DK163383B - Fremgangsmaade og reagenssystem til bestemmelse henholdsvis detektering af en bestemt polynucleotidsekvens i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer - Google Patents

Description

i

DK 163383 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en bestemt polynucleotidsekvens i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer, ved hvilken men kombinerer testmediet med en sonde, der omfatter 5 i det mindste.én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal bestemmes, og den komplementære sondesekvens, og detekterer hybridiseret sonde ved binding af et antistofreagens, der er i stand til at blive bundet til DNA/RNA- eller RNA/RNA-duplexer, der 10 dannes mellem den sekvens, der skal bestemmes, og den komplementære sonde-sekvens, og bestemmer det antistofreagens, der bliver bundet til sådanne duplexer, og opfindelsen angår desuden et reagenssystem til detektering af en bestemt polynucleotidsekvens i et testmedium ved nucleinsyre-hybridise-15 ring, omfattende (i) en polynucleotid-sonde, der indeholder i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal bestemmes, og (ii) et antistof-reagens, der kan bindes til DNA/RNA-eller RNA/RNA-duplexer, der dannes mellem den sekvens, der 20 skal bestemmes, og den komplementære sonde-sekvens.

Princippet for nucleinsyre-hybridiserings-bestemmelser er blevet udviklet af forskere på rekombinant-DNA-området som et middel til bestemmelse og isolering af bestemte poly-nucleotid-basesekvenser, der har interesse. Det vist sig, 25 at enkeltstrengede nucleinsyrer, f.eks. DNA og RNA, således som opnået ved denaturering af deres dobbeltstrengede former, vil hydbridisere eller rekombinere under passende betingelser med komplementære, enkeltstrengede nucleinsyrer. Ved mærkning af sådanne komplementære sonde-nucleinsyrer med en 30 let detekterbar kemisk gruppe blev det dernæst gjort muligt at detektere tilstedeværelsen af enhver polynucleotidsekvens af interesse i et testroedium indeholdende prøve-nucleinsyrer på enkeltstrenget form.

Foruden på rekombinant-DNA-området kan den analyti-35 ske hybridiseringsteknik anvendes til detektering af betydningsfulde nucleotider i den humane og veterinære medicin,

O

DK 163383 B

2 i landbruget, i næringsmiddelvidenskaben og på andre områder. I særdeleshed kan teknikken anvendes til detektering og identifikation af etiologiske midler såsom bakterier og vira, til screening af bakterier for antibiotisk resistens, 5 til hjælp ved-diagnose af genetisk unormale tilstande, f.eks. seglcelleanæmi og thalassemia, samt til detektering af cancerceller. En generel oversigt over teknikken og dens nuværende og fremtidige signifikans fremgår af Biotechnology (august 1983), side 471-478.

10 De nucleinsyre-hybridiserings-bestemmelsesmetoder, der hører til teknikkens stade, omfatter i almindelighed immobilisering af prøve-nucleinsyren på en fast bærer. Hybri-disering mellem bestemte basesekvenser eller gener af interesse i prøve-nucleinsyren bestemmes ved adskillelse af den 15 faste bærer fra den resterende del af reaktionsblandingen, som indeholder ubundet mærket sonde, efterfulgt af detektering af mærkningen på den faste bærer.

Nødvendigheden af at immobilisere prøve-nucleinsyrer for at kunne udføre hybridiseringsbestemmelsen ifølge den 20 kendte teknik frembyder to signifikante problemer. For det første er de procedurer, der kræves til at gennemføre immobiliseringen, tidsrøvende og tilføjer et trin, der er uønsket til rutineanvendelse af teknikken i et klinisk laboratorium. For det andet kan proteiner.og andre materialer i 25 den heterogene prøve, navnlig i tilfælde af kliniske prøver, interferere med immobiliseringen af nucleinsyrerne.

Som alternativer til immobilisering af prøve-nuclein-syrer og tilsætning af mærket sonde kan man anvende en im-mobiliseret sonde og mærke prøve-nucleinsyrerne in situ, el- 30 ler man kan anvende en dobbelt-hybridiseringsteknik, der kræver to sonder, hvoraf den ene immobiliseres, og den anden mærkes, jfr. Methods in Enzymology j>5, 468 (1968) samt Gene 21, 77-86 (1983). Det førstnævnte alternativ er imidlertid mindre ønskeligt, eftersom mærkningen af prøve-nucleinsyrer-35 ne in situ kræver en høj grad af teknisk ekspertise, der ikke rutinemæssigt findes hos kliniske teknikere, og der fin-

O

DK 163383 B

3 des ingen enkle og pålidelige metoder til styring af mærkningsudbyttet, hvilket kan være et signifikant problem, såfremt mærkningsmedierne indeholder varierende mængder af inhibitorer for mærkningsreaktionen. Den dobbelte hybridise-5 ringsteknik har de ulemper, at den kræver et yderligere reagens- og inkuberingstrin, og de kinetiske forhold ved hybri-diseringsreaktionen kan være langsomme og ineffektive. Nøjagtigheden af bestemmelsen kan også variere, såfremt komplementariteten af de to sonder med prøve-sekvensen er variabel.

10 Metoder til direkte detektering af det polynucleotid- -duplex, der dannes som produktet af hybridisering mellem prøve- og sonde-polynucleotiderne, idet der herved undgås kemisk mærkning og immobilisering af prøve- eller sonde-poly-nucleotider, har generelt vist sig at være utilfredsstillen-15 de. Forsøg på at frembringe antistoffer, der selektivt vil binde dobbeltstrengede DNA/DNA-hybrider via enkeltstrenget DNA, er slået fejl, jfr. Parker og Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", ed. Plescia og Braun, Springer-Verlag, NY (1969) , side 18 ff. Der er blevet opnået nogen succes ved 20 frembringelse af antistoffer, der vil binde DNA/RNA-blande-de hybrider eller RNA/RNA-hybrider og har lav affinitet til de enkeltstrengede polynucleotider, jfr. f.eks. Rudkin og Stollar, Nature 265, 472 (1977). Rudkin og Stollar fikserede hele celler på mikroskop-objektglas og afdækkede DNA*en 25 i kernen. Den blev hybridiseret med en RNA-sonde, og hybriden blev detekteret ved fluorescensmikroskopi med fluor-escein-mærket antistof til DNA/RNA. Disse metoder er imidlertid beskrevet, ligesom i tilfælde af de ovenfor diskuterede hybridiseringsmetoder under anvendelse af mærkede son-30 der, som krævende immobilisering af prøve-nucleinsyrerne.

Immobilisering af cellulær DNA til in situ-hybridisering er særlig svag, fordi DNA'en skal forblive fikseret til skrøbelige cellerester under hybridiseringen og immunkemiske detekteringstrin. De resultater, der iagttages ved fluorescens-35 mikroskopi, giver ikke kvantitative data vedrørende mængden af dannet hybrid.

DK 163383 B

4

Der forefindes således et fastslået behov for en nu-cleinsyre-hybridiseringsbestemmelse, der ikke kræver immobilisering eller mærkning af prøve-nucleinsyrér, og •'som ikke kræver dobbeltsonder. Endvidere bør en sådan teknik til-5 lade anvendelsen af en række forskellige mærkninger, navnlig af den ikke-radioisotope type. Tilvejebringelsen af en nucleinsyre-hybridiseringsbestemmelsesroetode og et reagenssystem med disse og andre fordele er hovedformålet med den foreliggende opfindelse.

10 Der er nu ifølge opfindelsen blevet tilvejebragt en nucleinsyre-hybridiseringsbestemmelsesmetode, som eliminerer nødvendigheden af at immobilisere eller mærke prøve-nuclein-syrer, og som kun kræver et enkelt sonde-element. Med den 1 foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde 15 til bestemmelse af en bestemt polynucleotidsekvens i et egnet testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer. Testmediet kombineres med en immobiliseret eller immobiliser-bar polynucleotid-sonde, der omfatter i det mindste én enkelt-strenget basesekvens, der er i det væsentlige komplmentær 20 til den sekvens, der skal bestemmes, under betingelser, der er favorable for hybridisering mellem den sekvens, der skal bestemmes, og den komplementære sonde-sekvens. Den komplementære sonde-sekvens vil udvælges således, at den i det væsentlige er sammensat af RNA, når den sekvens, der skal be-25 stemmes, er RNA eller DNA, hvilket vil sige, at en sådan sonde-sekvens kan vælges til at være RNA, når den prøve-sekvens, der har interesse, er RNA eller DNA. Når alternativt prøve--sekvensen, der har interesse, er RNA, kan den komplementære sonde-sekvens vælges til at være i det væsentlige sammen-30 sat af enten DNA eller RNA. Hybrider, der fremkommer som et resultat af hybridisering mellem sonde- og prøve-sekvensen, vil således være DNA/RNA- eller RNA/RNA-duplexer.

De resulterende hybrider kan dernæst detekteres, efter eller samtidig med immobilisering af sonden, når en så-· 35 dan kombineres med testmediet i en immobiliserbar form, ved tilsætning af et antistofreagens, der er i stand til at bli-

DK 163383 B

5 ve bundet til de dannede DNA/RNA- eller RNA/RNA-duplexer, hvorpå man bestemmer det antistofreagens, der bliver bundet til sådanne duplexer. Der kan anvendes en række forskellige metoder og reagenskombinationer til udførelse af den 5 foreliggende metodes princip. Betydningsfulde træk ved den foreliggende opfindelse er, at prøve-nucleinsyrerne ikke im-mobiliseres eller behøver at blive mærket inden kontakt med sonden.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den 10 allerede i det foregående angivne art, er således ejendommelig ved, at sonden er en immobiliseret RNA- eller DNA-sonde, og reagenssystemet ifølge opfindelsen, der er af den ligeledes i det foregående angivne art, er ejendommeligt ved, at sonden er immobiliseret RNA- eller DNA-sonde.

15 I Chemical Abstracts 10 (1969), nr. I13344d beskrives fremstillingen af anti-RNA/RNA-antiserum, der undersøges for specificitet ved todimensional immunodiffusion og komplement-fikseringsteknik. Der udføres imidlertid ingen hybridi-seringsbestemmelser, og der stilles ingen forslag om anven-20 delse af immobiliserede eller immobiliserbare sonder ved hybridiseringsbestemmelser.

I Chemical Abstracts 98 (1983), nr. 1157s er der beskrevet en indirekte fluorescens-immunocytologisk metode til visualisering af DNA/RNA-hybrider dannet på vaevssek-25 tioner. Specifikke DNA-sekvenser i chromosomerne af celler fikseret til glasplader detekteres ved hybridisering med RNA-sonder efterfulgt af binding af anti-DNA/RNA-antistoffer.

Den beskrevne bestemmelse involverer således immobilisering af prøve-polynucleotidstrengen i stedet for sonde-strengen 30 som ifølge den foreliggende opfindelse.

Ifølge Biochemistry 17, nr. 26, 5791-5798 (1978) anvendes der anti-DNA/RNA til rensning af DNA, der koder for en bestemt rRNA, der har interesse. Som i den ovenfor først omtalte artikel i Chemical Abstracts udføres der ingen 35 hybridiseringsbestemmelser, og der stilles ingen forslag om at anvende immobiliserede eller immobiliserbare sonder ved

DK 163383 B

6 hybridiseringsbestemmelser.

Antistofreagenset er nøglen til specifik og følsom detektering af hybridisering mellem sonde- og prøve^nuclein-syrerne. Naturligvis kan hele antistoffer eller passende 5 fragmenter og-polyfunktionelle former deraf anvendes som nærmere beskrevet i det følgende, og det vil forstås, at udtrykket "antistofreagens", således som det anvendes i det følgende, skal betyde hele antistoffer og deres polyfunktio-nelle og fragmenterede former, medmindre andet er angivet.

10 Bestemmelse af binding af antistofreagenset til hy- bridiserings-duplexer kan udføres på enhver bekvem måde. Det foretrækkes, at antistofreagenset mærkes med en detekterbar kemisk gruppe, f.eks. en enzymatisk aktiv gruppe, et fluorescerende middel, en chromophor, et luminescerende middel, 15 en ligand, der kan bindes specifikt, eller en radioisotop, idet ikke-radioisotope mærkninger navnlig foretrækkes. Det mærkede antistofreagens, der bliver bundet til resulterende immobiliserede hybrid-duplexer, kan let skilles fra det reagens, der ikke bliver bundet på denne måde, og den detek-20 terbare kemiske gruppe eller mærkning måles i hver særskilt fraktion, sædvanligvis i den førstnævnte.

Ved eliminering af nødvendigheden af at immobilisere eller mærke prøve-nucleinsyrerne tilvejebringes der med den foreliggende opfindelse en i høj grad fordelagtig hybridi-25 serings-bestemmelsesteknik. Den person/ der udfører analysen, behøver ikke at have særlige kvalifikationer eller at anvende megen tid på udførelsen af immobiliserings- eller mærknings-procedurerne. Der opnås endvidere fuldstændig eliminering af potentialet for prøve-interferenser med im-30 mobiliseringsproceduren. Det testsæt, der tilvejebringes til den kliniske bruger, vil omfatte den allerede immobili-serede sonde eller denne i en let immobiliserbar form, f.eks. ved binding til en immobiliseret bindingspartner. I systemerne ifølge den kendte teknik kan interferenser fra frem-3 5 medproteiner og andre materialer i prøven være et alvor-

O

DK 163383 B

7 ligt problem, hvadenten de prøve-nucleinsyrer, der skal im-mobiliseres, er RNA eller DNA.

Ved metoderne ifølge den kendte teknik gennemføres immobiliseringen ved adsorption på en mikroporøs membran, 5 f.eks. nitrocellulose, eller ved covalent binding til reaktive steder på en fast bærer. I det førstnævnte tilfælde kan proteiner fra prøven overtrække overfladen og blokere adsorptionen af nucleinsyrer. Endvidere kræver mange procedurer varmebehandling ved forhøjede temperaturer, almindeligvis 10 højere end 80°C, i vakuum til fiksering af adsorberede nucleinsyrer til bæreren. Såfremt slimstoffer eller andre materialer, der er endogene i forhold til prøven, er til stede, kan de blive tørret til bæreren til dannelse af en film, som kan adsorbere den mærkede sonde under hybridisering og for-15 øge baggrundssignalet og som følge deraf nedsætte sensitiviteten. Såfremt et enzym eller et andet proteinstof er involveret i detekteringen af mærkningen, kan dette også ofte bindes ikke-specifikt til filmen og bidrage yderligere til baggrundsproblemet. Såfremt der anvendes covalent immobilise-20 ring, kan proteiner og andre materialer fra prøven forventes at have tilgængelige reaktive grupper, der vil deltage i koblingsreaktionen og neutralisere koblingen af de ønskede nucleinsyrer.

Eftersom der med den foreliggende opfindelse tilveje-25 bringes den omhandlede sonde i foretrukne udførelsesformer på en allerede immobiliseret form eller på en form, der let immobiliseres ved binding til en immobiliseret bindingspartner, overvindes de ineffektiviteter, der er iboende i den kendte tekniks immobiliseringsmetoder, og derved opretholdes 30 bestemmelsens detekteringsgrænser. En yderligere fordel består i, at ikke-specifik binding af prøve-KNA eller -DNA til den faste bærer ikke genkendes af antistofreagenset. Baggrundssignalet vil derfor være lavt, og detekteringsgrænsen forbedres tilsvarende. I forhold til den dobbelte hybridiseringsmetode, 35 ved hvilken der anvendes såvel en mærket sonde som en immobi-

O

DK 163383 B

8 liseret sonde, kan det mærkede nucleotid bindes ikke-speci-fikt til den faste bærer og bidrage til baggrundssignal.

Dette er ikke en mulighed ved den foreliggende fremgangsmåde, eftersom der ikke er involveret nogen mærket sonde.

5 På tegningen er der skematisk illustreret foretruk ne fremgangsmåder til udøvelse af den foreliggende opfindelse. Anvendelsen af nucleinsyre-hybridisering som et analytisk værktøj er fundamentalt baseret på den dobbeltstrengede duplex-struktur af DNA. Hydrogenbindingerne mellem purin-10 og pyrimidinbaserne i de respektive strenge i dobbeltstrenget DNA kan opbrydes reversibelt. De to komplementære enkeltstrenge af DNA, der er resultatet af denne opsmeltning eller denaturering af DNA, vil associeres (også betegnet genforstærkning eller hybridisering) til gendannelse af du-15 plex-strukturen. Som det nu er velkendt i teknikken, vil kontakt med en første enkeltstrenget nucleinsyre, enten DNA eller ENA, som indeholder en basesekvens, der er tilstrækkeligt komplementær til en anden enkeltstrenget nucleinsyre under passende opløsningsbetingelser, resultere i dan-20 nelsen af DNA/DNA-, DNA/RNA- eller RNA/RNA-hybrider, alt efter forholdene.

I den udførelsesform, der er vist i fig. 1 på tegningen, bringes de enkeltstrengede prøve-nucleinsyrer i kontakt med den immobiliserede sonde under favorable hybridiserings-25 betingelser. De resulterende immobiliserede, hybridiserede duplexer, eventuelt efter adskillelse af sådanne duplexer fra resten af reaktionsblandingen, bringes i kontakt med en mærket form af antistoffer, der er specifikke for DNA/RNA-eller RNA/RNA-duplexerne. Efter vaskning til fjernelse af 30 ubundet, mærket antistof, måles den mærkning, der er til stede på den faste bærer.

I den udførelsesform, der er illustreret i fig. 2 på tegningen, bringes de enkeltstrengede prøve-nucleinsyrer i kontakt med en opløselig form for sonden, der er blevet pas-35 sende kemisk modificeret til at omfatte biotindele, der kan

O

DK 163383 B

9 bindes. Til de resulterende, opløselige hybrider, som dannes, sættes der en immobiliseret form for avidin, en bindingspartner for biotin, hvilket resulterer i dannelse af immobiliserede hybrider. De således immobiliserede duplex-5 er, eventuelt- efter adskillelse deraf fra resten af reaktionsblandingen, bringes i kontakt med mærkede anti-hybrid--antistoffer, og efter vaskning måles den mærkning, der er til stede på den faste bærer på samme måde som ovenfor.

10 Sonden

Sonden vil indeholde mindst én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal detekteres. En sådan basesekvens behøver imidlertid ikke at være et enkelt kontinuerligt polynucleo-15 tid-segment, men kan være sammensat af to eller flere individuelle segmenter, der er afbrudt af ikke-komplementære sekvenser. Disse ikke-hybridiserbare sekvenser kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og danne hårnålesløjfer. Desuden kan den komplementære region af sonden 20 være flankeret ved 3'-og 5'-terminalerne af ikke-hybridiserbare sekvenser, f.eks. de, der indeholder DNA'en eller RNA'en af en vektor, hvori den komplementære sekvens er blevet indsat til propagering. I hvert enkelt tilfælde vil sonden som præsenteret som et analytisk reagens udvise detek-25 terbar hybridisering ved et eller flere punkter med de prø-ve-nucleinsyrer, der har interesse. Lineære eller cirkulære , enkeltstrengede polynucleotider kan anvendes som sonde--elementet, idet væsentlige eller mindre portioner danner duplex med en komplementær polynucleotidstreng eller -stren-30 ge, forudsat at det kritiske homologe segment eller segmenter er på enkeltstrenget form og tilgængelig til hybridisering med prøve-DNA eller -KNA, og forudsat; at det antistof-reagens, der udvælges til anvendelse sammen med sonden, ikke på signifikant måde krydsreagerer med de dobbeltstrengede 35 regioner i sonden, f.eks. når antistofreagenset er specifikt o

DK 163383 B

10 for DNA/RNA-hybrider, og sonden indeholder RNA/RNA-dobbelt-strengede regioner eller omvendt. Den komplementære sondesekvens kan have enhver bekvem eller ønsket længde,.'der strækker sig fra så lidt som et dusin til så mange som 5 10.000 baser, og inkluderende oligonucleotider med mindre end ca. 50 baser.

RNA- eller DNA-sonden kan fås på en række forskellige konventionelle måder. Eksempelvis kan RNA i tilfælde af RNA-sonder isoleres som det naturlige produkt af celler, 10 f.eks. som 5s, 16s og 23s ribosomale RNA1er fra bakterier eller celleoverførings-RNA'er. Det er også praktisk muligt at isolere specifikke budbringer-RNA'er fra celler, der er specialiseret i produktion af store mængder af et protein, for hvilket budbringeren koder.

15 In vitro-syntese af RNA-sonder kan udføres med en vektor, der indeholder den meget aktive Salmonella typhi-murium bakteriofag SP6-transskriptions-promotor, jfr. Green et al (1983), Celle 32, 681. En vektor med multiple restrik-tions-endonuclease-steder stødende op til promotoren kan fås 20 fra Promega Biotec, Madison, WI. En DNA-sonde klones i vektoren, som dernæst propargeres i en bakterievært. Multiple RNA-kopier af den klonede DNA-sonde kan syntetiseres in vitro under anvendelse af DNA-afhængig RNA-polymerase fra bakteriofag SP6.

25 DNA-sonder kan fremstilles ud fra en række forskel- · lige kilder. Et helt bakterie-genom kan immobiliseres til en hybridiseringsbestemmelse, der er beregnet til detektering af bakterier i en typisk steril prøve. Ved bestemmelsen vil det være muligt at detektere talrige bakterie-RNA'er, 30 f.eks. ribosimale RNA'er og transfer-RNA'er. Alternativt kan specifikke DNA-sekvenser, der er komplementære til cellulære RNA'er, klones ind i velkendte plasmid- eller viral-vekto-rer og anvendes som hybridiseringssonder.

Det vil forstås, at når udtrykkene "RNA-sonde" og 35 "DNA-sonde" anvendes, er det ikke hensigten, at alle nucleo- o

DK 163383 B

11 tider indeholdt i sonden skal være ribonucleotider eller 2'--desoxyribonucleotider. Det fundamentale træk ved en RNA-eller DNA-sonde til den foreliggende opfindelses formål er, at sonden skal være af en sådan karakter, at den muliggør 5 stimulering af antistoffer til DNA/RNA- eller RNA/RNA-hy-brider indeholdende en RNA- eller DNA-sonde, som ikke krydsreagerer i en analytisk signifikant grad med de individuelle enkelte strenge, der danner sådanne hybrider. En eller flere af 21-rstillingerne på de nucleotider, der er indeholdt i son-10 den, kan derfor modificeres kemisk, forudsat at antistof-bindingsegenskaberne, der er nødvendige til udførelsen af den foreliggende bestemmelse, opretholdes i en væsentlig grad. Ligeledes kan en sonde, udover eller alternativt til en sådan begrænset 2'-desoxy-modifikation, i almindelighed have 15 enhver anden modifikation langs dens ribose-phosphat-skelet, forudsat at der ikke er nogen væsentlig interferens med specificiteten af antistoffet til det dobbeltstrengede hybridi-seringsprodukt, sammenlignet med dets individuelle enkelte strenge.

20 Når sådanne modifikationer eksisterer i en RNA- eller DNA-sonde, vil det immunogen, der anvendes til at frembringe antistofreagenset, fortrinsvis omfatte én streng, der har i det væsentlige tilsvarende modifikationer, idet den anden streng er i det væsentlige umodificeret RNA eller DNA afhæn-25 gigt af, om det er prøve-RNA eller -DNA, som det er hensigten at detektere. Fortrinsvis vil den modificerede streng i immunogenet være identisk med den modificerede streng i en RNA- eller DNA-sonde. Et eksempel på et immunogen er hybriden poly-(2'-O-methyladenylsyre)»poly(21-desoxythymidylsyre).

30 Et andet eksempel er poly-(2'-O-ethylinosinsyre)*poly-(ribo-cytidylsyre). De følgende eksempler er yderligere eksempler på modificerede nucleotider, der kan være indeholdt i en modificeret sonde: 2'-O-methylribonucleotid, 2'-O-ethylribonu-cleotid, 2'-azidodesoxyribonucleotid, 2'-chlordesoxyribonu-35 cleotid, 2'-O-acetylribonucleotid og phosphorthiolaterne el- o

DK 163383 B

12 ler methylphosphonaterne af ribinucleotider eller desoxy-ribonucleotider. Modificerede nucleotider kan forekomme i sonder som et resultat af indføring under enzymatisk syntese af sonden ud fra et templat. Eksempelvis er adenosin-5 -51-0-(1-thiotriphosphat) (ATPaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA-afhængige RNA-polymeraser og DNA-polymera-ser. Alternativt kan den kemiske modifikation indføres, efter at sonden er blevet fremstillet. Eksempelvis kan en RNA--sonde 21-O-acetyleres med eddikesyreanhydrid under milde 10 betingelser i et vandigt opløsningsmiddel, jfr. D.L. Steward et al., (1972), Biochim. Biophys. Acta 262, 227.

Den kritiske egenskab af en RNA- eller DNA-sonde til i den her omhandlede anvendelse er, at antistoffer frembragt mod sonden duplexeret med en komplementær RNA- eller DNA-15 -streng efter ønske, i deres bindingsegenskaber vil skelne mellem dupiex-formen af sonden og enkeltstrengede nukleinsyrer. Det er denne egenskab, der muliggør detektering af hybridiseret sonde i analyseblandingen uden signifikant baggrundsbinding til den uhybridiserede, enkeltstrengede form 20 af sonden eller vilkårlige, ikke-specifikt bundne, enkeltstrengede prøve-nucleinsyrer. Medens som ovenfor beskrevet visse modifikationer langs ribonucleotid- eller desoxyribo-nucleotid-strengen kan tolereres uden tab af antistof-skel-nen af duplexet fra enkeltstrenge, vil det almindeligvis 25 foretrækkes at anvende RNA-sonder, der er sammensat udelukkende af ribonucleotider, når prøve-polynucleotidet er RNA eller DNA. DNA-sonder kan anvendes med fordel, når prøven er RNA.

30 Immobilisering af sonden

Som allerede beskrevet anvendes sonden til hybridi-sering med prøve-nucleinsyrer på enten en immobiliseret eller en immobiliserbar form. En immobiliserbar form af sonden vil være en form, på hvilken sonden bekvemt kan gøres 35 immobiliseret efter hybridiseringsreaktionen. De midler,

O

DK 163383 B

13 ved hjælp af hvilke sonden til sidst immobiliseres, er ikke kritiske for den foreliggende opfindelse, og der kan anvendes enhver tilgængelig metode, sålænge hybrider /dannet mellem sonden og den sekvens, der har interesse, immobili-5 seres ved hjælp af en egenskab af sonden. Prøve-nucleinsy-rer underkastes således ikke direkte immobilisering.

Når sonden anvendes til hybridiseringsreaktionen på en immobiliseret form, kan den have enhver egnet form, der bevirker, at sonden og vilkårlige bestanddele af reaktions-10 blandingen, der er blevet associeret dermed ved hybridise-ring og/eller ved binding af anti-hybrid-reagenset, derefter kan isoleres eller adskilles fra den resterende blanding ved f.eks. centrifugering, filtrering, chromatografi eller dekantering. En række forskellige sammensætninger og 15 konfigurationer af en immobiliseret sonde vil således være åbenbare og tilgængelige for fagmanden på området. I det væsentlige enhver form for sonden, der er uopløselig i reaktionsblandingen, kan anvendes. Eksempelvis kan sonden ag-gregeres eller på anden måde udfældes, bundet til et uop-20 løseligt materiale, en polymer eller en bærer, eller indesluttet i en gel såsom agarose eller polyacrylamid, jfr.

Meth. Enzymol. 12B, 635 (1968) og PNAS 67, 807 (1970).

Det foretrækkes navnlig at anvende en fast bærer, hvortil sonden er knyttet eller fikseret ved covalente eller ikke-25 -covalente bindinger, idet sidstnævnte omfatter adsorptionsmetoder, der tilvejebringer en passende stabil og kraftig tilknytning. Den faste bærer kan antage en række forskellige fo’rmer og sammensætninger, herunder mikropartikler, perler, porøse og impermeable strimler og membraner, den indre 30 overflade af reaktionskar, f.eks. reagensglas og mikrotiter--plader, og lignende. Midler til binding af en ønsket reaktionspartner til en udvalgt fast bærer vil være en rutinesag for fagmanden på området.

En metode til adsorption af sonden på nitrocellulose-35 membraner involverer mætning af en opløsning af sonde med

O

DK 163383 B

14 natriumiodid og anbringelse af pletter eller filtrering af aliquoter på membranen, jfr. Bresser et al., (1983), DNA _2, 243. Natriumiodidet letter denaturering af sonden~og forøger adsorptionen på membranen. Alternativt kan sonden be-5 handles med glyoxal, sædvanligvis ved koncentrationer omkring 1 molær, og dernæst adsorberes på membranen. Sonden fikseres ved varmebehandling ved ca. 80°C under vakuum i et tidsrum af størrelsesorden fra 2-4 timer, jfr. P.S. Thomas, (1983) , Meth. in Enzymol. 100, 255.

10 Covalent immobilisering af RNA- eller DNA-sonder kan også udføres. Der kan anvendes en lang række forskellige bærematerialer og koblingsmetoder. Eksempelvis kan sonden kobles til phosphocellulose gennem phosphatgrupper aktiveret med carbodiimid eller carbonyldiimidazol, jfr. E.K.F. Bautz 15 og B.D. Hall, (1962), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA .48, 400-408, T.Y. Shih og M.A. Martin, (1974), Biochem. .13, 3411--3418. Også diazogrupper på m-diazobenzoyloxymethylcellulose kan reagere med guanin- og thymidin-rester af polynucleoti-det, jfr. B.E. Noyes og G.R. Stark, (1975), Cell J5, 301-310, 20 J. Reiser et al., (1978), Biochem. Biophys, Res. Commun. 85, 1104-1112. Polysaccharid-bærere eller -understøtninger kan også anvendes med kobling gennem phosphodiester-bindinger dannet mellem det terminale phosphat af polynucleotidet og understøtningens hydroxylgrupper ved vandopløseligt carbo-25 diimid-aktivering, jfr. D. Richwood, (1972), Biochim.

Biophys. Acta 269, 47-50, P.T. Gilham, (1968), Biochem.

1_, 2809-2813, eller ved kobling af nucleofile steder på po-lynucleoti'det med en cyanogenbromid-aktiveret bærer, jfr. D. J. Arndt-Jovin et al., (1975), Eur. J. Biochem. 54. 411-418 og 30 U. Linberg og S. Eriksson, (1971), Eur. J. Biochem. 18, 474-479. Endvidere kan 31-hydroxyl-terminalen af sonden oxideres med periodat og kobles ved Schiff-basedannelse med understøtninger, der bærer amin- eller hydrazidgrupper, jfr.

P.T. Gilham, (1971), Method. Enzymol. 21, 191-197 og H.D.

35 Hansske et al., (1979), Method. Enzymol. J>9, 172-181. Un-

O

DK 163383 B

15 derstøtninger med nucleofile steder kan omsættes med cyanur-chlorid og derpå med polynucleotidet, jfr. H.D. Hunger et al., (1981), Biochem. Biophys. Acta 653. 344-349'.

I almindelighed kan der anvendes en vilkårlig metode 5 til immobilisering af sonden, forudsat at den komplementære enkeltstrengede sekvens er tilgængelig til hybridisering til prøve-nucleinsyrer. Bestemte metoder eller materialer er ikke kritiske for den foreliggende opfindelse.

• Et særlig attraktivt alternativ til anvendelse af di-10 rekte immobiliseret sonde er anvendelsen af en immobiliser-bar form for sonde, der tillader, at hybridiseringen foregår i opløsning, hvor de kinetiske forhold er hurtigere. Normalt vil man ved en sådan udførelsesform anvende en sonde, der omfatter et reaktivt sted, der er i stand til at danne 15 en stabil covalent eller ikke-covalent binding med en reaktionspartner og opnå immobilisering ved udsættelse for en immobiliseret form for en sådan reaktionspartner. Fortrinsvis er et sådant reaktivt sted i sonden et bindingssted, f.eks. en biotin- eller hapten-del, der kan bindes specifikt og ik-20 ke-covalent med et bindingsstof, f.eks. avidin eller et antistof, der tjener som reaktionspartneren.

I det væsentlige ethvert par af stoffer kan omfatte parret af reaktivt sted/reaktiv partner, der udviser en passende affinitet til reaktion til dannelse af en stabil bin-25 ding, dvs. en binding eller kobling mellem de to, der forbliver i det væsentlige intakte under de påfølgende analysetrin, principielt adskillelses-og detekterings-trinene. Den dannede binding kan være en covalent binding eller en ikke--covalent sammenknytning, idet sidstnævnte især foretrækkes, 30 når den er karakteriseret ved en grad af selektivitet eller specificitet. I tilfælde af en sådan foretrukken bindingsdannelse vil det reaktive sted på sonden blive betegnet som et bindingssted, og reaktionspartneren som et bindingsstof, hvormed den danner en ikke-covalent, almindeligvis specifik bin-35 ding eller sammenknytning.

O

DK 163383 B

16 I en sådan foretrukken udførelsesform kan bindingsstedet være til stede i en enkeltstrenget hybridiserbar del eller i en enkeltstrenget eller dobbeltstrenget, ikke-hybri-diserbar del af sonden eller kan være til stede som et re-5 sultat af en kemisk modifikation af sonden. Eksempler på bindingssteder, der eksisterer i nucleotidsekvensen, findes,når sonden omfatter en promotorsekvens, f.eks. lac-promotor eller trp-promotor, der kan bindes med et promotor-protein, f.eks. bakteriofag-promotorer, RKA-polymerase, eller omfatter en 10 operator-sekvens, f.eks. lac-operator, der kan bindes ved hjælp af et repressor-protein, f.eks. lac-repressor, eller omfatter sjældne, antigene nucleotider eller sekvenser, f.eks.

5-brom- eller 5-iod-desoxy-uridin eller Z-DNA, der kan bindes ved hjælp af specifikke antistoffer, jfr. også GB patent-15 skrift nr. 2.125.964. Bindingssteder indført ved kemisk modifikation af det polynucleotid, der er indeholdt i sonden, er særlig nyttige og involverer normalt binding af en del af et specifikt bindingspar til sonde-nucleinsyren. Egnede bindingspar, hvorfra der kan vælges, omfatter biotin/avidin 20 (inklusive æggehvide-avidin og streptavidin), haptener og an-tigener/antistoffer, carbonhydrater/lectiner, enzymer/inhibi-torer og lignende. Når bindingsparret består af en proteindel og en ikke-proteindel, vil det normalt være foretrukkent at binde ikke-proteindelen til sonden, eftersom protein-delen kan 25 være instabil under denatureringsbetingelserne ved hybridise-ring af sonden. Foretrukne systemer omfatter binding af sonden med biotin eller et hapten og anvendelse af immobilise-ret avidin eller anti-hapten-antistofreagens.

Når sonden anvendes til hybridisering med den se-30 kvens, der har interesse, på en immobiliserbar form, kan de påfølgende trin med immobilisering af de dannede duplexer ved hjælp af en egenskab af sonden og tilsætning af anti-hy-brid-antistofreagenset, foregå i en vilkårlig ønsket orden. Immobilisering og anti-hybrid-tilsætning kan udføres ved sam-35 tidig tilsætning af de involverede reagenser og materialer,

O

DK 163383 B

17 eller den ene operation kan gå forud for den anden, med eller uden indskudte vaske- eller adskillelsestrin, og i vilkårlig rækkefølge. Når ordnede tilsætninger følges,'vil man naturligvis tage koncentrationerne af de tilsatte reagenser 5 i betragtning, således at man ikke overmætter de dannede hybrider og inhiberer interaktion dermed af de øvrige tilsatte materialer.

Skønt immobiliserede sonder eller immobiliserbare sonder, der bliver bundet til faste bærere ved specifikke bin-10 dingsprocesser, der er beskrevet ovenfor, foretrækkes, kan immobiliserbare sonder bindes til bærere ved processer med forholdsvis lav specificitet. I dette tilfælde vil bæreren binde den hybridiserede sonde, men ikke den ikke-hybridise-rede form. Mængden af hybrid måles dernæst med antistof-rea-15 genset. Et eksempel på en bærer af denne type er hydroxyl-apatit, der binder DNA/RNA- og RNA/RNA-duplexer, men ikke den enkeltstrengede type, jfr. Brenner og Falkow, Adv. in Genet. 16., 81 (1973) .

En kemisk aktiv eller aktiverbar gruppe kan også ind-20 føres i sonden og tillades at reagere med den faste bærer efter hybridiseringen. Dette system vil give en covalent im-mobiliseret sonde, og mængden af hybrid, der er koblet til bæreren, kan bestemmes med antistofreagenset.

25 Anti-hybrid-antistofreagens og detekteringsmetoder

Det her omhandlede antistofreagens er principielt karakteriseret ved dets evne til at binde de DNA/RNA- eller RNA/RNA-hybrider, der dannes mellem sonden og komplementære prøve-nucleinsyrer til signifikant udelukkelse af enkelt-30 strengede polynucleotider. Som allerede angivet ovenfor kan antistofreagenset bestå af hele antistoffer, antistof-fragmenter, polyfunktionelle antistof-aggregater eller i almindelighed ethvert stof, der omfatter et eller flere specifikke bindingssteder fra et antistof for RNA/RNA eller 35 DNA/RNA, alt efter tilfældet. Når stoffet har form af et

O

DK 163383 B

18 helt antistof, kan det tilhøre enhver af klasserne og underklasserne af kendte immunoglobuliner, f.eks. IgG eller IgM. Ethvert fragment af ethvert sådant antistof, der bi-beholder specifik bindingsaffinitet for den hybridiserede 5 sonde, kan også anvendes, f.eks. fragmenterne af IgG, det konventionelt kendes som Fab, F(ab') og Ftab'^· Desuden kan der, når dette er passende, anvendes aggregater, polymere, derivater og konjugater af immunoglobuliner eller deres fragmenter.

10 Immunoglobulin-kilden til antistofreagenset kan fås på enhver tilgængelig måde, f.eks. ved hjælp af konventionelle antiserum- og monoklonale metoder. Antiserum kan fås ved veletablerede metoder, der involverer immunisering af dyr, f.eks. en mus, en kanin, et marsvin eller en ged, med 15 et passende immunogen. Immunogiobulinerne kan også fås ved somatiske cellehybridiseringsmetoder, og disse resulterer i, hvad der almindeligvis betegnes som monoklonale antistoffer, idet metoderne også indbefatter anvendelsen af et passende immunogen.

20 Immunogener til stimulering af antistoffer, der er specifikke for DNA/RNA-hybrider, kan omfatte homopolymere eller heteropolymere polynucleotid-duplexer. Blandt de mulige homopolymere-duplexer foretrækkes især poly(rA)*poly(dT), jfr. Kittagwa og .Stollar (1982), Mol. Immunol. 19., 413. I 25 almindelighed vil man imidlertid fortrinsvis anvende hetero-polymer-duplexer, og disse kan fremstilles på en række forskellige måder, herunder transskription af ^X174-virion-DNA med RNA-polymerase, jfr. Nakazato (1980) , Biochem. .19., 2835.

De udvalgte RNA/DNA-duplexer adsorberes til et methyleret pro-30 tein eller forbindes på anden måde til et konventionelt immu-nogent bæremateriale, f.eks. okseserumalbumin, og injiceres i det ønskede værtsdyr, jfr. også Stollar, (1980), Meth. Enzymol. Ί0_, 70.

Antistoffer til RNA/RNA-duplexer kan frembringes mod 35 dobbeltstrengede RNA'er fra vira såsom rheovirus eller Fiji-

O

DK 163383 B

19 syge-virus, der bl.a. inficerer sukkerrør. Også homopolymer--duplexer såsom blandt andre poly(rl)*poly(rC) eller poly-(rA)‘poly(rU), kan anvendes til immunisering'som ovenfor omtalt.

5 Bindingen af antistofreagenset til det hybridiserede sonde-duplex ifølge den foreliggende opfindelse kan detek-teres ved hjælp af enhver bekvem teknik. Med fordel vil antistofreagenset selv være mærket med en detekterbar kemisk gruppe. En sådan kemisk gruppe kan være ethvert materiale 10 med en detekterbar fysisk eller kemisk egenskab. Sådanne materialer er blevet udviklet godt inden for immunobestemmel-sesområdet, og i almindelighed kan så godt som enhver mærkning, der kan anvendes ved sådanne metoder, anvendes i forbindelse med nærværende opfindelse. Særligt anvendelige er 15 enzymatisk aktive grupper, f.eks. enzymer, jfr. Clin. Chem.

22. 1243 (1976), US Reissue patentskrift nr. 31.006 og GB patentskrift nr. 2.019.408, enzymsubstrater, jfr. US patentskrift nr. 4.492.751, cofaktorer, jfr. US patentskrifterne nr. 4.230.797 og 4.238.565, og enzyminhibitorer, jfr. US patentskrift nr.

20 4.134.792, endvidere fluorescerende midler, jfr. Clin. Chem.

25, 353 (1979), chromoforer, luminescerende midler såsom ke-miluminescerende midler og bioluminescerende midler, jfr. US -patentskrift nr. 4.380.580, specifikt bindelige ligander såsom biotin, jfr. EP patentskrift nr. 63.879, eller et 25 hapten, jfr. PCT-publikation nr. 83-2286, og endvidere radio-isotoper såsom JH, DS, e, DI og qC. Sådanne mærkninger og mærkningspar detekteres på basis af deres egne fysiske egenskaber, f.eks. fluorescerende midler, chromoforer og radioisotoper, eller deres reaktive egenskaber eller bindings-30 egenskaber, f.eks. enzymer, substrater, cofaktorer og inhibitorer. Eksempelvis kan et med cofaktor mærket antistof detekteres ved tilsætning af det enzym, for hvilket mærkningen er en cofaktor, og et substrat for enzymet. Et antistof, der er mærket med et hapten eller en ligand, f.eks. biotin, kan 35 detekteres ved tilsætning af et antistof til haptenet eller

O

DK 163383 B

20 et protein, f.eks. avidin, der binder liganden, mærket med et detekterbart molekyle. Et sådant detekterbart molekyle kan være et eller andet molekyle med en målelig fysisk egenskab, f.eks. fluorescens eller absorbans, eller en deltager 5 i en enzymreaktion, jfr. f.eks. den ovenstående liste. Eksempelvis kan man anvende et enzym, der indvirker på et substrat til dannelse af et produkt med en målelig fysisk egenskab. Eksempler på sidstnævnte omfatter, men er ikke begrænset til 3-galactosidase, alkalisk phosphatase og peroxidase.

10 Andre mærkningsmetoder vil være åbenbare for en almindelig fagmand på området.

Alternativt kan antistofreagenset detekteres på basis af en nativ egenskab, f.eks. dens egen antigenicitet. Et mær- i ket anti-(antistof)-antistof vil bindes til det primære anti-15 stofreagens, når mærkningen for det andet antistof er en kon ventionel mærkning som ovenfor. Endvidere kan antistof detekteres ved komplement-fiksering eller anvendelse af mærket protein A, samt ved andre metoder, der kendes inden for teknikken til detektering af antistoffer.

20 Når antistofreagenset er mærket, hvilket er det fore trukne, associeres eller forbindes mærknings-delen og antistofreagenset til hverandre ved direkte kemisk binding, f.eks. en sådan, der omfatter covalente bindinger, eller ved indirekte binding, f.eks. ved inkorporering af mærkning i en mi-25 krokapsel eller et liposom, som igen er forbundet til antistoffet. Mærkningsmetoder er velkendte i teknikken, og der kan i forbindelse med den foreliggende opfindelse anvendes enhver bekvem metode.

30 Reaktionsblanding

Den testprøve, der skal analyseres, kan være ethvert medium af interesse og vil almindeligvis være en væskeprøve af medicinsk, veterinær, miljømæssig, ernæringsmæssig eller industriel betydning. Humane og animalske prøver og legems-· 35 væsker kan specielt analyseres ved hjælp af den foreliggende

O

DK 163383 B

21 metode, herunder urin, blod (serum eller plasma), mælk, cere-brospinalvæske, spyt, fækalt materiale, lungeaspirater, svælgtamponer, genitaltamponer og -exudater, rektal—tamponer og nasofarnygale aspirater. Når testprøven, der fås fra 5 patienten eller en anden kilde, og som skal analyseres, indeholder principielt dobbeltstrengede nucleinsyrer, således som indeholdt i celler, behandles prøven til denaturering af nucleinsyrerne, og om nødvendigt først til frigørelse af nucleinsyrer fra celler. Denaturering af nucleinsyrer udfø-10 res fortrinsvis ved opvarmning i kogende vand eller ved alkalisk behandling, f.eks. i 0,1 N natriumhydroxidopløsning, som om ønsket samtidig kan anvendes til lyse af celler. Frigørelse af nucleinsyrer kan f.eks. også opnås ved mekanisk sprængning (frysning/optøning, friktionsbehandling eller so-15 nisk behandling), fysisk-kemisk sprængning (detergenter såsom Triton, Tween, natriumdodecylsulfat, alkalibehandling, osmotisk chok eller varmebehandling) eller enzymatisk lyse (lysosym, proteinase K eller pepsin). Det fremkomne testmedium vil indeholde nucleinsyrer på enkeltstrenget form, 20 som dernæst kan bestemmes i overensstemmelse med den omhandlede hybridiseringsmetode.

Som det er kendt i teknikken, kan der anvendes forskellige hybridiseringsbetingelser ved analysen. Typisk vil hybridisering foregå ved svagt forøgede temperaturer, f.eks.

25 mellem ca. 35 og ca. 75°C og almindeligvis omkring 65°C, i en opløsning indeholdende puffer ved en pH-værdi mellem ca.

6 og ca. 8 og med passende ionstyrke, f.eks. 2XSSC, hvor 1XSSC = 0,15 M natriumchlorid og 0,015 M natriumcitrat, pH = 7,0, protein såsom okseserumalbumin, Ficoll (et varemærke, 30 der identificerer en copolymer af sucrose og epichlorhydrin, hvilken copolymer sælges af Pharmacia Fine Chemicals, Piscat-away, NY), polyvinylpyrrolidon og en denatureret fremmed-DNA, f.eks. fra kalvethymus eller laksesperma. Graden af komplementaritet mellem prøve- og sonde-strengene, som kræves for, 35 at hybridisering kan finde sted, afhænger af betingelsernes

O

22

DK 163383 B

strenghed. Udstrækningen og specificiteten af hybridisering påvirkes af de følgende principielle betingelser: 1. Renheden af nucleinsyrepræparatet.

2. Basesammensætning af sonden. G-C-basepar vil ud- 5 vise større termisk stabilitet end A-T- eller A-u-basepar.

Hybridiseringer, der involverer højere G-C-indhold, vil således være stabile ved højere temperaturer.

3. Længde af homolog basesekvens. Enhver kort sekvens af baser, f.eks. mindre end 6 baser, har en høj grad 10 af sandsynlighed for at være til stede i mange nucleinsyrer.

Der kan således opnås lille eller ingen specificitet ved hybridiseringer, der involverer sådanne korte sekvenser. Den omhandlede homologe sondesekvens vil være mindst 10 baser, almindeligvis 20 baser eller mere, og fortrinsvis mere end 15 100 baser. Fra et praktisk synspunkt vil den homologe son desekvens ofte ligge mellem 300 og 1000 nucleotider.

4. Ionstyrke. Graden af forstærkning tiltager, når ionstyrken af inkuberingsopløsningen tiltager. Den termiske stabilitet af hybrider forøges også.

20 5. Inkuberingstemperatur. Optimal forstærkning fore kommer ved en temperatur ca. 25-30°C under smeltetemperaturen (Tm) for et givet duplex. Inkubering ved temperaturer signifikant under optimum tillader mindre relaterede basesekvenser at hybridisere.

25 6. Nucleinsyrekoncentration og inkuberingstid. Med henblik på at drive reaktionen mod hybridisering vil normalt enten en hybridiserbar prøve-nucleinsyre eller en sonde-nu-cleinsyre være til stede i overskud, almindeligvis i et 100 ganges overskud eller mere.

30 7. Denatureringsreagenser. Tilstedeværelsen af mid ler, der opbryder hydrogenbindinger, f.eks. formamid og urinstof, forøger stringensen af hybridisering.

8. Inkuberingstid. Jo længere inkuberingstiden er, desto mere fuldstændig vil hybridiseringen være.

35 9. Rumfangseksklusionsmidler. Tilstedeværelsen af

O

DK 163383 B

23 disse midler, f.eks. dextran og dextransulfat, antages at forøge de effektive koncentrationer af de hybridiserende elementer, hvorved graden af resulterende hybridisefing forøges.

5 Normalt vil de temperaturbetingelser, der vælges til hybridisering, være uforenelige med bindingen af antistof-reagens til dannede hybrider og detektering af det omhandlede mærknings-respons. Som følge heraf vil antistofreagens-bindingstrinet og mærkningsdetekteringstrinet fore-10 gå efter fuldendelse af hybridiseringstrinet. Reaktionsblandingen vil sædvanligvis blive bragt på en temperatur i området fra ca. 3°C til ca. 40°C, hvorpå bindings- og detekterings-trinene udføres. Fortynding af hybridiserings-blandingen forud for tilsætning af antistofreagens er øn-15 skelig, når salt- og/eller formamid-koncentrationerne er tilstrækkeligt høje til at interferere signifikant med antistofbindingsreaktionen.

Det kan vise sig ved en bestemt analysesituation under anvendelse af en RNA-sonde, at sonden er udsat for par-20 tiel degradering ved alkalisk hydrolyse af phosphodiester-bindingerne eller ved nærværelsen af ribonucleaser. I det førstnævnte tilfælde kan hydrolyse reguleres ved undgåelse af udsættelse af sonden for en pH-værdi højere end ca. 10. Ribonucleaser kan effektivt inhiberes ved tilstedeværelsen 25 af sådanne stoffer som natriumdodecylsulfat, aurintricarb-oxylsyre, ribonucleosid-vanadyl-komplekser, heparin, di-ethylpyrocarbonat og proteinholdige inhibitorer isolerede fra pattedyrskilder.

30 Reagenssystem

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der som nævnt et reagenssystem, dvs. en reagenskombination eller reagensmidler, der omfatter alle de essentielle bestanddele, der kræves til gennemførelse af en ønsket ana-35 lysemetode. Reagenssystemet foreligger i en kommerciel,

O

24

DK 163383 B

t pakket form, som en komposition eller blanding, når foreneligheden af reagenserne tillader dette, i en testmaterialekonfiguration eller mere almindeligt i form af et testsæt, dvs. en pakket kombination af en eller flere beholdere, or-5 ganer eller lignende, der indeholder de fornødne reagenser, og som almindeligvis omfatter skrevne instruktioner til udførelse af analyser. Reagenssystemet ifølge den foreliggende opfindelse omfatter alle konfigurationer og sammensætninger til udførelse af de forskellige hybridiseringer, der er 10 beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

I alle tilfælde vil reagenssysternet omfattet (1) en immobiliseret eller immobiliserbar sonde som her beskrevet og (2) antistofreagenset, fortrinsvis mærket med en detek-terbar kemisk gruppe. En test-sæt-form for systemet kan 15 yderligere omfatte hjælpekemikalier, f.eks. bestanddelene af hybridiseringsopløsningen og denatureringsmidler, der er i stand til at omdanne dobbeltstrengede nucleinsyrer i en prøve til den enkeltstrengede form. Fortrinsvis inkluderes der også et kemisk lyse- og denatureringsmiddel, f.eks. alkali, til 20 behandling af prøven til frigørelse af enkeltstrenget nuclein-syre derfra.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler .

25 Eksempel 1

Hybridiseringsanalyse til detektering af bakteriuri under anvendelse af immobiliseret RNA-sonde A. Fremstilling af RNA-sonden

Et 800 basepar-fragment af tuf A-genet, der koder for 30 proteinet EF-Tu i Escherichia coli, er afledt af bakterio-fagen M13-10(ATCC 39403-131). Fragmentet klones mellem Hind III- og Eco RI-restriktions-endonuclease-steder af M13mp9 (New England Biolabs, Beverly, MA). Dette plasmid dyrkes i en E. coli-vært JM103 (Alac, pro), supE, thi, strA, sbcBl5, 35 hsdR4, F'traD36, proABlac IqZMl5. tuf A-fragmentet udskæres

O

DK 163383 B

25 fra M13-10 og klones i Hind III- og Eco Ri-stederne af den pSP64-plasmidvektor, der kan fås fra Promega Biotec., Madison, WI.

15 ml af en natten over henstillet kultur af E. coli 5 JM103, der bærer pSP64-plasmidet indeholdende tuf A-fragmen- tet, podes i 1 liter 2xYT-næringsvæske i en toliterkolbe. Kulturen inkuberes ved 37°C i 3 timer, og cellerne indhøstes.

De lyseres, og DNA'en isoleres ved phenol/chloroform-ekstraktioner. Det lukkede, cirkulære plasmid-DNA renses ved cen-10 trifugering i en cesiumchlorid-ethidiumbromid-gradient, jfr.

T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Det rensede plasmid chromatograferes på Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) i 10 mM tris-hy-15 drochlorid-puffer, pH = 7,5, indeholdende 0,1 M NaCl og 1 ml·! EDTA. Den udstrømmende væske, der indeholder DNA, opsamles, og DNA'en fældes med kold ethanol. Fældningen optages i 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM dithiothreitol og fordøjes i 1 time med en enhed EcoRI pr. mikrogram (pg) DNA. Dernæst ekstra-20 heres reaktionsblandingen én gang med en blanding af phenol og chloroform og én gang med chloroform, og DNA'en fældes med kold ethanol. Fældningen opløses i 10 mM tris-hydrochlorid--puffer, pH = 7,4, hvorved der fås 500 pg DNA pr. ml.

En reaktionsblanding på 500 mikroliter (pi) fremstil-25 les med følgende sammensætning: 50 pg af EcoRI-fordøjelses-produktet, 40 mM tris-hydrochlorid-puffer, pH = 7,5, 6 mM ' MgCl2, 2 mM spermin, 0,5 mM ATP, CTP, UTP og GTP, 10 mM dithiothreitol, 500 enheder RNAasin (Promga Biotec) og 50 enheder RNA-polymerase fra bakteriofagen SP6 (Promega Biotec).

30 Reaktionsblandingen får lov at henstå i 1 time ved stuetemperatur, og der tilsættes dernæst 50 enheder yderligere RNA--polymerase, og blandingen får lov at reagere i yderligere 1 time.

DNA i reaktionsblandingen fordøjes i 10 minutter ved 35 37°C med 10 jug RNase-fri DNase. Reaktionsblandingen ekstra-

DK 163383 B

O

26 heres med en blanding af phenol og chloroform og chromato-graferes på Sephadex G-50 i 10 mM tris-hydrochlorid-puffer, pH = 7,4, og 0,1 M NaCl. RNA'en opsamles og fældes med kold ethanol. Fældningen opløses i 50 mM natriumacetatpuffer, pH 5 =5,0, indeholdende 1 mM EDTA.

Den ovenfor beskrevne RNA-sonde immobiliseres på acryl-perler med reaktive epoxidgrupper, der er tilgængelige under handelsnavnet Eupergit C fra Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY. 3 ml 50 mM natriumacetatpuffer, 10 pH = 4,5, indeholdende 250 mg RNA-sonde, omrystes ved stuetemperatur i 10 timer sammen med 200 mg Eupergit C. Pufferen fjernes og analyseres for RNA til bestemmelse af udstrækningen af immobilisering, der har fundet sted.

Harpiksen vaskes derpå ved kortvarig omrystning med 15 1 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH = 6,5, indeholdende 1,2 M NaCl, 0,5% (vægt/rumfangsenhed) natriumdodecylsulfat, 1 mg polyvinylpyrrolidon pr. ml og 5 mg okseserumalbumin pr. ml. Denne hybridiseringsopløsning fjernes og erstattes med 1 ml frisk hybridiseringsopløsning, og suspensionen inkube-20 res ved 65°C i 1 time til fjernelse af ikke-covalent bundet RNA-sonde. Opløsningen fjernes, og harpiks-RNA-sonde-konju-gatet suspenderes i 50 ml af hybridiseringsopløsningen.

B. Fremstilling af methyleret thyroglobulin 25 100 mg oksethyroglobulin (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO) kombineres med 10 ml vandfri methanol og 400 pi 2,55 M HC1 i methanol. Denne blanding omrøres i en roterende blander ved stuetemperatur i 5 dage. Fældningen opsamles ved centrifugering og vaskes to gange med methanol og to gange 30 med ethanol, hvorpå den tørres under vakuum natten over. Der fås ca. 82 mg tørt pulver.

35

O

DK 163383 B

27 C. Fremstilling af antistof til DNA/RNA-hybrid

En DNA/RNA-hybrid fremstilles ved transskription af ^Xl74-virion-DNA med RNA-polymerase som beskrevet af Naka-zato, jfr. Biochem. .19, 2835 (1980) . 150 mikrogram af hy-5 briden i 250 μΐ 20 mM tri-hydrochlorid-puffer, pH = 7,4, og 1 mM EDTA kombineres med 150 pg methyleret thyroglobu-lin i 250 pi vand. Der dannes en fældning, der suspenderes i tris-puffer. Den fremkomne blanding emulgeres med et lige så stort rumfang af Freunds adjuvans. Mus immuniseres hver 10 for sig med 0,5 ml af suspensionen, og når der udvikles se-rum-antistof-titere til RNA/DNA, fremstilles der hybridomer, der screenes for monoklonalt antistof specifikt for RNA/DNA, jfr. Stuart et al., (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78.

3751 og Galfre og Milstein (1981), Meth. in Enzymol. T5, 1.

15 De klonede hybridomer propageres i den peritoneale hulhed hos mus til frembringelse af en stor mængde antistof. Ascitesvæsken påføres en søjle af Affigel-Blue-harpiks (Bio--Rad Laboratories, Richmond, VA), ækvilibreret med 10 mM tris-hydrochlorid-puffer, pH = 8,0, og 0,15 M NaCl. Ved den-20 ne chromatrografi fjernes albumin, og det eluerede protein, der indeholder antistoffet, chromatograferes på DEAE-sepha-rose (Pharmacia Fine Chemicals). Chromatogrammet udvikles med en lineær gradient af 10 mM tris-hydrochlorid, pH = 8,0, til 10 mM tris-hydrochlorid, pH = 8,0, 200 mM NaCl. Hoved-25 spidsen af elueret protein indeholder det monoklonale antistof frit for transferrin og albumin.

D. Fremstilling af β-galactosidase-antistof-konjugat

Sulfhydryl-rester på β-galactosidase blotlægges ved 30 reduktion med dithiothreitol. β-galactosidase (30000 enheder, kvalitet VIII, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 2 ml 0,1 M Ν-2-hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethan-sulfonat (HEPES), pH = 7,0, 0,09 M NaCl, kombineres med 3,5 pmol dithiothreitol og får lov at henstå ved stuetemperatur i 35 4 timer. Dithiothreitolen fjernes ved chromatografi på en o

DK 163383 B

28 2,5 cm x 80 cm-søjle af Sepharose 6B Cl (Pharmacia Fine Chemicals) i den ovenfor beskrevne puffer. Fraktioner indeholdende protein kombineres i en pool. Antallet af inol af sulfhydrylgrupper pr. mol enzym måles ved metoden ifølge 5 Ellman, jfr. Ellman (1959) , Arch. Biochem. Biophys. J32, 70.

5,3 mg succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyclo-hexan-l-carboxylat (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) opløses i 250 pi vandfrit Ν,Ν-dimethylformamid, og der sættes en aliquot på 40 pi til 3 ml 0,1 M HEPES-puffer, pH 10 =7,0, 0,15 M NaCl. En 25 pi aliquout af denne vandige op løsning sættes til 825 pi HEPES/NaCl-puffer og 100 pi 1 mM glutathion. Når denne reaktionsblanding har været henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter, bestemmes den uomsatte glutathion ved hjælp af Ellman's metode.

15 Monoklonalt antistof til DNA/RNA kombineres med 400 pmol SMCC i et slutrumfang på 533 pi HEPES/0,15 M NaCl--puffer og får lov at reagere i 1 time ved 30°C. Reaktionsblandingen chromatograferes på en 1 cm x 24 cm-søjle af Biogel P-2-harpiks (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Ca) og 20 elueres med HEPES/0,15 M NaCl-puffer. Udstrømmende væske indeholdende protein pooles, og proteinkoncentrationen bestemmes ved metoden ifølge Sedmack og Grossberg, Anal., Biochem.

79, 544 (1977), og antallet af maleinimidgrupper bestemmes ved titrering med glutathion som ovenfor beskrevet.

25 En portion på 2,8 mg af antistof-maleinimid-adduktet kombineres med 10 mg af dithiothreitol-behandlet 8-galacto-sidase og får lov at reagere i 4 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen chromatograferes ved 4°C på en 2,5 cm x 80 cm-søjle af Sepharose 6B Cl i HEPES/0,15 M NaCl ved 30 4°C. Strømningshastigheden sættes til 4 ml pr. time, og der opsamles fraktioner på hver 3 ml. Fraktionerne analyseres for β-galactosidase-aktivitet og antistof-bindingsaktivitet. Fraktioner, der har begge aktiviteter, slås sammen.

35

O

DK 163383 B

29 E. Hybridiseringsbestemmelse 10 ml aliquoter af urin fra patienter med mulige urinvejsinfektioner centrifugeres ved 10000 x G i K) minutter, og de ovenstående væsker dekanteres og kasseres. Sedi-5 menterne suspenderes i 50 μΐ 10 mM tris-hydrochlorid-puffer, pH = 8,0, indeholdende 20 mg æggehvide-lysozym pr. ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,1 M NaCl, og 5 mM EDTA. Reaktionsblandingen får lov at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter, og der tilsættes derefter 10 μΐ 1 M NaOH, og io den fremkomne alkaliske opløsning får lov at henstå ved stuetemperatur i 10 minutter til denaturering af DNA fra mulige bakterier i den oprindelige prøve. Reaktionsblandingerne neutraliseres ved tilsætning af 250 pi af den tidligere beskrevne pufrede suspension af harpiks-RNA-konjugatet.

15 Dette hybridiseringssystem inkuberes ved ca. 65°C i 15 timer under forsigtig omrystning.

Harpiks-RNA-sonde-konjugatet får lov at sætte sig, og væsken dekanteres. Harpiksen vaskes to gange ved suspendering i 0,5 ml 0,1 M natriumphosphat-puffer, pH = 7,4, 20 pr. gang, og 5 mg okseserumalbumin pr. ml. Harpiksen kombineres med 300 μΐ 0,1 M natriumphosphat-puffer, pH = 7,4, indeholdende 10 mM MgCl2, 5 mg okseserumalbumin pr. ml og 0,4 pg β-galactosidase-antistof pr. ml (anti-DNA/RNA). Blandingen omrystes forsigtigt i 1 time ved stuetemperatur, og harpik-25 sen vaskes to gange, i 1 minut pr. gang, med 5 ml 0,1 M natriumphosphat-puffer, pH = 7,4, indeholdende 0,1% Tween 20--detergent. Den vaskede harpiks omrøres forsigtigt i 30 minutter ved stuetemperatur i 1,0 ml 0,1 M natriumphosphat--puffer, pH = 7,4, indeholdende 800 pM 7-8-galactosyl-3-30 -[6-aminohexylcarboxamid]coumarin, jfr. Worah et al., Clin.

Chem., 27, 673 (1981). Ved afslutningen af denne inkubering måles fluorescensen af opløsningen under anvendelse af eks-citation ved 400 nm og emission ved 450 nm.

Fluorescens-signaler, der fremkaldes med urinprøver 35 indeholdende mere end 100000 bakterier pr. ml, vil være

O

30

DK 163383 B

signifikant højere end for de prøver, der indeholder mindre end 5000 bakterier pr. ml. Denne metode kan anvendes som en kvalitativ test for bakteriuri.

5 Eksempel 2 -

Hybridiseringsbestemmelse for E. Coli 23s-ribosomal RNA under anvendelse en immobiliseret DNA-sonde

A. DNA-sonde for 23s RNA

DNA-sonden er et EcoRI/Bglll-fragment fra rrnD-ope-10 ronen, der koder for 23s RNA i E. coli, jfr. Jinks-Robert-son et al., Cell _33, 865 (1983). Sonden omfatter ca. 2/3 af 23s RNA-sekvensen fra 31-hydroxylet og klones i en M13--virus-vektor, hvorved der fås enkeltstrenget virion-DNA, der er komplementær til cellulær, ribosomal RNA. M13-vi-15 rusen dyrkes i E. coli stamme JM103 og isoleres fra dyrkningsmediet ved fældning med polyethylenglycol. Virion--DNA'en renses fra viruspartiklerne ved phenolekstraktion, jfr. Maniatis et al., ovenfor.

Den rensede DNA gøres 0,3 M med hensyn til NaOH og 20 inkuberes ved 37°C i 4 timer til nedbrydning af forurenende RNA. Blandingen neutraliseres ved tilsætning af 30% eddikesyre, og DNA fældes med kold ethanol.

B. Antistof til DNA/RNA

25 Mus immuniseres med DNA/RNA-hybrid som beskrevet i eksempel 1, og miltceller fusioneres med SP 2/0-Agl4-mye-lomceller (tilgængelige fra American Type Culture Collection, Rockville, MD). Hybridomer, der sekreterer antistoffer, der er specifikke for DNA/RNA, identificeres som beskrevet 30 ovenfor. Det mest foretrukne hybridom er det, der er deponeret ved American Type Culture Collection, Rockville, MD, under ATCC HB 8730.

Antistoffer renses fra ascitesvæske ved HPLC under anvendelse af en LDC/Milton Roy-væskechromatograf udstyret 35 med CI-10-integrator. Ascitesvæsken dialyseres mod 0,01 M

O

DK 163383 B

31 kaliumphosphatpuffer, pH = 6,8, centrifugeres til fjernelse af partikelformet materiale og ledes gennem et 0,22 jam nitrocellulosefilter. 1-2 ml af behandlet ascitesvæske påsættes en 10 mm x 250 mm-anionbyttersøjle, der er ækyilibreret 5 med 0,01 M kaliumphosphat, pH = 6,84. Chromatogrammet fremkaldes med en 60 minutters lineær gradient fra 0,01 M kaliumphosphatpuffer, pH = 6,84, til 0,085 M kaliumphosphat, pH = 6,40, ved en strømningshastighed på 1 ml/minut. Den spids, der indeholder IgG, koncentreres, dialyseres mod phosphat-10 -pufret saltopløsning, pH = 7,4, centrifugeres til fjernel se af muligt denatureret protein, og IgG-koncentrationen bestemmes på basis af absorbansen ved 280 nm under anvendelse af e} mg/ml =1,40. i cm 15 C. Immobilisering af DNA-sonden

Meta-nitrophenylgrupper indføres på cellulosepulver og omdannes derpå til diazoniumsaltet til covalent immobilisering af DNA'en.

690 mg (2,46 mM) 1-[(m-nitrobenzyloxy)-methyl]-pyri-20 diniumchlorid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) kombineres med 128 mg natriumacetat i 7,7 ml vand. Der tilsættes 2 g Sigmacell, type 20 cellulose (Sigma Chemical Co.), og der blandes i ca. 15 minutter i et bægerglas nedsænket i et vandbad ved 60°C. Cellulosen bliver næsten tør, og den anbringes 25 i en ovn ved 135-140°C i 45 minutter. God inkorporering af m-nitrophenyl-rester er afhængig af vedligeholdelse af temperaturen ved en så høj værdi som muligt i løbet af dette tidsrum. Såfremt temperaturen er for høj, karameliseres cellulosen.

30 Efter varmebehandlingstrinet suspenderes cellulosen i vand, og klumper opbrydes ved gnidning af cellulosen i vand, indtil partiklerne kan passere gennem en 150 pm-tråd-sigte. Cellulosen vaskes tre gange med 120 ml vand pr. gang og to gange med 50 ml ethanol pr. gang. Cellulosen tørres 35 dernæst natten over i vakuum.

O

32

DK 163383 B

Nitrophenylgrupper på cellulosen reduceres ved inkuber ing af cellulosen ved 65°C i 1 time i 10 ml 0,1 M NajCO^ indeholdende 2,0 g natriumdithionit. Dernæst vaskes^'cellulosen flere gange med vand på en tragt af sintret glas og 5 én gang med 30%'s eddikesyre. Endelig vaskes den tre yderligere gange med vand og tørres i vakuum ved 40-50°C natten over.

250 mg af den reducerede cellulose sættes til 5,0 ml 1,2 M HC1 ved 0°C, og der tilsættes 13 pi 100 mg NaN02 pr.

10 ml. Denne blanding får lov at henstå i 1 time, og i løbet af dette tidsrum testes blandingen for nærværelsen af NaN02 med stivelse-iod-papir. Såfremt testen er svag eller negativ, tilsættes der 20 pi NaN02·

Ved afslutning af reaktionsperioden vaskes cellulosen 15 i rækkefølge med fra 30 til 50 ml koldt (0°C) vand på en tragt af koldsintret glas med fra 10 til 15 ml kold 10 mM urinstof, med yderligere koldt vand og til slut med ca. 1 ml 0,2 M natriumacetatpuffer, pH = 4,0. Cellulosen overføres hurtigt til en kolbe indeholdende 0,92 ml kold 0,2 M natriumacetat-20 puffer, pH = 4,0, indeholdende 69 pg af DNA-sonden.

Blandingen omrystes ved 0-4°C i 15 timer og vaskes derpå med 1 x SSPE (20 mM natriumphosphatpuffer, pH = 7,8, 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA), 0,1%'s natriumdodecylsulfat (SDS) på en glastragt af sintret glas. Cellulosen inkuberes ved 25 55°C i 4 timer i en hybridiseringsopløsning sammensat af følgende bestanddele: 2,0 ml formamid

1,5 ml 20 x SSPE

0,3 ml 10 mg okseserumalbumin/ml, 30 10 mg Ficoll/ml, 10 mg polyvinylpyrroli- don/ml 0,03 ml 10% SDS (w/v) 0,140 ml 4,25 mg laksesperma-DNA/ml Inden anvendelsen inkuberes laksesperma-DNA ved 37°C 35 i 17 timer i 0,3 M NaOH, neutraliseres med 30%·s eddike-

O

DK 163383 B

33 syre og indsamles ved fældning med kold (-15°C) ethanol.

Efter inkubering ved 55°C vaskes cellulosen to gange med ca. 10 ml af 1 x SSPE og 0,1% SDS. Cellulosen gensuspenderes i 5,0 ml af hybridiseringsopløsningen, og 0,2 ml 5 aliquoter af-opslæmningen anbringes i reaktionsglas til hybrids sering.

D. Fremstilling af 23s ribosomal RNA

Ribosomal RNA fremstilles ud fra E. coli, og 23s be-io standdelen isoleres ved sucrose-densitetgradient-centrifuge-ring, jfr. M. Takanami, Meth. Enzymo1. 12A, 491 (1967) og E. H. McConkey, Meth. Enzymol. 12A, 620 (1967) .

E. Hybridiseringsbestemmelse af 23s RNA 15 Hybridiseringsopløsningen aspireres fra reaktions glassene indeholdende cellulosen med den immobiliserede DNA--sonde. Dernæst sættes der 100 pi hybridiseringsopløsning indeholdende 10 ng 23s RNA/ml til hvert glas, og disse inkuberes ved 55°C i de angivne tidsrum. Ved afslutningerne af in-20 kuberingerne fjernes hybridiseringsopløsningerne, og cellulosen vaskes med 0,5 ml 1 x SSPE, 0,1% SDS, inkuberes ved 55°C i 30 minutter i 0,5 ml 1 x SSPE, 0,1% SDS og vaskes én gang med 0,5 ml 1 x SSPE, 0,1% SDS.

De dannede mængder DNA/RNA måles ved immunoanalyse.

25 Cellulosen i hvert glas rystes ved stuetemperatur i 30 minutter med 50 pi 20 mM natriumphosphatpuffer, pH = 7,4, indeholdende 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% (rumfang/rumfang)

Tween 20 og 5,0 mg BSA pr. ml. Dernæst sættes 100 pi af denne opløsning indeholdende 1,0 pg antistof til DNA/RNA til 30 hvert glas, og omrystningen fortsættes i 30 minutter. Væsken fjernes ved aspirering, og cellulosen vaskes fire gange med hver gang 0,5 ml 0,1 M tris-hydrochloridpuffer, pH = 8,0, indeholdende 5 mM MgCl2, 0,5% Tween 20 og 5,0 mg oksealbumin pr. ml (tris/MgC^/Tween/BSA) . Dernæst sættes der til 35 hvert glas 150 pi af med alkalisk phosphatase mærket anti-

O

34

DK 163383 B

muse-IgG (Sigma Chemical Co.), fortyndet 200 gange i tris/-MgCl2/Tween/BSA, og der omrystes ved stuetemperatur i 1,0 timer.

Cellulosen fra hver analyse vaskes to gange med hver 5 gang 0,5 ml tris/MgCl2/Tween/BSA indeholdende 0,5 M NaCl, hvorefter cellulosen overføres til rene reagensglas under anvendelse af fra 1,5 til 2,0 ml af denne pufferopløsning. Pufferen fjernes, og den alkaliske phosphatase-mærkning, der er bundet til cellulosen, måles.

10 Til dette formål tilsættes der 200 ml 1,0 M dietha- nolamin-hydrochlorid-puffer, pH = 9,8, indeholdende 1 mM MgCl2 og 1 mg p-nitrophenylphosphat pr. ml, og der inkuberes ved 25°C i 30 minutter. Dernæst undertrykkes den enzym-katalyserede reaktion ved tilsætning af 1,5 ml 0,1 M 15 Na^PO^, og absorbanserne ved 405 nm optegnes. Resultaterne er som følger:

Hybridiseringstid _(timer)_ Absorbans 0 0,34 20 0,5 1,18 1.0 1,36 2.0 1,85 8.0 2,27 12,0 2,32 25 24,0 2,34

Absorbanserne forøges med hybridiseringstiden, hvilket viser, at der er dannet stigende mængder af DNA/RNA-hy-brider.

30 Eksempel 3

Hybridiseringsbestemmelse for 23s ribosomal RNA under anvendelse af en immobiliserbar DNA-sonde

Prøve-RNA'en hybridiseres med en opløselig DNA-sonde med tilknyttede biotinrester. Dernæst bindes den hybridise-35 rede og ikke-hybridiserede DNA-sonde til en fast bærer med o

DK 163383 B

35 immobiliseret streptavidin. Mængden af DNA/RNA på bæreren måles ved en immunoanalyse under anvendelse af enzym-mærket antistof til DNA/RNA.

5 A. Biotinvieret sonde-DNA

Den i eksempel 2 ovenfor beskrevne M-13-virus med indsætningen komplementær til 23s RNA propageres i E. co-li stammen JM103, og bakteriecellerne indhøstes til isolering af den replikative form af den virale DNA. Denne dob-10 beltstrengede DNA renses ved cesiumchlorid-ethidiumbromid--densitets-gradient-centrifugering, jfr. Maniatis et al. ovenfor.

Biotin-rester indføres i denne dobbeltstrengede DNA ved nick-translation under anvendelse af biotinyleret dUTP, 15 der er tilgængelig fra Enzo Biochem. Inc., NY, jfr. P.R.

Langer et al., Proc. Natl., Acad. Sci. _78, 6633 (1981) og J.J. Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. _80, 4045 (1983).

Kontaminerende RNA nedbrydes ved behandling med alkali som beskrevet i eksempel 2. Umiddelbart inden anven-20 delsen denatureres den biotinylerede sonde ved anbringelse af opløsningen i et bad med kogende vand i 4 minutter.

B. Immobilisering af streptavidin

Streptavidin (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, 25 CA) immobiliseres på Act-Ultrogel®AcA 22 (tilgængelig fra LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD), der er en acrylamid-agarose-bærer aktiveret med glutaraldehyd, jfr.

S.G. Doley et al., FEBS Letters 65^, 87 (1976). Immobiliseringen udføres i overensstemmelse med fabrikantens in-30 struktioner, hvorved der fås ca. 0,5 pg streptavidin pr.

10 pi pakket Act-Ultrogel AcA 22.

C. Hybridiseringsbestemmelse

2 ml Aliguoter af urinprøver, der mistænkes for at 35 indeholde bakterieinfektion, centrifugeres ved 3000 x G

o 36

DK 163383 B

til sedimentering af bakterierne, og de ovenstående væsker dekanteres fra. 90 pi af den i eksempel 2 beskrevne hybri-diseringsopløsning sættes til hver pellet, og 5 pi af den biotinylerede sonde (ved en koncentration på 0,5 pg/ml i 5 20 mM natriumphosphatpuffer, pH = 7,0, 0,5 mM EDTA) tilsæt tes. Blandingerne omrystes til suspendering af de tilstedeværende pellets (såfremt disse findes), og de inkuberes ved 55°C i 4,0 timer.

Dernæst sættes der til hver blanding 700 pi 20 mM 10 natriumphosphatpuffer, pH = 7,4, indeholdende 5,0 mg okse-albumin og 50 pi af Ultrogelen med immobiliseret streptavi-din til fortynding af hybridiseringsopløsningen og immobilisering af den biotinylerede sonde.

Blandingerne omrystes ved stuetemperatur i 2 timer, 15 og væsken fjernes fra bæreren.

Den mængde DNA/RNA-hybrid, der er forbundet med Ul-trogel-bæreren, måles ved immunoanalyse som beskrevet i eksempel 2 i forbindelse med cellulose-bæreren.

Til sammenligning testes de ikke-behandlede urinprø-20 ver for bakterier ved hjælp af 1 pl-sløjfekulturmetoden under anvendelse af MacConkey- og blodagarplader. Pladerne inkuberes ved 37°C i 36 timer, og kolonierne optælles.

Urinprøver med høje bakterieniveauer ifølge kulturmetoden giver høje absorbanser ved hybridiseringsbestemmelsen.

25 30 35

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en bestemt poly-nucleotidsekvens i et testmedium indeholdende enkeltstrengede nucleinsyrer, ved hvilken man kombinerer testmediet med en 5 sonde, der omfatter i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal bestemmes, og den komplementære sondesekvens, og detekterer hybridiseret sonde ved binding af et antistofreagens, der er i stand til at blive bundet til DNA/RNA- eller 10 RNA/RNA-duplexer, der dannes mellem den sekvens, der skal bestemmes, og den komplementære sonde-sekvens, og bestemmer det antistofreagens, der bliver bundet til sådanne duplexer, kendetegnet ved, at sonden er en immobiliseret RNA- eller DNA-Sonde.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof sekre-teret af hybridom-cellelinien HB 8730, der er deponeret i American Type Culture Collection.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l eller 2, kende-20 tegnet ved, at antistofreagenset er mærket med en detekterbar kemisk gruppe, der er udvalgt blandt en enzymatisk aktiv gruppe, et fluorescerende middel, en chromofor, et luminescerende middel, en specifikt bindelig ligand og en radioisotop.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at testmediet omfatter en biologisk prøve, der er blevet underkastet betingelser til frigørelse og denaturering af deri tilstedeværende nucleinsyrer.

5. Reagenssystem til detektering af en bestemt poly-30 nucleotidsekvens i et testmedium ved nucleinsyre-hybridise-ring, omfattende (i) en polynucleotid-sonde, der indeholder i det mindste én enkeltstrenget basesekvens, der er i det væsentlige komplementær til den sekvens, der skal bestemmes, og (ii) et antistof-reagens, der kan bindes til DNA/RNA-35 eller RNA/RNA-duplexer, der dannes mellem den sekvens, der skal bestemmes, og den komplementære sonde-sekvens, k e n - DK 163383 B 38 detegnet ved, at sonden er immobiliseret rna- eller DNA-sonde.

6. Reagenssystem ifølge krav 5, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof sekre- 5 teret af hybridom-cellelinien HB 8730, der er deponeret i American Type Culture Collection.

7. Reagenssystem ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at sonden er immobiliseret ved fiksering til en fast bærer.

8. Reagenssystem ifølge ethvert af kravene 5-7, kendetegnet ved, at antistof-reagenset er mærket med en detekterbar kemisk gruppe, der er valgt blandt en enzymatisk aktiv gruppe, et fluorescerende middel, en chromo-for, et luminescerende middel, en specifikt bindelig ligand 15 og en radioisotop.