DK166828B1 - Mono-sialo gangliosid gm1p, praeparater indeholdende dette samt anvendelse deraf til fremstilling af et laegemiddel - Google Patents

Description

DK 166828 B1

Opfindelsen angår mono-sialo gangliosid GM1P, præparater indeholdende dette samt anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel.

De pågældende forbindelser er effektive til be- 5 handling af bakterielle, virale, protosoale og fungale infektioner samt tumorer hos pattedyr.

Gangliosider er en klasse naturligt forekommende glycosphingolipider, der indeholder en oligosaccha-riddel, hvortil der kan være knyttet en eller flere 10 sialsyregrupper. Gangliosider er blevet fundet i hjernen, milten, leveren, nyrerne og blodet på pattedyr og også i hønseæg (se Ledeen, J. Supramolecular Structure, 8:1-17 (1978) Cell Surface Carbohydrates and Biological Recognition 437-453, for en almen oversigt over 15 gangliosider).

Strukturen af gangliosid GGNT1 er anført (Wie-gandt, Angew Chemie Internat. Edn. 7. 87 (1968)) til at være som følger:

CH (CH ) CH=CH

20 HcA

HCNHCO (CH-.) ,,CH_ | 2 16 3 CH I 2 0

CH,OH

25 \ CH20H CH20HcJ^

HO I OH

CH20H Ι/l o yf—0

30 30 klvI

/ \ J>H

\OH A NHCOCH, ΓΊ

OH

35 hvori R er en sialsyregruppe.

Ifølge den nomenklatur, der er foreslået af Sven-nerholm (J. Neurochem., 10, 613, 1963) betegnes de for- 2 DK 166828 B1 skellige gangliosider med bogstavet G efterfulgt af et blandt fire bogstaver M, D, T eller Q afhængigt af om gangliosidet er et mono-, di-, tri- eller tetrasialo-gangliosid. Disse bogstaver efterfølges af talangivel-5 ser, der muliggør betegnelse af gangliosider, der indeholder den samme mængde sialsyre, men med forskelligge chromatografiske mobiliteter. Disse gangliosider kan have stillingsisomere, der kan skelnes ved anvendelse af et bogstav efter det nummeriske indeks, f.eks.

10 gangliosid GMlb. Gangliosid GM1 er det samme som gGNT1*

Det er blevet postuleret, at gangliosider spiller en rolle i centralnervesystemets (CNS) normale virkning, og der er blevet fremført hypoteser (Micele, Caltagirone 15 og Gainotti, Acta Psychiatra Scand., 1977, 55, 102) om, at gangliosider kan udøve en positiv virkning ved behandlingen af neuropatiske syndromer. For nylig er det blevet foreslået (Spiegel Ravid og Wilchek, Proc. Natl.

Acad. Sci., USA 76:, 5277, (1979)), at gangliosider er 20 involveret i lymfocytstimuleringen hos pattedyr. Der er imidlertid ikke fremført nogen antydning om, at ganglio-siderne kan påvirke virkningen af phagocyter (polymorph-kernede leukocyter, makrophager, histiocyter osv.).

Polymorphkernede leukocyter (PMN) og makro-25 phager (MC) udgør de væsentlige typer hvide blodceller og er ansvarlige for bekæmpelse af infektioner ved især bakterielle og fungale infektioner,samt forebyggelse af spredning af tumorer hos pattedyr. Fagocyter virker normalt i blodstrømmen eller ved infektionsstedet via 30 blodstrømmen.

Det har nu vist sig, at visse gangliosider har en antibakteriel, antiviral, antifungal, antiprotozoal og/eller antitumor virkning og kan forøge virkningen af antibakterielle, antivirale, antifungale, antiprotozoale 35 og/eller antitumorvirkende midler in vivo. Den antibakterielle, antivirale, antifungale, antiprotozoale 3 DK 166828 B1 og/eller antitumorvirkning, der observeres, når ganglio-sidet indgives alene, menes at skyldes, at gangliosidet forøger fagocytvirningen.

Fysiske og kemiske undersøgelser viser, at gang-5 liosiderne ifølge opfindelsen, der herefter benævnes som gangliosider G^P, har den samme kemiske struktur som de naturligt forekommende gangliosider, men en anden fysisk form end disse. Det menes, at gangliosiderne GM1P aggre-gerer sig på en anden måde end de naturligt forekommende 10 gangliosider gM1' hvorfra GM1P er afledt.

Følgelig angår opfindelsen et mono-sialo gang-liosid Gj^P, der er ejendommeligt ved, at det (A) er fremstillet ved følgende fremgangsmåde:

(l) koncentrering af en vandig opløsning indehol-15 dende et mono-sialo gangliosid med formlen I

CH3(CH2)n CH=CH HOCH

HCNHC0RV

20 ch2 0

CH_OH

A

25 CH20H CH2OH 0YLj/)

HO j OH

30 \0H i/t NHCOCH3

OH

hvori R4 betyder en C15_23 alifatisk kæde, 35 n er 12 eller 14, og R5 betyder acetyl- neuraminsyre; og calciumkationer under sub- 4 DK 166828 B1 atmosfærisk tryk ved en temperatur mellem 40°C og 80 C i et tidsrum mellem 18 og 240 timer, (2) justering af pH til mellem 2 og 3 efterfulgt 5 af dialyse, og (3) afdampning af det vandige opløsningsmiddel, og (B) ved, at (a) det ved tyndtlagschromatografi (i) giver en positiv reaktion overfor svovl- 10 syrereagens (koncentreret svovlsyre:vand, 1:1), resorcinolreagens, orcinol/Fed3 og andre typiske reagenser for gangliosidbe-stemmelse, (ii) giver ringe reaktion overfor ninhydrin- 15 reagens (0,2% ninhydrin i ethanol), (b) det i vandig opløsning af et 13C-NMR spek trum, som vist i fig. 2, (c) det in vivo har aktivitet i mus overfor Kleb-sielle pneumonia, og 20 (d) det in vivo har aktivitet i mus overfor Her pes HSV-1 (stamme F).

Det har vist sig, at poly-sialo gangliosider let hydrolyserer termisk til opnåelse af de tilsvarende mono-sialo gangliosider. Især hydrolyserer poly-sialo 25 gangliosider ved den temperatur, der anvendes til at fremstille de omhandlede produkter. Det mono-sialo gang-liosid, der anvendes ved fremstillingen af de omhandlede produkter er derfor passende et mono-sialo gangliosid opnået kommercielt som et monokomponent gangliosid eller 30 i en blanding af gangliosider (f.eks. gangliosid GIII fra Sigma) eller i form af materiale ekstraheret fra naturlige kilder (hjerne, blod, blodceller osv.), der indeholder gangliosider, f.eks. acetonisk pulver (opnået efter konventionelle metoder) eller frysetørret hjerne 35 opnået fra dyrehjerner, passende oksehjerner, eller som dannes in situ ud fra et eller flere poly-sialo ganglio- 5 DK 166828 B1 sider under betingelserne i trin 1 ved den omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede produkter .

De gangliosider, der anvendes ved fremstillingen 5 af de omhandlede produkter, er passende i en i det væsentlige ren form (dvs. mindre end 50%, passende mindre end 20% og fortrinsvis mindre end 10% urenheder), der kan opnås ved konventionelle rensningsmetoder, der anvendes til at rense gangliosider, såsom søjlechroma-10 tografi (se f.eks. L. Svennerholm, Methods in Carbohydrate Chemistry, 6, 464-474).

Den vandige opløsning i trin 1 i krav 1 fremstilles fortrinsvis ved simpel blanding af gangliosidet med en vandig opløsning indeholdende calciumioner (såsom en 15 vandig opløsning af calciumchlorid) til at give en cal-ciumionkoncentration på mellem 1 og 10 mM (fortrinsvis ca. 5 mM) efterfulgt af grundig blanding. Alternativt kan den vandige opløsning fremstilles ved dialyse af gangliosidet overfor en vandig opløsning indeholdende 20 calciumkationer (såsom en vandig opløsning indeholdende calciumhydrogencarbonat) for at opnå en calciumionkon-centration på 1 til 5 mM. Dialysen udføres passende i et tidsrum på mellem 24 og 72 timer, bekvemt 48 timer. Det vand, der anvendes ved denne dialyse, kan enten være 25 naturligt vand eller destilleret vand, der indeholder calciumkationer, eller destilleret vand, hvortil sådanne kationer er blevet sat. Inden koncentrering af den vandige opløsning tilsættes bekvemt en mindre andel C-j__4 alkanol, fortrinsvis methanol. Det har vist sig, at 30 tilsætningen af 25% v/v methanol (i forhold til rumfanget af den totale opløsning) er særligt bekvemt i det tilfælde, hvor den vandige opløsning fremstilles ved dialyse, idet methanolet fortrinsvis tilsættes efter dialysen.

35 Ved koncentreringstrinnet holdes rumfanget af den opløsning, der koncentreres bekvemt konstant ved kon- 6 DK 166828 B1 tinuerlig tilsætning af yderligere opløsning indeholdende gangliosid og calciumkationer til erstatning for afdestilleret vand. Det totale rumfang af den vandige opløsnig reduceres derved med en faktor på mellem 10 og 5 40 ved en typisk præparation. Der påtrykkes bekvemt et vakuum (passende mellem 20 og 50 mm Hg), og den indre temperatur holdes mellem 55 og 80°C, passende 59,5°C , ved anvendelse af et ydre temperaturområde på mellem 60 og 90°C, passende 67,5°C. Koncentreringsproceduren er 10 herunder fortrinsvis kontinuerlig og lineært progressiv.

Koncentreringen er passende afsluttet efter mindre end 110 timer. Når koncentreringen udføres på en vandig opløsning ved en temperatur på 59,5°C, udføres koncentreringsprocessen bekvemt i ca. 55 timer.

15 Den koncentrerede opløsnings pH justeres i trin 2 med organiske eller mineralske syrer til et foretrukkent pH på ca. 2,6. Den anvendte syre er bekvemt HCl, passende 6 N HCl. Dialysen udføres passende overfor destilleret vand eller en fortyndet syreopløsning med et pH på 20 ca. 2,6 (en fortyndet saltsyreopløsning' foretrækkes) efterfulgt af dialyse overfor destilleret vand. Det destillerede vand er passende gendestilleret inden anvendelse. Denne dialyse udføres passende ved en temperatur på mellem 1 og 10°C, bekvemt 4°C, i ca. 24 til 72 25 timer, passende 48 timer.

Afdampningen af det vandige opløsningsmiddel i trin 3 udføres ved konventionelle metoder, der er velkendte for fagmænd, f.eks. ved den teknik, der kendes som frysetørring, dvs. ved frysning af den vandige op-30 løsning og afdampning af vandet under vakuum.

Det omhandlede gangliosid G^P vil normalt indeholde mindre end 80%, passende mindre end 50%, mere passende mindre end 20% og fortrinsvis mindre end 5% urenheder såsom gangliosid GM1, andre gangliosider eller 35 andre derivater deraf. Det omhandlede gangliosid GM1P kan adskilles fra ikke derivatiserede gangliosider ved 7 DK 166828 B1 dialyse af en vandig suspension af en blanding af deri-vatiserede og ikke-derivatiserede gangliosider, der indeholder en mindre andel methanol, overfor destilleret vand og frysetørring af den resulterende suspension.

5 Et gangliosid GM1P ifølge opfindelsen har vist sig at have en Rf-værdi på 0,245 (sammenlignet med Rf på 0,31 for gangliosid GM1) ved tyndlagschromatografi (substrat: Merck Silica Gel 60 F254, opvarmet til 110°C i 30 minutter, pladetykkelse 0,25 mm, elueringsmiddel: chlo-10 roform/methanol/vand, 55/45/10; pladen mættet i en time inden eluering), skønt det også har vist sig, at denne værdi nærmer sig værdien for GM1 efterhånden som renheden af GMlp stiger. Det giver positiv reaktion ved sprøjtning med svovlsyre (koncentreret svovlsyre:vand 15 1:1) med resorcinolreagens med orcinol/FeCl3 og med andre typiske reagenser til bestemmelse af gangliosider, men ringe reaktion ved sprøjtning med ninhydrin (0,2% i ethanol). Det har et NMR spektrum, der er som vist i . fig. 2.

20 Ud fra en sammenligning af 13C NMR spektrene for mono-sialo gangliosidet GM1 (fig. 1) i vand og produktet ifølge opfindelsen GM1P (fig. 2), er det klart, at de væsentlige forskelle i spektrene er, at mange af toppene fra Gj^P er meget bredere end de tilsvarende toppe fra 25 GM1 (NB de viste spektre er blevet udjævnet med et digitalt filter, hvis liniebredde er den samme som den gennemsnitlige topbredde i hvert tilfælde). Det menes, at disse forskelle skyldes modifikationer i den måde, hvorpå gangliosidmolekylerne er forbundet med hinanden 30 både i fast tilstand og i vand. Det er velkendt, at gangliosider aggregerer i vand, f.eks. M. Corti, V. De-giorgio, R. Ghidoni, S. Sonnino og G. Tettamanti, Chemistry and Physics of Lipids 26 (1980) 225-238.

Det menes også, at der ikke er nogen kemiske for-35 skelle mellem GM1P og GM1, eftersom 13C nmr spektrene af en blanding af GM1P og GM1 i opløsning i chloroform methanol: vand (60:34:6 v/v) kun viser et sæt toppe.

DK 166828 Bl 8

Gangliosidet GM1P kan også skelnes fra det naturligt forekommende gangliosid GM1 på basis af deres optiske aktiviteter, f.eks. ved cirkulær dichroismemåling og ved differentiel kalorimetri.

5 Gangliosidforbindelserne ifølge opfindelsen har anvendelige pharmakologiske egenskaber som ikke besiddes af udgangsforbindelserne med formlen I.

Den omhandlede opfindelse angår også et farmaceutisk præparat, der er ejendommelig ved, at det omfat-10 ter et gangliosid GM1P som defineret ovenfor sammen med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel. Mængden af gangliosid, der er til stede i et sådant præparat, vil normalt ligge mellem 0,05 og 100 mg, passende mellem 0,5 og 10 mg og bekvemt 1 mg. Dosis af det indgivne gangliosid 15 vil normalt være mellem 0,1 og 500 mg, passende mellem 0,5 og 50 mg, bekvemt 0,5 til 10 mg pr. person pr. dag pr. uge. Den nøjagtige dosis vil naturligvis variere alt efter patientens tilstand og indgivningsvejen. Det menes, at de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen 20 kan anvendes f.eks. inden operationer for at hjælpe med til at afhjælpe de immunodepressante virkninger af visse anæstetika (halothan osv.); profylaktisk til at forbedre celleforsvaret hos børn under epidemier, efter virale infektioner for at forhindre udviklingen af bakterielle 25 og fungale infektioner og tumorer, og ved behandlingen af immunodepression, f.eks. for at modvirke den immunodepressante virkning af cytostatiske lægemidler, der f.eks. gives til cancerpatienter. Gangliosid GM1P kan også med nytte kombineres med andre aktive midler og 30 indgives i form af passende farmaceutiske præparater.

Følgelig angår opfindelsen et farmaceutisk præparat, der er ejendommeligt ved, at det omfatter et mono-sialo gangliosid GM1P som defineret tidligere i kombination med et antibakterielt, antiviralt, antipro-35 tozoalt, antifungalt og/eller antitumormiddel eller i kombination med et stof, der nedsætter eller forøger 9 DK 166828 B1 virkningen af fagocyter hos pattedyr sammen med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel.

Passende antibakterielle midler inkluderer benzylpyrimidiner, tetracykliner, β-lactamantibiotika, 5 såsom penicillinerne og cephalosporinerne, sådanne antibiotika, der indeholder sukkerkomponenter, såsom amino-glycosidantibiotikaene, og sulfonamider.

Trimethoprim, diaveridin og tetroxoprim er særligt kendte eksempler på benzylpyrimidiner, der har en 10 antibakteriel virkning, men andre benzylpyrimidiner, hvori phenylgruppen er substitueret med en eller flere substituenter, fortrinsvis tre substituenter, er også egnede til inkludering i de omhandlede præparater. Passende substituenter inkluderer C1-4 alkoxygrupper inklu-15 siv sådanne, der indeholder et yderligere oxygenatom i carbonkæden, såsom methoxyethoxy, 01-4 alkylgrupper, C2_4 alkenylgrupper, C1-4 alkylthiogrupper, halogenatomer, aminogrupper, eventuelt substitueret med en eller to C-]__4 alkylgrupper, samt andre substituenter, der er 20 velkendte indenfor teknikken.

Passende tetracykliner inkluderer tetracyklin, oxytetracyklin, doxycyklin, chlortetracyklin, demethyl-chlortetracyklin og tetracyklinphosphatkompleks.

Passende penicilliner inkluderer de naturligt 25 forekommende penicilliner og de semisyntetiske penicilliner, såsom de der indeholder en acylaminosidekæde knyttet til 6-stillingen i penicillinkernen. Ampicillin, amoxycillin, azidocillin, talampicillin, carbencillin, ticarcillin, piperacillin, oxacillin, azlocillin, mezo-30 cillin, hetacillin, flucloxacillin, cloxacillin og ben-zylpenicillin er særligt passende penicilliner til inkludering i de omhandlede præparater.

Passende cephalosporiner inkluderer de, der dannes som gæringsprodukter, såsom cephalosporin C, og de, 35 der fremstilles semisyntetisk, såsom de der indeholder en acylaminosidekæde i 7-stillingen i cephalosporinker- -------- DK 166828 B1 10 nen, f.eks. cephadin, cephoxitin, cephamandol, cephamy-cinerne, cephaloridin, cephalexin, cephalatin, cephur-oxim, cephaloglycin og cepharimnatrium.

Andre β-laetamantibiotika er grundigt blevet gen-5 nemgået indenfor teknikken. Eksempler på særligt egnede aminoglycosidantibiotika til inkludering i de omhandlede præparater er streptomycin, erythromycin, carbomycin, kanamycinerne, amicetin, gentamycin og oleandomycin.

Passende sulfonamider til inkludering i de om-10 handlede præparater inkluderer sulfanilamid, sulfadia-zin, sulfamethiazol, sulfapyridin, sulfathiazol, sulfa-merazin, sufamethazin, sulfioxazol, sulformethoxin, 2-(p-aminobenzen)sulfonamid-3-methoxypyrazin (Kelfizi-na) , p,p1-diamino-diphenylsulfon, amino-p-toluensulfon-15 amid, 5-sulfanilamido-2,4-dimethyl-pyrimidin, é-fN^-ace-tylsulfanilamido)-5,6-dimethoxy-pyrimidin, 3-sulfanil-amido-4,5-dimethylisoxazol, 4-sulfanilamido-5-methoxy-6-decyloxypyrimidin-sulfamonomethoxin, 4-p-(9-hydroxy-qui-nilinyl-4-azo)-phenyl-sulfanilamido-5,6-dimethoxypyrimi-20 din, sulfadimethoxin, sulfadimidin, sulfamoxol, sulfa-doxin, sulfaguanidin, sulfathiodimethoxin, sulfamethoxa-zol, sulfaquinoxalin og p-(2-methyl-8-hydroxy-quinoli-nyl-5-azo)-phenyl-sulfanilamido-5,6-dimethoxypyrimidin.

Et særligt passende antiviralt middel til brug i 25 kombination med det omhandlede mono-sialo gangliosid GM1P er acyclovir.

Stoffer, der nedsætter virkningen af fagocyter hos pattedyr og derfor er egnede til inkludering i de omhandlede farmaceutiske præparater, er godt dokumente-30 rede i litteraturen. Sådanne stoffer inkluderer cytostatiske midler, f.eks. adriamycin og alkyleringsmidler (f.eks. cyclophosphamid) og vincaalkaloider samt corti-costeroider, f.eks. β-methazon.

Tilsvarende er stoffer, der forøger fagocyters 35 virkning hos pattedyr, og som derfor er egnede til inkludering i de omhandlede farmaceutiske præparater, vel- 11 DK 166828 B1 dokumenterede i litteraturen. Sådanne stoffer inkluderer pyrancopolymer, glucan, muramyldipeptid, lentinan, tuftsin, CP og BCG osv.

En gruppe foretrukne farmaceutiske præparater 5 ifølge opfindelsen omfatter et mono-sialo gangliosid GM1P som defineret tidligere sammen med et antibakte-rielt middel og et farmaceutisk bæremiddel. Særligt foretrukne antibakterielle midler inkluderer benzylpy-rimidinerne, f.eks. trimethoprim, tetracyklinerne, 10 f.eks. tetracyklin, aminoglycosidantibiotikaene, f.eks. gentamycin, de semisyntetiske penicilliner, f.eks. ampi-cillin samt cephalosporinerne.

En yderligere gruppe foretrukne farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen omfatter et gangliosid 15 GM1P som defineret tidligere sammen med et stof, der nedsætter eller forøger fagocyters virkning hos pattedyr, i kombination med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel.

En yderligere gruppe foretrukne farmaceutiske 20 præparater omfatter et mono-sialo gangliosid GM1P som defineret tidligere sammen med et antibakterielt middel, der nedsætter virkningen af polymorphokernede leukocyter hos pattedyr, i kombination med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel. Tetracyklinerne er eksempler på sådanne 25 antibakterielle midler.

Endnu en yderligere gruppe foretrukne farmaceutiske præparater omfatter mono-sialo gangliosid Gm1p som defineret tidligere sammen med et antiviralt middel, såsom acyclovir. En yderligere gruppe foretrukne farma-30 ceutiske præparater omfatter mono-sialo gangliosid GM1P som defineret tidligere sammen med et antiprotozoalt middel såsom pyrimethamin.

Forholdet mellem mono-sialo gangliosidderivatet og den anden aktive komponent i præparatet vil normalt 35 ligge fra 100:1 til 1:500 og passende 1:1 til 1:100 efter vægt.

12 DK 166828 B1

Det nøjagtige vægtforhold mellem mono-sialo gang-liosidderivatet og den anden aktive komponent vil variere afgængigt af den særlige anden aktive komponent, der inkorporeres i præparaterne.

5 Den optimale dosis af mono-sialo gangliosidderi- vatet og den anden aktive komponent vil naturligvis variere afhængigt af arten af den anden komponent, patientens tilstand og indgivningsvejen, men dosis af mono-sialo gangliosidderivatet vil normalt ligge fra 0,01 mg 10 til 500 mg, og fortrinsvis 0,1 til 10 mg pr. person pr. dag (0,001 til 0,1 mg/kg legemsvægt pr. dag). Kombinationen af gangliosidet med den anden aktive komponent vil normalt blive givet i en dosis på 0,1 til 500 mg, passende l til 100 mg, og fortrinsvis 1 til 50 mg pr.

15 person pr. dag.

Det farmaceutisk acceptable bæremiddel skal naturligvis være "acceptabelt" i den forstand, at det er foreneligt med de andre ingredienser i præparatet og ikke er skadeligt for præparatets modtager. Bæremidlet 20 kan være fast eller flydende, en blanding af faste og flydende stoffer, og det kan formuleres med andre komponenter i præparatet som en enhedsdosis, f.eks. en tablet, kapsel eller dosispulver til oral indgivning eller et suppositorie til rektal indgivning. Andre far-25 maceutisk aktive stoffer kan også inkluderes i de omhandlede præparater, dg præparatet kan formuleres efter en vilkårlig af de indenfor farmacien velkendte teknikker, der grundlæggende består i blanding af komponenterne. Enhedsdosisformuleringer til oral, rektal eller 30 parenteral indgivning indeholder bekvemt en kombination af gangliosid GM1P-derivatet og den anden aktive komponent i præparatet i en mængde i området 0,1 til 500 mg, fortrinsvis l til 50 mg.

Til oral indgivning kan fine pulvere eller granu-35 later af komponenterne indeholde fortyndingsmidler og dispergeringsmidler samt overfladeaktive midler og kan 13 DK 166828 B1 foreligge i en mixtur i vand eller i en sirup, i kapsler eller dosispulvere i tør tilstand, eller i en vandig eller ikke-vandig suspension, der også kan inkluderes et suspensionsmiddel; i tabletter, der fortrinsvis 5 fremstilles ud fra granulater af den aktive ingrediens med et fortyndingsmiddel ved komprimering med bindemidler og smøremidler; eller i en suspension i vand eller en sirup eller olie eller i en vand/olieemulsion, hvor smags-, konserverings-, suspensions-, fortykkelses- og 10 emulgeringsmidler også kan være inkluderet. Granulaterne eller tabletterne kan være overtrukne, og tabletterne kan være opdelte.

Til parenteral indgivning (ved intravenøs, intra-peritoneal eller subkutan indgivning) kan de omhandlede 15 præparater foreligge i enhedsdosis- eller multidosisbe-holdere i vandige eller ikke-vandige injicerbare opløsninger, der kan indeholde antioxidanter, puffere, bak-teriostater og solutter, der gør præparaterne isotoniske med blodet; eller i vandige eller ikke-vandige suspen-20 sioner, såfremt suspensions- og fortykkelsesmidler kan inkluderes; extemporane injektionsopløsninger og -suspensioner kan fremstilles ud fra sterile pulvere, granulater eller tabletter, der kan indeholde fortyndings-, dispersions- og overfladeaktive midler, bindemidler og 25 smøremidler. De opløsningsmidler, der anvendes i disse præparater er opløsningsmidler, der ikke er skadelige for mono-sialo gangliosidderivatets stabilitet. Foretrukne opløsningsmidler inkluderer vand, saltopløsning og EDTA. Organiske opløsningsmidler såsom glycolerne, 30 især ethylen- og propylenglycol, kan ofte inkorporeres i de omhandlede injicerbare opløsninger.

Såfremt vand er opløsningsbæremidlet, vil en puffer også normalt være til stede. Saltopløsning er det foretrukne opløsningsmiddel.

35 Præparaterne kan også foreligge i form af todels pakninger, idet delene blandes inden indgivning. I en 14 DK 166828 B1 sådan todelspakning vil gangliosid GM1P bekvemt foreligge som et frysetørret fast stof.

Det foretrækkes at indgive de omhandlede præparater parenteralt.

5 Det kan ofte være ønskeligt at indgive en dosis af mono-sialo gangliosid GM1P inden indgivningen af et præparat ifølge opfindelsen, der indeholder en anden aktiv ingrediens. De omhandlede præprater kan således foreligge i form af en pakning, der indeholder i det 10 mindste én enhedsdosis af mono-sialo gangliosid GMlp som defineret tidligere og i det mindste én enhedsdosis af et præparat ifølge opfindelsen, der indeholder en anden aktiv ingrediens, som defineret tidligere, idet de separate enhedsdosis tydeligt er afmærket, sammen med in-15 struktioner til sikring af, at dosis indgives i den korrekte rækkefølge.

De omhandlede præparater og mono-sialo gangliosid GM1P kan anvendes til behandling eller profylakse af bakterielle, virale, fungale og protozoale infektioner 20 samt tumorer hos pattedyr, især mennesker. Præparaterne og mono-sialo gangliosid GM1P anvendes fortrinsvis til profylakse af bakterielle, virale, fungale og protozoale infektioner samt til at forebygge tumorer i at brede sig hos pattedyr.

25 Den omhandlede opfindelse angår således også an vendelsen af et mono-sialo gangloisid GM1P som tidligere defineret til fremstilling af et lægemiddel til forøgelse af modstandsdygtigheden mod bakterie-, virus-, fungus- eller protozoininfektion eller mod tumorer.

30 De følgende eksempler belyser fremstillingen af gangliosiderne GM1P samt deres farmakologiske egenskaber, jfr. eksemplerne.

DK 166828 B1 15

Eksempel 1

Fremstilling af gangliosid GM1P.

(i) friskt gråt materiale (1 kg) fra oksehjerne homogeniseredes med acetone (3 liter), og den 5 resulterende suspension filtreredes under vakuum. Resten blandedes med acetone (1 liter ), og homogeniseredes og filtreredes som ovenfor. Den faste rest af acetonetørret pulver tørredes under en luftstrøm ved stue- 10 temperatur i 18 timer. Typisk udbytte af ace tonetørret pulver var 150-200 g/kg gråt materiale.

(ii) Det triturerede acetonetørrede pulver (19,2 g) fra oksehjerne sattes til en chloroform/ 15 methanolblånding (2100 ml, 1:1). Blandingen rystedes kraftigt i 1 time og filtreredes derefter. Chloroform (1050 ml) og 0,1 M kaliumchloridopløsning (625 ml) sattes til filtratet.

20 Blandingen rystedes i yderligere 1 time og henstilledes derefter natten over. Den øvre fase på ca. 1270 ml, der var udskilt ved henstand, fraskiltes og dialyseredes overfor gendestilleret vand ved 15°C i 48 timer i en 25 Visking slange.

(iii) Den vandige opløsning frysetørredes efter dialyse, og det frysetørrede pulver toges op i gendestilleret vand og dialyseredes igen i 48 timer. Den vandige opløsning frysetørre- 30 des, og det resulterende produkt chromatogra- feredes på en siligagelsøjle efter Svenner-holm's metode (Methods in Carbohydrate Chemistry, 6, 464-474) under eluering med en chloroform-methanol-vandblanding. De frak- 35 tioner, der indeholdt gangliosid GM1 samle des og frysetørredes.

16 DK 166828 B1

Det frysetørrede produkt optoges i gen-destilleret vand og dialyseredes med løbende hanevand ved 15°C i 48 timer i en Visking slange (9,5 cm's diameter, 110 cm's længde).

5 En vandig opløsning af calciumhydrogencarbo- nat i destilleret vand (calciumionkoncentra-tion ca. 200 pg/ml) kan anvendes som erstatning for hanevand.

(iv) En vandig opløsning af mono-sialo ganglio-10 sidet koncentreredes ved kontinuerlig for dampning under vakuum med den fordamper, der er vist i fig. 3. 200 ml af den vandige opløsning anbragtes i en rundbundet kolbe, og kolben opvarmedes ved en badtemperatur på 15 67,5°C (ydre temperatur 59,5°C). Det vand, der afdestillerede under vakuum, erstattedes kontinuerligt med yderligere vandig ganglio-sidopløsning fra en flaske (2) ved hjælp af en føler (9) og en automatisk ventil (5), 20 der var justeret til at reagere på signaler fra føleren, således at der sattes det samme væskerumfang til kolben via ventilen (5), som der fordampede og passerede forbi føleren (9) som kondensat.

25 (v) pH af den koncentrerede gangliosidopløsning (200 ml) justeredes til pH 2,6 ved tilsætning af koncentreret (50%) saltsyre. Den resulterende opløsning dialyseredes overfor løbende gendestilleret vand (100 liter) i 48 timer 30 under magnet omrøring ved 4°C i en Visking slange (4,5 cm's diameter, 160 cm's længde).

Den således opnåede opløsning lyofiliseredes i et standard frysetørringsapparat. Udbyttet var mellem 95 og 100 mg udfra 19,2 g aceto-35 netørret pulver.

DK 166828 B1 17

Eksempel 2

Proceduren fra eksempel 1 gentoges op til afslutningen af trin (iv). Den koncentrerede gangliosidop-løsnings (200 ml) pH justeredes derefter til pH 2,6 ved 5 tilsætning af koncentreret (50%) saltsyre. Den resulterende opløsning dialyseredes overfor en vandig opløsning af saltsyre (pH 2,6) med et "Amicon" membransystem (membran U5UM05 med 500 M.W. og diameter 62 mm), indtil ef-fluenten fra dialysen havde et pH på 2,6 (dette skete 10 efter ca. 18 timer). Den sure opløsning dialyseredes overfor destilleret vand med en Visking slange som i eksempel 1, og den således opnåede opløsning lyofilise-redes i et standard frysetørringsapparat.

15 Biologisk virknig af de omhandlede gangliosidderivater.

1. Overfor K. pneumonia.

Schweiziske hankønsalbinomus (Charles River CDl) med en vægt på 20+1 g randomiseredes og opdeltes i to grupper på hver 20 dyr. Musene injiceredes 20 intraperitonealt med 0,25 ml/10 g mus med en 24 timers bouillonkultur af Klebsiella pneumonia CN 3632 i hjerne-hjertebouillon (Difco), der var blevet centrifugeret, vasket med saltopløsning og derefter gensuspenderet i saltopløsning til op-25 nåelse af 2 x 107 mikroorganismer/ml. En gruppe på 20 mus havde forinden fået 2,5 mg/kg ganglio-sid GM1P opnået efter fremgangsmåden i eksempel 2 indgivet intravenøst 24 timer inden K. pneumonia-infektion. Resultaterne på den 8. dag efter 30 infektion var som følger:

Gruppe Dødelighed

Antal døde %Dødelighed Kontroller 16/20 80

Gangliosid GM1P 0/20 0 18 DK 166828 B1 2, Overfor Herpes HSV-l (stamme F) virus.

BALB/c mus med en vægt på 16 g randomiseredes i tre grupper på hver 6 dyr. Musene injiceredes intraperitonealt med 2,5 x 1010 pfu/ml (12 LD50) 5 HSV-l (stamme F) virus fra Dr. B. Roizman på Uni versity af Chicago. To grupper mus fik henholdsvis 0,6 mg/kg og 3 mg/kg GM1P opnået efter fremgangsmåden i eksempel 2 indgivet intraperitonealt to gange dagligt begyndende 48 timer inden infek-10 tion, indtil den 7. dag efter infektion. Dyrene i den tredie gruppe, der virkede som kontroller, injiceredes det samme rumfang opløsningsmiddel samtidig som de behandlede dyr.

Gruppe Overlevelsestid GOT Antal over- 15 for hver mus i (timer) levende den _timer_7. dag_ 1 12,12,12,24,24,36 20 0/6 2 180,192, 288, 288, 288 254 4/6 20 3 180,192, 288, 288, 288, 288 254 4/6

Gruppe 1 = kontroller 2 = 0,6 mg/kg gangliosid GM1 derivat 25 3 = 3,0 mg/kg gangliosid GM1 derivat GOT = gennemsnitlig overlevelsestid 3. . Overfor Plasmodium berghei protozoa.

40 schweiziske hankønsalbinomus (Charles river 30 CDl) med en vægt på 22±1 g fordeltes tilfældigt i grupper på 10 og injiceredes intraperitonealt med 0,1 ml/10 g citreret blod fra 6 dage parasitise-rede mus, hvilket blod var blevet fortyndet 1:1000 (v/v) med saltopløsning til opnåelse af 35 1,58 x 106 P. berghei I.S.S./ml. Kontrolgruppen (1) injiceredes saltopløsning, gruppe 2 ganglio- 19 DK 166828 B1 sid gM1p fremstillet efter fremgangsmåden i eksempel 1 (5 mg/kg s.c. i saltopløsning), gruppe 3 med det kendte antiprotozoale middel pyrimeth-amin (l mg/kg s.c. i CMC 0,25% i vand, w/v) og 5 gruppe 4 med både GM1P og pyrimethamin i de oven for anførte dosis. Dosisrumfanget var 0,25 ml/10 g· GM1P blev indgivet 24 timer og 2 timer inden infektion (dag 0), og pyrimethaminet på dagene 0, 1 og 2.

10

Resultaterne var som følger: Dødelighed (%)

Gruppe Dag 9 Dag 13 1 100 (100) 15 2 90 100 3 50 90 4 20 80 GM1P har således en antiprotozoal virkning og 20 forøger også effektiviteten af et standard antiprotozo-alt middel. 1

Overfor Candida albicans.

53 schweiziske hankønsalbinomus (Charles River 25 CDl) med en vægt på 23±1 g fordeltes tilfældigt i grupper på henholdsvis 10, 14, 14 og 15 mus (grupperne l til 4). Dyrene i gruppe 1 injiceredes saltopløsning som kontrolgruppe; gruppe 2 injiceredes cyclophosphamid 50 mg/kg (0,2 ml/mus) 30 intravenøst 96 timer inden infektion; gruppe 3 cyclophosphamid 50 mg/kg (0,2 ml/mus) intravenøst 96 timer inden infektion og GM1P 10 mg/kg (0,25 ml/10 g) subkutant 96 og 24 timer inden infektion og gruppe 4 GM1P 10 mg/kg (0,25 ml/10 g) sub-35 kutant 96 og 24 timer inden infektion. Musene injiceredes derefter intravenøst med 0,225 ml/mus 20 DK 166828 B1 18 timers kultur af Sabouraud glucosebouillon indeholdende 1,204 x 107 Candida albicans celler/ml (stamme CN7996).

5 Resultaterne var som følger:

Gruppe Gennemsnitlig Antal i live _overlevelsestid_dag 23_ 1 8,0 0 2 1,21 0 10 3 6,28 0 4 12,06 3

Disse resultater viser, at GM1P har en antifungal virkning og også, at det i en vis grad reverterer den 15 immunosuppressante virkning af cyclophosphamid.

Toksicitet.

Gangliosid GM1P fra eksempel 2 injiceredes intra-20 peritonealt til mus til en maksimal dosis på 30 mg/kg.

Der bemærkedes ingen toksiske virkninger.

Claims (4)

1. Mono-sialo gangliosid GM1P, kendetegnet ved, at det (A) er fremstillet ved følgende fremgangsmåde : (1) koncentrering af en vandig opløsning indehol-5 dende et mono-sialo gangliosid med formlen I CH3(CH2)n CH=CH HOCH HCNHCO RV

10 CH, I 2 O CH-OH ,Λ

15 C.H20B CH20H HO I OH ch2oh M— O o /Γ-0 HO Γ J Wy γλΓ nn n«

20 Uh J nhcoch3 OH hvori R4 betyder en C15_23 alifatisk kæde, 25. er 12 eller 14, og betyder acetyl- neuraminsyre; og calciumkationer under sub- atmosfærisk tryk ved en temperatur mellem 0 0 40. og 80 C i et tidsrum mellem 18 g 240 timer, 30 (2) justering af pH til mellem 2 og 3 efterfulgt af dialyse, og (3) afdampning af det vandige opløsningsmiddel, og (B) ved, at (a) det ved tyndtlagschromatografi DK 166828 B1 (i) giver en positiv reaktion overfor svovlsyrereagens (koncentreret svovlsyre: vand, 1:1), resorcinolreagens, orcinol/FeCl3 og andre typiske reagenser for gangliosidbe- 5 stemmelse, (ii) giver ringe reaktion overfor ninhydrin-reagens (0,2% ninhydrin i ethanol), (b) det i vandig opløsning har et 13C-NMR spektrum, som vist i fig. 2, 10 (c) det in vivo har aktivitet i mus overfor Kleb- sielle pneumonia, og (d) det in vivo har aktivitet i mus overfor Herpes HSV-l (stamme F).

2. Farmaceutisk præparat, kendetegnet 15 ved, at det omfatter et mono-sialo gangliosid GM1P ifølge krav l sammen med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel.

3. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter en eller flere blandt: 20 et antibakterielt middel, et stof, der nedsætter fagocy-ters virkning hos pattedyr, et antiviralt middel, et antiprotozoalt middel, et antifungalt middel og et anti-tumormiddel.

4. Anvendelse af et mono-sialo gangliosid GM1P 25 ifølge krav l til fremstilling af et lægemiddel til forøgelse af modstandsdygtigheden mod bakterie-, virus-, fungus- eller protozainfektion eller mod tumorer.