DK164803B

DK164803B - Fastfasebundet siliciumoxidprodukt, dets fremstilling og anvendelse

Info

Publication number: DK164803B
Application number: DK084887A
Authority: DK
Inventors: Hugh E Ramsden; Iii Joseph M Patterson
Original assignee: Baker Chem Co J T
Priority date: 1986-02-20
Filing date: 1987-02-19
Publication date: 1992-08-24
Also published as: EP0234129A3; IE863409L; CA1283090C; DE3677587D1; DK84887D0; IL81270A; DK164803C; DK84887A; JPS62212218A; IL81270A0; US4650784A; ATE60913T1; EP0234129A2; AU587302B2; KR870007940A; AU6707186A; JPH0647453B2; IE59565B1; EP0234129B1; KR890004080B1

Description

1 DK 164803 B

o

Opfindelsen angår et fastfaseekstraktionsmateriale, især et sådant materiale, der er egnet til oprensning af urinprøver til analyse af cannabinoider i urin.

Påvisning af brug af marihuana ved analyse af bio- 5 logiske prøver såsom urin eller blod er ved at blive mere udbredt. Da anvendelse af urinprøver indebærer en ikke- -indtrængende og mere bekvem fremgangsmåde, er påvisning Λ 9 af metabolitter af -tetrahydrocannabinol i urin begyndt at finde større popularitet. Desuden er anvendelsen 10 af en sådan undersøgelsesmetode begyndt at udvikle sig til mere betydelig og mere udbredt anvendelse, ikke blot på grund af dens anvendelse til fra begyndelsen af at påvise marihuanabrugere, men som supplement til stofrådgivningsprogrammer som undersøgelsesmetode til at kontrol-15 lere overholdelsen af afvænningsordninger oq fortsat afholdenhed fra brug af marihuana.

λ9

Af de mange metabolitter af -tetrahydrocannabinol, der findes i urin, er den vigtigste 11-nor— -tetrahydrocannabinol-9-carboxylsyre, herefter betegnet 20 ThC-COOH, enten i dens frie eller konjugerede (glucoro-nid)-form. Der findes forskellige ikke-automatiserede fremgangsmåder til påvisning af THC-COOH i urin, såsom tyndtlagschromatografi, gaschromatografi, gaschromato-grafi/massespektrometri, radioimmunanalyse, enzymforstær-25 ket immunanalyse og i den seneste tid væskechr oma tograf i med høj ydeevne (HPLC) . Sådanne metoder er imidlertid temmelig arbejdsintensive og på grund af de talrige og varierede interfererende stoffer i urinprøven meget besværlige at udføre. Det er desuden vanskeligt at måle 30 THC-COOH i urin på grund af dette materiales komplekse natur. Ekstraktionen af THC-COOH vanskeliggøres, fordi THC-COOH er en organisk syre blandt et stort antal forskellige organiske syrer, der er til stede i urin. Et antal af disse organiske syrer har chromatografiske egen-35 . 0

2 DK 164803 B

skaber, der ligner THC-COOH's og vil interferere med målingen af denne. Det er derfor for at kunne opnå en meningsfuld og relativt hurtig måling af THC-C00H i urin nødvendigt at kunne ekstrahere den selektivt 5 urinprøven.

Gængse metoder til undersøgelse af fuldstændige urinprøver for tilstedeværelsen af THC-C00H anvender sædvanligvis enten tyndtlagschromatografi eller enzymforstærket immunanalyseteknik (EMIT) fra Syva Company.

10 Når først en positiv prøve er opdaget, udføres en analyse til bekræftelse, sædvanligvis ved gaschromatografi/-massespektroskopi. Bekræftelsen kan imidlertid med passende oprensning af urinprøven, dvs. koncentrering af THC-C00H i urinprøven, og anvendelse af en intern stan-15 dard foretages ved HPLC. Der findes således et stort behov for en mere tilfredsstillende fremgangsmåde til oprensning af urinprøver til koncentrering af THC-COOH, der er til stede i disse prøver. En fastfasebundet chro-matografisk pakning, der éntydigt og specifikt ekstra-20 herer THC-COOH fra human urin, vil være særdeles ønskelig. Hertil kommer, at en bundet fast fase, der er specifik nok for THC-COOH nu tillader selektiv eluering af THC--C00H fra søjlen uden fjernelse af urenhederne fra søjlen eller selektiv eluering af urenhederne fra søjlen uden 25 fjernelse af THC-COOH, ville være særdeles ønskelig.

Der er et stort behov for en bundet fast fase, der giver en renset urinekstrakt, der er ren nok til at tillade en mere følsom analyse for THC-COOH ved bekræftende metoder såsom HPLC. Urene ekstrakter fører også til høje 30 og støjpåvirkede grundlinier, der forringer muligheden for påvisning af lave niveauer af THC-COOH. Oprensning af urinprøver i tilstrækkelig grad til påvisning af lave niveauer af ^HC-COOH ville være mest ønskelig.

35

3 DK 164803 B

o

Ifølge opfindelsen tilvejebringes der en bundet fast fase, der tillader ekstraktion af en højere renset eller koncentreret form for THC-COOH fra human urin, ved et fastfasebundet siliciumoxidprodukt med formlen 5 i

SO R

I I , v , (I) -0-Si-tCH2-hrX-C-/CH+-C00R2

I I U

O R IrVp 10 | '* ίο -O-Si- 0 er skelettet af en kiselgel eller et glas med bestemt 20 porestørrelse, X er valgt blandt -O-, -S-,

OH OH

-o-ch2-ch-ch2-o- og -o-ch2-ch-ch2-s-, 25 1 hvert R og R er uafhængigt af hinanden valgt blandt hy- 3 drogen, alkyl med 1-3 carbonatomer og *fCH,) -COOR ,

r\ «3 ^ IU

R^ og RJ betyder uafhængigt af'hinanden alkyl med 1-4 carbonatomer , n er et helt tal fra 2 til 5, 30 p er 0 eller 1, og m er et helt tal fra 1-4.

Med sådanne fastfasebundne siliciumoxidprodukter opnås en meget renere ekstrakt af THC-COOH fra urin end fra tidligere anvendte eller tilgængelige bundne faser,

4 DK 164803 B

og dette tillader kvantitativ bestemmelse ved meget lave- 0 re niveauer af THC-C00H og også mere nøjagtig måling af THC-C00H. Desuden er det meget enklere . at anvende denne bundne fase, og der opnås en hurtigere ekstraktion af THC-C00H.

De fastfasebundne siliciumoxidprodukter med form- g len I ifølge opfindelsen fremstilles ved omsætning af

a) en fastfasebundet siliciumoxidreaktant med formlen II

> o 10 >-o-si-z

> I

> o 15 hvori £ ^ C-o-Si-

> I

> O

har samme betydning som i formel I, og 20 Z er valgt blandt 6 Λ -fCH,) -C = C-R° og «CH0) -0-CH--CH-CH., * Χ Λ Λ IC 2 m 2 2 R R° 4 5 6 hvori R , R og R uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen og alkyl med 1-3 carbonatomer, og x er et helt tal fra 0 til 3, med det forbehold, at det samlede antal carbonatomer i gruppen Z, når Z er den umættede gruppe, ikke overstiger 5 carbonatomer, og 30 3 m er et helt tal fra 2-5, med

b) en forbindelse med formlen III

R

35 hy-c—/chVcoor2 I u R NRVp 5

DK 164803 B

hvori Y er valgt blandt -0- og -S-, hvert R og R1 er uafhængigt af hinanden valgt blandt hydrogen, alkyl med 1-3 carbonatomer og -(CH2)-C00R3, 5 R2 og R3 betyder uafhængigt af hinanden alkyl med 1-4 carbonatomer, p betyder 0 eller 1, og m er et helt tal fra 1 til 4, i et egnet indifferent organisk opløsningsmiddel med et 10 kogepunkt på mindst ca. 80“C, b) udvinding af den dannede faste fraktion fra reaktionsblandingen, og c) opvarmning af denne faste fraktion til en temperatur og i et tidsrum, der er tilstrækkelig til at tørre, 15 hvorhos siliciumoxidet fortrinsvis er en partikelformig kiselgel med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 20 til ca. 70 /xm og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 500 Å.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling 20 af det her omhandlede produkt, hvor x er -S, er ejendommelig ved; a) omsætning af 1) en fastfasebundet siliciumoxidreaktant med formlen 25 s i

> I

>-0-Si—f CH2tn" SH

> I

*> o ! 30 hvori n er et helt tal fra 2 til 5, med 2) en forbindelse med formlen fRl\ CH-\CH-J—COOR2 « \ yp

R-C-R

35 hvori hvert R og R1 uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen, alkyl med 1-3 carbonatomer og -(CH2)m-C00R3, 6

DK 164803 B

R2 og R3 uafhængigt af hinanden betyder alkyl med 1-4 car-bonatomer, n er et helt tal fra 2 til 5, p er 0 eller 1, og 5 m er et helt tal fra 1 til 4, i nærværelse af en initiator af frie radikaler og et egnet indifferent organisk opløsningsmiddel med et kogepunkt på mindst ca. 80°C, 3) udvinding af den dannede faste fraktion fra reaktions-10 blandingen, og 4) opvarmning af den faste fraktion til en temperatur i et tidsrum, der er tilstrækkelig til at tørre, hvorhos siliciumoxidet fortrinsvis er en partikelformig kiselgel med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 20 15 til ca. 70 /m og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 500 Å.

De fastfasebundne siliciumoxidreaktanter med formlen II er fortrinsvis baseret på kiselgel eller glas med bestemt porestørrelse (CPG). Kiselgelen er kiselgel med 20 en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 3 til" ca. TO^um og en gennemsnitlig porestørrelse på ca. 50 til ca.

1000, fortrinsvis ca. 50 til ca. 250 Å. Glaspartiklerne med bestemt porestørrelse, der er et silicat-bæremate-riale, som ligner siliciumoxid til anvendelse i væskechro-25 ma tograf i, er kommercielt tilgængelige., f.eks. fra Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, og er CPG med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 37 til ca. 177^.um og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 40 til ca. 1000 Å, fortrinsvis fra ca. 40 til ca. 500 Å.

30 De fastfasebundne siliciumoxidprodukter med form len I ifølge opfindelsen fremstilles sædvanligvis i overensstemmelse med de følgende trin: A. Omsætning af et fastfasebundet siliciumoxid med formlen II som anført ovenfor, hvori siliciumoxidske-35 lettet enten er kiselgelpartikler med en gennemsnit lig diameter fra ca. 3 til ca. 70^um og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 1000 Å eller 0

7 DK 164803 B

glaspartikler med bestemt porestørrelse med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 37 til 177^um og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 40 til ca. 1000 Å, og en initiator af frie radikaler om nødvendigt med 5 en forbindelse med formlen III som anført ovenfor i et indifferent organisk opløsningsmiddel, som har et kogepunkt på mindst ca. 80°C og er indifferent over for frie radikaler, idet denne reaktion udføres fra stuetemperatur til ca. 80°C eller mere i ca. 2 til 10 ca. 10 timer, B. genvinding af den dannede faste fraktion fra reaktionsblandingen, og C. opvarmning af denne faste fraktion til en temperatur og i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at tørre 15 produktet.

Blandt de indifferente organiske opløsningsmidler, der er egnede til fremstilling af de fastfasebundne siliciumoxid-produkter med formlen I er aliphatiske carbonhydrider, f.eks. heptan, octan, nonan og lignende, aromatiske carbonhydrider, 20 f.eks. benzen, toluen, sylen og lignende, og" andre indifferente opløsningsmidler såsom glym, diglym og lignende. Normalt giver et forhold på 1:5 af fastfasebundet silicium-oxidreaktant med formlen II i gram til organisk opløsningsmiddel i ml en egnet reaktionsblanding.

25 Når den fastfasebundne siliciumoxidreaktant med form len II er en reaktant, hvori Z er gruppen tCH9) -C = C-R^, z x '4 '5 R* ΈΓ anvendes en katalytisk mængde initiator af frie radikaler som katalysator. Sådanne initiatorer af frie radikaler er 30 kendte, f.eks. organiske peroxider, såsom benzoylperoxid, eller azobisisobutyronitril og lignende.

Som eksempler på fastfasebundne siliciumoxidreaktanter med formlen II, der anvendes ved reaktionen ifølge opfindelsen, kan f.eks. nævnes fastfasebundet glycidoxypropylsi-35 liciumoxid med formlen 0

8 DK 164803 B

>o o C Λ >-0-Si-CH2CH2CH20CH2-C-CH2, 5 >0 1 i ίο

-O-Si-CH·?-CH=C

o

10 og lignende. J

Som eksempler på reaktanterne med formlen III, der anvendes ved reaktionen ifølge opfindelsen, kan f.eks. nævnes dimethyltartrat, dimethyImaleinat, methyllactat, methyl-2--hydroxyisobutyrat, ethyl-mercaptoacetat, methyl-3-mer-15 captopropionat, dimethy1-mercaptosuccinat, trimethylci- trat, 2-mercapto-dimethylsuccinat, 2-mercaptomethyl-dime-thylsuccinat, 2-mercapto-ethylbutyrat, 2-mercapto-ethyl-propionat, 2-mercapto-butylpropionat, trimethylcitrat og lignende.

20 Sædvanligvis omsættes reaktanterne med formlerne II

og III i støkiometrisk ækvivalente mængder eller med et lille overskud af reaktanten med formlen III. Reaktionen kan udføres ved stuetemperatur, selv om forhøjede temperaturer omkring 80°C eller højere kan anvendes til forøgel-25 se af reaktionshastigheden. Reaktionen skrider hurtigt frem til fuldstændig afslutning (trin .1) i løbet af 2 til 10 timer. Under blandingen af reaktanterne udføres med fordel omrøring, selv om reaktionen derefter kan fortsætte uden yderligere omrøring.

30 Den dannede faste fraktion udvindes fra reaktions- blandingen ved gængse fysiske metoder, f.eks. filtrering, centrifugering og lignende. Sædvanligvis er et filtrerings-middel egnet, som er tilstrækkeligt til at tilbageholde en partikelstørrelse på 5^um, medens centrifugering er 35 egnet til en partikelstørrelse på 3yum.

9

DK 164803 B

o

Den udvundne faste fraktion varmehærdes derpå ved en temperatur og i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at tørre. Sædvanligvis har ca. 1 til 4 timer ved ca. 40 til ca. 120°C vist sig tilstrækkelige.

5 Det er også muligt at fremstille de fastfasebundne

siliciumoxidprodukter med formlen I ifølge opfindelsen, hvori X betyder -S-, ved omsætning, som ovenfor omtalt, at et fastfasebundet mercaptoalkylsiliciumoxid med formlen IV

10 i !0

-0-Si-{CH2*rr SH O

1. 1

hvori n er et helt tal fra 2-5, fortrinsvis 3, med en forbindelse med formlen V

2° (f)

• CH\CH/p-C00R2 R-C-R

1 2 hvori R, R , R og p har de for formlen I angivne betyd-25 ninger, i nærværelse af en initiator af frie radikaler og et passende organisk opløsningsmiddel. De egnede reaktionsbetingelser med hensyn til tid, temperatur og oprensningsmetoder er generelt de samme som anført ovenfor med hensyn til omsætningen af forbindelserne med form-30 lerne II og III.

De fastfasebundne reaktionsprodukter med formlen I udgør hidtil ukendte, nyttige bundne faser til oprensning, koncentrering og adskillelse af THC-COOH, især fra human urin, og er særlige egnede til anvendelse med fast-35

DK 164803 B

xo faséekstraktionsinstrumentering, især i forbindelse med væskechromatografi med høj ydeevne (HPLC). Det nye fast-fasebundne produkt kan anvendes som søjlefyld og kan have forskellige mesh-størrelser, f.eks. fra ca. 50 til 5 ca. 500 mesh. Et eksempel på den metodik, der er egnet til oprensning og koncentrering eller adskillelse af THC-COOH ligner den i litteraturen beskrevne, der anvender andre meget mindre effektive bundne faser, f.eks. den af M. Elsohly, J. Analytical Toxicology, bind 7, 10 side 262-264, November/December 1983 omtalte metodik.

En søjle til fastfaseekstraktion ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved, at den er fyldt med det fast-fasebundne siliciumoxidprodukt ifølge opfindelsen, og en fastfaseekstraktionsproces ifølge opfindelsen til oprensning 15 og koncentrering af ll-nor-A9-tetrahydrocannabinol-9-car-boxylsyre fra en urinprøve er ejendommelig ved, at fastfase-produktet ifølge opfindelsen anvendes som fast fase.

I de følgende eksempler fremstilledes de som reaktanter anvendte fastfasebundne siliciumoxider med formlen 20 II, nemlig fastfasebundet glycidoxypropylsiliciumoxid, fastfasebundet allylsiliciumoxid og fastfasebundet mer-captopropylsiliciumoxid på følgende måde, der skal tjene som eksempel.

25

Fremstilling A

Fastfasebundet glycidyloxypropylkiselgel

Til 100 g kiselgel, 40^,um, 60 Å, sættes 40 ml gly- cidoxypropyltrimethoxysilan i 500 ml toluen og 8 ml vand under omrøring. Reaktionsblandingen får lov at stå ved 30 stuetemperatur natten over, og det faste reaktionsprodukt filtreres fra og vaskes to gange med toluen og to gange med methanol. Reaktionsproduktet anbringes i en ovn ved 80°C i ca. 3 timer til hærdning og tørring. Udbytte: 115,1 g; Analyse 6,10% C, 1,57% H.

35 o

n DK1648U3B

Fremstilling B

Fastfasebundet mercaptopropylkiselgel

Til 100 g kiselgel, 40^,um, 60 Å, sættes under omrøring 112,5 g mercaptopropyltrimethoxysilan i 1250 ml toluen og 20 ml vand. Efter henstand natten over ved stue-5 temperatur frafiltreres det faste reaktionsprodukt og vaskes to gange med toluen og to gange med methanol. Reaktionsproduktet anbringes i en ovn ved 80°C i ca. 3 1/2 time til hærdning og tørring. Udbytte: 304,2 g; Analyse 3,73% C, 1,17% H, 3,14% S.

10

Fremstilling C

Fastfasebundet allylkiselgel

Til 100 g kiselgel, 40yUm, 60 Å, sættes under om-røring 40 ml allyltrimethoxysilan i 500 ml toluen og 1 ml vand. Efter henstand natten over ved stuetemperatur frafiltreres reaktionsproduktet og vaskes to gange med toluen og to gange med methanol. Reaktionsproduktet anbringes i en ovn ved 80°C i ca. 5 1/2 time til hærdning og tørring.

2Q Udbytte: 110,2 g; Analyse 3,88% C, 1,24% H.

De følgende repræsentative eksempler illustrerer fremstillingen af de hidtil ukendte fastfasebundne produkter ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 25

Til 50 ml toluen sættes under omrøring 10 g fastfasebundet mercaptopropylsiliciumoxid, 4 ml dimethylmaleinat og 0,25 g benzoylperoxid. Reaktionsblandingen anbringes i et vandbad, der holdes på ca. 80°C i ca. 4 1/2 - 5 timer. Reaktionsblandingen filtreres, og filterkagen vaskes to gange med toluen og to gange med methanol og tørres i en ovn ved ca. 80°C i et tidsrum på ca. 1 til 1 1/2 time. Udbytte: 10,24 g; Analyse 6,59% C, 1,55% H, 3,20% S.

_ Eksempel 2 35

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 anvendes 4 ml dimethylitaconat i stedet for dimethylmaleinat. Udbytte: 10,56 g; Analyse 7,94% C, 1,78% H, 2,27% S.

12 DK 164803 B

o

Eksempel 3

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 anvendes 4 ml ethylcrotonat i stedet for dimethylmaleinat. Udbytte 10,08 g; Analyse 5,70% C, 1,62% H, 3,21% S.

5

Eksempel 4

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 anvendes 4 ml butylacrylat i stedet for dimethylmaleinat, vandbadet holdes på ca. 75°c, og der anvendes 0,05 g azobisisobu-10 tyronitril i stedet for benzoylperoxid. Udbytte: 11,1 g; Analyse 10,86% C, 2,29% H, 3,21% S.

Eksempel 5

Til 50 ml toluen sættes under omrøring 10 g fast-15 fasebundet allylsiliciumdioxid, 4 ml ethylmercaptoace- tat og 0,05 g azobisisobutyronitril. Reaktionsblandingen anbringes i et vandbad, der holdes ved ca. 75°C, i ca.

5 timer. Reaktionsblandingen filtreres, og filterkagen vaskes to gange med toluen og to gange med methanol og 20 tørres i en ovn ved ca. 80°C i ca. 105 minutter. Udbytte: 11,15 g; Analyse 7,03% C, 1,55% H, 2,55% S.

Eksempel 6

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 5 anvendes 4 ml 25 methyl-mercaptopropionat i stedet for ethyl-mercapto-acetat. Udbytte: 11,23 g; Analyse 6,95% C, 1,58% H, 2,70% S.

Eksempel 7 30 Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 5 anvendes 4 ml dimethyl-mercaptosuccinat i stedet for ethyl-mercapto-acetat. Udbytte: 11,50 g; Analyse 7,48% C, 1,52% H, 2,68% S.

35

13 UK lt>4»U^S IS

o

Eksempel 8

Til 50 ml toluen sættes under omrøring 10 g fastfase-bundet glycidoxypropylsiliciumoxid, 4 ml methyl-mercapto-acetat og 0,5 ml vand. Reaktionsblandingen anbringes i 5 et vandbad, der holdes på ca. 80°C, i ca. 4 timer. Reaktionsblandingen filtreres, vaskes to gange med toluen og to gange med methanol og tørres i en ovn ved ca. 80°C i ca. 1 time. Udbytte: 10,5 g; Analyse 7,14% C, 1,54% H, 1,55% S.

10

Eksempel 9

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 8 anvendes 4 ml methyl-mercaptopropionat i stedet for methyl-mercapto-acetat. Udbytte: 10,4 gj Analyse 6,73% C, 1,41% H, 15 1,14% S.

Eksempel 10

Til 50 ml toluen sættes under omrøring 10 g fast-fasebundet glycidoxypropylsiliciumdioxid, 4 g trimethyl-20 citrat og 250^ul IN HC1. Reaktionsblandingen anbringes i et vandbad, der holdes på ca. 80°^ i ca. 5 timer. Reaktionsproduktet frafiltreres, og filterkagen vaskes to gange med toluen og to gange med methanol og tørres i en ovn ved ca. 80°C i ca. 1 time. Udbytte: 10,05 g; Ana-25 iySe 7,57% C, 1,63% H.

Eksempel 11

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 10 anvendes 4 ml dimethylmalat i stedet for trimethylcitrat. Udbytte: 3° 10,53 g; Analyse 7,64% C, 1,49% H.

Eksempel 12

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 11 anvendes 4 ml dimethyl-mercaptosuccinat i stedet for trimethylcitrat og 35 0

14 DK 164803 B

250^,ul vand i stedet for IN HC1. Udbytte: 10,57 g;

Analyse 6,77% C, 1,53% Η, 1,03% S.

Eksempel 13 5 Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 11 anvendes 4 ml dimethyltartrat i stedet for trimethylcitrat. Udbytte: 10,42 g; Analyse 6,14% C, 1,25% H.

Eksempel 14 10 Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 11 anvendes 4 ml methyllactat i stedet for trimethylcitrat. Udbytte: 10,32 g.

Som eksempel på anvendelsen af de fastfasebundne produkter ifølge opfindelsen ved oprensningen af urinprøver til analyse for cannabinoider kan der henvises til 15 de nedenstående eksempler. I de følgende eksempler hydro lyseres urinprøven først for at hydrolysere den konjugerede form af THC-COOH til den frie fom med henblik på chroma-tografisk behandling ifølge opfindelsen. Typisk udføres sådant hydrolyse af en urinprøve på følgende måde: 20 3 ml urin, 3 ml destilleret vand og 300^,ul Ί0Ν KOH-opløs- ning anbringes i et 15 ml glas med skruelåg. Låget lukkes, opløsningen blandes omhyggeligt, og glasset anbringes i et vandbad ved 60°C i ca. 20 minutter. Efter dette hydrolysetrin indstilles hydrolysatets pH-værdi til 6 ved tilsæt-25 ning af den passende mængde koncentreret HC1.

Eksempel 15

En standard 3 ml fastfaseekstraktionssøjleindsats (serologisk kvalitet) fyldes tørt med 500 mg bundet fast-30 fase fra eksempel 1. Bunden af indsatsen friktionskobles derpå via en forbindelse af Leur-type til en passende vakuummanifold. Vakuumet forøges derpå til 350 mm kviksølv, hvilket fører til en strømningshastighed på 5 ml pr. min.

Søjlen behandles derpå til befugtning af den bundne fase 35

15 UIV IOH-OUO D

0 og til udskylning af opløselige stoffer ved tilsætning af 2 x 2 ml methanol efterfulgt af 2 x 2 ml destilleret vand (der må passes på, at kolonnen ikke løber tør under eller efter behandlingen). Vakuumet fjernes derpå. Der indføres 5 tilstrækkeligt destilleret vand til at fylde indsatsen 2/3. En standardpropylenbeholder (serologisk kvalitet) på 15 ml friktionskobles derpå til ekstraktionssøjlens top via en adapter. Derpå indføres 5 ml destilleret vand i søjlen sammen med den hydrolyserede urinprøve. Hele 10 opløsningen suges derpå gennem kolonnen med en strømhastig hed på 5 ml pr. min. (350 mm kviksølv). Beholderen skylles med en lille portion destilleret vand, efter at den er løbet tør. Ekstraktionssøjlen får lov til at løbe tør og derefter fjernes beholderen af adapteren. På dette punkt 15 iagttages en farvet zone på ca. 2 mm ved toppen af indsat sen. Denne zone består af den ekstraherede THC-COOH sammen med en stor mængde medekstraherede urenheder. Disse urenheder vaskes fra den bundne fase, ved at der gennem kollen med en strømhastighed på 5 ml pr. minut suges to 20 portioner på 1 ml 45% acetonitril/55% 0,1N HCl-opløsning i vand. Den farvede zone ved søjlens top fjernes fra søjlen ved den første mængde vaskeopløsning. Søjlen får lov til at lufttørre i 1 minut, før vakuumet fjernes. Derpå anbringes et stativ med et 3 ml glas til prøveopsamling 25 i vakuummanifolden, således at elueringsvæsken fra fast-faseekstrakticnssøjlen opsamles. Vakuumet justeres igen således, at der opnås en strømningshastighed på 5 ml pr. minut (350 ral kviksølv), og tre portioner på 0,5 ml 100% acetonitril indføres i kolonnen. Når først kolonnen 30 er tørret, fjernes vakuumet, og prøveopsamlingsglasset, der indeholder elueringsvæsken med den koncentrerede THC--COOH-prøve fjernes fra stativet i vakuummanifolden. De bundne faser ifølge opfindelsen tilvejebringer en meget hurtigere, nemmere og mere effektiv prøvefremstillings-35 teknik, dvs. koncentrering af THC-COOH i prøven, end det er muligt med de hidtil tilgængelige bundne 'faser.

Claims

16 DK 164803 B Patentkrav.

1. Fastfasebundet siliciumoxidprodukt, kendetegnet ved formlen 5 >0 R >-0-Si-tCH2*fi-X-C-/CHV-C00R2 > I I hj ^ O R \RVp ,0 I hvori > o > I >-0-Si- 15 > I > o er skelettet af en kiselgel eller et glas med bestemt pore-20 størrelse, OH X er valgt blandt -0-, -S-, -0-CH -CH-CH--O- og 2 » OH -o-ch2-ch-ch2-s-, 25 hvertR og R·*· er uafhasngigt af hinanden valgt blandt o hydrogen, alkyl med 1-3 carbonatomer og -(CH,) -C00R , 2 3 ^ m R og R betyder uafhængigt af hinanden alkyl med 1-4 carbonatomer, n er et helt tal fra 2-5, 30. er 0 eller 1, og m er et helt tal fra 1 til 4.

2. Fastfasebundet siliciumoxidprodukt ifølge krav 1, kendetegnet ved, at siliciumoxidet er valgt blandt en partikelformet kiselgel med en gennemsnitlig par-35

17 DK 164803 6 o tikeldiaraeter fra ca. 3 til ca. 70yum og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 1000 Å og et partikelformet glas med bestemt porestørrelse med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 37 til ca. 177^,um og en 5 gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 40 til ca. 100 Å, fortrinsvis den partikelformede kiselgel.

3. Fastfasebundet siliciumoxidprodukt ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at n betyder 3, 10. betyder -S-, 3 hvertR er valgt blandt hydrogen, -CH^ eller -{CI^)m~COOR , hvori m betyder 1, og p betyder 0 eller 1,

15 R1 betyder hydrogen eller -(CH2)m-COOR3, hvori m betyder 1, og R3 betyder -CH3, og R2 er valgt blandt -CH3, ”C2H5 °9 ”C4H9/ fortrinsvis således at 20 hvertR betyder hydrogen, p betyder 0, og R2 betyder -Ο,,Η,..

4. Fastfasebundet siliciumoxidprodukt ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at 25. betyder 3, X betyder -S-, et R betyder hydrogen, og det andet R betyder -(CHJ -COOR3, hvori å in m betyder 1, og 30 R3 betyder -CH3, p betyder 0, og R2 betyder -CH3· 35 o is DK 164803 B

5. Fastfasebundet siliciumoxidprodukt ifølge krav 2, kendetegnet ved, at n betyder 3, X betyder -S-, 5 hvert R betyder hydrogen, p betyder 1, R·*· betyder - (CHj^-COOR2, hvori m betyder 1, og R2 betyder -CH3 t og 10 r2 betyder -CH3.

6. Fastfasebimdet siliciumoxidprodukt ifølge krav 2, kendetegnet ved, at n betyder 3, X betyder -S-, 15 hvertR betyder hydrogen, p betyder 1, R1 betyder hydrogen, og R2 betyder -C4Hg.

7. Søjle til fastfaseekstraktion, kendeteg-20 net ved, at den er fyldt med det fastfasebundne siliciumoxidprodukt ifølge krav 1-6.

8. Fastfaseekstraktionsproces til oprensning og koncentrering af ll-nor-Zi^-tetrahydrocannabinol-9-carboxyl-syre fra en urinprøve, kendetegnet ved, at den 25 faste fase ifølge krav 1 til 6 anvendes som fastfase.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et fastfasebundet siliciumoxidprodukt ifølge krav 1, kendetegnet vedi a) omsætning af 30 1) en fastfasebundet siliciumoxidreaktant med formlen > o > I >-0-Si-Z > I 5 o o

19 DK 164803 B hvori ίο -o-si- O 10 er skelettet af en kiselgel eller et glas med bestemt porestørrelse, og Z er valgt blandt 0 6 /\ •fCH,) -C = C -R og -fCH,) -0-CH--CH-CH, * X M IC ZIU / Z

15. R 4 5 6 hvori R , R og R uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen og alkyl med 1-3 carboantomer, 20. er et helt tal fra 0 til 3, med det forbehold, at det samlede antal carbonatomer i gruppen Z, når Z er umættet, ikke overstiger 5 carbonatomer, og m er et helt tal fra 2 til 5, med 25 2) en forbindelse med formlen R hy-c-/chYcoor2 UH 30 hvori Y er valgt blandt -0- og -S-, hvert R og R^ er uafhængigt af hinanden valgt blandt hy- 35 drogen, alkyl med 1-3 carbonatomer og -(CH~) -C00R3, 2. m 0

20 DK 164803 B 2 3 R og R betyder uafhængigt af hinanden alkyl med 1-4 car-bonatomer, p betyder 0 eller 1, og m er et helt tal fra 1 til 4, 5. et egnet indifferent organisk opløsningsmiddel med et kogepunkt på mindst ca. 80°C, b) udvinding af den dannede faste fraktion fra reaktionsblandingen , og c) opvarmning af denne faste fraktion til en temperatur og 10 i et tidsrum, der er tilstrækkelig til at tørre, hvorhos siliciumoxidet fortrinsvis er en partikelformig kiselgel med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 20 til ca. 70^um og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 500 Å.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af et fastfasebunet siliciumoxidprodukt ifølge krav 1, hvori X er -S-, kendetegnet ved: a) omsætning af 1. en fastfasebundet siliciumoxidreaktant med formlen ίο I -O-Si—tCH2tn-SH hvori n er et helt tal fra 2 til 5, med 2. en forbindelse med formlen /Λ , CH—\ CH-1—COOR .. λ /p R-C-R hvori 35 o 2! DK 164803 B hvert R og R1 uafhængigt af hinanden er valgt blandt hy- 3 drogen, alkyl med 1-3 carbonatomer og -(CK9) -C00R , A Λ H All Rz og RJ uafhængigt af hinanden betyder alkyl med 1-4 carbonatomer, 5. er et helt tal fra 2 til 5, p er 0 eller 1, og m er et helt tal fra 1 til 4, i nærværelse af en initiator af frie radikaler og et egnet indifferent organisk opløsningsmiddel med et kogepunkt på 10 mindst ca. 80°C, 3. udvinding af den dannede faste fraktion fra reaktionsblandingen , og 4. opvarmning af den faste fraktion til en temperatur i et tidsrum, der er tilstrækkelig til at tørre, 15 hvorhos siliciumoxidet fortrinsvis er en partikelformig kiselgel med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 20 til ca. 70^um og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 500 Å. 20 25 30 35