DK170346B1

DK170346B1 - Granulocyt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktor(CSF)-proteiner, fremgangsmåde til fremstilling deraf, ekspressionsvektor og E.coli-celle til brug ved denne fremgangsmåde samt anvendelse af disse proteiner

Info

Publication number: DK170346B1
Application number: DK619086A
Authority: DK
Inventors: Paul Habermann; Hubert Muellner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1985-12-21
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1995-08-07
Also published as: KR940005585B1; IE59779B1; ATE71144T1; FI865186L; NO865191L; KR870006188A; AU637139B2; FI865186A0; EP0228018B1; DE3545568A1; IL81020A0; AU6675686A; EP0228018A3; DK619086D0; ZA869557B; AU6268390A; DE3683267D1; AU601959B2; EP0228018A2; NO865191D0

Description

i DK 170346 B1

Human granulocyt-makrofag-"Colony-Stimulating,,-f aktor (GM-CSF), i det følgende kaldet "CSF", er et glycoprotein med en molvægt på ca. 23.000 Dalton. cDNA-sekvensen og ekspressionen af glycoproteinet i pattedyreceller er allerede 5 kendt (G.G. Wong et al., Science 228 (1985), 810-815, D.

Métcalf, Science 229 (1985), 16-22).

Opfindelsen angår gramilocyt-makrofag-"Colony Stimu-lating"-faktor(CSF)-proteiner, som er tilgængelige ved i og for sig kendte variationer af DNA-sekvenserne. Således kan 10 man eksempelvis ved konstruktionen af vektorer til fusionsproteiner indbygge spaltesteder, som efter fraspaltning af CSF-proteinet viser C-terminale og/eller N-terminale variationer i aminosyresekvensen. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af CSF-proteiner ifølge opfindel-15 sen. Desuden angår opfindelsen anvendelsen af CSF-proteiner ifølge opfindelsen til fremstilling af lægemidler samt lægemidler, som indeholder eller består af CSF-proteiner ifølge opfindelsen, især lægemidler til stimulering af proliferatio-nen af haematopoietiske celler og til fremme af ganulocyt-20 og makrofag-dannelsen.

Opfindelsen angår desuden ekspressionsvektorer til anvendelse i bakterier, især i E. coli, som indeholder en for CSF eller et CSF-fusionsprotein kodende DNA i egnet orden ("operatively linked to") .

25 Yderligere aspekter af opfindelsen og foretrukne udførelsesformer derfor belyses nærmere i det følgende eller defineres i patentkravene.

Til belysning af opfindelsen tjener endvidere figurerne 1-15 på tegningen, hvor man i hvert enkelt tilfælde, for 30 det meste i form af et rutediagram, anskueliggør fremgangsmåderne i eksemplerne med det samme nummer. Disse figurer er ikke i korrekt målestok, især i polylinkerområdet er målestokken "forlænget".

Således vises der i fig. 1 og fortsættelserne 35 la og lb deraf fremstillingen af vektoren pW 225, som tjener til direkte ekspression af (Met-)CSF. De følgende 2 DK 170346 B1

O

figurer angår vektorer, som leder til ekspression af fusionsproteiner, i hvis N-terminal der er anbragt et "ballast"--protein foran CSF-aminosyresekvensen, og dette protein er afledt af en delsekvens af det humane interleukin-2, 5 i det følgende betegnet "IL-2" eller "/^EL-2": * I fig. 2 og fortsættelserne 2a og 2b deraf vises fremstillingen af vektoren pW 216, der koder for et fusionsprotein, ud fra hvilket der ved syrespaltning fremstår et CSF-derivat, som N-terminal er forlænget med 10 aminosyren prolin.

I fig. 3 vises syntesen af vektoren pW 240, der koder for et fusionsprotein, som efter syrespaltning leder til et CSF-derivat, som i stedet for den faste aminosyre (alanin) bærer prolin.

15 Fig. 4 angår fremstillingen af vektoren pW 241, som koder for et fusionsprotein, der efter syrespaltning leder til et CSF-derivat, hos hvilket den første aminosyre (alanin) mangler.

I fig. 5 vises fremstillingen af vektoren pW 242, 20 som koder for et fusionsprotein, som efter syrespaltning leder til et CSF-derivat, i hvilket de første 5 aminosyrer er fjernede.

Fig. 6 angår fremstillingen af vektoren pW 243, der koder for et fusionsprotein, hvilket efter syrespaltning 25 leder til et CSF-derivat, i hvilket de første 7 aminosyrer mangler.

I fig. 7 vises syntesen af vektoren pW 244, der koder for et fusionsprotein, ved hjælp af hvilket man efter syrespaltning får et CSF-derivat, i hvilket 30 de første 11 aminosyrer er eliminerede.

I fig. 8 og fortsættelsen 8a deraf vises synteten af vektoren pW 246. Denne koder for et fusionsprotein, i hvilket der efter IL-2-delsekvensen følger to varierede, som "CSF"' betegnede sekvenser. Efter 35 syrespaltning får man et CSF-derivat, i hvilket prolin er N-terminaltforan den første aminosyre, og i hvilket den 3 DK 170346 B1 0..

sidste aminosyre er udskiftet med asparaginsyre.

I fig. 9 vises syntesen af vektoren pW 247/ som koder for et fusionsprotein, i hvilket der efter IL-2-delsekyensen følger tre CSP'-sekvenser. Efter syre-5 spaltning fås det i fig. 8 karakteriserede CSF-derivat.

I fig. 10 og fortsættelsen, fig. 10a, deraf vises fremstillingen af hybridplasmiderne pS 200-204, som har syntetiske CSF-DNA-delsekvenser, idet plasmidet pS 200 indeholder "Synteseblok I" ifølge bilag I, plasmidet pS 201 10 indeholder "Synteseblok II" ifølge bilag II, plasmidet pS 202 indeholder "Synteseblok III"’’ ifølge bilag III, plasmidet pS 203 indeholder hele det syntetiske gen, og pS 204 er et ekspressionsplasmid, som ligeledes indeholder hele den syntetiske CSF-DNA-sekvens. Efter ekspression og syrespalt-15 ning fås det samme CSF-derivat, som er'beskrevet i fig. 2.

I fig. 11 og fortsættelsen, fig. 11a, deraf vises syntesen af ekspressionsplasmidet pS 207, som koder for et fusionsprotein, som efter spaltning med N-bromsuccinimid giver et CSF-derivat, i hvilket Trp i positionerne 13 og 20 122 hver gang er erstattet af His.

I fig. 12 er vist en syntetisk DNA-delsekvens, som tillader fremstillingen af CSF-derivat, i hvilket Ile i position 100 er erstattet af Thr.

I fig. 13 og fortsættelsen, fig. 13a, deraf vises 25 syntesen af ekspressionsplasmidet pS 210, som koder for et fusionsprotein, der efter cyanbromid-spaltning giver et CSF-derivat, i hvilket alle methionin-grupper er erstattet af neutrale aminosyrer, nemlig i stilling 36 af Ile og i stillingerne 46, 79 og 80 af Leu.

30 I fig. 14 vises en syntetisk DNA-sekvens, som ifølge synteseskemaet i fig. 13 tillader fremstillingen af et CSF-derivat, i hvilket Met i position 36 er erstattet af Ile og i position 46 af Leu, og i stedet for amino-syrerne 79 og 80 er der en eneste Leu-gruppe.

35 I fig. 15 vises til slut en syntetisk DNA, hvis anvendelse i synteseskemaet ifølge fig. 13 muliggør frem- 0 4 DK 170346 B1 stillingen af et CSF-derivat, i hvilket Mét i stilling 36 er erstattet af Ile og stilling 46 af Leu, og hvori de to aminosyrer i stilling 79 og 80 er fjernede. ♦

Det har vist sig, at den "åbne aflæsningsraster" 5 fra en DNA, som koder for interleukin-2, er især fordelagtig * som ekspressionshjælp til ekspression af peptider og proteiner, og at en N-terminal andel af IL-2, som i det væsentlige modsvarer de første hundrede aminosyrer, er særligt godt egnet' til fremstilling af fusionsproteiner.

10 Man får altså som hovedprodukt et fusionsprotéin, som fuldstændigt eller til den helt overvejende del består af eukaryotiske proteinsekvenser. På overraskende måde erkendes dette protein åbenbart ikke som fremmed protein af værts-proteaserne og nedbrydes heller ikke straks igen.

15 Det er en yderligere fordel, at fusioiisproteinerne ifølge opfindelsen er tungtopløselige til uopløselige og følgelig" simpelt kan skilles fra de opløselige proteiner, hensigtsmæssigt ved hjælp af centrifugering. Da det ifølge opfindelsen i henseende til funktionen som "ballast-del" 20 af fusionsproteinet ikke kommer an på, at IL-2-delen er et biologisk aktivt molekyle, kommer det for så vidt heller ikke an på den eksakte struktur af IL-2-delen. Det er tilstrækkeligt, at i det væsentlige de hundrede første L-termi-nale aminosyrer foreligger. Det er altså eksempelvis muligt 25 at ved N-terminalen udføres variationer, som tillader en spaltning af fusionsproteinet, såfremt det ønskede protein er ordnet dertil N-terminalt. Omvendt kan man C-terminalt udføre variationer· for at muliggøre eller lette fraspaltningen af det ønskede protein.

30 Den for human-IL-2 kodende naturlige DNA-sekvens er kendt fra EP-A nr 0.091.539. Den der anførte litteratur refererer til muse- og rotte-IL-2. Disse pattedyr-DNA kan tages i betragtning til syntesen af proteinerne ifølge opfindelsen. Hensigtsmæssigt går man imidlertid ud fra en 35 syntetisk DNA, især fordelagtigt fra en DNA for human-IL-2, som er beskrevet i det tyske offentliggørelsesskrift nr.

DK 170346 Bl 5 3.419.955 eller i EP-A 0.163.249. Denne syntetiske DNA har ikke kun det fortrin, at de i KODON-udvalget er afstemt til de givne forhold hos den hyppigst anvendte vært, E. coli, men den indeholder ligeledes en række spaltesteder 5 til restriktionsendonucleaser ved begyndelsen eller i om-*> rådet for den 100. triplet, hvilke man kan gøre brug af ifølge opfindelsen. Herved er det imidlertid ikke udelukket, at der i det mellemliggende område kan foretages variationer i DNA, hvorved man kan gøre brug af de yderligere 1° spaltesteder.

Gør man brug af nucleaserne Ban II, Sac I eller Sst I, får man således en IL-2-delsekvens, som koder for ca. 95 aminosyrer. Denne længde er almindeligvis tilstrækkelig til at få et uopløseligt fusionsprotein. Hvis eksempel-15 vis et ønsket hydrofilt CSF-derivat alligevel ikke er tilstrækkeligt tungt opløselig^ men man ikke - for at producere så lidt "ballast" som muligt - men gøre brug af de ved C-terminalen nærliggende spaltesteder, kan man således •ed tilsvarende adapters eller linkers forlænge DNA-sekven-20 sen ved den N- og/eller C-terminale ende og således "spalte "ballast"-delen på mål". Man kan naturligvis også anvende DNA-sekvensen - mere eller mindre - til slutningen og således danne - eventuelt modificeret - biologisk aktivt IL-2 som "biprodukt".

25 CSF-Molekylerne ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at de har den almene formel Pro-(As)X-CSF(12-126)-Z, hvori (As)x helt eller delvis betyder de første 11 aminosyrer i den naturlige CSF-sekvens, og Z betyder Glu eller Asp.

30 De omhandlede CSF-proteiner har det væsentlige kende tegn, at de ved N-terminalen indeholder aminosyren prolin.

Disse CSF-proteiner forekommer i modsætning til naturligt forekommende humant GM-CSF ikke i det menneskelige legeme.

Det skal i denne forbindelse fremhæves, at humant GM-CSF 35 naturligvis ikke virker antigent i det menneskelige legeme, da der ellers ville indtræde en autoimmunreaktion i legemet, 6 DK 170346 B1 hvilket da heller ikke er tilfældet hos sunde mennesker. På baggrund af artiklen af Benjamin et al. (1984) er det overraskende, at de omhandlede CSF-proteiner som ikke forekommer i naturen, ikke virker antigent, da Benjamin et al. allerede 5 har vist, at der dannes antistoffer mod høj konserverede proteiner, som kun afviger fra naturligt forekommende proteiner med hensyn til en eneste aminosyre. Det er netop på grund af de omhandlede CSF-proteiners manglende antigene potentiale, at det overhovedet er muligt at anvende disse 10 som farmaceutika til mennesker. I denne henseende er de endog det naturligt forekommende humane GM-CSF overlegne, da de er mere stabile overfor proteaser end human GM-CSF.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man indbygger et gen, der koder for CSF, i en bakte-15 riel ekspressionsvektor, transformerer"bakterier, især E. coli, dermed og bringer genet til ekspression deri.

Spaltningen af fusionsproteinet kan ske på i og for sig kendt måde kemisk .‘eller enzymatisk. Valget af den egnede fremgangsmåde retter sig fremfor alt efter det 20 ønskede proteins aminosyresekvens. Er i broelementet Y ved carboxyterminalen tryptophan eller methionin eller Y Trp eller Met, kan der således ske en kemisk spaltning med N-bromsuccinimid eller halogencyan, såfremt der hver gang syntetiseres CSF-derivater, som ikke indeholder disse 2 5 amino syrer.

CSF og derivater deraf, som i deres aminosyresekvens indeholder Asp-Pro og er tilstrækkeligt syrestabilt, kan, som det er allerede er vist ovenfor, proteolytisk spaltes på i og for sig kendt måde. Herved får man proteiner, 30 som indeholder N-terminalt prolin og C-terminalt asparaginsyre. P-å denne måde kan man altså også syntetisere modificerede proteiner.

Asp-Pro-bindingen kan udformes endnu mere syrelabilt, når dette broelement er (Asp)n~Pro eller 35 Glu-(Asp)n-Pro, idet n er 1-3.

7 DK 170346 B1

Eksempler på enzymatiske spaltninger er ligeledes kendte, idet man også kan anvende modificerede anzymer med forbedret specificitet (jfr. C.S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297).

5 Fusionsproteinet udvindes ved ekspression i et bakterielt ekspressionssystem på i og for sig kendt måde.

Hertil egner alle kendte værts-vektorsystemer såsom bakterier af arterne Streptomyces, B. subtilis, Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, især E. coli, sig.

10 DNA-sekvensen, som koder for det ønskede protein, indbygges på kendt måde i en vektor, som i det valgte ekspressionssystem sikrer en god ekspression.

I denne forbindelse vælger man hensigtsmæssigt promotoren og operatoren blandt trp, lac, tac, PL eller PR 15 fra fagen hsp, omp eller en syntetisk promotor, som de eksempelvis er foreslået i det tyske offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 eller i EP-A nr. 0.173.149. Fordelagtigt er tac-promotor-operator-sekvensen, som imidlertid er gængs i handelen (eksempelvis ekspressionsvektor pKK223-3, 20 Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).

Ved ekspressionen af fusionsproteinet ifølge opfindelsen kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at ændre enkelte tripletter i de første aminosyrer efter ATG-start-25 -codon for at hindre en eventuel basepardannelse på mRNA-planet. Sådanne ændringer som at fjerne eller addere enkelte aminosyrer er velkendte for fagfolk, og opfindelsen angår ligeledes disse ændringer.

Der foretrækkes CSF-proteiner, som i tilslutning til 30 det N-terminalt adderede prolin har hele CSF-aminosyresekven-sen. Det har dog overraskende vist sig, at også variationerne af CSF-molekylet, som fås ved eliminering af de første elleve aminosyrer, er biologisk aktive.

Fordelagtige er også varianter af opfindelsen, som 35 først leder til fusionsproteiner, som indeholder CSF-sekven-sen mere end én gang, fordelagtigt to eller tre gange. I dis- 0 8 DK 170346 B1 se fusionsproteiner er ballast-delen naturligt mindsket og udbyttet af det ønskede protein denned øges.

Ved American Type Culture Cellection er plasmidet pHG 23 deponeret under nummeret ATCC 39900 i E. coli, og dette plasmid 5 fås ved indbygning af CSP-cDNA-sekvensen i Pst I-spaltestedet * "af pBR 322. DNA-sekvensen svarer herved til den i fig. 3 (B) af Wong et al. beskrevne variant. Ved indbygning gøres der brug af Pst I-spaltestedet nær 5'-enden på den ene side og af et ved GC-"Tailing" indført Pst I-sted ved 10 3'-enden (EP-A 0.183.350).

Eksempel 1 Pro°-CSF

(5 Vektoren pUC 12 åbnes med Eco' RI og Pst I, og det store fragment (16) isoleres. Dette fragment (16) ligeres med det syntetiske DNA-fragment (17) og fragmentet (2) (eksempel 1? figur 1). Kompetente celler af E. coli JM 103 transformeres med ligeringsblandingen, og man selekterer 20 de ønskede kloner, som indeholder plasmidet pW 212 (18).

Fra plasmid-DNA fraspaltes fragmentet (19) med Pvu I og Pst I, og dette fragment indeholder CSF--sekvensen.

Ved indføjelse af lac-repressoren (P.J. Parabaugh, 25 Nature 274 (1978) 765-769) i plasmidet pKK 177-3 med pUC 8-polylinkeren (Amann et al., Gene 25 (1983) 167? EP-A nr. 0.133.282) får man plasmidet pJF118 (20) (fig. 1; jfr. tysk patentansøgning nr. P 3.526.995.2, eksempel 6, fig. 6). Dette åbnes ved det singulære restriktionssted 30 for Ava I og formindskes på i og for sig kendt måde ved exonuclease-behandling til ca. 1000 bp. Efter ligering fås plasmidet pEW 1000 (21), hvori man får lac-repres-sorgenet fuldstændigt, som imidlertid på grund af formindskelsen foreligger i tydeligt større antal kopier end 35 udgangsplasmidet.

DK 170346 B1 0 ' 9 I stedet for plasmidet pKK177-3 kan man ligeledes udgå fra det ovennævnte i handelen gængse plasmid pKK223-3, indbygge lac-repressoren og forkorte det frembragte produkt analogt.

5 Plasmidet pEW 1000 (21) åbnes med restriktions enzymerne EcoR I og Sal I, og fragmentet (22) isoleres.

Plasmidet pl59/6 (23), fremstillet ifølge tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.419.995 (EP-A nr. 0.163.249), eksempel 4 (fig. 5), åbnes med restriktionsenzymerne 10 Eco RI og Sal I, og det lille fragment (24) isoleres, og dette fragment indeholder IL-2-sekvensen.

Ved ligering af fragmenterne(22) og (24) fås hybridplasmidet pEW 1001 (25).

Plasmidet (25) åbnes på den ene side med Eco RI 15 og Pvu I, hvorved man får fragment (26) , hvilket indeholder den største del af IL-2-sekvensen. Denne delsekvens betegnes i figurerne med "/\IL2".

På den anden side åbnes plasmidet (25) med Eco RI og Pst I, og det store fragment (27) isoleres.

20 Ved ligering af fragmenterne (19), (26) og (27), transformation af kompetente E. coli 294-celler og selektion får kloner, som indeholder plasmidet pW 216 (28). Plasmid-DNA karakteriseres ved restriktions- og DNA--sekvensanalyse.

25 En kultur af E. coli-celler, der står natten over, og som indeholder plasmidet (28), fortyndes med LB-medium (J. H. Miller, se ovenfor), der indeholder 50 ^ig/ml ampi-cillin, i et forhold på ca. 1:100, og væksten følges via OD-måling. Ved OD = 0,5 indstilles kulturen til 30 1 mM isopropyl-3-galactopyranosid (IPTG), og bakterierne centrifugeres fra efter 150-180 minutters forløb. Bakterierne koges i 5 minutter i en pufferblanding (7 molær urinstof, 0,1% SDS, 0,1 molær natriumphosphat, pH-værdi = 7,0), og der påføres prøver på en SDS-gelelektroforeseplade.

35 Efter elektroforese fås et proteinbånd fra bakterier, som indeholder plasmidet (28), og dette bånd svarer til o 10 DK 170346 B1 størrelsen af det forventede fusionsprotein. Efter opluk-ning af bakterierne (French Press; Dyno-Miihle) og centrifugering befinder fusionsproteinet sig i udfældningen/ således at allerede i den ovenstående væske betydelige mængder af 5 de øvrige proteiner kan skilles fra. Efter isolering af * ‘fusionsproteinet frigøres det forventede CSF-derivat, som indeholder yderligere N-terminalt prolin/ ved syrespaltning. Dette viser aktivitet i den biologiske test.

De angivne induktionsbetingelser gælder for ryste-10 kulturer; ved større fermenteringer er det hensigtsmæssigt med tilsvarende ændrede OD-værdier og eventuelt let varierede IPTG-koncentrationer.

Eksempel 2 15 Pro1-CSF(2-127)

Ved ligering af fragmenterne (2) (fig. 1) og (16) (fig. 2) med den syntetiske DNA-sekvens (29) får man hybrid-plasmidet (30), som lige med undtagelse af den syntetiske DNA-sekvens modsvarer plasmidet (18).

20 Fra plasmidet (30) fraspaltes med Pvu I og Pst I

fragmentet (31), som indeholder CSF-DNA-sekvensen, hvori codon for den første aminosyre imidlertid er erstattet af en codon for protein. Ved ligering af fragmentet (31) ved fragmenterne (26) og (27) får man hybridplasmidet 25 pW 240 (32). Ekspressionen i E. coli, som gennemføres ifølge eksempel 1/ giver et CSF-derivat, hvori den første aminosyre er erstattet af prolin. Også dette derivat har biologisk aktivitet.

30 Eksempel 3 CSF(2-127)

Et plasmid, som indeholder CSF-DNA-sekvensen med et Pst-I-restriktionssted på 3'-enden deraf, eksempelvis plasmidet pHG 23 (ATCC 39900) , spaltes med Sfa NI,

35 og det lineariserede plasmid (34) opfyldes delvist ved hjælp af Klenow-polymerase og GTP. Det udragende nucleotid A

o 11 DK 170346 B1

Fra plastxnidet (43) isoleres fragmentet (44) med Pvu I og Pst I, og dette fragment indeholder DNA--sekvensen for CSF-derivatet. Dette fragment (44) ligeres med fragmenterne (26) og (27), hvilket leder til dannelsen 5 af hybridplasmidet pW 242 (45).

Ekspressionen ifølge eksempel 1 leder til dannelsen af et fusionsprotein, ud fra hvilket man efter syrespaltning får et CSF-derivat, i hvilket de første fem aminosyrer mangler. Også dette produkt er biologisk aktivt.

10 fraspaltes med Sl-nuclease og derpå fraspaltes fragmentet (35) med Pst I.

Ved ligering af fragmentet (35) med den syntetiske DNA-sekvens (36) og fragmentet (16) (fig. 2) får man plasmi-det (37), som er analogt til plasmidet (18).

15 Fra plasmidet (37) fraspaltes fragmentet (38) ved hjælp af Pvu I og Pst I. Dette fragment ligeres med fragmenterne (26) og (27), hvorved man får plasmidet pW 241 (39) .

Ved ekspression ifølge eksempel 1- får man fusions-20 protein, som efter syrespaltning giver et CSF-derivat, hvori den første aminosyre mangler. Dette derivat er biologisk aktivt.

Eksempel 4 25 CSF (6-127).

Plasmidet (33) (eller et tilsvarende plasmid, som indeholder CSF-*-DNA-sekvensen) spaltes først helt med Pst I og derpå delvist med Bst NI, og fragmentet (40) isoleres.

De syntetiske DNA-sekvenser (41) og (36) (fig. 4) 30 ligeres først til sekvensen (42), og denne ligeres derpå med fragmentet (16) (fig. 2) og fragmentet (40) , hvorved man får plasmidet pW 212 (43).

35 0 12 DK 170346 B1

Eksempel 5 CSF(8-127).

Ligerer man først den syntetiske DNA-sekvens (36) (fig. 4) med den syntetiske DNA-sekvens (46) og derpå 5 det således tilvejebragte DNA-fragment (47) med fragmenterne (40) og (16), får man således hybridplasmidet (48).

Fra dette spaltes ved hjælp af Pvu I og Pst II fragmentet (49) , som indeholder DNA-sekvensen for CSF-derivatet.

Ligering af fragmenterne (49, (26) og (27) giver hybrid-10 plasmidet pW 243 (50), som svarer til plasmidet (45) lige med undtagelse af den forkortede DNA-sekvens for CSF-derivatet.

Ekspressionen ifølge eksempel 1 leder til et fusionsprotein, som efter syrespaltning giver et CSF-deri-15 vat, hvori de første syv aminosyrer mångler. Også dette derivat er biologisk aktivt.

Eksempel 6 CSF(12-127).

20 Ligerer man den syntetiske DNA-sekvens (51) med fragmenterne (33) og (16), får man således hybridplasmidet (52). Spalter man fra dette ved hjælp af Pvu I og Pst I sekvensen (53), som indeholder DNA-sekvensen for CSF-derivatet, og ligerer dette fragment (53) med fragmenterne (26) 25 og (27), får man således hybridplasmidet pW 244 (54), der svarer til plasmidet (45) lige med undtagelse af den forkortede CSF-sekvens.

Ekspressionen ifølge eksempel 1 leder til et fusionsprotein, som efter syrespaltning giver et CSF-derivat, 30 hvori aminosyrerne 1-11 er fjernede. Også dette forkortede molekyle er biologisk aktivt.

Eksempel 7 -

Pro°-CSF(1-126)-Asp.

35 Man spalter delvist DNA-sekvensen (19) (fig. 2) med Bst NI og isolerer fragmentet (55), som indeholder o 13 DK 170346 B1 den største del CSF-sekvensen.

Ved spaltning af plasmidet (33) (fig. 4) (eller et tilsvarende plasmid, som indeholder CSF-DNA-sekvensen) med først Pst I og derpå partielt med Bst NI får man DNA-5 -sekvensen (56), som omfatter den største del af CSF--sekvensen.

Man syntetiserer DNA-sekvensen (57) , som komplete-rer sekvensen (56) til en DNA-sekvens, som koder for CSF--derivat, i hvis C-terminal glutaminsyren er erstattet'af 1o asparaginsyre.

Vektoren pUC 13 åbnes med Pst I og Sma I og man isolerer det store fragment (58). Ligerer man dette restplasmid (58) med fragmenterne (56) og (57)^ får man således hybrid-plasmidet pW 245 (59) med den C-terminalt modificerede 15 sekvens.

Fra plasmidet (59) spalter man ved hjælp af Sfa NI og Pst I fragmentet (60) fra, som indeholder den modificerede CSF-DNA-sekvens. Dette fragment (60) ligeres med den syntetiske DNA-sekvens (61) og fragmentet 20 (55), hvorved man får DNA-sekvensen (62). Denne ligeres med DNA-fragmenterne (26) og (27) (fig. 2), hvorved man får hybridplasmidet pw 246 (63). Dette plasmid er gengivet to gange i'fig. 8a, idet man skal hente det kodende fusionsproteins aminosyresekvens fra den nederste gengivelse.

25 Ved ekspressionen ifølge eksempel 1 fås et fusions protein, af hvilket der efter syrespaltning fremkommer et CSF-derivat, som N-terminalt er forlænget med prolin, og hvori den sidste aminosyre desuden er erstattet af asparaginsyre. Dette derivat er biologisk aktivt.

30

Eksempel 8 Pro°-CSF(1-126)-Asp

Man spalter hybridplasmidet (63) (fig. 8) med Eco RI og Pst I og isolerer fragmentet, som i 35 tilslutning til IL-2-delsekvensen indeholder de to modificerede CSF-sekvenser. Denne sekvens (64) spaltes DK 170346 Bl 14

O

delvis med Rsa I, og de to fragmenter (65) og (66) isole res. Ved ligering af DNA-sekvenserne (27), (65), (67), (61) og (60) får man hybridplasmidet pW 247 (68), hvori de ligerede sekvenser er ordnede i den nævnte rækkefølge.

5 Ekspressionen ifølge eksempel 1 giver et fusions- protein, ud fra hvilket der efter syrespaltning fås det samme CSF-derivat som ifølge eksempel 7.

Eksempel 9 10 Syntetisk gen (for Pro°-CSF).

Ved i og for sig kendte fremgangsmåder, eksempelvis ifølge phosphitmetoden (tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.327.007, 3.328.793, 3.409.966, 3.414.831 og 3.419.995) syntetiseres de tre "synteseblbkke"I (CSF-I), i figurerne .jg betegnet som (69) , II (CAF-II)j i figurerne som (70) , og III (CSF-III); i figurerne som (71) . I disse synteseblokkes nucleotidfølge er de syntetiserede oligonucleotider Ia-Im, Ila-IIf og Illa-IIIl indtegnede (bilag).

Med valget af nucleotiderne til det syntetiske 20 gen fastsættes der ikke kun singulære spaltesteder ved de tre synteseblokkes sammenstykningssteder, men inden for genfragmenterne ligeledes en række singulære restriktionssteder. Disse er angivne i de følgende tabeller. Disse singulære restriktionssteder kan på i og for sig kendt måde 25 tjene til at udskifte, at supplere eller fjerne codons for aminosyrer.

30 35 0 15 DK 170346 B1

Sgiteseblok I (CSF I)_ Spaltning efter nucleotid nr.

Enzym Genkendelsessekvens (kodende streng)

Nar I GG+CGCC 1 5 Hpa II C+CGG 4 ‘ Hae II GGCGC4C 4

Nae I GCC4GGC 5

Pvu I CGAT+CG 13

Sal I G+TCGAC 24 10 Acc I GT4CGAC 25

Hine II GTC4GAC 26

Hpa 1/ GTT4AAC 48

Hine II

Hha I GCG40 66 15 Hinf I G+AGTC \ 88

Nru I TCG+CGA 89

Xma III ClGGCCG 95

Sac II CCGC4CG 101

Eco RV GAT4ATC 128 20

Synteseblok II (CSF-II) 25 Spaltning efter nucleotid nr.

Enzym Genkendelsessekvens (kodende streng)

Afl III A4CATGT 157

Mlu I A4CGCGT 169 30 Xho I ClTCGAC 175

Tag I T+CGA 176

Hga I GACGC (5/10) 177

Ava I C+TCGAG 177

Alu I AG+CT 180 35 Sac 1/ GAGCT+C 182

Hgi AI

Stu 1/ AGG+CCT 194

Hae I

0 16 DK 170346 B1

Synteseblok III (CSF-III)

Spaltning efter nucleotid nr. Enzym Genkendelsessekvens (kodende streng) 5 Afl II C+TTAAG 217 - Hae III GG+CC 224

Apa I GGGCC+C 227

Mnl I CCTC (7/7) 238

Nhe I G*CTAGC 241 10 Mae I C+TAG 242

Aha II GA+CGTC 280

Aat II GACGT4C 283

Sci NI G4CGC 287

Mst I TCG+GCA 288 15 Sau 3AI/ IGATC 296

Mb o I

Dpn I GA+TC 298

Asu II TT+CGAA 308

Aha III TTT+AAA 318 20 Ava II G4GTCC 382

Eco RI I +CCAGG 384

Bst NI/ CC+AGG 380

Ser PI

25 De tre synteseblokke klones først enkeltvis, forøges i E. coli og isoleres igen:

Synteseblokken CSF-I (69) indbygges i pUC 12-derivatet (16), hvorved man får plasmidet pS 200 (72).

pUC 12 åbnes med restriktionsenzymerne Pst I og 30 Hind III og ligeres med det lineariserede plasmid (73) fra synteseblokken CSF-II (70), hvorved man får plasmidet pS 201 (74) .

pUC 13 åbnes med Hind III og Sma I, og det linea-riserede plasmid (75) ligeres med CSF-III, hvorved man får 35 plasmidet pS 202 (76).

0 17 DK 170346 B1

De reisolerede synteseblokke (69)/ (70) og (71) ligeres derpå i den med Eco RI og Sma II lineariserede vektor pUC 12 (77), idet man får plasmidet pS 203 (78).

Dette hybridplasmid forøges - såsom plasmiderne med de en-5 kelte synteseblokke - i E. coli 79/02, og det syntetiske gen karakteriseres ved restriktions- og sekvensanalyse.

Plasmidet (78) spaltes partielt med Pvu I og Barn HI, og det lille fragment (79) isoleres med hele CSF-sekvensen.

10 Ekspressionsplasmidet (21) åbnes med Eco RI og

Barn HI, og det store fragment (80) isoleres. Dette fragment (80) ligeres derpå med fragmentet (26), som indeholder IL-2-delsekvensen, og det syntetiske gen (79). Herved får man plasmidet pS 204 (81) som koder for et fusionsprotein, 15 i hvilket der på IL-2-delsekvensen først følger broelementet, som tillader syrespaltningen, og derpå aminosyresekven-sen af CSF. Ved syrespaltning fås følgelig et CSF-derivat, som er N-terminalt forlænget med prolin.

20 Eksempel 10 CSF(1-12)His(14-121)His(123-127)

Erstatter man i synteseblok I oligonucleotiderne la og Ib samt Ic og Id med de syntetiske sekvenser (82) og (83), får man således en modificeret synteseblok I, som ko- ..

25 der for en CSF-I-analog, hvori Trp står foran den første aminosyre (Ala) og i position 13 erstattes Trp med His.

Plasmidet (72) (fig. 10) åbnes med Eco RI og Hpa I, og det store fragment (84) isoleres. Dette ligeres derpå med de syntetiske fragmenter (82) og (83), hvorved man får 30 plasmidet pS 205 (85) som koder for dette modificerede CSF I- (CSF-11) .

Man åbner plasmidet (76) (fig. 10) med Hind III og Sal I og isolerer det lille (86) og det store (87) fragment. Det lille fragment (86) efterspaltes med Taq I} og

OC

fragmentet (88) isoleres.

Det store fragment (87) ligeres derpå med (88) og ' 18 DK 170346 B1 0 det syntetiske fragment (89), i hvilket codon for Trp i position 122 er erstattet med His, idet man får plasmidet pS 206 (90), som koder for det modificerede CSF III (CSF-III')· Dette plasmid transformeres, forøges og re-5 isoleres efter E. coli, spaltes med Hind III og Sal I, “ og det lille fragment (91), som koder for CSF-III', isoleres.

Plasmidet (85) spaltes partielt med Pvu I og med Pst I, og det lille fragment (92), som koder for CSF-I' isoleres.

10 Ligerer man derpå fragmenterne (22), (26), (92), (70) og (91), får man således plasmidet pS 207 (93). Dette koder for et fusionsprotein, i hvilket der på IL-2-delse-kvensen følger et broelement, som umiddelbart foran den første aminosyre af CSF (Ala) indeholder Trp. Da Trp i CSF-15 -molekylet i positionerne 13 og 122 erstattes af His kan der derefter ske en spaltning af fusionsproteinet med N-brom-succinimid. Derved får man CSF--derivatet, hvori tryptophan i begge positioner er erstattet af histidin.

20 Eksempel 11 CSF(1-99)Thr(101-127)

Erstatter man ved syntesen af synteseblokken III oligonucleotiderne Ille og Ulf med den syntetiske sekvens (94); og går man i øvrigt frem ifølge eksempel 9, får man 25 således et CSF-derivat, hvori ILe i position 100 er erstatte't af Thr.

Eksempel 12 CSF(1-35)Ile(37-45)Leu(47-78)Leu-Leu(81-127) 30 Man syntetiserer først oligonucleotidet (95), som i position 36 indeholder codon for Ile i stedet for Met, og oligonucleotidet (96), hvori codon for Met er erstattet af Leu. .

Derpå åbnes plasmidet (72) (fig. 10) med Pvu I 35 og Xma III, og fragmentet (97) isoleres. Endvidere syntetiserer man sekvensen (98), i hvilket der forud for codon for ' 19 DK 170346 B1 0 den første aminosyre er anbragt codon for Met.

Ligerer man derpå fragmenterne (16), (98), (97), (95) og (96) , får man således plasmidet pS 208 (99). Dette svarer til plasmidet (72), men indeholder i CSF-I-sekven-5 sen i positionen 0 codon for Met, i position 36 et codon for Ile og i position 46 et codon for Leu.

Man syntetiserer endvidere sekvensen (100), som i positionerne 79 og 80 koder for Leu i stedet for Met.

10 Åbner man plasmidet (76) (fig. 10) med Hind III

og Nhe I, isolerer det store fragment (101) og ligerer det med den syntetiske sekvens (100), får man således plasmidet pS 209 (102), som svarer til plasmidet (76) på nær udbytningen af de to codoner i position 79 og 80 i CSF-III-15 -sekvensen.

Man spalter derpå plasmidet (93) (fig. 11a) partielt med Pvu I og med Sal I og isolerer det store fragment (103). Plasmidet (99) åbnes ligeledes partielt med Pvu I og med Pst I, og man isolerer det lille fragment (104) 20 som indeholder den modificerede CSF-I-sekvens. Desuden åbner man plasmidet (102) med Hind III og Sal I og isolerer det lille fragment (105) , som omfatter den modificerede CSF-III-sekvens.

Derpå ligerer man fragmenterne (103), (104), Ϊ70) 25 og (105), hvorved man får plasmidet pS 210 (106), som svarer til plasmidet (93) (fig. 11a), men koder for et CSF-derivat, i hvilket Met står i positionen 0, og på den anden side er de fire Met-grupper erstattet af andre aminosyrer.

Transformerer man med plasmidet (106) E. coli, 30 får man således efter induktion et fusionsprotein, som er spalteligt med cyanohalogenid, idet man får et CSF-derivat, som i position 36 indeholder Ile og i positionerne 46, 79 og • 80 Leu.

35 DK 170346 B1 20 o

Eksempel 13 CSF(1-35)Ile(37-45)Leu(47-78)Leu(81-127) Går man frem ifølge eksempel 12, men i stedet for den syntetiske sekvens (100) anvender den syntetiske sekvens 5 (107), får man således et deletionsprodukt, hvori der i po sition 36 står Ile og i position 46 Leu, og hvori der i stedet for aminosyrerne79 og 80 forekommer aminosyren Leu.

10 Eksempel 14 CSF(1-35)Ile(37-45)Leu(47-78)-(81-127) Går man frem ifølge eksempel 12, men i stedet for den syntetiske sekvens (100) indsætter den syntetiske sekvens (108) får man således et deletionsprodukt, hvori der 15 i position 36 står Ile og i position 46 Leu, og aminosyrerne i positon 79 og 80 er fjernede.

20 25 " 30 35 21 DK 170346 B1 0

Bilag

Synteseblok I (CSF-I) (69) 5 --Ici-----Ic 1 · ·

• AAT TCG ATC GAC GAC CCG GCG CCG GCcJcGA TCG CCG TCT CCG

GC TAG CTG CTG GGC CGC GGC CGG GCT AGcJgGC AGA GGC

(Eco Ri) Ile Asp Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro

io »--xt—LU_122. ^-1J

t 50 XC — ► - 2e - -—X-3

TCG ACC CAG CCC |tGG GAA CAC GTT AAC GCG AT C CAG GaJa GCG 15 AGC TGG GTC GGG ACC CTT|GTG CAA TTG CGC TAG GTC CTT CGC

Ser Thr Gin Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gin Glu Ala τά—^ι--m_if

1\--—-—-H

20 c · · · ·

CGG CGTCTG CTG AAC CTG AGT CGC|GAC ACG GCC GCG GAA ATG

Gcjc GCA GAC GAC TTG GAC TCA GCG CTG TGC | CGG CGC CTT TAC

Arg Arg Leu leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met li—«-£22)-Xf,-(30)-^ ^-(35)-1 k 25 --U_!« • · · · ·

AAC GAA ACC GTT GAAJgTGATA TCT GAG ATG TTC GAC CTG CA

TTG CTT TGG CAA CTT CAC TATjAGA CTC TAC AAG CTG G (Pst I) 30 Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp(leu) T/ (40) (45) (50)

Xk----► ----p* 35 * 22 DK 170346 B1 0

Synteseblok II (CSF-II) (70) 150 ^ τη- .

--Ha- ---JlC

5 · · · · ** (Pst i)g gaa ccg aca tgt ctc cag acg|cgt ctc gag ctc tac

AC GTC CTT GGC TGT ACA GAG GTC TGC GCA GAG|CTC GAG ATG

(Gln)Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu leu Tyr (50) __ (55) (60) _ .

10 JLL ia 1 " pm ............... II Cl _ 200 w 214 n c--- -*-jPe-►*> AAA CAA GGCjCTT CGT GGT TCT CTG ACC A (Hind III)

TTT GTT CCG GAA GCAlCCA AGA GAC TGG TTC GA

15 lys Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr (Lys)

Icl-<«>---iZSljrf-- 20 25 30 > 35 0 23 DK 170346 B1

Synteseblok III (CSF-III) (71) 215 ΤΓ 250 _ ^—......ilia-----JITc • · · · ·

5 , AG CTT AAG GGG CCC CTC ACC ATG ATG GCT AGC CAc|tAC AAA

("Hinå III) A TTC CCC GGG GAG TGG TAC TAC CGA TCG GTG ATG TTT | (Leu)lys Gly Pro leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr lys (72) (75) (80) (85) --BTfc--- 10 ffic - - - ***· --UTe

CAG CAC TGC CCG CCG ACT CCG GAG ACg|tCT TGC GCA ACG CAG GTC GTG ACG GGC GGC TGA GGC CTC TGC AGA ACg]CGT TGC GTC

Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gin ,5 ---^£L_sN-r(95) ► *-sr-f 300 _ jTe-7—-;-J-ϋί-3-;--

ATO ATCIACC TTO GAA TOT TTT AAA GAA AAC CTS AAG GAC ITT

TAG TAG TGG AA&I CTT AGA AAA TTT CTT TTG GAC TTC CTG AAA

20

Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe _-Ooo) (105) (110) j!Lf--Hi 350 391 --Ml i------nrk • · · · ·· ^

25 |cTG CTT GTT ATA CCG TTC GAC TGT TGG GAG|CCG GTC CAG GAA

GAC GAA|CAA TAT GGC AAG CTG ACA ACC CTC GGC CAG|GTC CTT

Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gin Glu (115) (120) (125) .

Dpi--l&j -► --/II i

30 V

Mk— »

Sal I Pst I TGA TA*G TCG ACT GCA GCC C ACT ATC AGC TGA CGT CGG G 35 Stp Stp (Sma I)

Ri ^

Claims

24 DK 170346 B1 PATENTKRAV.

1. Granulocyt-makrofag-"Colony Stimulating”-faktor-(CSF)-proteiner, kendetegnet ved, at de har den almene formel

2. Fremgangsmåde til fremstilling af CSF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man indbygger et gen, der 10 koder for CSF, i en bakteriel ekspressionsvektor, transformerer bakterier, især E. coli, dermed og bringer genet til ekspression deri.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man udtrykker CSF i form af et fusionsprotein, 15 som derpå spaltes enzymatisk eller kemisk.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at fusionsproteinet N-terminalt nabostillet til CSF indeholder aminosyresekvensen (Glu)m-(Asp)n-Pro, 20 hvori m er nul eller 1 og η 1, 2 eller 3, og spaltes proteo-lytisk.

5. Bakteriel ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den indeholder mindst ét gen, som koder for CSF ifølge krav 1.

5 Pro-(As)χ-CSF(12-126)-Z, hvori (As)x helt eller delvis betyder de første 11 aminosyrer i den naturlige CSF-sekvens, og Z betyder Glu eller Asp.

6. Bakteriecelle, især E. coli, kendeteg net ved, at den indeholder en vektor ifølge krav 5.

7. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det indeholder eller består af CSF ifølge krav 1.

8. Anvendelse af CSF ifølge krav 1 til fremstilling 30 af lægemidler. 35