DK167148B1 - Komplekser af selen- og tellur-ethylendioxy-derivater, farmaceutiske praeparater deraf og anvendelse af komplekserne til fremstilling af farmaceutiske praeparater - Google Patents

Description

DK 167148 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte komplekser af selen- og tellur-ethylendioxy-derivater, farmaceutiske præparater deraf og anvendelse af komplekserne til fremstilling af farmaceutiske præparater.

5 I DK patentansøgning nr. 4870/85 beskrives organiske forbindelser af tellur og selen, som er aktive in vitro og in vivo til produktion af cytokiner. Disse forbindelser er også anvendelige til et antal sygdomme som anført i den nævnte patentansøgning. Et træk ved disse forbindelser af 10 tellur og selen er den relative uopløselighed af forbindelserne i vandige medier, hvilket medfører vanskeligheder ved fremstilling af farmaceutiske præparater til parenteral indgivelse.

Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at citronsyre 15 og vinsyre vil danne et stabilt, i vand letopløseligt kompleks med visse af de ovennævnte kendte organiske forbindelser af tellur og selen.

Opfindelsen angår således komplekser af forbindelser med formlen 20 -j _ X . 0 - CH, NH4 /l\ (I) X' X Ό - CH2 25 “ hvori Q betyder selen eller tellur, og X betyder halogen, med citrat eller tartrat. X betyder fortrinsvis chlor, og Q betyder fortrinsvis tellur.

30 Disse forbindelser er i stand til at fremkalde IL-2- -dannelse samt proliferation af IL-2-producerende celler og aktivering af IL-2-receptorsteder.

Opfindelsen angår også et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det omfatter et kompleks ifølge 35 opfindelsen og et farmaceutisk bærestof.

Opfindelsen angår desuden anvendelsen af et kompleks -¾ 2 DK 167148 B1 ifølge opfindelsen til fremstilling af et farmaceutisk præparat til stimulering af lymfokin-producerende celler.

Komplekserne ifølge opfindelsen kan dannes ved at bringe en forbindelse med formlen I i kontakt med et ugif-5 tigt, farmaceutisk acceptabelt kompleksdannende middel indeholdende enten citronsyre eller vinsyre, som danner et vandopløseligt kompleks med tellur- eller selenforbindelsen.

I almindelighed foretrækkes det at fremstille komplekserne ifølge opfindelsen ved at bringe en forbindelse med formlen 10 li kontakt med et puffersystem indeholdende enten citronsyre eller vinsyre og et tilsvarende alkalimetalsalt deraf, såsom natrium- eller kaliumsaltet.

Generelt kan ækvimolære mængder af syrerne og de tilsvarende alkalimetalsalte kombineres i vandige opløsninger 15 med en forbindelse med formlen I til dannelse af komplekset ifølge opfindelsen. Pufferkoncentrationer på 0,05-0,5 M foretrækkes, men højere eller lavere koncentrationer kan anvendes forudsat, at koncentrationen er tilstrækkelig til, at forbindelsen med formlen I opløses. Højere molariteter 20 kan anvendes til dannelse af koncentrater, som kan fortyndes før intravenøs indgivelse, eller til fremstilling af andre doseringsformer. Mængden af forbindelsen med formlen I er afhængig af den sluttelige anvendelse af produktet. Når der er tale om citrat, har det vist sig, at koncentrationer på 25 5 mg/ml og større af ammonium-trichlor-(dioxoethylen-0,0')- tellurat kan opløseliggøres. Dette står i modsætning til phosphatpuffer (PBS), hvori kun ca. 200 μg/ml ammonium-tri-chlor-(dioxoethylen-0,0')-tellurat kan opløseliggøres. Det foretrækkes at anvende den vandige opløsning af komplekset 30 direkte uden udvinding og genopløsning af dette. Komplekset er stabilt i frosset eller afkølet tilstand og ved stuetemperatur eller forhøjede temperaturer. Komplekserne ifølge opfindelsen kan indgives til pattedyr til behandling af cancer, immundefekter, autoimmunitetssygdomme og infektions-35 sygdomme ved anvendelse af mængder, der er effektive i hvert enkelt tilfælde. Behandlingen vil lette symptomerne på disse 3 DK 167148 B1 sygdomme, idet den vil forårsage, at pattedyret producerer forøgede mængder af lymfokiner. Komplekserne kan også anvendes til produktion in vitro af forøgede mængder af cytoki-ner såsom lymfokiner og/eller deres receptorer, og disse 5 materialer kan anvendes som terapeutiske midler til indgivelse til pattedyr til lindring af cancer, immundefekter og infektionssygdomme. Et farmaceutisk præparatet ifølge opfindelsen vil kunne anvendes i kombination med andre kemo-terapeutiske midler mod cancer, såsom cyclophosphamid.

10 Udtrykket cancer anvendes som omfattende leukæmi og faste tumorer, som opstår spontant, ved kontakt med et kar-cinogent middel, ved bestråling eller på grund af oncovirus-ser. Disse sygdomstilstande er velkendte af fagmanden og omfatter sådanne tilstande som binyretumorer, benmarvstumo-15 rer, gastrointestinale tumorer, hjernetumorer, brysttumorer, hudtumorer, lungetumorer, ovarietumorer, urogenitale tumorer og lignende. I Merck Manual, 13. udgave, Merck & Co. (1977) beskrives mange af disse tilstande, jf. side 647-650; 828-831; 917-920; 966; 970-974; 1273; 1277; 1371-1376; 1436- 20 1441; 1563 og 1612-1615.

Udtrykket immundefekt sygdomme anvendes til at beskrive en forskelligartet gruppe af tilstande, såsom erhvervet immundefektsyndrom (AIDS), som hovedsagelig er karakteriseret ved en forøget modtagelighed over for forskellige infektioner 25 med deraf følgende alvorlig akut, tilbagevendende og kronisk sygdom, som skyldes en eller flere defekter i de specifikke eller ikke-specifikke immunsystemer. På side 205-220 i Merck Manual, 13. udgave, beskrives mange af disse tilstande.

Udtrykket autoimmunitetssygdomme omfatter sygdomme, 30 hvor immunsystemet producerer auto-antistoffer mod et endogent antigen med deraf følgende vævsbeskadigelse. Disse tilstande beskrives på side 241-243 i Merck Manual, 13. udgave.

Udtrykket infektionssygdomme omfatter sådanne patho-35 logiske tilstande, der hidrører fra bakterie-, virus- eller svampeorganismer, som invaderer og forstyrrer den normale 4 DK 167148 B1 funktion i pattedyrets krop. I Merck Manual, 13. udgave, side 3-149 beskrives disse tilstande.

Komplekserne ifølge opfindelsen kan indgives oralt, parenteralt, transkutant, topisk eller ved kontakt med slim-5 hinder. Forbindelserne kan indgives oralt i form af væske i kapsler af hård eller blød gel, i opløsning eller suspension, i kapsler eller tabletter, der kan fremstilles ved anvendelse af konventionelle excipienser, bindemidler, smuldringsmidler og lignende. Den parenterale indgivelse kan være intramus-10 kulær, intravenøs eller intradermal, idet der anvendes et bærestof med forsinket frigivelse, eller subcutan. Koncentrationen af komplekserne i kombination med farmaceutisk bærestof er ikke kritisk og kan vælges efter ønske. Remington's Practice of Pharmacy, 9., 15. eller 16. udg. beskriver 15 forskellige farmaceutiske bærestoffer.

Det har vist sig, at nogle komplekser af tellurforbindelser ifølge opfindelsen vil hydrolysere i nærværelse af vand. Disse hydrolyserede materialer er aktive in vivo og in vitro, selv om de hydrolyserede materialer efterhånden 20 sønderdeles og mister deres evne til at fremkalde lymfokin-udskillelse. Af denne grund bør materialerne være frisk fremstillede. Hvis komplekserne indgives oralt i tør form er de aktive til fremkaldelse af produktion af lymfokiner. Komplekserne bør fortrinsvis holdes under vandfri betin-25 gelser indtil umiddelbart før anvendelsen.

Topiske præparater kan anvendes ved at dispergere komplekserne i en hydrofil eller hydrofob kosmetisk base. Topiske præparater omfatter væsker, salver, cremer, lotioner, geler og pastaer. Vaseline eller kommercielle præparater, 30 såsom Oil of Olay, kan anvendes. Koncentrationen kan være 0,0001-10 vægtprocent.

Doseringen af komplekserne ifølge opfindelsen, der anvendes til at stimulere lymfokinproduktion eller til at behandle de bestemte sygdomstilstande, der er beskrevet i 35 de foreliggende beskrivelse, kan varieres afhængigt af den pågældende sygdom og sygdommens stadium. Generelt kan der 5 DK 167148 B1 indgives en mængde forbindelse i området fra 0,05 x 10"·* til 1 x 10"3 g/kg legemsvægt, fortrinsvis 0,1 x 10"3 til 0,5 x 10"3 g/kg legemsvægt. Der kan f.eks. anvendes en dosis på 1-3 mg pr. dag til et pattedyr på 75 kg som tilstrækkelig 5 mængde til at fremkalde lymfokinproduktion, men doseringen kan varieres afhængigt af den individuelle reaktion og den tilstand, der behandles. Til behandling af AIDS kan 1,0-9,0 mg/m2 kropsoverflade indgives intravenøst tre gange om ugen. Desuden kan komplekser ifølge opfindelsen indgives 10 sammen med sådanne midler som 9-(l,3-dihydroxy-2-propoxyme-thyl)-guanin (DHPG) og/eller AZT.

Komplekserne kan foruden til behandling af de ovenfor beskrevne pattedyr-sygdomme anvendes til veterinære formål ved behandling af virussygdomme og immunsygdomme, 15 som rammer heste, hovdyr og fjerkræ. Disse sygdomme kan behandles ved anvendelse af de mængder af forbindelsen, der kan anvendes til behandling af de ovenfor beskrevne pattedyrsygdomme .

Til anvendelse in vitro kan celler stimuleres til at 20 producere lymfokiner ved anvendelse af 1 x 10"8 til 1 x 10"4, fortrinsvis 1 x 10"7 til 1 x 10"5 g kompleks pr. 106 celler/ml.

Foreløbige toksicitetsundersøgelser hos mus har vist en LD5(j-værdi på 300 /zg/25 g legemsvægt hos 6 uger gamle 25 mus for komplekset ifølge eksempel 1. Komplekserne kan anvendes som antibakterielle midler eller midler mod virus hos planter eller hos dyr. Virusinfektioner, såsom ”West Nile"-virusinfektioner hos mus kan behandles med komplekset ifølge eksempel 1 i en dosis på 10 μg/dag/mus. Bakterieinfek-30 tioner hos planter, såsom krongaller fremkaldt af Agrobac-terium tumefaciens, kan behandles eller forebygges ved anvendelse af en 0,1%'s opløsning af komplekser ifølge opfindelsen.

De følgende eksempler belyser den biologiske virkning 35 af komplekserne ifølge opfindelsen i sammenligning med kontroller ifølge kendt teknik.

6 DK 167148 B1

Resultaterne i eksemplerne viser, at den biologiske virkning af komplekserne ifølge opfindelsen kan variere en del afhængigt af koncentrationen af citrat hhv. t ar trat, men at det i alle tilfælde er muligt at opnå en biologisk 5 virkning af samme størrelsesorden som ifølge kendt teknik ved passende indstilling af citrat- hhv. tartratkoncentra-tionen.

Eksempel 1 10 To citratpuf feropløsninger fremstilles ved at kom binere 0,05 M natriumcitrat med 0,05 M citronsyre eller ved kombinere 0,1 M natriumcitrat med 0,1 M citronsyre. pH-Vær-dien er ca. 4 afhængigt af den tilsatte mængde forbindelse A. Til disse opløsninger sættes op til 5 mg/ml ammonium-15 trichlor-(dioxoethylen-0,o')-tellurat.

Efter opbevaring ved forskellige temperaturer i ca.

2¼ måned fremstilles der fortyndinger af disse opløsninger, og der gennemføres et muse-milt-forsøg som følger:

Milten fjernes fra Balb-c-mus med en alder på 6-20 8 uger. Miltcellerne presses gennem 60 mesh (US standard) rustfrit stålnet, som hviler i 5 mm Petriskåle indeholdende PBS, til adskillelse af cellerne. Cellerne opsamles derefter i centrifugerør og centrifugeres ved 1000 o/m i 10 minutter.

Den ovenstående væske bortkastes, og cellerne behandles med 25 5 ml hypotonisk puffer (0,15 M ammoniumchlorid, 0,01 M ka- liumhydrogencarbonat opløst i dobbeltdestilleret vand, pH-værdi 7,2) i nøjagtig 2 minutter. Derefter sættes der PBS (8,0 g NaCl, 200 mg KC1, 1150 mg Na2HP04, 200 mg KH2P04, 100 mg/1 CaCl2 (vandfrit), 100 mg/1 MgCl2»6H20, vand op til 30 1 liter) til cellerne, og prøverørene centrifugeres i 10 mi nutter ved 1000 o/m. Celler skylles to gange og tælles i et hæmocytometer, idet trypanblåt anvendes til at undersøge levedygtigheden. Cellerne indstilles til en koncentration på 107 levedygtige celler pr. ml. Cellerne bringes i kon-35 takt med 25 mg/ml phorbol-myristat-acetat (PMA) og med varierende mængder af komplekset i vand. Derefter inkuberes cel- 7 DK 167148 B1 lerne ved 37“C, 7,5% C02 i 96 timer. Den ovenstående væske opsamles og undersøges for IL-2-aktivitet ved anvendelse af tritieret thymidin (3H-TdR). Resultaterne af bestemmelsen på 25%'s og 12,5%'s ovenstående væske er vist som tællinger 5 pr. minut (cpm) i en jø-scintillator og er anført i tabel I. Tabel i viser fremkaldelsen af IL-2-aktivitet, som opnås med varierende mængder af komplekset.

Tabel I

10

Ammonium-trichlor--(dioxoethylen-O,0')- -tellurat % Ovenstående væske 15 Mg/ml 25% 12,5% 0,05 M 0,5 76138 99850 citrat 0,1 91022 65518 20 0,05 5450 1728 0,1 M 0,5 65632 50778 citrat 0,1 55127 27582 25 0,05 3432 1597 kontrol 0,5 43833 35270 med PBS 0,1 44378 28035

Mg+ Ca+ 0,05 3762 1865 30 placebo 1:10 -0- 5157 2878 1:40 -0- 4085 4172 1:100 -0- 3320 2192 35 Eksempel 2

Ved anvendelse af de samme procedurer som i eksempel 1 fremstilles 0,02 M tartratpuffer ud fra 0,02 M vinsyre og 0,02 M kaliumtartrat i forholdet 1:4. En 0,04 M tartratpuffer DK 167148 Bl s fremstilles også ved anvendelse af de samme procedurer. Komplekset dannes ved at sættes ammonium-trichlor-(dioxo-ethylen-0,0')-tellurat til den vandige tartratpuffer. Effektiviteten af komplekset med hensyn til at stimulere IL-2-5 produktion bestemmes ved muse-milt-forsøget. Resultaterne er anført i tabel II.

Tabel II

10 Ammonium-trichlor- -(dioxoethylen-0,0') - Ovenstående -tellurat væske fcpnO_

Mg/rnl 25% 12,5% 15 0,02 M 0,5 64563 58015 tartrat- 0,1 11258 5722 puffer 0,05 1152 887 0,04 M 0,5 1513 610 20 tartrat- 0,1 2610 1598 puffer 0,05 1423 665 kontrol 0,5 43833 35270 med PBS 0,1 44378 28035 25 Mg++ & Ca++ 0,05 3762 1865

Eksempel 3

Citrat- og tartrat-komplekser af ammonium-trichlor-(dioxoethylen-0,01)-tellurat undersøges for evnen til at 30 stimulere humane mononukleære celler.

Venøst helblod (med heparin, Evans 10 IU/ml blod) fortyndes med RPMI-medium (GIBCO, Inc., Grand Island, NY) i forholdet 1:1. Det fortyndede blod placeres forsigtigt på "Lymphoprep" (Nylgard & Co., Oslo, Norge, densitet 1,077 35 g/ml), idet der anvendes to dele fortyndet blod til en del "Lymphoprep". I hvert rør er der 3 ml "Lymphoprep" og 6-7 ml fortyndet blod. Rørene centrifugeres i 30 minutter ved 1600 o/m ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen opsamles 9 DK 167148 B1 de mononukleære celler fra mellemfasefraktionen og vaskes tre gange med RPMI. Cellerne resuspenderes i RPMI, tælles på et hæmocytometer, idet trypanblåt anvendes til undersøgelse af levedygtighed, og indstilles derefter til en 5 koncentration på 1 x 10“6 celler pr. ml i beriget RPMI. De i tabel III anførte koncentrationer tilsættes i et volumen på 10% af celleblandingen. Portioner på 0,2 ml fra hver prøve anbringes i brøndene af mikroplader (NUNC) (tredobbelt bestemmelse). Mikropladerne inkuberes i 72 timer ved 37°C 10 efter tilsætning af 3H-methylthymidin, 1U Ci/brønd (Nuclear Research Center, Israel) til kulturerne. Cellerne inkuberes natten over og høstes med en cellehøster. Proliferationen måles med en /9-scintillationstæller, og resultaterne er anført i tabel III.

15

Tabel III

Ammonium-trichlor- Phorbol-myristat-acetat -(dioxyethylen-0,0')- (PMA)_ 20 -tellurat 1,5 ng/ml 0,5 ng/ml /ig/ml celler celler 0,02-M 0,5 1418 1680 tartrat- 0,1 30992 20620 25 puffer 0,05 22883 12800 0,04 0,5 2762 527 tartrat- 0,1 20713 12990 puffer 0,005 15327 16782 30 0,05 M 0,5 1822 745 citrat- 0,1 49402 8713 puffer 0,05 3937 5298 35 kontrol 0,5 3287 2945 PBS 0,1 42857 19810

Mg+ & Ca++ 0,05 12923 6663

Claims (3)

1. Komplekser af selen- eller tellur-ethylendioxy--derivater med formlen 5 Ί “ X .0 - cn2 NH4 χ^Χ^) - CH2 10 “ hvori Q betyder selen eller tellur, og X betyder halogen, med citrat- eller tartration.

2. Farmaceutisk præparat, kendetegnet 15 ved, at det omfatter et kompleks ifølge krav 1 og et farmaceutisk bærestof.

3. Anvendelse af et kompleks ifølge krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til stimulering af lymfokin-producerende celler.