml I.P.).

Gruppe 3 får (på dag 7 og 10 efter inokulation) SPLV'er 20 indeholdende streptomycinsulfat med 10 mg/kg legemsvægt (hver indgivelse er på 3,0 ml, I.P.). Vaginale vatpinde-prøver fra hunde og hepariniserede blodprøver tages med regelmæssige mellemrum før, under og ved forsøgets afslutning. Disse dyrkes på Brucella-agar for at isolere 25 Brucella canis. Resultaterne ses i tabel XI. Der tages serumprøver før, under og ved forsøgets afslutning til bestemmelse af serum antistof over for Brucella canis.

Også disse resultater er vist i tabel XI. 1 35

. DK 163105B

φ > Ο + + Ο Ο Ο W Η •Η ·Η Η +J 4>- D -Ρ _ 0) <1X3 (0 'Ο +» η d ο ft g μ ω -η ρ) ε to a ο ω ο + + οοο . -ρ _ χ (0 * λ ·η ο> Ρ Μ g (1) Ό Ο Η g Η t η a q α ί S ρ 3 1(1)2 023 ΟΟΟ^ΦΦ > Ρ t, » Η 0 fcco £ <£ α> w W Ρ Ρ 4J *0

•Η Κ 022 ΟΟΟ g ij * S

r* S Ό = Q)

Φ g P -P

n ft 8 S Q)

U S > Q) P

Λ 03 -P P

rri , (D CO &

H ^ <D -P

® <° X& W

2 > oo+ oo+ ^ Mg)

c Ό CuX C

m — Ρ -Η X -H

“o ffi 0 -H C

O d > Q) = W

φ -Η P xj * A

g om o + + + o + φ p > di · c *L x d o) °<o d h jj g ^ <D d βιΉ 0) O 0 0) H *·

u -P p h H) i ΐ -P

ω α pp aQ)-PC5P

0 Φ 2 022 O O 03 -P w ω + iO ffi jj u o -ΗΛ £ > 2 ΰ φ > .· α) co cj co p g ρ λ ε .¾ ^-2 CO · Φ n Q Q £< ID CldMJ) ® K 022 OOH o c h 0) (0 c __

«V «ri c, Οι -Ρ Η ·Η v CD

2 R ft W «Η Η -Ρ M

* Λ S d «ρ φ p di·^ (ri .5 o oioæro 2 ζ ·Η013Ή>£ UJ > -P -H P w

• <0 «Π CQ P £ O

u ~ p d α) >1 (Uh H ® OP ΟΗΟΌ O) 5 > +j +j «η an <d ·ρ S § -r| 3 > 0 H (0 U i> 0++ + + + Ρ·ΡΗ·ίθ^ΝΡ(Ρ

S, a aapPOiH

a “ o> oi d d * o rn ®P (d d+> ΟΝ!» £ rH i α) H 2 Di d η -g <d co oi d ε -h Λ |n o + + oo + °c e “JH0 0*H0 Qi C •I kJ ^ "jf H j v qq 5<do entd oi a UH] g 022 O O 03 7^ d 0) ® Qj ®

S? 2} <D Λ ·- > Ό P

d 5>o>® ~~p d +J

»S ? 5 ►> 5 5 M

°.g «.c ry qq in ®II 0X010 ·σ ft § 022 oo « 1 dwOHPfi £ S h tfo (0 om® 3 3 ·ρ jd d ‘w Ό RT, ^ .v^ o ρ Prj

Lo ^®0)3d30 riJ cm ^10-P+J(1)WX3 d ·α°+)^Η Did φ _1 fri)| »ri OHftC3dP^ m4-> d h «(Odii-POd

φ c -H 'D dlw ϋ I Ό >h*H

Ρ Ρ·ΗΌ (0 -PdCDiPHOP

<Do3 odd d Λ nrlfS’00 o,-0 i_ijj jjoioio o) 20ii(0'—' a- x (0Ό ‘W-HO xiocs·^ Λ ω O H ^ ‘!i N ^ 5

«μ® Φ-p . © , HCS

_i _j c -^CD-Q U

Φ3Ε(1)Φ α) 2 KJ S CO P U CD CD

XI CO P D)‘Η Ό Ρ Ρ> _ (OCDdiodo)·© ^ C· Cn 01 ^ Ρ Ρ E fa W ® 50

DK 163105 B

21 dage efter inokulering med Brucella canis aflives hundene. Følgende væv fjernes aseptisk, homogeniseres og fortyndes serievis på Brucella-agar til isolering af Brucella canis: hepariniseret blod, vaginal-eksudat, 5 lunger, milt, ledvæske, uterus, ovarier, knælymfekirtler, spytkirtler, tonsiller, mediastinal lymfekirtler, mesen-teriske lymfekirtler, knoglemarv, overfladiske cervicale lymfekirtler og axillære lymfekirtler. Resultaterne med hensyn til overlevende Brucella canis pr. væv efter 4 10 dages inkubation ses i tabel XII.

15 20 25 1 35

Tabel XII

DK 163105B

51

Resultater af kultur af vævsprøver fra B. canis-inficere- de hunde, der har fået en antibiotikumkur med 2 behand- , . å) 5 linger SPLV'er med Strepto- h) C\ ø) Væv J streptomycin 1 mycin Kontrol 10 -—-

Helt blod 0 + +

Vaginaludskrab 0 + +

Lunger 0 + +

Milt 0 + + 15 Ledvæske N.D. 0 0

Uterus 0 + +

Ovarier 0 + +

Knælymfekirtler N.D. + +

Spytkirtler 000 20 Tonsiller 0 + +

Mediastinalelymfekirtler 0 N.D. 0

Mesenteriske lymfekirtler N.D. 0 0

Knoglemarv 0 +

Overfladiske cervicale 25 lymfekritler N.D. N.D. +

Axillære lymfekirtler 0 + + 1 2 3 4 5

Dyr behandlet på dag 7 og 10 efter infektion.

2

Prøver taget ved obduktion fortyndes serievis på 30 Brucella-agar; + = lig med eller højere end 1 CFU; 0 = ingen kolonier.

3 SPLVer indeholdende streptomycinsulfat, 10 mg/kg legemsvægt, I.P.

4

Streptomycinsulfat (vandigt), 10 mg/kg legemsvægt, 35 Ι·Ρ· 5

Kontroldyr får ingen behandling.

DK 163105 B

52

Resultaterne af dyrknings-og serologiske prøver af hunde inficeret med Brucella canis før, under og ved to-trins antibiotikumindgivelse ses i tabel XI. Alle dyrene er serologisk negative over for tidligere at have været 5 udsat for Brucella canis, således som det måles ved hjælp af negative serum titere, og er dyrkningsnegative med hensyn til blodkulturer og kulturer af vaginalpodninger.

Alle dyrene ses at være dyrkningspositive med hensyn til både blod- og vaginal kultur før behandlingerne på dag 7 10 og 10. Hunde, der behandles med vandigt streptomycin, eller hunde, der ikke får nogen behandling, forbliver dyrkningspositive med hensyn til blod- og vaginalkultur under efterbehandlingsperioder før afslutningen på dag 21. Gruppe 3, der får liposomer indeholdende streptomy-15 cin, bliver dyrkningsnegative på dag 1 efter første behandling og forbliver negative under hele efterbehandlingsperioden. Hunde, der ikke får behandling eller vandigt streptomycin, udvikler påviselige serumtitere over for Brucella canis-antigener ved dag 21 efter 20 inokulation, medens de, der behandles med SPLV'er indeholdende antibiotika på dag 7 og 10 efter inokulation, ikke udviser noget påviseligt antistof over for Brucella canis antigen. 1 2 3 4 5 6

Resultaterne fra isolation af Brucella canis fra 2 inficerede hunde, der er behandlet med en to-trins 3 antibiotikumindgivelse, som ses i tabel XII, viser, at 4 hos hunde er behandling med SPLV’er indeholdende strep 5 tomycin den eneste effektive behandling til eliminering 6 af alle levedygtige Brucella canis i alt væv fra alle organprøver.

Behandling af Brucella abortus hos marsvin

35 15 voksne hunmarsvin inokuleres med Brucella abortus ATCC

23451 (lx 107 CFU, I.P.). 7 dage efter inokulation deles dyrene i 3 grupper på hver 5 dyr. Gruppe 1, der er

DK 163105 B

53 kontroldyr, får ingen behandling. Gruppe 2 får vandigt streptomycinsulfat, I.P.-injektioner (0,2 ml) med 10 mg/kg legemsvægt på dag 7 og 10 efter inokulation med Brucella abortus. Gruppe 3 får SPLV'er indeholdende 5 streptomycinsulfat som I.P.-injektioner (0,2 ml) med 10 mg/kg legemsvægt på dag 7 og 10 efter inokulation med Brucella abortus. På dag 14 efter inokulation med Brucella abortus aflives alle dyrene, miltene fjernes aseptisk, homogeniseres og fortyndes serievis på Brucel-10 la-agar til isolering af Brucella abortus. Resultatet med hensyn til overlevende Brucella abortus pr. milt efter 4 dages inkubation ses i fig. 7. Kun SPLV'er indeholdende streptomycin er effektive til eliminering af Brucella abortus i marsvinemilt. Hos dyr, der får vandigt strepto-15 mycin eller ingen behandling, påvises levedygtige Brucella abortus-bakterier.

Behandling af Brucella abortus-infektion hos køer 20 9 svært inficerede dyr benyttes til dette forsøg. Brucel la abortus-bakterier isoleret fra mælk og vaginaludskrab bliver og forbliver negative i 6 uger efter behandling med SPLV'er indeholdelse streptomycin. Når der igen kommer infektion hos disse dyr, findes der kun bakterie-25 isolationer i fjerdedele af yveret, der er positive før behandling. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 krydsninger (Herford/Jersey/Brangus), 22 måneder gamle, 2 ikke-drægtige køer, der er bekræftet positive over for 3 30 Brucella abortus-kultur, anvendes. Mindst 4 måneder før 4 påbegyndelsen af undersøgelse udsættes dyrene eksperimen- 5 7 6 telt perkonjunctivum med 1 x 10 CFU Brucella abortus 7 under midten af drægtighed, hvilket resulterer i abort 8 og/eller Brucella abortus-kultur-positive mælke- ellr 9 35 uterine sekretioner og/eller fostervæv.

DK 163105 B

54 Køerne holdes i individuelle isolationsstalde og deles i 3 grupper. Behandlingen består af en kur med to doser med 3 dages mellemrum, som følger: (1) 3 køer injiceres intraperitonealt med fysiologisk saltvandsopløsning. (2) 5 2 køer injiceres intraperitonealt med vandigt antibioti kum (streptomycin med 10 mg/kg legemsvægt) plus forud fremstillede pufferfyldte SPLV'er. (3) køer injiceres intraperitonealt med SPLV-indkapslet streptomycin (10 mg/kg legemsvægt). Set samlede volumen pr. injektion er 10 100 ml pr. dyr.

Under de første 2 måneder foretages dobbelte bakteriologiske kulturer af mælke- og uterine sekretioner hver uge, forudsat at der kan fås sekreter. Derpå aflives alle 15 køer med en overdosis af natriumpentabarbitol, og følgende indsamles i to eksemplarer med henblik på bakteriologisk dyrkning: (1) lymfekirtler:venstre og højre cetal, venstre og højre suprapharyngeaie, venstre og højre mandibulare, venstre og højre parotide, venstre og højre 20 præcapulare, venstre og højre præfemorale, venstre og højre axilære, venstre og højre popliteale, venstre og højre interne ileale, venstre og højre supramammilære, venstre og højre renale, bronchiale, mediastinale, mesenteriske og hepatiske; (2) kirtler: alle fire fjerde-25 dele i brystkirtlen, venstre og højre binyre og thymus (hvis den forekommer); (3) organer og andet væv: milt, lever, venstre og højre uterushom, vervix, vaginal, nyrer og tonsiller. 1 2 3 4 5 6

Efter obduktion fryses alle væv og holdes ved -70 °C

2 under transport. Vævene optøet, afbrændes med alkohol og 3 trimmes aseptisk før vejning. Når først vægten er noteret 4 (0,2-1,0 g) homogeniseres vævet i 1 ml steril saltvands 5 opløsning og fortyndes serievis med steril saltvandsop- 6 løsning til 1:10~10 af den oprindelige homogenatsuspen-sion. Alikvote mængder (20 nl) af hver fotyndning fra serievise suspensioner udstryges på Brucella-agar og 55

DK 163105 B

anbringes til inkubation ved 37 °C. Der foretages dobbelte bestemmelse for hver vævstype.

Agaren undersøges hver dag, og der gives points med hen-5 syn til bakterievækst. Alle kolonier, der fremkommer før 3 dages forløb, isoleres, overføres og gramfarves til bestemmelse af identitet. På dag 5, 6 og 7 under inkubation tælles kolonier med morfologi, vækst og gramfarvning, der stemmer med Brucella abortus; CFU pr.

10 gram væv bestemmes derpå. Repræsentative kolonier overføres atter med henblik på bakteriebeskæftelse for Brucella abortus.

Der foretages bakteriologiske isolationer på alle vævs-15 prøver og mængdebestemmelse af bakterier pr. gram væv foretages. Resultaterne fra fire dyr - 1 placebokontrol og 3 dyr behandlet med SPLV-indkapslet streptomycin - er anført i tabel XIII.

20 25 1 35

Tabel XIII

DK 163105B

56

Resultaterne af kulturer af vævsprøver fra Brucella abortus inficerede køer

Uoehandx. SPLV-indkapslet streptomyci ^ Væv_kontrol_1_2_3___

Binyre venstre 0 0 ϋ 0

Binyre højre ++ v 0 +

Cefal lymfekirtel h -r+ τ 0 +

Cefal lymfekirtel v 0 00+

Axillær iymfekirtel h i-++ u + 0 axiilær lymfekirtel v ++ 0-0 0

Bronchial lymfekirtel 0 0 0 u

Cervix 0 000 nepatisk lymfekirtel t++t 0 0 u 15

Uterushorn venstre 0 00+

Uterushorn højre 0 000

Int. ileal lymfekirtel h ++ 000

Int. ileal lymfekirtel v ++++ 0+0

Nyre U 0 0 u 70

Lever U 0 0 o

Lunge 0 0 0_ 0

Mammillær kirtel venstre for 0 + _ + g " " venstre bag 0 0 0 + ” ’* nøjre for ++ 0 0 u ?5 højre bag ++ 0 0 u

Mandibular lymfekirtel h +++ 0 0 0

Mandibular lymfekirtel y +++ 0 0 U

Mediastinal lymfekirtel ++ 0 h- q

Mesenterisk lymfekirtel +++ < ø g 30 «respvclymfekirtel v ++r 0 g ·; øreSDytlymfekirtel h +++ 0 0 g

Knælymfekirtel v + Π ø g

Knælvmfek irtol h + i ; 0

Præiemoral ivmiekirtel + ~ Q

35

Præscaoular Ivm.foKirtel v u 0 0 τ

Præscaouiar ivmiekirtel h +++i- n 0

DK 163105B

Tabel XIII (fortsat) 57

Ubehandl. SPLV-indkapsiet streptomycin Væv____ kontrol_i_2___3_

Renal lymfekirtel u 0 0 o 5 Mi it +τ+ 0 u 0

Supramammiilær lk, højre +++ +00

Supramammillær lk, venstre 0 0 0 0

Suprapharangeal lk, venstre + 000

Suprapharangeal lk, højre 0 000 20 Tnymus 0 0 0 0 vagrna +++ 000 0 Ingen påviselige bakterier ved dyrkning af 0,3-1 gram væv.

+ mindre end 200 kolonier/gram væv 25 ++ mere end 30u kolonier/gram +++ mere end i000 koionier/gram ++++ mere end 100.000 kolonier/gram.

20 1 35 > 30

DK 163105 B

58

Eksempel 4; Behandling af øjenlidelser

Bakterielle og lignende infektioner samt mange andre lidelser i øjet er anledning til verdensomspændende 5 økonomiske og sundhedsmæssige problemer, der, dersom de ikke behandles eller behandles forkert, fører til tab af synet og eventuelt død på grund af sepsis. Bakterieinfektioner i Øjet hos dyr og mennesker vides at kunne forårsages af mange forskellige slags bakterier, her-10 under, men ikke begrænset til: Clostridium-arter, Coryne-bacterium-arter, Leptospira-arter, Moraxella-arter, Mycobacterium- arter, Neisseria-arter, Propionibacterium-arter, Proteus-arter, Pseudomonas-arter, Serracia-arter, Escherionia coli-arter, Staphylococcus-arter, Strepto-15 coccus-arter og bakterielignende orgaismer, herunder

Mycoplasma-arter og Mickettsia-arter. Både dyr og mennesker fungerer som opholdssteder for potentiel spredning af infektiøse bakterier indbyrdes. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Sådanne bakterille infektioner kan ikke behandles med 2 antibiotika uden langvarige og besværlige behandlings 3 kure, der resulterer i enten hyppige, helt op til hvert 4 20. minut hos mennesker med visse infektioner, eller 5 uacceptabelt høje koncentrationer af antibiotikum i væve- 6 ne. Løbende behandlingsmetoder er vanskelige af mange 7 andre grunde. Den infektiøse organisme i øjets over 8 fladevæv er i nogle tilfælde yderst resistent over for 9 antibiotikas baktericide virkning, og topisk indgivelse 10 af antibiotika kan resultere i, at præparatet hurtigt 11 fjernes fra øjenhulen, hviket giver varierende kontakt 12 tider. Som en almindelig regel skal behandling af øjen 13 infektioner være fuldstændig effektiv, fordi eventuelt 14 tilbageværende infektion simpelthen atter inficerer gen 15 nem tåresekretionen, og cyklus begynder forfra. Endvidere 16 kan i mange tilfælde de præparatkoncentrationer, der er nødvendige for at eliminere infektionen, forårsage en nedsættelse af synet og i visse tilfælde resultere i

DK 163105 B

59 total blindhed. Den økonomiske virkning af sådanne sygdomme hos husdyr fremgår af de millioner af dollars, der hvert år går tabt, fordi den eneste mulige måde at bekæmpe sådanne infektiøse sygdomme på er længerevarende 5 terapi og karantæne.

De følgende forsøg bedømmer effektiviteten af behandling, hvorved der anvendes frit antibiotikum i glycerim i sammenligning med antibiotikum indesluttet i SPLV'er til 10 M. bovis-infektioner i øjet.

M. bovis bevirker infektiøs keratoconjunctivitis (røde øjne) hos kvæg. Denne lidelse er kendetegnet ved blepha-rospasme, tåreflod, conjunctivities og varierende grader 15 af corneal uklarhed samt sårdannelse. Voksne køer kan udvikle let feber med let nedsat appetit og nedsat mælkeproduktion. Selv om en række antibiotika er effektive over for moraxella bovis, skal de indgives og gentages ofte ved topisk påføring eller subkonjunktival 20 injektion.

Ifølge de her anførte eksempler forlænges det terapeutiske stofs effektivitet og virkningsvarighed. Det er overraskende, at dette system er effektivt med kun en 25 eller to indgivelser, da sådanne infektioner ikke reagerer på enkel ordinær behandling med antibiotika. De sædvanlige behandlinger efterlader ofte små blivende infektioner, der igen inficerer øjet, så at den infektiøse cyklus begynder forfra, medmindre infektionen helt 30 udryddes ved talrige gentagelser af behandlingen.

Behandling af infektiøse keratoconjunctivis hos mus 160 sorte C57-mus deles i 8 grupper. Den ene halvdel af 35 hver gruppe udsættes for U.V.-bestråling i hvert øje (for at skabe corneale læsioner). Alle dyrene inokuleres derpå med Moraxella bovis, der inddryppes i det højre øje med 60

DK 163105 B

koncentrationer på 1 x 10^ bakterier pr. øje. 24 timer efter inokulation bedømmes alle dyrene med hensyn til graden af corneal uklarhed. De 8 grupper behandles med topisk påføring af følgende i hvert øje: grupperne 1 og 2 5 får 10 til SPLV- indesluttet streptomycin (30 mg/ml); grupperne 3 og 4 får 10 ni streptomycin (100 mg/ml); grupperne 5 og 6 får 10 dl pufferfyldte SPLV'er suspenderet i vandigt streptomycin (100 mg/ml), og grupperne 7 og 8 får 10 dl steril saltvandsopløsning (NB! det ikke-10 inficerede venstre øje behandles med samme topiske opløsninger for at finde ud af, om SPLV'er irriterer øjet; der iagttages ingen irritation). En gang daglig bedømmes dyrene med hensyn til fremskridt eller regression af de corneale læsioner, og på dag 3, 5 og 7 efter behandling 15 podes det højre øje, og der foretages isolationer med hensyn til M. bovis på repræsentative dyr. M. bovis-kolo-nier bestemmes ved hjælp af kolonimorfologi og reaktivitet over for fluorescerende mærket antistof over for M. bovis-pili. Resultaterne, der ses i tabel XIV, viser, at 20 kun SPLV-indesluttet streptomycin er effektivt til at udrydde infektionen.

25 1 35

„ 0 „ DK 163105 B

•S - S’ s d > «0 Ή ^ Η η βίο in in in in mm in in 0) u c in w \ \ ^ \ \ \ 4-> Ό

. 0(0 ^ cs co o in co o <D

S +> Λ ft " HQ) {§ •0 3Λ m 00 8 ^ ” to 3 2 « μ ρ p m m in in in in in in d ¢) g g? ” » « o ™ m o 2 s 0 Λ (0

•H Q) rH

μ · d) ^ A! . 2 β .3 3 (DO Γ «Η η «Η 5 5 · S . 0 S so •s * m u o o ο o o 00¾ <2 iC ~ β e λ w -o d Ό a) 11

d p β CO OO Ο O NHCOOW

α) γΛ A m N

1 dlo 8 Ρ ΟΛΧ CS OO Η Ο HM ’'l* O > 0 W <N β 3 ,¾ β

£) a H

to ·β h K en *W Oj Μ Λ ΛΛΛΛ/\.η ΙΓΑ · 4J Q)0)HO3C^HO 00 00 N H W H ^ •H (1) *P C 1 (0 λ) > a«w h ft s -2, p DiW 0 5 i?

p 00 00 co co O O^HCn ft S

H Ο Ρ O HH H CS HH Η H £ .

^ £ 01 -Η , β M

5, . p «Η β D) T? h <0 c „

§ a _ <*0000 M<ONCOc C

ο μ Λ ra p ° >( p 0 ΟΠ3 g ^ H g* 2 ΗΛΟΟΗΟΟΟ O'f' O I " 0 β Η Η P HHÆ * φ S SS* <s OH H o in cn in in β o jjj |j η β ε ^ β ti ” P Λ H C β O D> •s w β βπ ft 3 ε P s C Η CO Η M CO ^ ^ 00 H .^ £ O 'ft q c ft jj (j p *.

* 8 Η β 3 0 H

ih moo > c- po o o ωπ j§P ~

β O HH H rH å 0 ft II H

JJ o Λ 01 w ϋ ^ 5 β H , o

ft d P 1-1 v H

d H l-l -o d β β c w—Scii - β β I e e g g 5 3 Π - ·Η ρ—' Ο *· Η Ρ-' β 0 Μ 2 i d > ο 30 ω d > ο 3ϋ β ω ft η ηΐ ρ Η &Η d 3 Η J ΝΗ C β ·0 Η Ο β ο β ϋ Λ 6 ffl Ή ε 0 S W Η ΜΟ βϋ ^ Λ -6 &ωοοο ^“οω^Ήβε -Η (μ η) S Ρ Ό >ι β ε 4-> Ό >1 Η J? ^ « Η OOJO-dE Ό OOJftCS ® β *2 10 ο<0 ΡΡβΗΟ β Ρ Ρ β Ή 0 OlO flfl d

U ISno.SS +SHhQ.'dh+JCWgg-H

g I s ^e*s88· t esusss· is g« s

x S3 ϋ ·38Ή+.>ϋ m οϊΪ4>>ί t§ -Sh S

J ' » S gj-gsg· &a 2¾ δ o mm X d-H4-iPWP 1 ΟΗ<Η»ΗΐΟ·μ g SS H Sfc!lS+HP o §feS + HP lo Λ o 62

DK 163105 B

Behandling af kanin-conj unctiva med i SPLV-indesluttet antibiotikum M. bovis, ATCC stamme 10900, fortyndes til en koncentra- 7 5 tion på 1 x 10 celler pr. ml steril saltvandsopløsning (0,85% NaCl). Alikvote mængder (0,1 ml) bakterielle suspensioner inokuleres topisk i øjnene på 10 voksne hunkaniner. Prøver til dyrkning tages hver dag ved podning af conjunctivae og udstryges på blodagarplader 10 til isolering af M. bovis. 3 dage efter inokulation deles kaninerne i 3 grupper: 2 dyr (kontroldyr) får ingen behandling; 4 dyr får streptomycin i steril saltvandsopløsning (koncentration 10 mg/kg legemsvægt), og 4 dyr får i SPLV-indesluttet streptomycin i en steril saltvandsop-15 løsning (koncentration 10 mg streptomycin/kg legemsvægt).

Alle opløsninger indgives topisk i hvert øje. Efter 24 timer genoptages podning af conjunctivae på alle kaniner og fortsættes dagligt i 7 dage. Resultaterne af isolering med hensyn til M. bovis på blodagarplader ses i tabel XV.

20 25 1 35

„ * . DK 163105 B

ω co 4 S c^ ++ + + + + οοοο o ~ ό -η

g °» SJ

d -rlvD ++ + + + + ΟΟΟΟ u g 1 ή a ® 2 (0 .μ Ο) ω £ ιη +++ + + + ΟΟΟΟ 'Η * i 3g 21 U , -Η 0 aw ++ ++++ οοοο κ> “ Λ 0 Ή £ °* S’ £ <0 Η W Ο β Η Ο ϊ| „+++ + + ++ + + + ® g

. 2¾ «·5 S

s ΰ 5 eg· 3 d n o O * Μ μ Φ -o

Qj i (D (0 o S CO +> 0)° §

•Η +1 m S

o o Φ ¥> £ £ $ ·° g, H H aj . Λ S . « ΰδ S 5> ” a 2q «“ * a h

d ft +> C -H

5 · H CQ ^ H h h o) © ω v o) ^ d in m -H £3 0< w

«η C « O

α D) o -Η Ή to -H

μ dN ++ +o++ 0+++ go X c ~ 3 I H > O) -_4 c CD · ft μ s CO 0) 5 -,-ι S O H >

Ό +5 2 > μ « W

da o d w ε (1) S λ ft CQ Φ HOO OOOOOOOO ϋ -Η H D)

(0 S g H O l-l H

> gr a £3 0) •H e (ϋΰ Bl «I s§ s " ίΐ §1 g«. B * Ϊ o μ o

Od g Oi H

* tf U ^ « IS - cg £. £ o o > c μ ·& od H I a

g “ ιΗ HN H <N C*W HNCO^f 'S O K O O

Λ i i frt i \ O* iQ

•I g S d 3 ! e| e ^ s c 3 4 o -μ h +>

3 5 O H o A CO

Li 5 ‘H +) i-l 3d o o μ H 4. μ U H H o o j e O O w μ «ft +" s- % - d

•H rn O 'O'-'OdO

^ /-v +^ O + fi ·Η i-l

IH ϋ Ό μο -O ^ -H O CO

Φ d 5 H-H UtOM&'O

ud o co o o 3 t* o c

> 2Φ & e& SS 10 S. V

£ d μ ho co μ o o > Γ-CH-H ft2 ft d a 3 Ο Η μ ft

φ 33 ft μ O >0 «O < CO CO

fl M C C C tø 4* 4 ^ ^ S S g o £ ω ω« ΟΛΌΦ

DK 163105B

64

Behandling af keratoconjunctivitis, der stammer fra sub-cutane infektioner M. bovis, ATCC stamme 10900, fortyndes til en koncentra- 7 5 tion på 1 x 10 celler pr. ml i steril saltvandsopløsning. Alikvote mængder (0,1 ml) af bakterie-suspensioner inokuleres i øjnene på voksne kaniner, der tidligere er beskrevet inficeret som beskrevet i afsnit 9.2. og ikke behandlet med SPLV'er. Højreøjet på alle 9 kaniner 10 inokuleres med 0,1 ml M. bovis suckutant i konjuncti-valvæv og i venstreøjet på alle kaniner inokuleres med 0,1 ml M. bovis topisk. Kulturer tages daglig fra con-junctivae på begge øjne fra alle kaninerne og udstryges på blodagarplader til isolering af M. bovis. 3 dage efter 15 inokulering deles kaninerne i 3 grupper: 2 dyr får ingen behandling; 3 dyr får streptomycin i en standard ophthal-misk glycerinsuspension (streptomycinkoncentration 10 mg/kg legemsvægt), og 4 dyr får en saltvandssuspension af SPLV-indesluttet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat 20 pr. kg legemsvægt). Suspensionen eller opløsningen indgives topisk (0,1 ml) i hvert øje. Efter 24 timer og hver af de efterfølgende 5 dage foretages conjunctivpodning på alle kaniner. Resultaterne af isolering med hensyn til M. bovis på blodagarplader ses i tabel XVI. Der foretages 25 obduktion af alle dyr ved forsøgenes afslutning, og conjunctivae fjernes fra alle dyr. Disse bedømmes med points for vascularisation og findeles, homogeniseres og udstryges på blodagarplader til isolering af M. bovis. Resultaterne ses i tabel XVII.

30 35

Tabel XVI

65

DK 163105 B

Resultater af isolation fra kaninconjunctivae efter ino-kulering af M. bovis i conjunctivalmembraner og behandling med streptomycin 1 ophthaimisk glycerolopløsning eller SPLV-indkapslet streptomycin i saltvandsopløsning 5 a) M. bovis-kulturer ' C )

Dage efter infektion '

Antal, Før behandling Efter behandling Gruppe dyrc 1 2 3 4 5

Kontrol 1 + + + + + 2 + + + + +

Streptomycin i glycerolT

opløsning } 1 + + + + + 2 + + + + + 15 3 + + + + + SPLV-indkapslet streptomycine' 1 + + 000 2 + + 0 0 0 3 + + 0 0 0 4 + + 0 0 0 20 a) Kulturer får points for tilstedeværelse af M. bovis-kolonier på blodagarplader efter 24 timer ved 37 °C.

Plus ( + ) er flere en lig med 1 CFU M. bovis pr. iso-lat; 0 er ingen påviselige kolonier. 1 2 3 4 35

Alle dyr inokuleres med 1 x 10^ CFU M. bovis topisk i 25 begge øjne; 1 x 10D CFU M. bovis injiceres i conjunc tival membraner i højre øje, og 1 x 10° CFU M. bovis påføres topisk i venstre øje.

2

Dyr behandles med 0,1 ml opløsning topisk i hvert øje.

3

Dyr behandling topisk i hvdrt øje med streptomycin (10 mg/ kg legemsvægt) i ophthalmisk glycerolbase.

30 4

Dyr behandles topisk i hvet øje med SPLV-indkapslet streptomycin (10 mg/kg legemsvægt) i steril saltvandsopløsning.

Tabel XVII

66

DK 163105 B

Resultater af obduktion af øjenhule og dermed forbundet væv fra kaniner efter inokulering med M. bovis i conjunctivalvæv og behandlingen med enten streptomycin i ophthalmisk glycerolopløsning eller .SPLV-indkapslet 5 streptomycin i steril saltvandsopløsning3'

Isolering af M. bovis-kul- Vascularisation turer af højre øjeD' , _ Kontrol A + 2+ 10 B + 2+

Streptomycin i glycerolopløsning A + 2+ B + 1+ 15 C + 2+ D + 2+ SPLV-indkapslet streptomycin A 0 0 B 0 ° 20 C 0 0 D 0 0 a) Forklaring som i tabel XII, udført på dag 5 efter inficering.

25 b) Vascularisation bedømmes som følger: 0 = kar normale; 1 = nogle kar klart dilaterede og infiltrerede af mindre kar? 2 = diffus rødme og de enkelte kar kan ikke skelnes med lethed; 3 = diffus blodig rødme, vas-kulær lækage og effusion af blod i conjunctivae. 1 35

DK 163105 B

67

Bedømmelse af SPLV'ers effektivitet sammenlignet med li-posompræparater ved behandling af øjeninfektioner M. bovis (ATCC stamme 10900) fortyndes til en koncentra- 7 5 tion på 1 x 10 celler pr. ml i steril saltvandsopløsning. Alikvote mængder (0,1 ml) bakteriesuspensioner inokuleres subcutant i conjunctivalvævet i begge øjne på voksne kaniner. Der tages dagligt podning fra conjunc-tivae fra begge øjne fra alle kaniner, der udstryges på 10 blodagarplader til isolering af M. bovis. 5 dage efter inokulation deles kaninerne i 6 grupper: 2 dyr får ingen behandling (kontroldyr); 3 dyr får en suspension af SPLV-indkapslet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg legemsvægt), som derpå fortyndet 1:100 har en O.D.4go 15 (optisk densitet ved 480 nm) lig med 0,928; 3 dyr får en suspension af SPLV-indkapslet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg legemsvægt), som fortyndet 1:100 har °*D*4gQ lig med 0,449; 3 dyr får en suspension af SPLV-indkapslet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat 20 pr. kg legemsvægt), som fortyndet 1:100 har en O.D.^qq lig med 0,242; 4 dyr får en suspension af SPLV-indkapslet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg legemsvægt), som fortyndet 1:100 har en °-D*4go Hg med 0,119, og 2 dyr får en suspension af multilamellare 25 vesikler (MLV’er) indeholdende streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg legemsvægt) med en O.D.^qq i en fortynding på 1:100 lig med 0,940. MLV'er fremstilles ved den af Fountain m.fl. i Curr. Micro. 6, 373 (1981) beskrevne fremgangsmåde ved at tilsætte streptomycin-30 sulfat til den tørrede lipidfilm, som derefter omhvirvles og får lov at kvælde i 10 timer; ikke-indesluttet streptomycin fjernes ved gentagen centrifugering.

Suspensionerne indgives topisk i hvert øje. Efter 24 35 timer tages konjunctivalpodning fra alle kaniner dagligt i 9 dage og udstryges på blodagar. Resultaterne af isolering med hensyn til M. bovis på blodagarplader ses i 68

DK 163105 B

tabel XVIII. Der foretages obduktion af alle dyr. Disse bedømmes for tåresekretion og conjunctivae fjernes aseptisk fra alle dyr. Disse bedømmes for vascularisation og findeles, homogeniseres og udstryges på blodagarplader 5 med henblik på isolation af M. bovis. Resultaterne er vist i tabel XIV.

10 15 20 25 30 35

DK 163105B

J gj μ ω

j Β| Η +++0000+0000++0+ C -H

A C

ω·Η «Ο-Η m cn ω il ΪΛ H ++0+000+0000++0+ 0} .

10 i? 0)2 ο φ 0 Ν Λ|Η5

Olrrj Η + + + +000+0000++0+ •Λ*0?! .si „ °·«0 g > C tj^-1

>iH Η H + + + O O O O + O O O O + + o + c S'S

f (0 Ό <0 3 S

£ to d ^ > 6 0 id JQ ? _ Ή τ4 Χίο E J9 2 (1) i—i + + +OOOO+O+O+ + +O+ <D Ό ·Η Ό c - Λ e Q) Ή (0 Φ w ^ S >, “ β φ o + + o + o o o + o o o o + + o o >ΗΦ o, e > η -μ τί 3 3 ft 0 0 Η P P ^ 7 . xi n t) ύ Φ o)

Zja c oo + + 0+ 000 + + ooo + + o+ d μ _ d Φ . (0 3 0¾ g S S Λ § |2 ra m Λ t> + + +0000000+0000+ Orø.,

Se 0 <D S

S P u E c H o P Ό + + + +OOO+OO + +OOO+ § §· ft to -η p S Ό ω o a p φ o φ ®

P (0 (0 -Η Λ II

P X H 0) P 11 c to n? 0) m + + + + + + + + + + + + + + + + 0rø + φ -Η H P C Vu ..

(0 I ·Η C -j q T3 rj + + + + + + + + + + + + + + + + P e

P 2 c O 3N

cn o e o w 40 §Φ φ oo + + + + + + + + + + + + + + + + ^ « Λ 5 sil Λ n) Ij S (0 ^ o ·& cs + + + + + + + + + + + + + + + + o!?!· cg h °$2

Sej h + + + + + + + + + + + + + + + + s7]j x to " ^ φ Η A *5 (sj «8 ft o φ o t.

U W «3 « J)

φ·0 O Φ JJ

o s H

a” K *&® C^ & i n •h 7 73 η ω φ rø H HNHISHNfOHNCOHCSCOHNCO -,¾¾ s" R 332 £ e n a - 5 φ u · S ^ to o> ίο h S Ti o c o) a) 7 P n u h K g 0) C Ό 3

o η η Ό O P

a R 0 0 Η H

£ .¾ Ο4Λ D

•jr iJ4J^->.4J<~'P^~'OHii Σ 2 ρα) οι no) 0) ό c rø ·<ο jj Φ Η Η ·· Η ·· H ·· ^ > o*® P rø HCWC'-'CQCHtOCjHMqH ,,7,(.51

(0 rø -Η α·Η P Q.-H a-H a-H Η P η H

ΰ 4J q,0(OOa)(OOP(OOP(OOP >« o <d h η ΟΦ (0>ιΑί>ιΌ^>ια)^>ιΟ^ϊ^Φ Ό S ®

t: i EO g flU gflfl ÉOO EO 3 d W

5 5 rø .-i røodONdOddOddod a) -o o -h ” p a φ o c p -π p p -η p >i-h p np p n 7 6 7^ _i ti i« o. u *h a i au i ap 1 ap 1 ap η o ο·<ο φ h.$ a p 1 ω>ωο>ω^>ω^>α>ίΗ <<OAia rø rørø M O JPAP 3APPAPPAPP ^ h5 CD & StOCGCO'-'CÆCØ'-^WW'-'røtø'-' β

• μ m JDK 163105 B

2 0 "" (0 0 ho ε ο w Ό jjfl 0) ffl ο, , o -3 ·& «ο

e (0 H+ + + + + η) μ H

aX m HHHOOOOCMOOOOOHOO U

ο <d o> m 55 d μ · 0 H (0

Η H °(d tCO

*rj i eh mo c

in > d H <D

® g -Η Λ «0 Λ ·Η 2 w · cn raw 2 -O 0 m v .5 - S 0) m o " ° 1¾ > h 0 £ S u S & 5 ®11 2 Ϊ5 U ®CT ®

Cb (0 + + + + + + + + + + + + j n r. Q) p—I HHHHOHONOHOHHHHH Zj rn o£ 3 ^ S ο» £ *H U , <M 0(0

5 CO CO ^ H

H CO (do n d ^ o (0 JJ g A! Mj «eg ® ® *

Ora© & 2 S’ μ a o 2 .5 m (0 c ·* d · ΰ η n k Ό · π -P "tL Q) S d 0) 0 §>£ >H m Chh «3«· jS j ο o 'g ra

Is Λ .2¾¾ 8b 2d s d g μ 0 $ -d

•Ho ·Η B 0) (0 9 H

o ΰ μ m + + +0000+0000++0+ 9¾ >C w £ d ra ^0) O , «.μ „ Ό C -P b μ o 11 0 Ό Ο Ή(0(0β > Ο Ό H O -W d ^ ε ο -μ η μ με ο ^ “ ο £ ο ο Η Η Ό Ο ο Η 0 Ο «<0 Ο) ra ϋ> ο) Γ] μ »e Η « .. χ * i Ο "Η ^ 5j C — Ο Η 0) Ο Ό 2 m ·0 4J g, Ο ® ΟΙ ® c μ η ό Η 2> ο (0 (!) ^ j 3ί μ ^ m ε ^ h •So >ι ό „ *3 g Λ 10 3 g ο 10 11 ^ Η Η CM Η CM Η CM 00 Η CM CO Η CM 00 Η CM 00 - 9 | β Ο - ® ο> « > ω S ο ο ο -μ Η ,« μ * :*0(0

«η c x2 wbiH

ra < ο η 3 ο > η ε 2 m aim c*® ο ε 5 m η ίο 9 η <0 £ ~3 ‘η ο

1J(0 μ Ο £ cn C

t, > jq Ό ο ε η

3 Η ·Η Ο C

5 μ d 11 ο w μ ο ο ε ο„ οι οι S c ο η ν ra ra d ud μ μ ^μ ^μ ^ ωμ χ ο m , ·Γ>τ> μ Q) (D CM 0 'tf (I) vq Cd " aj ε tj did a)H H ·· H ·· H C ·· 0) (i) μμ ε>ο ® O fi Hfirac—>raCHraCHra*riH w h ra s- o oh ra η Οι·η μ QjH an & o η μϋ μι ε μ ο fto in ο ο ® ομ ο ομ « ^μ ora æ ο > ο ίμ ra >iX ί*Ό χ >i ο χ >η ο χ μ ο επ οηλό η μ ή ε ϋε,οεο'ϋε'θ,ο6ο,οε'θ ε ομ ο ο χ ra ο η oocoixcoacoficoc ©οόλόη μ μ ο c μ η μ μ η μ ><η μ >ι·η μ >i ό ra c ra ο ή η ημΟ) μ μ&ι αμ ι Οιμ ι &μ ι αμ οληοη ra sno μ ιο>οο>ομ>ομ>ομ m > ε > &< ιι λ ra > μ d >μβΐμΉ^μο^μο^μο to ο ο μ ο ►αμ^μ^ΑμμΑμμι^μμ gi os.ara χ s ram ra^to wwcd ra^tfl ra^ ra λ o EKSEMPEL 15 71

DK 163105 B

Behandling af virale infektioner 5 Lymfocytisk choriomenigitis-virus (LCMV), et medlem af Arenavirus-gruppen, er kendt for at fremkalde sygdomme hos mennesker, og LCVM-infektion er dødelig hos mus, der inokuleres intracerebralt med dette virus. Musenes død forårsages af immunceller, der reagerer mod virus-10 inficerede celler. Virus dræber ikke cellerne, hvori det formerer sig, derfor skal det terapeutiske middel, der anvendes til mus, enten inhibere virusformering, så at immuncellerne ikke aktiveres, og/eller inhibere aktiveringen af immunceller.

15

Nedenstående eksempel viser effektiviteten af at behandle virale infektioner ved indgivelse af en SPLV-indkapslet antiviral forbindelse.

20 Behandling af dødelig lymfocytisk choriomenigitis-virus-infektioner hos mus

Swiss-mus, der er 2 måneder gamle, inokuleres intracere-bralt med en dødelig dosis af LCM-virus, dvs. 100 plaque-25 dannende enheder (PFU) med 0,05 ml inokulum pr. mus.

Musene deles i 4 grupper på hver 7 dyr og behandles på dag 2, 3 og 4 efter inficering ved intraperitoneale injektioner med 0,1 ml/dosis/mus, som følger: (1) "SPLV-R-gruppen" behandles med en suspension af æggephosphati-30 dylcholin-SPLV'er indeholdende 3 mg "Ribavarin"/ml. Der fremstilles SPLV'er ved anvendelse af 100 mg lipider og 0,3 ml af 100 mg præparat/ml PBS-puffer; indeslutningen af præparatet er 10%; (2) "R-gruppen" behandles med en opløsning af "Ribavarin" 3 mg/ml i PBS; (3) "SPLV-grup-35 pen" behandles med pufferfyldte SPLV’er (dvs. SPLV'er fremstillet som ovenfor, men uden "Ribavarin”); og (4) "kontrolgruppen" behandles med PBS. På dag 5 efter infi-

DK 163105 B

TI

cering aflives 2 mus fra hver gruppe, og deres milt homogeniseres (2 milt/gruppe homogeniseres i PBS ved 1/20 vægt pr. volumen puffer). De plaque-dannende enheder (PFU) pr. ml bestemmes for hver suspension. De øvrige 5 5 mus i hver gruppe observeres for dødelighed 2 gange dagligt i 30 dage. Resultaterne findes i tabel XX.

Tabel XX

a \ 10 Behandling af dødelig LCM-virusinfektion hos mus

Virus udvundet fra milt

Gruppe Dødelighed*3^ (PFU x 10^/ml)c^ 15 -

Kontrol 5/5 7,0 SPLV-gruppe 5/5 6,9 R-gruppe 5/5 5,2 SPLV-R-gruppe 3/5 3,4 20 - a) 2 måneder gamle mus inokuleres intracerebralt med en dødelig dosis, dvs. 100 PFU LCM-virus i 0,05 ml inoku-lum.

25 b) Dødeligheden er udtrykt som antal døde/antal i gruppen, og 1 deres milt homogeniseres med en koncentration på 1 g milt/20 ml homogenat.

30

Tabel XX viser tydeligt en nedgang i dødelighed og en nedgang i virus, der kan udvindes fra de inficverede dyr.

Det har endnu ikke kunnet afgøres, om disse resultater skyldes "Ribavarin"s anti-virale aktivitet, som det 35 frigøres fra SPLV'erne, eller om det skyldes en immunmodulation af museværten under den protraherede frigørelse af "Ribavarin" fra SPLV'erne.

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af stabile, plurilamel-5 lare vesikler med en vesikelstørrelse inden for området 500 - 10 000 nm og et antal lipiddobbeltfag inden for området fra nogle få til over 100, hvilke vesikler har - en større stabilitet mod autooxidation under oplagring 10. en puffer; - en større stabilitet i legemsvæsker; - en større procentandel lækage af indfanget, opløst 15 materiale ved eksponering over for urea, guanidin eller ammoniumacetat; - en mindre procentandel lækage af indfanget, opløst materiale ved eksponering over for saltsyre eller se- 20 rum; og - en fordeling af indfanget indhold via cytosol i celler ved indgift til cellerne i kulturer, 25 kendetegnet ved, at man a) fremstiller en dispersion af mindst et amfipatisk lipid i et organisk opløsningsmiddel; 1 2 3 4 5 6 b) kombinerer den under a) opnåede dispersion med en van 2 dig fase til dannelse af en tofaseblanding, i hvilken 3 den vandige fase fuldstændig kan emulgeres, idet vo 4 lumenforholdet mellem opløsningsmiddel og vandig fase 5 er fra 3:1 til 100:1, og 6 c) emulgerer den vandige fase og afdamper det organiske opløsningsmiddel fra tofaseblandingen, idet man i DK 163105 B trinnene a), b) og c) arbejder ved en temperatur i området 4-60 °C, for derved at opnå stabile plurila-mellare vesikler, der i det væsentlige er fri for MLV, SUV og REV. 5

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at temperaturen i trinnene a) og b) ligger under faseovergangstemperaturen for i det mindste et af lipi-derne. 10

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man i trin a) som opløsningsmiddel anvender et fluorcarbon, en diethylether eller blandinger deraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at man anvender et opløsningsmiddel, som indeholder en antioxidant, fortrinsvis butyleret hydroxytoluen, BHT.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at emulgeringen i trin c) gennemføres før eller samtidig med afdampningen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man sammen med den vandige fase i trin b) tilsæt- 25 ter det materiale, der skal indfanges i vesiklerne, således at mindst 20% af materialet indfanges i vesiklerne. 1 35