DK172012B1 - Rekombinant human-H2-præprorelaxin, -prorelaxin og -relaxin samt polypeptid med relaxinaktivitet. - Google Patents

Description

i DK 172012 B1

Opfindelsen angår 1 alt væsentligt ren rekomblnant human-H2-præpro-relaxin, -prorelaxln og -relaxin samt i alt væsentligt rent poly-peptid med relaxinaktivitet.

5 I beskrivelsen til DK patentansøgning nr. 3664/83 med prioritet 12. aug.1982 omtaltes den molekylære kloning og karakterisering af et gen, der koder for humanrelaxin. Vi har nu fundet et andet gen, som også koder for humanrelaxin.

10 Yderligere angår opfindelsen modificerede gener, der koder for de individuelle relaxinkæder og for ovennævnte modificerede former.

[Note: Litteraturreferencer, som anvendes i den følgende beskrivelse, angives i slutningen af beskrivelsen].

15 I pionerarbejdet af Hisaw 1926 foreslås en vigtig rolle for peptidhormonet relaxin i pattedyr, ved at det virker dilaterende på skambensfugen og således gør fødselsprocessen lettere. Relaxin syntetiseres og opbevares under svangerskab i ovariernes corpus 20 luteum og frigøres i blodstrømmen forud for fødslen. Tilgængeligheden af ovarier har gjort det muligt at isolere og bestemme aminosyresekvensen af relaxin fra svin (James et al, 1977; Schwabe et al, 1977), fra rotter (John et al, 1981) og fra hajer (Schwabe et al, 1982). Det biologisk aktive hormon består af to peptidkæder 25 (kendt som A- og B-kæderne), sammenholdt ved disulfidbindinger, 2 inter-kæde bindinger og 1 intra-kæde binding. Strukturen ligner således meget strukturen af insulin hvad angår anbringelsen af disulfidbindingerne, hvilket har ført til spekulation angående et fælles stamgen for disse hormoner (James et al, 1977; Schwabe et al, 30 1977).

Rekombinant-DNA-metoder er blevet anvendt til isolering af cDNA- kloner for både rotte- og svinerelaxiner (Hudson et al, 1981; Harley et al, 1982), se også DK patentansøgning nr. 615/83. Syntetiske 35 nukleotider indeholdende 11 nukleotider og fremstillet på basis af aminosyresekvensinformation blev anvendt som primere for syntesen af cDNA-prober (-prøvemidler), som var stærkt beriget med hensyn til relaxin-cDNA-sekvenser, hvorved identificerede relaxin-cDNA-kloner i gen-"biblioteker" hidrørende fra både rotte- og svineovarievæv. Man 2 DK 172012 B1 fandt, at relaxinstrukturgenet i begge tilfælde kodede for et enkelt kædeforstadie, som ligner preproinsulin i den overordnede konfiguration, dvs. signalpeptid/B-kæde/C-peptid/ A-kæde.

5 Corpus luteum i ovariet såvel som i deciduale og placentale væv er de mest sandsynlige steder, hvor relaxin-beslægtede gener kommer til udtryk. På grund af den store udbredelse af mange peptidhormoner er det imidlertid meget sandsynligt, at relaxingenet også kommer til udtryk i ikke-reproduktivt væv, inklusiv hjerne og mave/tarm-syste-10 met. Relaxin har de almene egenskaber som en vækstfaktor har og er i stand til at ændre bindevævs natur og påvirke glatte musklers kontraktion. Vi formoder, at den ene eller begge de genstrukturer, der omtales i denne beskrivelse og i DK patentansøgning nr. 3664/83 er vidt udbredt i legemet. Vi formoder, at de relaxinpeptider, der ^ udtrykkes af sådanne gener, spiller en vigtig fysiologisk rolle ud over deres veldokumenterede hormonale funktion under reproduktionen.

Følgende forkortelser anvendes i den foreliggende beskrivelse:

Hl: det relaxingen, der omtales i DK patentansøgning nr. 3664/83, ?0 som er afledt ud fra en genklon, H2: det relaxingen, der beskrives her, og som afledes ud fra en cDNA-klon, 25 30 35 3 DK 172012 B1 DNA : deoxyribonukleinsyre A : adenin RNA : ribonukleinsyre T : thymin 5 cDNA : komplementært DNA G : guanin (syntetiseres enzymatisk ud C : cytosin fra en mRNA-sekvens) U : uracil mRNA : meddeler-RNA (messenger-RNA) 10 Koderel etionerne mellem nukleotidsekvensen i DNA og aminosyre-sekvensen i protein benævnes den genetiske kode og er anført nedenfor.

Første Tredie 15 base base (5' ende) _Anden base (3' enden)

U C A G

Phe Ser Tyr Cys U

y Phe Ser Tyr Cys C

20 Leu Ser Stop Stop A

Leu Ser Stop Trp G

Leu Pro His Arg U

ς Leu Pro His Arg C

^ Leu Pro Gin Arg A

Leu Pro Gin Arg G

Ile Thr Asn Ser U

^ Ile Thr Asn Ser C

30 Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

Val Ala Asp Gly U

6 Val Ala Asp Gly C

35 Val Ala Glu Gly A

Val Ala Glu Gly G

De forkortelser, der anvendes for aminosyrerne i tabellen, 4 DK 172012 B1 identificeres som følger:

Phenylalanin (Phe) Histidin (His)

Leucin (Leu) Glutamin (Gin) 5 Isoleucin (Ile) Asparagin (Asn)

Methionin (Met) Lysin (Lys)

Valin (Val) Asparaginsyre (Asp)

Serin (Ser) Glutaminsyre (GIu)

Prolin (Pro) Cystein (Cys) 10 Threonin (Thr) Tryptophan (Trp)

Alanin (Ala) Arginin (Arg)

Tyrosin (Tyr) Glycin (Gly)

Hver 3-bogstavkode (kaldet en codon) i tabellen, f.eks. AUG, CAU 15 (ellers kendt som en deoxynukleotidtriplet eller nukleotidtriplet) svarer til et trinukleotid i mRNA med en 5'-ende på venstre side og en 3'-ende på højre side. Bogstaverne står for de purin- eller pyri-midinbaser, der udgør nukleotidsekvensen. Alle de DNA-sekvenser, der refereres til heri, er sekvenser i den streng, hvis sekvens svarer 2° til mRNA-sekvensen, idet thymin (T) angives i stedet for uracil (U).

Opfindelsen vil blive diskuteres yderligere og uddybet i den efterfølgende diskussion. Der vil blive henvist til den tilhørende tegning, hvor: 25 fig.l viser et forkortet restriktionsenzymkort og sekventerings-strategien for cDNA-klonen i pBR322, genklonen Hil og GT10 cDNA-klonerne a-f. Pilene angiver sekventeringsretningen på endemærkede fragmenter (se metoder). GT10-klonerne a-f blev sekventeret ved 30 subkloning i en M13-vektor, hvilket beskrives senere. Nucleotiderne nummereres fra AUG-initieringscodon, position 1-3, til den terminerende codon, positionen 554-556.

Fig. 2 sammenligner aminosyresekvensen og mRNA-sekvensen for human-35 præprorelaxin H2 (øverst) med den tilsvarende sekvens for Hl (nederst). Sekvenserne er blevet anbragt ved siden af hinanden for at maximere homologi, idet nukleotid-identiteter er blevet angivet ved stjerner og aminosyrehomologer med indrammede arealer. Aminosy-rerne nummereres fra starten af B-kæden (H2-gensekvensen begyndende 5 DK 172012 B1 ved -1 og Hl-sekvensen ved +1), skønt denne position alene repræsenterer den hypotetiske start for B-kædesekvensen og ganske enkelt er blevet deduceret ud fra homologien med de beslægtede porcin- og rottepreprorelaxinstrukturer. Stjernen under Ala 45 i C-peptidet 5 angiver positionen for en intron i G/CA-codon i begge gener.

Fig.3 viser autoradiogrammer af identiske nitrocellulosestrimler taget fra a) Northern-geloverførsel af humanovarie-RNA eller b) g-plaque svarende til Hl-genet (gH7) eller H2-genet (gGTlO-a), hvor 10 der som hybridiseringsprober anvendes A: et tilfældigt primet 600 bp lang H2-relaxin-cDNA-fragment (72-660), B: en H2-specifik 25-mer (483-507), C: en Hl-specifik 25-mer (483-507), D: en Hl-specifik 25-mer (248-272).

15 Fig. 4 viser autoradiogrammer af identiske nitrocellulosestrimler efter Northern-geloverførsel af humanovarie-RNA, hvor der som hybridiseringsprober anvendes fragmenter af H2-cDNA-klonen i pBR322 (se fig. 1).

20 A: 600 bp-fragment (72-660) svarende til det meste af det kodende område.

B: 5'-ikke-translateret område (til Hinf-I-stedet ved nukleotid 30).

C: 3'-ikke-translateret område (fra Hinf-I-stedet ved nukleotid 25 660).

D: 3'-ikke-transi ateret område (fra Hpa-I-stedet ved nukleotid 850).

Fig. 5 sammenligner aminosyresekvenserne for B- og A-kæderne for de to humane relaxingener, human insulin og andre medlemmer af relaxinfamilien. Indrammede arealer udpeger områder, som er bevaret mellem de to humane relaxingener og relaxinfamilien. Pile angiver sandsynlige spaltningssteder for proteolytisk spaltning, hvilket bekræftes ved proteinsekveteringsresultater for den aminosyretermi- 35 nåle rest af B- og A-kæderne i porcinrelaxin (Schwabe et al, 1977;

James et al, 1977), rotterelaxin (John et al., 1981), hajrelaxin (Schwabe et al, 1982) og "dogfish"-relaxiner (Schwabe et al, 1983).

Den på fig. 2 viste H2-mRNA-sekvens bestemtes ved de metoder, der 6 DK 172012 B1 omtales herefter. For at gøre det lettere at sammenligne, er den nummerering af aminosyrer, der tidligere er anvendt for det peptid, der hidrører fra Hl-sekvensen, blevet bevaret i den foreliggende beskrivelse for det H2-afledte peptid. Strukturen af Hl-preprorela-5 xin blev afledt ud fra gensekvensen ved sammenligning med de homologe strukturer af svine-og rotterelaxin. H2-preprorelaxinstrukturen blev deduceret ved sammenligning med Hl-strukturen såvel som med svine- og rottestrukturerne. Bekræftigelse af A- og B-peptidkæde-strukturerne er blevet tilvejebragt ved syntese og kæderekombination 10 in vitro, hvilket tilvejebringer et materiale, som er biologisk aktivt i uteruskontraktionsanalysen.

Det fremgår af fig. 2, at den foreliggende og de tidligere sekvenser udviser signifikante forskelle såsom som ligheder. Bemærkelsesvær-digt er: (1) Signifikante aminosyreforskelle i de tre hovedområder: (a) den N-terminale ende af B-kæden (b) den N-terminale ende af A-kæden 20 (c) midten af C-peptidet.

(2) Områder med stærk homologi 1 B-kæden og C-peptidet: (a) 120 identiske baser fra Val® til Ile47.

(b) 88-90 identiske baser fra Phe*®* til Ser13^.

25

De to gener ligner derfor meget hinanden, men forskellen er tilstrækkelig til at indicere, at H2-genet virkelig er et andet gen og ikke blot et polymorft gen af Hl.

30

In vitro indvirkningen (eng.: processing) på Hl-preprorelaxin er ikke helt kendt, men 1 analogi med svinerelaxin forventes spaltningen af signalpeptidet at ske ved Ala’*-Lys*-bindingen. Udskæ-ringen af Hl-C-peptidet forudsiges at ske ved Leu -Ser og

Arg*36-Arg137, hvilket således giver Hl-B- og Hl-A-kæderne på 32 35 henholdsvis 24 aminosyrerester (fig.2).

I H2-preprorelaxin er Ala"* blevet erstattet med Asp og man ville således forvente spaltning af signalpeptidet efter alanin svarende til position -2 i Hl. Spaltning af forbindelsen mellem H2-B-kæden og DK 172012 B1 7 32 C-peptidet forventes efter Leu i analogi med alle andre prorela- xiner, hvilket giver H2-B-kæden med 33 aminosyrerester. Spaltning af 136 forbindelsen mellem H2-C-peptidet og A-kæden vil ske efter Arg i analogi med rottepreprorelaxin, hvilket således giver H2-A-kæden med 5 24 aminosyrerester.

Som anført i forbindelse med vore undersøgelser af svinerelaxin er der indre sekvenser i svinerelaxinens B- og A-kæde, som alle er essentielle elementer for biologisk aktivitet. Vore syntetiske 10 undersøgelser på humanrelaxinkæden viser lignende resultater, hvilket angives i større detaljer senere.

Ifølge et aspekt for den foreliggende opfindelse tilvejebringes et gen til ekspression af human H2-preprorelaxin.

15

Med mindre andet angives, vil de efterfølgende henvisninger til gensekvenser for preprorelaxin, prorelaxin, relaxin og signalet, A-, B- og C-peptiderne samt til selve peptiderne angå H2-varianter og udelukke Hl-varianterne.

20

Ovennævnte aspekt af opfindelsen tilvejebringer mere specifikt et dobbeltstrenget DNA-fragment til ekspression af human preprorelaxin, hvilket fragment omfatter en kodende streng og en komplementær streng svarende til den fuldstændige mRNA-sekvens (codon -25 til 160), som vises på fig. 2 på den tilhørende tegning.

Opfindelsen omfatter også en hvilken som helst subunit (underenhed) af H2-preprorelaxingensekvensen beskrevet herefter eller en hvilken som helst ækvivalent til denne sekvens eller subunit. Blandt de 30 subunits, som omfattes af denne definition, er de individuelle strukturelle gener, der koder for signalpeptidkæden og de separate H2-A- og H2-B-peptider samt H2-C-kæden i humanpreprorelaxin (se fig.

2) og hvilke som helst kombinationer af disse kæder, f.eks. generne, der udtrykker H2-A- og H2-B-peptiderne, separat eller som prorelaxin 35 (med H2-C-kæden). Disse subunits omfatter også fragmenter og kombinationer af fragmenter af hvilke som helst af disse gensekvenser.

Ifølge et andet aspekt for den foreliggende opfindelse 8 DK 172012 B1 tilvejebringes således et gen til ekspression af human prorelaxin.

Mere specifik tilvejebringes med dette aspekt for opfindelsen et dobbeltstrenget DNA-fragment, der koder for humanprorelaxin, hvilket 5 fragment omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de codon, der er nummereret 1 til 160 i den på fig. 2 viste mRNA-sekvens.

Ifølge et yderligere aspekt for opfindelsen tilvejebringes gener til 10 den separate ekspression af A-, B- og C-kæderne i humanrelaxin eller en hvilken som helst kombination af to eller flere af disse kæder samt et hvilket som helst fragment eller kombination af fragmenter af kæderne.

Mere specielt tilvejebringer dette aspekt ved opfindelsen dobbeltstrengede DNA-fragmenter til den separate ekspression af A-og/eller B- og/eller C-kæderne i humanrelaxin (eller fragmenter som ovenfor beskrevet), hvilket DNA-fragmenter omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de codon, der er nummereret som -1 til 32, 33-136 og 137-160 i den på fig. 2 i den tilhørende tegning viste mRNA-sekvens.

De ovenfor beskrevne gener kan ud over de angivne codon også indbefatte de hensigtsmæssige "start"- og "stop"-codon, f.eks. AUG 25 henholdsvis UGA (codon -25 og 161 i figur 2).

En fagmand vil forstå, at der kan eksistere polymorfe former af generne. Sådanne former er inkluderet i den foreliggende opfindelse.

^ Opfindelsen omfatter ligeledes komplementerne til de ovenfor nævnte sekvenser, underenheder eller ækvivalenter samt de tilsvarende RNA-sekvenser, underenheder eller ækvivalenter.

Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse tilveje-35 bringes der en DNA-transfervektor omfattende deoxynucleotidse-kvenserne, der svarer til de ovenfor definerede gener.

Som vist ovenfor indeholder den genetiske kode "overflødige" koder (redundancer), det vil sige at der for visse aminosyrer er mere end 9 DK 172012 B1 en codon. Opfindelsen omfatter således de deoxynucleotidsekvenser, i hvilke de codon'er, der er afbildet på tegningen, eller deres cDNA-ækvival enter er erstattet med andre codon'er, som koder for den samme aminosyre.

5

Som allerede anført ovenfor kan der fremstilles peptider med relaxinaktivitet, og som adskiller sig fra B- og/eller A-kædestruk-turerne i naturlig relaxin. Disse forskelle kan omfatte deletion (udeladelse) af en eller flere aminosyrer og/eller addition 10 (tilføjelse) af yderligere aminosyrer og/eller substitution af forskellige aminosyrer i de naturlige kæder.

Opfindelsen omfatter således også gener og DNA-transfervektorer, som beskrevet ovenfor, hvori en eller flere af de naturlige codon'er er 15 udeladt og/eller er erstattet med codon'er, som koder for andre aminosyrer end den, der kodes for med den naturlige codon, og/eller der er tilføjet yderligere codon'er til den naturlige sekvens.

Transfervektorerne ifølge opfindelsen kan også omfatte bl.a. gene-20 tisk information, som sikrer deres replikation, når de er overført til en værtscelle. Disse celler kan f.eks. omfatte celler af pro-caryotiske mikroorganismer, såsom bakterier, og også eukaryotiske celler, såsom gær og svampe foruden også celler såsom pattedyrceller og -cellelinier.

25

Eksempler på transfervektorer, der er almindeligt benyttet ved bakteriel genetisk arbejde er plasmider og DNA fra visse bakterio-fager. Både fag-DNA og bakterielle plasmider er blevet anvendt som transfervektorer ved det foreliggende arbejde. Det må imidlertid 30 forstås, at andre transfervektortyper kan anvendes. De generelle metoder til frembringelse af sådanne transfervektorer og overføringen af dem til mikroorganismer er velkendt indenfor det faglige område.

35

Opfindelsen omfatter også en prokaryotisk eller eukaryotisk celle, der er transformeret med en hvilken som helst af de ovenfor omtalte transfervektorer.

En foretrukken mikroorganisme er den særdeles velkendte Escherichia 10 DK 172012 B1 col i. men en hvilken som helst anden egnet mikroorganisme kan anvendes.

Ifølge et yderligere aspekt ved den foreliggende opfindelse tilveje-5 bringes der en fremgangsmåde til fremstilling af en DNA-transfer-vektor til brug ved bevaring og replikering af en deoxynukleotidsekvens, der koder for human preprorelaxin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en deoxynukleotidsekvens, der koder for human preprorelaxin, forbindes med et DNA-molekyle, der er fremstillet ved 10 at spalte en transfervektor med et restriktionsenzym.

DNA-transfervektorer til brug ved bevaring og replikation af deoxynukleotidsekvenser, som koder for human preprorelaxin og for A-og B-kæderne i humanrelaxin, kan fremstilles på lignende måde ud fra de hensigtsmæssige deoxynukleotider.

A- og B-peptidkæderne samt også prorelaxin og preprorelaxin kan fremstilles ved de sædvanlige fremgangsmåder til genekspression, dvs. ved at dyrke celler, der indeholder den behørigt transformerede 20 transfervektor, og isolere og oprense det (de) ønskede peptid(er), der er produceret af cellerne.

Opfindelsen omfatter således endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et fusionsprotein, der omfatter aminosyresekvensen i

OC

humanpreprorelaxin som dets C-terminale sekvens samt en del af et prokaryotisk eller eukaryotisk protein som dets N-terminale sekvens, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man inkuberer en cellekultur, der er transformeret med en ekspressionstransfervektor, som omfatter en deoxynukleotidsekvens, der koder for humanprepro-30 relaxin, og som er fremstillet ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.

Fusionsproteiner, der omfatter aminosyresekvenserne for human prorelaxin og/eller A- og/eller B- og/eller C-kæderne i humanrelaxin 35 kan fremstilles tilsvarende.

De således fremstillede fusionspeptidprodukter vil foreligge i form af et fusionsprotein, i hvilket det ønskede peptid er forbundet med en del af et prokaryotisk eller eukaryotisk protein, som er 11 DK 172012 B1 karakteristisk for værtscellen. Disse fusionsproteiner udgør også en del af opfindelsen.

Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til syntetisering af 5 humanprorelaxin, der omfatter A- og B-peptiderne, som er adskilt fra hinanden med et C-peptid, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en kultur af celler, der er transformeret med en ekspressionstransfervektor, som omfatter en deoxynukleotidsekvens, der koder for human prorelaxinet, og som er fremstillet som beskrevet ovenfor, 10 inkuberes under betingelser, der er egnet til ekspression af den sekvens, der koder for human prorelaxin, og at humanprorelaxin oprenses fra lysatet eller dyrkningsmediet fra cellerne.

Det interessante peptid kan indvindes fra fusionsproduktet ved en 15 hvilken som helst passende, kendt spaltningsprocedure.

Som det allerede er anført ovenfor kan transfervektoren være modificeret ved codon-substitution/-deletion/-addition, eller sådanne modifikationer som vil frembringe modificerede fusionspeptider. På 20 denne måde kan der fremstilles hensigtsmæssige modifikationer til at fremme spaltningen af fusionspeptiderne, f.eks. ved forbindelsen mellem B/C- eller C/A-kæderne, eller til ændring af peptidkæde-adfæren under efterfølgende kemisk eller biologisk behandling.

25

Som anført ovenfor tilvejebringer opfindelsen ligeledes human-relaxin, -prorelaxin og -preprorelaxin.

Relaxin kan fremstilles ved direkte kombination af separate A- og B-kæder ved en hvilken som helst af de fremgangsmåder, der for tiden 30 kendes og bruges til fremstilling af insulin.

På tilsvarende måde som insulin kan relaxin fremstilles ud fra prorelaxin ved oxidation eller ved på anden måde at omdanne sulf- hydrylgrupperne på A- og B-peptiderne i relaxin, der er fremstillet 3 5 som ovenfor beskrevet, til dannelse af di sulfidtværbindinger mellem A- og B-peptiderne, og derpå udskære C-peptiderne, f.eks. ved en enzymkatalyseret hydrolyse, som er specifik for de bindinger, som sammenbinder C-peptidet med A- og B-peptiderne.

12 DK 172012 B1

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes ydermere en fremgangsmåde til syntetisering af humanrelaxin, hvilken fremgangsmåde omfatter, at A- og B-kæderne i relaxin (i deres fulde længde, eller i forkortede eller modificerede udgaver) kombineres ved i sig 5 selv kendte metoder til kombination af A- og B-kæder i humaninsulin.

Ved en sådan fremgangsmåde reduceres en blanding af S-sulfonerede A-og B-kæder, hvorpå blandingen overlades til oxidation i luften.

10 Vi har ligeledes konstateret, at vlrkningsfuldheden ved ovenanførte fremgangsmåde forbedres, når den ene eller begge A- og B-kæder foreligger 1 form af et S-thioethyl-cys-derivat 1 stedet for på S-sulfoformen.

15 I beskrivelsen til Australsk patentansøgning nr. 15413/83 (PF 4385/82) er det også vist, at den ene eller både A- og B-kæderne i relaxinet kan forkortes i amino- og/eller carboxyterminal erne uden væsentligt tab af biologisk aktivitet og under opnåelse af forbedrede kombinationsudbytter. Disse metoder kan ligesåvel anvendes til 20 fremstilling af humanrelaxin.

Ved et andet aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringes en human- relaxin-analog, som i det væsentlige består af forkortede og/eller modificerede former af de naturlige B- og/eller A-peptidkæder.

25

Dette aspekt ved opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde til fremstilling af en humanrelaxinanal og, hvilken fremgangsmåde omfatter dannelse af de forkortede og/eller modificerede B- og/eller A-peptidkæder samt kombinering af dem ved en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder.

Vore undersøgelser af både svine- og menneskerelaxin har vist, at relaxinaktivitet kan være til stede ved human-A-kæder så korte som A(10-24) og B-kæder så korte som B(10-22), selv om de praktiske minima forventes at være A(4-24) henholdsvis B(4-23). Det er allerede kendt, at peptidet A(4-24)-B(1-25) har relaxinaktivitet.

Generelt kan A-kæden for den foreliggende relaxinstruktur (H2) varieres fra A(1-24) til A(10-24) og B-kæden fra B(-1-32) til B(10-22).

13 DK 172012 B1

De foretrukne kombinationer afledes fra:

A B

5 En hvilken (1-24) med en hvilken (-1-23) som helst af (2-24) som helst af (op til) (3-24) (-1-31)

Modifikatoner af B- og/eller A-kæderne kan ifølge den foreligdende 10 opfindelse involvere enten "genetisk" modifikation, som beskrevet ovenfor, eller kemisk modifikation af B- og/eller A-kæderne (i enten fuld længde eller forkortet form) før kombination ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Der kan anvendes to typer modifikationer enten enkeltvis eller i kombination.

15

Den første type involverer modifikation af en eller flere af de aminosyrer, som forekommer i de naturlige eller forkortede B- og/ eller A-kæder. Denne modifikation vil almindeligvis involvere beskyttelse af aktive grupper på en eller flere af aminosyrerne ved i 20 sig selv kendte metoder, og disse beskyttelsesgrupper kan om ønsket fjernes efter kombination af de (modificerede) A- og B-kæder.

Eksempler på denne type modifikation indbefatter acetylering, formylering eller lignende beskyttelse af frie aminogrupper, her-25 under den N-terminale, amidering af C-terminale grupper eller dannelsen af estere af hydroxyl- eller carboxylgrupper. Formyl-gruppen er et typisk eksempel på en let fjernelig beskyttelsesgruppe.

30

Den anden type modifikation omfatter, at en eller flere af de naturlige aminosyrer i B- og/eller A-kæderne erstattes med en herfra forskellig aminosyre (indbefattende D-formen af en naturlig aminosyre). Denne almene modifikationstype kan også involvere deletion af en naturlig aminosyre fra kæden eller tilføjelse af en eller flere ekstra aminosyrer til kæden.

Formålet med sådanne modifikationer er at forøge kombinationsudbytterne af A- og B-kæderne under bibeholdelse af produktets aktivitet, dvs. relaxin eller en analog heraf, eller at forstærke 14 DK 172012 B1 eller modificere aktiviteten af produktet for et givet kombinationsudbytte. Denne modifikation kan udstrækkes sig til frembringelsen af syntetiske analoger, som har relaxin-blokerende eller -antagonistiske virkninger.

5

Et specifikt eksempel på den første modifikationstype er modificeringen af tryptofanresten (Trp) ved B2 ved addition af en formyl-gruppe.

10 Eksempler på den anden modifikationstype er erstatningen af Met-delen ved B24 med norleucin (Nle), valin (Val), alanin (Ala), glycin (Gly), serin (Ser) eller homoserin (HomoSer).

Ved dette aspekt omfatter opfindelsen også humanrelaxinanal oger 15 fremstillet ud fra naturlige eller forkortede B- og/eller A-kæder, der er modificeret ifølge opfindelsen som beskrevet ovenfor.

A- og B-peptidkæderne og også prorelaxin og preprorelaxin kan fremstilles ved sædvanlige genekspressionsfremgangsmåder, det vil 20 sige ved dyrkning af en mikroorganisme, som indeholder den hensigtsmæssige, transformerede transfervektor, og isolering og rensning af det ønskede peptid (eller peptider), der er produceret af mikroorganismen.

25

De således frembragte peptidprodukter kan foreligge i form af et fusionsprotein, i hvilket det ønskede peptid er forbundet med en del af et prokaryotisk protein.

Opfindelsen beskrives og illustreres yderligere ved den efter-30 følgende beskrivelse og de benyttede eksperimentelle procedurer og de herved opnåede resultater.

35 15 DK 172012 B1

Metoder oq materialer

Isolering af mRNA oa cDNA-klonina 5

Humanovarievæv, der var opnået ved kirurgi til behandling af en ektopisk graviditet, blev hurtigt frosset ned på tøris, og RNA blev isoleret i 5M guanidiniumthiocyanat (Merck) ifølge den af Chirgwin et al., 1979 beskrevne metode. Poly-A+-RNA blev omdannet til 10 dobbeltstrenget DNA (Wickers et al., 1978) og klonet enten ved den homopolymere G/C-"tailing"-metode i en pBR322-plasmidvektor (Chang et al., 1978) eller ved lambda-pakkemetoden under anvendelse af AGTIO-vektoren (Huynh et al., 1983). Det er vores erfaring, at 4 transformationseffektiviteten med pBR322-metoden (10 rekombinanter ^ pr. /ig cDNA) var langt mindre end med lambda-metoden (op til 106 rekombinanter/Mg cDNA).

Fremstilling af hvbridiseringsprober 20

Der fremstilledes radioaktivt mærkede prober ved primede synteser på forskellige DNA-fragmenter under anvendelse af denaturerede, statistisk vilkårlige primere af kalvethymus-DNA (Hudson et al., 1983, Taylor et al., 1976). DNA-templaten (100-200 /ig) blev denatureret med de statistisk vilkårlige primere (l^g) ved kogning i 25 20 μΐ HgO i 2 minutter. Syntesen blev indledt ved tilsætning af 30

ml reaktionsblanding indeholdende 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM

NaCl, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2, 5 enheder E.coli DNA-polymerase 1 (Klenow-fragment), 500 /iM af respektivt dCTP, dGTP, dTTP og 0,3 μΜ a-[^P]-dATP (ca. 3000 Ci/mmol, Amersham). Efter inkubering ved 37°C 30 i 30 minutter blev reaktionen bragt til afslutning ved fortynding i 300 μΐ af en puffer indeholdende 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0,

ImM EDTA, og reaktionsblandingen blev passeret gennem en

Sephadex-G50-søj1e (1 cm x 5cm) i den samme puffer. Den radioaktivt mærkede probe blev indsamlet fra topfraktionerne ved udtømt volumen og fældedes med 2 volumener ethanol ved -20°C i 2 timer under anvendelse af tRNA (^g) som bærer (carrier).

16 DK 172012 B1

Selektion af specifikke cDNA-kloner

Til screening af den humane ovarie-cDNA-klonbank for relaxin-5 specifikke sekvenser anvendtes som en probe et segment af det tidligere identificerede human-Hl-gen svarende til et 400 nukleotid-segment, der koder for C-peptidet og A-kæden fra aminosyre 64, gennem terminenngscodon og indbefattende 80 baser af det ikke-translaterede 3'-område. En enkelt positiv cDNA-klon fra pBR322-10 biblioteket isoleredes og sekventeredes. 23 unikke rekombinanter isoleredes fra XGTlO-bibliotekerne, men af disse blev kun 6 underkastet fuldstændig nukleotidsekvensanalyse.

DNA-sekvensanalvse 15

Sekventeringsstrategien og et forkortet restriktionskort for cDNA-klonerne opsummeres på fig. 1. Rekombinantplasmidet i pBR322 fordøjedes med restriktionsenzymerne Hpa II (P), Hinf I (F) eller Taq I (T) og blev endemærket under anvendelse af revers trans- 20 scriptase og det hensigtsmæssige α-mærkede deoxynucleotidtriphosphat (dCTP for Hpa II og Taq I, dATP for Hinf I). Fragmenter blev internt spaltet med en anden restriktionsendonuklease og derefter adskilt ved elektroforese på 8% polyacrylamidgel er før sekventering ved den af Maxam og Gilbert et al., 1977 beskrevne kemiske 25 nedbrydningsmetode.

cDNA-kloner i XGT10 blev sekventeret ved subkloning af Eco RI

restriktionsfragmenter i M13mp9 og under anvendelse af de af Sanger et al., 1977 beskrevne metoder.

30

Southern oo Northern gel analyser

Blev udført på oprenset genomisk DNA efter restriktionsendonukl easespaltning ved metoden Ifølge Southern (1975) eller på oprenset RNA. De DNA-fragmenter, som anvendtes som prober, fandtes at være specifikke overfor enten exon I eller exon II i Hl-genklonen på trods af, at de havde en lille mængde flankerende sekvenser. Disse fragmenter blev frembragt ved i M13mp8 at subklone et 500 bp Alu I fragment af XH7-klonen i tilfældet med exon I-proben, og et 400 bp 17 DK 172012 B1

Eco RI-Ava II fragment for exon-II-proben. Der blev frembragt en probe fra H2-cDNA-klonen ved at fordøje med Hinf I og isolere en 300 bp dublet svarende til det kodende område fra Asp I til den terminerende kode og indbefattende 110 baser af det ikke-translate-5 rede 3'-område (fig.l). Oligonukleotidprober syntetiseredes ved den kemiske phosphitmetode af Beaucage og Caruthers (1981) og blev endemærket med γ- P-ATP under anvendelse af T4-polynucleotidkinase. Hybridiseringsbetingelserne udregnedes på basis af G+C-indholdet.

10 Isolering og nukleotidsekvensanalvse af H2-aenklonen

Det humane genom-A-bibliotek af Lawn et al. (1978) blev undersøgt ved hjælp af de tidligere omtalte metoder (Hudson et al., 1983) med undtagelse af, at der som probe anvendtes en blanding af ^ DNA-fragmenter svarende til exon I og exon II af Hl-genklonen. Positive fager dyrkedes i 1 liter flydende kulturer, DNA'et blev isoleret og fordøjet med restriktionsendonuklease forud for kortlægning med exon I og II prober. Et 4-kilobase EcoRl-fragment fandtes at indeholde hele det kodende exon I område, hvilket dif- ?n ferentierer denne klon fra den homologe Hl-genstruktur. Dette fragment subklonedes i M13mp8 og sekventeredes ved metoden af Maxam og Gilbert (1977). Efter fordøjelsen med Ava I blev fragmenter, der spændte over det kodende område, endemærket og spaltedes internt med et andet restriktionsenzym (Hpa II eller Hinf I) til frembringelse 25 af fragmenter, der er egnet til sekvensanalyse.

Isolering af en cDNA-klon

Prøver af human corpus luteum opnåedes ved kirurgisk intervention i 30 ektopiske graviditeter eller fra lutectomi ved kejsersnit. Fra RNA isoleret fra et enkelt corpus luteum konstrueredes et cDNA bibliotek i pBR322 tilvejebringende ca. 300 unikke rekombinanter. Screening af dette bibliotek med en Hl-cDNA-probe afslørede en enkelt rekombinant med sekvenshomologi til humanrelaxin I. For at forøge det totale antal rekombinanter fra en så lille mængde ovarievæv konstrueredes cDNA-biblioteker under anvendelse af AGT10-kloningssystemet (Huynh et al., 1983). Screening med en relaxin-specifik probe identificerede 23 unikke cDNA-kloner, hvoraf 6 blev karakteriseret som vist på fig. 1. Nukleotidsekvensanalyse 18 DK 172012 B1 afslørede, at alle 6 cDNA-rekombinanter indkodede fragmenter af samme relaxinstrukturgen (fig.2), og dog var denne sekvens forskellig fra den tidligere omtalte genklon (Hudson et al., 1983).

Vi forventede, at denne nye sekvens svarede til det andet 5 humanrelaxin-gen (H2), som var blevet observeret i genomisk DNA.

Det var overraskende, at ingen af cDNA-klonerne indeholdt en polyadenosinsekvens ved 3'-enden, skønt størrelsen af cDNA-klonerne i pBR322 og AGTIO (1800 bp henholdsvis 1900 bp) indicerede, at der I® blev syntetiseret store transkriptionsprodukter under klo ningsprocessen. Disse to cDNA-kloner havde overlappende sekvensidentitet ved den 3'-terminale ende, hvilket bekræftede, at de hidrørte fra den samme mRNA-struktur. Vi tilskrev tabet af poly-A-enden til for tidlig afslutning af den dobbeltstrengede transkrip- 15 tionsreaktion eller overskydende Sl-nucleasenedbrydning under kloningsprocessen.

Isolering af en oenklon svarende til det andet gen ?0 8

En grundig undersøgelse af 10 rekombinantfag fra det humane genbibliotek ifølge Lawn et al., (1978) under anvendelse af blandede prober specifik for exon I eller II i AH7-relaxinklonen afslørede 16 positive fager. Restriktionskortlægningsanalyse i lille skala afslørede, at 14 af disse rekombinantfager svarede til det tidligere 25 omtalte Hl-relaxingen (11 var identisk med AH7-genklonen; 3 var identisk med gH5, en anden genklon af Hl-genet, som tidligere omtalt af Hudson et al., 1983). De to andre rekombinantfager var imidlertid identiske og havde et unikt restriktionsmønster, der var karakteristisk for H2-relaxingenet, hvis struktur er givet i fig. 1. Det 30 usædvanlige rekombinantforhold afspejler enten deres andel i det oprindelige genbibliotek eller skyldes selektiv vækst under ampi i-fikation. Southernblot-analyser af denne nye rekombinantfag (AHI1) under anvendelse af separate prober svarende til enten exon I eller II i AH7-klonen afslørede, at AH11 kun indeholdt exon I kodnings-området. Forsøg på at finde en genklon i fuld længde og svarende til H2-relaxingenet enten i biblioteket ifølge Lawn et al., (1978) eller i et andet bibliotek (Dr. R.Crawford, upubliceret) er indtil nu ikke lykkedes.

19 DK 172012 B1

Nukleotidsekvensen af det relaxinkodende område af XgHll fandtes at være identisk med det, der observeredes i den på fig. 2 viste cDNA-klon. En intron afbryder det kodende område på nøjagtig samme position som i gH7-genklonen (Hudson et al., 1983), hvilket antyder, ^ at disse gener opstod ved en gendubl ikationsbegivenhed på et eller andet tidspunkt i evolutionen.

Northern gel analyse 10 RNA i soleredes fra forskellige prøver af human corpus luteum taget fra forskellige personer under kirurgisk indgreb for ektopisk svangerskab eller under kejsersnit. Northern gel analyse under anvendelse af prober fremstillet fra det kodende område af enten det ene eller det andet relaxingen afslørede, at to mRNA hovedarter på 15 ca. 1000 bp og 2000 bp var til stede i fem undersøgte humanovarie-RNA-prøver (fig.3). De mindre mRNA-arter var 2-3 gange mere talrige i de undersøgte RNA-prøver, og dette resultat var uafhængigt af, om den anvendte probe i analysen svarer til Hl- eller H2-relaxin, hvilket indicerer, at der under vore eksperimentelle betingelser 20 sker en høj grad af krydshybridisering. For at skelne imellem, om disse to mRNA-arter repræsenterer de separate produkter fra Hl- og H2-generne, syntetiseredes oligonukleotidprober over et område med minimal homologi (60%) mellem de to relaxingener (enhederne 137-144 på fig. 2). Disse syntetiske 25-mere oligonukleotidprober blev 25 32 mærket radioaktivt ved behandling med kinase og q- P-ATP, og de blev anvendt som hybridiseringsprober under betingelser, der har vist sig at tilvejebringe specificitet for enten Hl- eller H2-gelerne (fig.3). Northern gel analyse under anvendelse af de radioaktivt mærkede prober afslørede, at begge mRNA-arterne svarer 30 til produkter fra H2-genet. Vi kunne ikke påvise nogen transkrip-tionsprodukter fra Hl-genet under anvendelse af de specifikke prober, dog ville et lavt ekspressionsniveau (mindre end 5% af H2-niveauet) være vanskelig at identificere.

35

Til analyse af de forskellige mRNA-transkriptorer fra H2-genet fremstilledes specifikke prober fra segmenter af de to store H2-cDNA-kloner svarende til det kodende område og de ikke-transiaterede 5'- og 3'-områder (fig.4). Det større mRNA-transkript (ca. 2 kb i længde) hybridiseredes selektivt til segmenter af det ikke- 20 DK 172012 B1 translaterede 3'-område fra begge cDNA-kloner, fra en position ca.

100 baser fra termineringscodon. Et potentielt polyadenylerings-signal eksisterer i nukleotidsekvensen i cDNA-kl onerne, 140 baser fra termineringscodon, og dette område har ikke homologi med porcin-5 relaxinpolyadenyleringsstedet. Spørgsmålet om, hvorvidt det kortere mRNA-produkt imidlertid polyadenyleres nær denne position kan ikke løses, før fuld længde cDNA-kloner svarende til begge mRNA-former er blevet isoleret og karakteriseret.

10 Når man mangler gensekvensen for H2-genet, er det ikke muligt at definere de mekanismer, der fører til dannelsen af de to mRNA-transkriptorer. Som i tilfældet med kollagen- og β-mikrogi obul ingenerne er det muligt, at spaltningen af det primære RNA-transkript kan ske ved alternative polyadenyleringssteder. På den anden side 15 kan vi ikke udelukke muligheden for alternative splejsningsmekanismer, sådan som det forekommer i kalcitonin-, væksthormon- og a-krystal1 i ngenerne.

Den primære struktur af preprorelaxin indkodet i H2-oenet.

20

Man forstår endnu ikke helt den måde humanpreprolaxingenerne behandles på in vivo, og den må deduceres ved analogislutning med behandlingen af svine- og rottepreprorelaxiner (fig.5). De forud- sagte B- og A-kædestrukturer for Hl- og H2-generne er blevet bragt 25 på linie med andre medlemmer 1 relaxinfamilien og humaninsulin vist i fig. 5.

Fraspaltningen af signalpeptidet i Hl var blevet forudsagt (Hudson et al., 1983) at ske efter en enhed med en kort sidekæde, såsom 30

Ala j, -2 eller -4 eller efter Ser_g. Spaltning efter Ala_j er i overensstemmelse med homologi til svinepreprorelaxin og humanpre- proinsulin. Ved lignende analogi sker spaltningen af H2-signalpep- tidet sandsynligvis efter Ala_2, skønt spaltning efter Ala_4 eller

Ser c er andre muligheder.

35 'e

Ved analogi med rotte- og svineprorelaxiner sker spaltningen ved forbindelsen mellem B-kæden/C-peptidet efter Leu 32 i begge Hl- og H2-forstadier. Begge humanrelaxin-B-kæder har imidlertid ved positionerne 29-30 den konserverede dibasiske sekvens Lys-Arg, 21 DK 172012 B1 hvilket er et kendt indvirkningssted (eng: processing site) i andre prohormoner, såsom proinsulin, og spaltning her kan ikke udelukkes.

For at afgøre dette, vil direkte aminosyresekvensanalyse af relaxin isoleret ved corpus luteum hos gravide vare nødvendig. For tiden 5 synes den mest sandsynlige struktur af Hl-B-kaden at vare 32 enheder (Lys 1 til Leu 32) og H2-B-kaden at vare 33 enheder (Asp_j til leu32).

Spaltningen ved forbindelsen mellem C-peptidet og A-kaden i 10 Hl-prorelaxin er blevet forudsagt (Hudson et al., 1983) at ske efter Arg 136 indenfor en gruppe på 4 basiske enheder, fordi Arg-Pro-imidbindingen ved 137-138 vil vare resistent overfor proteolyse. H2-prorelaxin har den samme sekvens på 4 basiske enheder og et lignende indvirkningstrin efter Arg 136 vil resultere i at både Hl-15 og H2-relaxin-A-kaderne er 24 enheder lange.

Biologisk aktivitet af H2-qenet

Som anført i tidligere undersøgelser af syntetiske svinerela- ^ xinpeptider er der kernesekvenser i svinerelaxin B- og A-kaderne, som indeholder alle de essentielle elementer for biologisk aktivitet. Vores synteseundersøgelser på Hl-relaxinpeptiderne har vist, at kombination af den komplette Hl-A-kade (Arg 137 - Cys 160) og en forkortet form af Hl-B-kaden (Lys 1 - Ser 25) tilvejebragte 25 materiale, som udviste biologisk aktivitet (Hudson et al., 1983).

Yderligere undersøgelser af begge Hl- og H2-genstrukturerne under anvendelse af peptidsyntesen viser, at begge gener koder for former af relaxin, som er biologisk aktive i rotteuteruskontraktion- analysen.

30

Kemisk svntese af et modificeret humanrelaxin H2 (hRLXl ΑΠ-241 -Bf-1-24) fil Svntese af humanrelaxin-A-kade. H2-hRLX ΑΠ-241 35

Aminosyresekvensen svarende til enhederne 1-24 i humanrela-xin-A-kæden udledt som beskrevet ovenfor ud fra nucleotidsekvensen i den genomiske klon blev syntetiseret ved faststoffase-proceduren ifølge de generelle principper, der er beskrevet af Merrifield 22 DK 172012 B1 (f.eks. Barany, G. og Merrifield, R.B. i "The Peptides", red.: E.Gross & J. Meienhofer, Academic Press, N.Y., s.1-284, 1980).

* * Ν-α-tert-butyloxycarbonyl -4-methyl-benzyl-L-cystein ( i det 5 følgende betegnet "BOC") blev koblet til en 1% tværbunden poly styrenharpiks via phenylacetamidomethyl (PAM) -koblingen i et omfang på 0,30 mmol/g under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Tam et al., (Synthesis !£, 955-057, 1979). BOC-L-CYS-PAM-harpiksen (8,0 g) blev overført til en reaktionsbeholder i en Beckman model 990 10 peptidsyntetisør, og aminosyresekvensen fra enhed 23 til 1 blev samlet ved den trinvise tilsætning af hver aminosyre beskyttet på passende måde. Den aminotermi nåle BOC-beskyttelsesgruppe på hver aminosyre blev fjernet ved behandling af harpiksen med 35% tri fluoreddikesyre i methylenchlorid i 30 minutter efterfulgt af en ^ neutralisation med 5% di isopropyl ethyl amin i methylenchlorid i 15 minutter. Efter hver behandling blev harpiksen vasket grundigt med methylenchlorid. Den næste aminosyre i sekvensen (med a-aminogruppen passende beskyttet af BOC-gruppen, og hvor det var nødvendigt med en passende beskyttelse af en funktionel sidekædegruppe) blev koblet ^ til harpiksen under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid (DCC).

Harpiksen blev omrørt med aminosyren i methylenchlorid i 10 minutter forud for indføringen af DCC'et, som også var opløst i methyl en-chlorid. Et 2,5 molær overskud (6,0 mmol) af aminosyre og DCC blev benyttet ved hver kobling. Efter omrøring i 1 time blev en prøve af 25 harpiksen fjernet fra reaktionsblandingen og undersøgt for tilstedeværelse af frie aminogrupper under anvendelse af ninhydrinproceduren ifølge Kaiser et al. (Anal. Biochem., M> 595-598, 1970). Hvis ninhydrinprøven var negativ indicerende fuldstændig kobling, blev reaktionscyklussen fortsat med BOC-beskyttelsesfjernelse, neutral i-30 sati on og kobling med næste aminosyre. I tilfælde af en positiv ninhydrinprøve blev koblingsreaktionen gentaget med yderligere aminosyre og DCC.

Aminosyrer med funktionelle sidekædegrupper blev benyttet i form af 35 følgende beskyttede derivater: N-a-BOC-2,6-dichlorbenzyl-L-tyrosin, N-a-B0C-£-ch1orbenzyloxy- carbonyl-L-lysin, N-ar-BOC-L-serin-O-benzylether, N-a-amyloxycarbo- Λ nyl-N -tosyl-L-arginin, N-a-BOC-L-threonin-0-benzylether, 23 DK 172012 B1 Ν-α-BOC-S-ethylmercapto-L-cystein (til CYS i A-kædesekvensposition 15, 11 og 10).

Efter samling af 1-24 peptidsekvensen blev den sidste BOC-gruppe på 5 det aminotermi nåle argi nin fjernet under anvendelse af afbeskyttelses-neutralisationscyklussen, og peptidharpiksen blev tørret i vakuum (vægt af peptidharpiks 13,0 g). En portion af peptidharpiksen (2 g) blev behandlet med vandfri hydrogenfluorid i nærværelse af ani sol (2 ml) ved 0°C i 30 minutter. Den totale kon-10 takttid for harpikspeptidet med hydrogenfluorid (HF) blev holdt på et minimum (ikke over 70 minutter) ved hurtig fjernelse af HF under vakuum fra en oliepumpe. Harpikspeptidet blev derpå vasket adskillige gange med ethylacetat til fjernelse af anisol overskud, peptidet blev ekstraheret i 1M eddikesyre, og opløsningen blev lyophiliseret.

^ Udbyttet af rå-peptid (med cyteinet i positionerne 10, 11 og 15 stadig beskyttet som S-thioethylderivater) var 392 mg. Indledende rensning af rå-peptidet skete ved gelfiltrering på Biogel PIO i 0,1 M eddikesyre. De fraktioner, der repræsenterede hovedtoppen fra denne søjle, og som blev elueret på et sted svarende til en mole-20 kyl vægt på ca. 3000, blev opsamlet og lyophili seret. Aminosyreana-lyse af en prøve af dette peptid indicerede, at alle aminosyrerne i 1-24 sekvensen forekom i det rette forhold.

Yderligere rensning af [S-thioethyl-Cys^’^*^]-hRLX A( 1-24)-25 peptidet blev udført ved præparativ omvendt fase HPLC på en Waters C-18 Bondapak-søjle under anvendelse af et 0,1% TFA-vand/aceto-ni tri 1-solventsystem.

En prøve (80 mg) af det ved gelfiltrering rensede peptid blev 30 S-sulfoneret med en blanding af natriumsulfit og natriumtetrathionat (samlet reaktionstid 3 timer) ifølge fremgangsmåden beskrevet af Du et al., (Scientia Sinica.lOI, 84-104 (1961)). Præcipitatet, der dannedes under S-sulfoneringsreaktionen, blev fjernet ved filtrering, og både præcipitatet og supernatantopløsnlngen blev dialyseret mod destilleret vand ved 4°C i 48 timer. Indholdene i dialyseposerne blev lyophil iseret til opnåelse af 39,5 mg peptid fra supernatantopløsningen og 20,3 mg peptid fra præcipitatet, som fremkom under S-sulphoneringsreaktionen. En prøve af det "opløselige" [S-sulfo-Cys10’H’15’24]-hRLX A( 1-24)-peptid blev 24 DK 172012 B1 renset ved præparativ omvendt fase HPLC på en Waters C-18 Bondapak-søjle under anvendelse af et 0,1% TFA-vand/acetonitril solventsystem.

Mi) Syntese af forkortet humanrelaxin-B-kæde. H2-hRLX BM-24) 5

Aminosyresekvensen svarende til enhederne -1 - 24 i H2- humanrelaxin-B-kæden blev synteseret under anvendelse af de ovenfor beskrevne procedurer begyndende med 6,Og N-a-tert-butyloxy-carbonyl-L-methionin-O-benzyl-L-serin-phenylacetamid-methylpolysty-10 renharpiks ladet med 0,5 mmol Met pr. gram. Sidekædebeskyttelsesgrupperne, der blev benyttet til syntese af A-kæden, blev også benyttet til B-kæden, herunder S-ethylmercaptoderivatet til begge cysteiner i positionerne 10 og 22. Glutaminsyreenhederne i positionerne 4 og 5 og asparaginsyreenheden 1 position -1 blev adderet som ^ N-a-BOC-£-benzylesterderivatet. Glutaminet i position 18 blev koblet ved en fremgangsmåde med aktiv ester under anvendelse af N-a-BOC-L-glutamin-p-nitrophenylester i DMF. Efter kobling af tryptofanet i position 2 blev der tilsat 0,1 % indol til trifluoreddikesyre-afbe-skyttelsesreagenset og til de efterfølgende methylenchloridvask.

20

Slutvægten af peptidharpiksen efter fjernelse af BOC-gruppen fra den aminotermi nåle asparaginsyreenhed og vacuumtørring var 8,5 g. En portion af peptidharpiksen (3,5 g) blev behandlet med vandfri hydrogenfluorid i nærværelse af anisol (2 ml) ved 0°C 1 30 minutter, 25 og B-kædepeptidet blev Isoleret under anvendelse af den ovenfor be- 10 22 skrevne procedure for A-kæden. Det rå [S-thioethyl-Cys ’ ]-hRLX B(-l-24), (0,97 g) blev renset ved gelfiltrering på BioGel P10 i 0,1M eddikesyre efterfulgt af præparativ HPLC.

30

En prøve (100 mg) af det ved gelfiltrering rensede peptid blev S-sulfoneret ved pH 8,3 i 3 timer, reaktionsblandingen blev filtreret, og præclpltatet og supernatantopløsningen blev dialyseret mod destilleret vand. Det "opløselige" peptid, der blev indvundet efter lyophilisering, udgjorde 42,4 mg; det "uopløselige" peptid udgjorde 59,5 mg. De S-sulfonerede B-kædepeptider blev yderligere renset ved præparativ HPLC under anvendelse af en C-18 omvendt-fasesøjle og et 0,1% TFA-vand-acetonitrilsolventsystem.

35 25 DK 172012 B1

Hiil Kædesammenfoinina

De syntetiske H2 hRLX A(l-24)- og H2 hRLX B(-l-24)-peptider blev sammenføjet under anvendelse af fremgangsmåden, beskrevet af Chance 5 og Hoffmann (australsk patentansøgning nr. 68844/81) til insulinkæder, hvorved de S-sulfonerede peptider blev blandet i et forhold A:B på 2,6:1 ved en peptidkoncentration på 10 mg/ml i gly-cinpuffer, pH 10,5. Dithiothreitol i glycinpuffer blev derpå tilsat i en mængde, der samlet tilvejebragte 1,0 sulfhydrylgruppe for hver 10 S-sulfogruppe. Reaktionsblandingen blev derpå omrørt i en åben beholder i 24 timer.

Som en yderligere modifikation af denne fremgangsmåde er det blevet opdaget, at kædesammenføjningsreaktionen til dannelse af biologisk aktivt relaxin forløb effektivt, når en eller fortrinsvis begge peptidkæderne blev anvendt som deres S-thioethyl-Cys-derivater i stedet for i S-sulfoformen, som angivet af Chance og Hoffmann (citeret ovenfor) i forbindelse med insulin. Anvendelsen af S-thioethyl-Cys-peptiderne eliminerer et reaktions- og rensnings- 20 trin, der kræves til omdannelse af peptiderne til S-sulfoderiva-terne. Ifølge den erhvervede erfaring ledsages S-sulfoneringsomsæt-ningen af relaxinpeptiderne af sidereaktioner, som gør det vanskeligt at rense S-sulfopeptiderne, hvilket resulterer i lave udbytter.

25

Ved anvendelse af de ovenfor angivne betingelser blev der opnået kædesammenføjningsudbytter på fra 1,5 til 6,0% som målt ved den biologiske aktivitet ved kontraktionsforsøg med rotteuterus ifølge Wiqvist & Paul (Acta Endocrinol., £9, 135-136, 1958).

30

Eksempel på kædesammenføininasreaktlon

Humanrelaxin-H2-[S-thioethyl-Cys^’**’^]-A(l-24), (4,2 mg tørvægt, 2,4 mg peptid ved aminosyreanalyse, 0,84 ømo1) blev opløst i 500 øl 0,1M glycinpuffer, pH 10,5, i et 3 ml piastcentrifugerør forsynet 33 med prop. Humanrelaxin-H2-[S-sulfo-Cys^’**]-B(-l-24), (1,60 mg,

1,60 mg peptid ved aminosyreanalyse, 0,33 ømol) opløst i 200 øl 0,1M glycinpuffer, pH 10,5, blev tilsat og blandingen blev omrystet. En delmængde (23,0 øl, 2,21 ømol DTT) af en stamopløsning af dithiothreitol (DTT), der var fremstillet med 0,1 M glycinpuffer, pH

26 DK 172012 B1 10,5 (0,96 pmol DTT 1 10 /il), blev tilsat til peptidopløsningen, og efter en kort omrystning fik reaktionsblandingen lov til at henstå ved 4°C i 24 timer under luftens adgang. Blandingen blev derefter centrifugeret, og delprøver af supernatantopløsningen blev testet 5 for biologisk relaxinaktivitet ved rotteuterus-kontraktionsforsøg. Delprøver af reaktionsblandingen forhindrede de spontane kontraktioner af rotteuterus på en dosisafhængig måde. En 75 ml delprøve forhindrede fuldstændig uteruskontraktioner, hvilket svarer til et kædesammenføjningsudbytte på 5,3% sammenlignet med en na-10 turlig svinerelaxin-A22-B31-standard.

Syntese af autentisk humanrelaxin H2 (hRLX) ΑΠ-241 -Bi=1:32) 15 (i) Syntese af humanrelaxin H2-kæde: hRLX BM-32) i fuld længde

Den aminosyresekvens, der svarer til enhederne -1 til +32 i den fulde længde af human-H2-relaxin-B-kæden, blev syntetiseret under anvendelse af de ovenfor beskrevne metoder og begyndende med 6,4 g ?0 Ν-α-tert-butyloxycarbonyl-L-leuci n-phenylacetamidomethylpolystyren-harpiks ladet med 0,23 mmol Leu pr. g. De sidekædebeskyttende grupper, der anvendtes for A(l-24) og B(-l - 24)-peptiderne blev også anvendt til B-kæden i fuld længde inklusiv S-ethylmercapto- derivatet for begge cysteiner i positionerne 10 og 22. En modi- 25 fikation af denne strategi var anvendelsen af N-formylderivatet af BOC-L-tryptofan til kobling ved sekvenspositionerne 27 og 2.

Slutvægten af peptidharpiksen efter kædesamling var 8,2 g. En del af peptidharpiksen (4,0 g) blev behandlet med vandfri hydrogen-30 fluorid-anisol som beskrevet i de tidligere eksempler til frembringelse af 1,50 g rå [S-thioethyl-Cys^’22,N-formyl-Trp2,2^] hRLX B(-l - 32). Det rå peptid oprensedes ved gelfiltrering på BioGel P6 i 0,1 H eddikesyre. Hovedtoppene, der blev elueret fra gel fil treringssøjlen, karakteriseredes ved aminosyreanalyse.

35

Fraktioner, hvor analyserne stemte overens med -1 til 32 peptidsekvensen, opsamledes og frysetørredes. Deformylering af tryptofanenhederne udførtes ved at behandle peptidet (100 mg) med natriumhydroxidopløsning (5 ml), pH 11,5 1 5 minutter, i hvilken tidsperiode peptidet præcipiterede fra opløsningen.

27 DK 172012 B1

Reaktionsblandingen neutral i seredes til opløsning af peptidet, og blandingen påførtes direkte på en BioGel P6-søjle i 0,1 M eddikesyre. Fjernelse af formylgrupper fra tryptophan måltes ved UV-spek-troskopi ved at følge, at N-formyl absorptionen ved 300 nm forsvandt 5 og tilsynekomst af de karakteristiske tryptophanspektre med et absorptionsmaximum ved 280 nm. Peptidfraktioner, der eluerede fra søjlen og havde den korrekte aminosyreanalyse opsamledes og frysetørredes.

10 Forsøg på at oprense [S-thioethyl-Cys*^’22( hRLX B]-1 - 32)-peptidet ved preparativ HPLC faldt ikke heldigt ud, på grund af tab af peptid ved adsorption til søjlemediet. Peptid renset ved gel kromatografi anvendes direkte i kædesammenføjningseksperimenter.

15 (ii) Kædesammenføjning af A(1-24) med B(-1 - 32): fremstilling af humanrelaxin H2_

De syntetiske S-sulfonerede og S-thioethyl-H2 humanrelaxin A(1-24)-peptider kobledes til S-thioethyl-H2-humanrelaxin-B(-l-32) under 20 anvendelse af de kædesammenføjningsmetoder, der tidligere er beskrevet for den forkortede B-kæde (-1 - 24). Prøver af blandingen efter sammenføjning undersøgtes for biologisk relaxinaktivitet i rotteuterus-kontraktionsforsøg. Delprøver af reaktionsblandingen forhindrede de spontane kontraktioner af rotteuterus på en dosis-25 afhængig måde. 100 μΐ delprøve forhindrede fuldstændig uteruskontraktioner, hvilket svarer til et kædesammenføjningsudbytte på 3,0% sammenlignet med en naturlig sv1nerelaxin-A22-B3l-standard.

30 35 28 DK 172012 B1

LITTERATURFERENCER

5 Anderson, H.L., Long, J.A. og Hayashida, T.

Immunofluorescence studies on the localisation of relaxin in the corpus luteum of the pregnant rat. Biol.Reprod. 23, 499-504 (1975).

Beaucage, S.L. og Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 10 (1981).

Chang, A.C.Y. Nature 2Z5, 617-624 (1978).

Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. og Rutter, W.J.: ^ Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochem. 18, 5294-5299 (1979).

Haley, J., Hudson, P., Scanlon, D., John, M., Cronk, M., Shine, J., Tregear, G. og Niall, H. DNA 1, 155-162 (1982).

20

Hisaw, F.L. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. £2, 661-663 (1926).

Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. og Niall, H. Nature 291.

127-131, (1981).

25

Hudson, P., Haley, J., John, M., Cronk, M., Crawford, R., Hara- lambidis, J., Tregear, G., Shine, J. og Niall, H.: Structure of a genomic clone encoding biologically active human relaxin. Nature 301, 628-631 (1983).

30

Huynh, T., Saint, R. og Davis, R. (1983) personlig kommunikation.

James, R., Niall, H., Kwok, S. og Bryant-Greenwood, G.: Nature 267, 544-546 (1977).

3 5

John, M.J., Walsh, J.R., Borjesson, B.W. og Niall, H.D.: Endocrinology 2fi8, 726-729 (1981).

Lawn, R.M., Fritsch, E.F., Parker, R.C., Blake, G. og Maniatis, T.

29 DK 172012 B1

Cell 15, 1157-1174 (1978).

Maxam, A.M. og Gilbert, W. (1977): A new method for sequencing DNA.

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74» 560-564.

5

Morrison, D.A., i: Methods in Enzymology. R.Wu, ed. (New York: Academic Press) s.326-331 (1979).

Roychoudbury, R., Jay, E. og Wu, R.: Terminal labelling and addition 10 of homopolymer tracts to duplex DNA fragments by terminal deoxynucleotidyl transfrase. Nucleic Acid Res. 3, 863-877 (1976).

Sanger, F., Coulson, A.R., Barreli, B.G., Smith, A.J.H. og Roe, B.A.

J.Mol.Biol. 143, 161-178 (1980).

15

Schwabe, C., Gowan, L.K. og Reinig, J.W., Ann.N.Y.Acad.Sci. 280» 6-12, (1982).

Schwabe, C., McDonald, J.K. og Steinetz, B.C. Biochem.Biophys. Res.

20 Commun, 25» 503-510 (1977).

Southern, E.M., J.Mol.Biol. 38 503-517 (1975).

Taylor, J.M., Illmersee, R. og Summers,J. Biochem.Biophys.Acta 442.

25 324-330 (1976).

Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Picket, R., Tischer, E., Rutter, U.J. og Goodman, H.M.: Rat insulin genes: construction of plasmids containing the coding sequences. Science 196, 1313-1319 30 (1977).

Vogt, V.M.: Purification and further properties of single-strand- specific nuclease from Aspergillus oryzae. Eur.J.Biochem. 33» 192-200 (1973).

Wickers, M.P., Buell, G.N. og Schimke, R.T.: Syntesis of double-stranded DNA complementary to lysozyme, ovomucoid, and ovalbumin mRNAs. J.Biol.Chem. £53, 2483-2495, (1978).

35

Claims (5)

1. I alt væsentligt ren rekombinant human-H2-præprorelaxin eller derivater heraf med samme biologiske virkning, kendetegnet 5 ved, at det er fri for andre human-proteiner.

2. I alt væsentligt ren rekombinant human-H2-prorelaxin ifølge krav 1, som er fri for andre human-proteiner.

^ 3. I alt væsentligt ren rekombinant human-H2-relaxin ifølge krav 1, som er fri for andre human-proteiner.

4. I alt væsentligt rent rekombinant polypeptid ifølge krav 1 med relaxinaktivitet, kendetegnet ved, at H2-relaxin A-kæden: 15 1 5 10 Gin Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His 15 20 24 Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys, 20 og H2-relaxin B-kæden: -11 5 10 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 25 " 15 20 Glu Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met 25 30 32 Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu er modificeret ved udeladelse af op til ni aminosyrer fra den aminoterminåle ende af A-kæden, og/eller at B-kæden er forkortet med op til ni aminosyrer fra den aminoterminåle ende og/eller med op til ni aminosyrer fra den carboxylterminale ende. 35

5. Polypeptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det består af en hvilken som helst af A-kæderne A(1-24), A(2-24), A(3-24), A(4-24) eller A(5-24) i kombination med en hvilken som helst af B-kæderne B(-1-23) til B(-1-32). DK 172012 B1

6. Polypeptid ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at relaxin-A- og/eller -B-kæden er modificeret ved tilføjelse af en beskyttelsesgruppe på en fri amino-, carboxyl- eller hydroxygruppe. ^ 7. Human-H2-relaxinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A-kæden: 1 5 10 Gin Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His 10 15 20 24 Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys, og H2-relaxin B-kæden: 15 -1 1 5 10 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 15 20 Glu Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met 25 30 32 20 Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu er modificeret ved erstatning af mindst én af de neutrale aminosyrer med en derfra forskellig aminosyre på den betingelse, at analogen besidder relaxinaktivitet. 25

8. I alt væsentligt rent polypeptid ifølge krav 4 eller 5, k e n - detegnet ved, at B-kæden er blevet modificeret ved erstatning af Met-resten i B(24) med et element, der er udvalgt fra gruppen bestående af valin, alanin, glycin og serin. 30

9. I alt væsentligt rent polypeptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er udvalgt fra gruppen bestående af signal-, A-, B-, og C-polypeptidkæderne i human-H2-præprorelaxin, som er fri for andre human-proteiner. 35

10. I alt væsentligt rent polypeptid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at A-polypeptidkæden er: (i) en human-H2-relaxin A-kæde, der er udvalgt fra gruppen DK 172012 B1 bestående af A(1-24) til A(5-24), hvorhos aminosyrerne 1-24 har følgende sekvens: 1 5 10

5 Gin Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His 15 20 24 Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys, og at B-polypeptidkæden er: 10 (ii) en human-H2-relaxin B-kæde, der er udvalgt fra gruppen bestående af B(-1-32) til B(4-23), hvorhos aminosyrerne -1-32 har følgende sekvens: 15 -11 5 10 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 15 20 25 Gly Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser 25 30 32 20 Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu, og at C-polypeptidkæden er: (iii) en human-H2-prorelaxin C-kæde, som har den i figurerne 2A-2D angivne aminosyresekvens som ordnet i figur 2.

11. I alt væsentligt rent polypeptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at polypeptidet omfatter: 30 (i) en human-H2-relaxin A-kæde, der er udvalgt fra gruppen bestående af A(l-24) til A(5-24), hvorhos aminosyrerne 1-24 har følgende sekvens: 1 5 10 35 Gin Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His 15 20 24 Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys (ii) en human-H2-relaxin B-kæde, der er udvalgt fra gruppen DK 172012 B1 bestående af B(-l-32) til B(4-23), hvorhos aminosyrerne -1-32 har følgende sekvens: -11 5 10

5 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 15 20 Glu Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met 25 30 32 Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu, og 10 (iii) en human-H2-prorelaxin C-kæde med den i figurerne 2A-2D angivne aminosyresekvens som ordnet i figur 2, hvorhos C-kædeaminosyresekvensen er modificeret i forbindelsen mellem B/C- og C/A-kæderne til fremme af kløvning af B/C- og 15 C/A-forbindelserne og efterfølgende udskæring af C-kæden. 20 25 30 35