JPH05268984A - 酵母発現ベクターの発現方法 - Google Patents
酵母発現ベクターの発現方法Info
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- JPH05268984A JPH05268984A JP4200091A JP20009192A JPH05268984A JP H05268984 A JPH05268984 A JP H05268984A JP 4200091 A JP4200091 A JP 4200091A JP 20009192 A JP20009192 A JP 20009192A JP H05268984 A JPH05268984 A JP H05268984A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 酵母グリセルアルデヒト−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼプロテアーゼプロモーターの転写制御
下にある外来性ＤＮＡのセグメントを少なくとも含んで
なる酵母発現ベクターにコードセグメントを挿入して得
られるコードセグメント発現ベクターで酵母細胞を形質
転換し、その形質転換体で前記コードセグメントを発現
する方法。 【効果】 コードセグメントの強化された発現が可能に
なる。
デヒドロゲナーゼプロテアーゼプロモーターの転写制御
下にある外来性ＤＮＡのセグメントを少なくとも含んで
なる酵母発現ベクターにコードセグメントを挿入して得
られるコードセグメント発現ベクターで酵母細胞を形質
転換し、その形質転換体で前記コードセグメントを発現
する方法。 【効果】 コードセグメントの強化された発現が可能に
なる。
Description
【０００１】
【発明の背景】微生物系において外来性遺伝子を最大に
発現せしめるためには一般に、発現ベクター中に相同性
制御要素を用いるのが有利である。発現の効率（生成物
の生産）は使用するプロモーターの強力さの関数であ
り、それに比例すると信じられる。さらに、実験者のコ
ントロールの下での栄養的因子による遺伝子発現の制御
はさらに有用な操作手段を提供する。酵母の解糖系酵素
の遺伝子、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ〔ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−
３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（ＧＡＰＤＨ）〕及びピルベートキナーゼ〔ｐｙｒｖａ
ｔｅ ｋｉｎａｓｅ（ＰｙＫ）〕についてコードする遺
伝子は上記の有用な性質、すなわち高レベルの発現（非
常に効率的なプロモーターが推定される）及び増殖培地
の成分による制御に対する感受性を有する。例えば、Ｇ
ＡＰＤＨは、市販のパン酵母の乾燥重量の５％という大
きな部分を占めることができる〔Ｋｒｅｂｓ，Ｅ．
Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５３）２００：
４７１〕。さらに、これらの酵素は非常に誘導されやす
い。例えば、酵母の培養が酢酸塩での増殖からグルコー
スでの増殖に移行した場合、ＧＡＰＤＨの活性は培地中
の糖の濃度に比例して２００倍まで増加する〔Ｍａｉｔ
ｒａ Ｐ．Ｋ．及びＬｏｂｏ Ｚ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９７１）２４６：４７５〕。これらの結果
は、これらの遺伝子の転写機構が、これらの遺伝子の
５′非コードフランク領域中に存在するＤＮＡ配列の関
与により高度に制御されることを示唆する。
発現せしめるためには一般に、発現ベクター中に相同性
制御要素を用いるのが有利である。発現の効率（生成物
の生産）は使用するプロモーターの強力さの関数であ
り、それに比例すると信じられる。さらに、実験者のコ
ントロールの下での栄養的因子による遺伝子発現の制御
はさらに有用な操作手段を提供する。酵母の解糖系酵素
の遺伝子、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ〔ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−
３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（ＧＡＰＤＨ）〕及びピルベートキナーゼ〔ｐｙｒｖａ
ｔｅ ｋｉｎａｓｅ（ＰｙＫ）〕についてコードする遺
伝子は上記の有用な性質、すなわち高レベルの発現（非
常に効率的なプロモーターが推定される）及び増殖培地
の成分による制御に対する感受性を有する。例えば、Ｇ
ＡＰＤＨは、市販のパン酵母の乾燥重量の５％という大
きな部分を占めることができる〔Ｋｒｅｂｓ，Ｅ．
Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５３）２００：
４７１〕。さらに、これらの酵素は非常に誘導されやす
い。例えば、酵母の培養が酢酸塩での増殖からグルコー
スでの増殖に移行した場合、ＧＡＰＤＨの活性は培地中
の糖の濃度に比例して２００倍まで増加する〔Ｍａｉｔ
ｒａ Ｐ．Ｋ．及びＬｏｂｏ Ｚ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９７１）２４６：４７５〕。これらの結果
は、これらの遺伝子の転写機構が、これらの遺伝子の
５′非コードフランク領域中に存在するＤＮＡ配列の関
与により高度に制御されることを示唆する。
【０００２】この発明は、制御可能な酵母遺伝子ＧＡＰ
ＤＨ及びＰｙＸの５′非コード領域に対応するＤＮＡ断
片の分離、構造、及び酵母発現プラスミド中での好結果
を伴う使用に関する。強力な転写促進（ｐｒｏｍｏｔｉ
ｎｇ）活性を有するＤＮＡ配列を含有するこれらの断片
を「プロモーター」と称する。このプロモーターは、そ
の転写制御の下で外来性遺伝子によりコードされる蛋白
質の商業的大量生産のためのＤＮＡベクターの典型的な
成分である。
ＤＨ及びＰｙＸの５′非コード領域に対応するＤＮＡ断
片の分離、構造、及び酵母発現プラスミド中での好結果
を伴う使用に関する。強力な転写促進（ｐｒｏｍｏｔｉ
ｎｇ）活性を有するＤＮＡ配列を含有するこれらの断片
を「プロモーター」と称する。このプロモーターは、そ
の転写制御の下で外来性遺伝子によりコードされる蛋白
質の商業的大量生産のためのＤＮＡベクターの典型的な
成分である。
【０００３】さらに、この発明は、プロモーター−外来
性遺伝子−ターミネーターの「カセット」を構成する適
当なターミネーターをさらに含んで成る酵母発現ベクタ
ーに関する。酵母中で外来性ＤＮＡを発現しようとする
初期の試みは失敗した〔Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．等、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９８０）２８３：２８５〕。この報告にお
いては、ヘモグロビンＤＮＡ（それ自体のプロモーター
と共に挿入された）は転写されたが、このＲＮＡがスプ
ライス（ｓｐｌｉｃｅ）されなかった。この結果につい
て種々の説明が可能である。すなわち、転写開始位置の
不正確及び／又は介存配列（イントロン）をスプライシ
ングするための酵母の能力の不足である。
性遺伝子−ターミネーターの「カセット」を構成する適
当なターミネーターをさらに含んで成る酵母発現ベクタ
ーに関する。酵母中で外来性ＤＮＡを発現しようとする
初期の試みは失敗した〔Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．等、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９８０）２８３：２８５〕。この報告にお
いては、ヘモグロビンＤＮＡ（それ自体のプロモーター
と共に挿入された）は転写されたが、このＲＮＡがスプ
ライス（ｓｐｌｉｃｅ）されなかった。この結果につい
て種々の説明が可能である。すなわち、転写開始位置の
不正確及び／又は介存配列（イントロン）をスプライシ
ングするための酵母の能力の不足である。
【０００４】酵母の３種類のＧＡＰＤＨ遺伝子がクロー
ニングされている〔Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．等、Ｂａ
ｓｉｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）１９，
２９１〕が、これらのプロモーターは組換ＤＮＡ法によ
る酵母中での発現系を構成するために使用されていな
い。ＰｙＫ遺伝子もすでにクローニングされているが、
遺伝的補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によっ
てのみである（構造的研究は行われていない）〔カワサ
キ Ｇ．及びＦｒａｅｎｅｌ Ｄ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．（１９８２）
１０８；１１０７〕。他の酵母プロモーター、例えばア
ルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ）のプロモーター〔Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ，Ｐ．等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）２９
８：３４７、及びＨｉｔｙｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．等Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８１）２９３：７１７〕、並びにホスホグ
セレートキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ
Ｋｉｎａｓｅ）〔Ｔｕｉｔｅ，Ｍ．Ｆ．等、ＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８２）１：６０３、及びＨｉｔｚｅｍａ
ｎ，Ｒ．Ａ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：
６２０〕が、酵母における発現のために外来性遺伝子に
連結されているが、ターミネーターは使用されなかっ
た。この発明は、酵母発現系のための新規なプロモータ
ーを提供し、そして強化された発現を伴う非常に効果的
なプロモーターの利点と適切に連結されたターミネータ
ーの利点を結びつける。
ニングされている〔Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．等、Ｂａ
ｓｉｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）１９，
２９１〕が、これらのプロモーターは組換ＤＮＡ法によ
る酵母中での発現系を構成するために使用されていな
い。ＰｙＫ遺伝子もすでにクローニングされているが、
遺伝的補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によっ
てのみである（構造的研究は行われていない）〔カワサ
キ Ｇ．及びＦｒａｅｎｅｌ Ｄ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．（１９８２）
１０８；１１０７〕。他の酵母プロモーター、例えばア
ルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ）のプロモーター〔Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ，Ｐ．等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）２９
８：３４７、及びＨｉｔｙｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．等Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８１）２９３：７１７〕、並びにホスホグ
セレートキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ
Ｋｉｎａｓｅ）〔Ｔｕｉｔｅ，Ｍ．Ｆ．等、ＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８２）１：６０３、及びＨｉｔｚｅｍａ
ｎ，Ｒ．Ａ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：
６２０〕が、酵母における発現のために外来性遺伝子に
連結されているが、ターミネーターは使用されなかっ
た。この発明は、酵母発現系のための新規なプロモータ
ーを提供し、そして強化された発現を伴う非常に効果的
なプロモーターの利点と適切に連結されたターミネータ
ーの利点を結びつける。
【０００５】
【発明の要約】この発明は、酵母ＧＡＰＤＥプロモータ
ー又は酵母ＰｙＫプロモーターの転写制御の下にある外
来性ＤＮＡ断片、例えば肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）表面
抗原（ＨＢｓＡｇ）についてコードするＤＮＡ断片を含
んでなる酵母発現ベクターに関する。ターミネーターも
又、適切に連結することができる。この発現ベクターは
典型的には酵母複製開始点及び細菌複製開始点を有し、
そしていずれのタイプの細胞中でも複製することができ
る。この発現ベクターは、酵母細胞を形質転換するのに
使用された場合、外来性ＤＮＡのセグメントによってコ
ードされる蛋白質の実質的な量を生成せしめるであろ
う。
ー又は酵母ＰｙＫプロモーターの転写制御の下にある外
来性ＤＮＡ断片、例えば肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）表面
抗原（ＨＢｓＡｇ）についてコードするＤＮＡ断片を含
んでなる酵母発現ベクターに関する。ターミネーターも
又、適切に連結することができる。この発現ベクターは
典型的には酵母複製開始点及び細菌複製開始点を有し、
そしていずれのタイプの細胞中でも複製することができ
る。この発現ベクターは、酵母細胞を形質転換するのに
使用された場合、外来性ＤＮＡのセグメントによってコ
ードされる蛋白質の実質的な量を生成せしめるであろ
う。
【０００６】
【発明の具体的な記載】本来、酵母発現プラスミドは次
の点を含む特定の利点を有する。酵母は、当業界におい
てよく知られている方法により、商業的生産のための大
規模培養において増殖することができる。これに対し
て、細胞は大規模培養において、しばしば、「ファージ
・アウト」（ファージによる溶菌）の問題に遭遇する。
酵母はさらに、哺乳動物細胞と同様に新たに合成された
蛋白質に炭水化物を付加する能力を有するようである。
細胞はこの能力を有しない。今や、ｃＤＮＡ配列を容易
に利用することができ、イントロンを有する発現ベクタ
ーの問題は容易に回避される。
の点を含む特定の利点を有する。酵母は、当業界におい
てよく知られている方法により、商業的生産のための大
規模培養において増殖することができる。これに対し
て、細胞は大規模培養において、しばしば、「ファージ
・アウト」（ファージによる溶菌）の問題に遭遇する。
酵母はさらに、哺乳動物細胞と同様に新たに合成された
蛋白質に炭水化物を付加する能力を有するようである。
細胞はこの能力を有しない。今や、ｃＤＮＡ配列を容易
に利用することができ、イントロンを有する発現ベクタ
ーの問題は容易に回避される。
【０００７】この発明のベクターは、非常に高い効率を
有するプロモーターを含む。ここで、プロモーターは、
隣接するＤＮＡセグメントの転写を開始するために機能
することができるＤＮＡセグメントとして定義される。
転写とは、プロモーター領域に隣接するＤＮＡの１本鎖
に相補的なＲＮＡ（ここでは、メッセンジャーＲＮＡ、
すなわちｍＲＮＡ）の合成である。真核生物において
は、メッセンジャーＲＮＡ合成はＲＮＡポリメラーゼＩ
Ｉと称する酵素により触媒される。プロモーター機能の
最少必須要素は次の通りである。すなわち、転写開始の
ための出発点を提供すること、及びこの出発部位の近く
にＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を提供しメッセン
ジャーＲＮＡ合成のための鋳型として適当なＤＮＡ鎖の
選択を可能にすることである。さらに、真核性プロモー
ターは、そのコントロールの下でコードセグメントの転
写の相対的効率を制御するために機能する。活性プロモ
ーターは隣接ＤＮＡコードセグメントの鎖に相補的なｍ
ＲＮＡの比較的大量の合成を惹起するプロモーターであ
る。
有するプロモーターを含む。ここで、プロモーターは、
隣接するＤＮＡセグメントの転写を開始するために機能
することができるＤＮＡセグメントとして定義される。
転写とは、プロモーター領域に隣接するＤＮＡの１本鎖
に相補的なＲＮＡ（ここでは、メッセンジャーＲＮＡ、
すなわちｍＲＮＡ）の合成である。真核生物において
は、メッセンジャーＲＮＡ合成はＲＮＡポリメラーゼＩ
Ｉと称する酵素により触媒される。プロモーター機能の
最少必須要素は次の通りである。すなわち、転写開始の
ための出発点を提供すること、及びこの出発部位の近く
にＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を提供しメッセン
ジャーＲＮＡ合成のための鋳型として適当なＤＮＡ鎖の
選択を可能にすることである。さらに、真核性プロモー
ターは、そのコントロールの下でコードセグメントの転
写の相対的効率を制御するために機能する。活性プロモ
ーターは隣接ＤＮＡコードセグメントの鎖に相補的なｍ
ＲＮＡの比較的大量の合成を惹起するプロモーターであ
る。
【０００８】プロモーターの機能の構造的相互関係は明
確には確立されていない。プロモーターセグメントは通
常、ある構造遺伝子の５′末端に隣接して存在する領域
としての性質において同定される。（遺伝子の５′末端
及び３′末端は、これから転写されたｍＲＮＡの対応す
るそれぞれの末端を示し、そしてコードされた蛋白質の
ＮＨＺ−末端及び−ＣＯＯＨにそれぞれ対応するものと
理解される。）色々な種からの色々な遺伝子のためのプ
ロモーターのヌクレオチド配列の比較から、これらの間
で共通な、ヌクレオチド配列の類似性を有する非常に短
い領域が見出されている。これらの領域の内特に顕著な
ものは、「ＴＡＴＡボックス」、すなわち転写開始部位
から一般に約７０〜２３０ヌクレオチド上流に位置し、
一般に類似するＴＡＴＡＡ配列を有する約５〜１０ヌク
レオチドのセグメントである。構造的比較を概観するた
めには、Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ Ｒ．及びＣｈａｍｂｏ
ｎＰ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１
９８１）５０：３４９を参照のこと。ＴＡＴＡボックス
は転写の開始において機能すると信じられる。
確には確立されていない。プロモーターセグメントは通
常、ある構造遺伝子の５′末端に隣接して存在する領域
としての性質において同定される。（遺伝子の５′末端
及び３′末端は、これから転写されたｍＲＮＡの対応す
るそれぞれの末端を示し、そしてコードされた蛋白質の
ＮＨＺ−末端及び−ＣＯＯＨにそれぞれ対応するものと
理解される。）色々な種からの色々な遺伝子のためのプ
ロモーターのヌクレオチド配列の比較から、これらの間
で共通な、ヌクレオチド配列の類似性を有する非常に短
い領域が見出されている。これらの領域の内特に顕著な
ものは、「ＴＡＴＡボックス」、すなわち転写開始部位
から一般に約７０〜２３０ヌクレオチド上流に位置し、
一般に類似するＴＡＴＡＡ配列を有する約５〜１０ヌク
レオチドのセグメントである。構造的比較を概観するた
めには、Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ Ｒ．及びＣｈａｍｂｏ
ｎＰ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１
９８１）５０：３４９を参照のこと。ＴＡＴＡボックス
は転写の開始において機能すると信じられる。
【０００９】外来性遺伝子は、プロモーターに関連する
正常な構造遺伝子由来のコドンを含有しないか又は実質
上含有しないであろう。通常、外来性遺伝子は、プロモ
ーターを含む制御領域の非コード３′末端に連結され、
制御遺伝子に天然に関連する内性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅ
ｎｏｕｓ ｇｅｎｅ）のＮ末端のアミノ酸が排除される
であろう。すなわち、外来性遺伝子に連結された場合、
制御領域に保存されるのは３コドン（９ヌクレオチド）
未満であろう。
正常な構造遺伝子由来のコドンを含有しないか又は実質
上含有しないであろう。通常、外来性遺伝子は、プロモ
ーターを含む制御領域の非コード３′末端に連結され、
制御遺伝子に天然に関連する内性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅ
ｎｏｕｓ ｇｅｎｅ）のＮ末端のアミノ酸が排除される
であろう。すなわち、外来性遺伝子に連結された場合、
制御領域に保存されるのは３コドン（９ヌクレオチド）
未満であろう。
【００１０】コードセグメントの３′末端におけるター
ミネーター配列の存在により発現が強化される。この効
果は一般に原核性転写系へのｒｈｏファクターの付加の
場合に類似しており、ＲＮＡポリメラーゼの離脱速度が
上昇し、転写の再開始速度が上昇する。ターミネーター
配列は外来性ＤＮＡセグメントの検出し得る発現には必
要でないが、これを適切に連結すれば発現が強化される
ことが理解されよう。ターミネーター領域は、プロモー
ター領域が関連するのと同一の又は異る構造遺伝子と関
連することが当然可能である。
ミネーター配列の存在により発現が強化される。この効
果は一般に原核性転写系へのｒｈｏファクターの付加の
場合に類似しており、ＲＮＡポリメラーゼの離脱速度が
上昇し、転写の再開始速度が上昇する。ターミネーター
配列は外来性ＤＮＡセグメントの検出し得る発現には必
要でないが、これを適切に連結すれば発現が強化される
ことが理解されよう。ターミネーター領域は、プロモー
ター領域が関連するのと同一の又は異る構造遺伝子と関
連することが当然可能である。
【００１１】この発明のＧＡＰＤＨ又はＰｙＫ構造のた
めの最も適当なＤＮＡベクターはシャトルベクターであ
る。これらのベクターは細菌株、例えばＥ．コリ（Ｅｃ
ｏｌｉ）と酵母との間を往復（ｓｈｏｔｔｌｅ）するこ
とができる。なぜならこれらのベクターは細菌複製開始
点及び酵母複製開始点を有するからである〔例えば、Ａ
ｍｍｅｒｅｒ Ｇ．等、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮ
Ａ，Ｐｒｏｃ．Ｔｈｉｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｔ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ Ｍａｃｌｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｗａ
ｌｔｏｎ Ａ．Ｇ．編）、１８５頁、エルゼビール、ア
ムステルダムを参照のこと〕。典型的な細菌複製開始点
は、例えばｐＢＲ３２２から導かれる。最も有用な酵母
複製開始点は、２ミクロンサークルとして知られる染色
体外遺伝要素に見出される。実験室株において、２ミク
ロンプラスミドＤＮＡは細胞当り約５０コピー見出さ
れ、そして安定に維持される。概観するために例えばＣ
ｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｎ．（１９８
２）９６：１１９を参照のこと。この酵母プラスミドも
配列決定されている〔Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．等、Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８０）２８６：８６０〕。
めの最も適当なＤＮＡベクターはシャトルベクターであ
る。これらのベクターは細菌株、例えばＥ．コリ（Ｅｃ
ｏｌｉ）と酵母との間を往復（ｓｈｏｔｔｌｅ）するこ
とができる。なぜならこれらのベクターは細菌複製開始
点及び酵母複製開始点を有するからである〔例えば、Ａ
ｍｍｅｒｅｒ Ｇ．等、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮ
Ａ，Ｐｒｏｃ．Ｔｈｉｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｔ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ Ｍａｃｌｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｗａ
ｌｔｏｎ Ａ．Ｇ．編）、１８５頁、エルゼビール、ア
ムステルダムを参照のこと〕。典型的な細菌複製開始点
は、例えばｐＢＲ３２２から導かれる。最も有用な酵母
複製開始点は、２ミクロンサークルとして知られる染色
体外遺伝要素に見出される。実験室株において、２ミク
ロンプラスミドＤＮＡは細胞当り約５０コピー見出さ
れ、そして安定に維持される。概観するために例えばＣ
ｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｎ．（１９８
２）９６：１１９を参照のこと。この酵母プラスミドも
配列決定されている〔Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．等、Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８０）２８６：８６０〕。
【００１２】この発明の構成において使用されるプラス
ミド及び宿主細胞の代表例がアメリカン・タイプ・カル
チュアー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されてい
る。プラスミドｐＰｙＫ９．１．１．並びに酵母細胞形
質転換体２１５０−２−３／ｐＨＢＳ−５６ ＧＡＰ３
４７／３３、及び２１５０−２−３／ｐＨＢｓ５６Ｐｙ
Ｋが、１９８３年２月１８日に寄託され、それぞれＡＴ
ＣＣ受け入れ番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ）４００
６１，２０６６５及び２０６６６が与えられた。
ミド及び宿主細胞の代表例がアメリカン・タイプ・カル
チュアー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されてい
る。プラスミドｐＰｙＫ９．１．１．並びに酵母細胞形
質転換体２１５０−２−３／ｐＨＢＳ−５６ ＧＡＰ３
４７／３３、及び２１５０−２−３／ｐＨＢｓ５６Ｐｙ
Ｋが、１９８３年２月１８日に寄託され、それぞれＡＴ
ＣＣ受け入れ番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ）４００
６１，２０６６５及び２０６６６が与えられた。
【００１３】次に記載する例において、多くの技法、反
応及び分離方法は当業界においてはすでによく知られて
いる。特にことわらない限りすべての酵素は１又は複数
の商業的供給源、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，ベベリー、マサチューセッツ；Ｃｏｌｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ウアルサム、マ
サチューセッツ；Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，エルクハート、インディアナ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳ，Ｉｎｃ，インディアナ
ポリス、インディアナ；及びＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ロックビレ、
メイランドから入手することができる。
応及び分離方法は当業界においてはすでによく知られて
いる。特にことわらない限りすべての酵素は１又は複数
の商業的供給源、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，ベベリー、マサチューセッツ；Ｃｏｌｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ウアルサム、マ
サチューセッツ；Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，エルクハート、インディアナ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳ，Ｉｎｃ，インディアナ
ポリス、インディアナ；及びＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ロックビレ、
メイランドから入手することができる。
【００１４】制限酵素消化のための緩衝液及び反応条件
は、特にことわらない限り各酵素の製造者の推奨に従っ
て使用した。他の酵素反応、ゲル電気泳動分離及びＥ．
コリの形質転換は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ（１９７９）６８に記載されている。酵母プ
ロトプラストの形質転換は本質上、Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９７８）２７５：１０４に記戟されている方
法により行うことができる。
は、特にことわらない限り各酵素の製造者の推奨に従っ
て使用した。他の酵素反応、ゲル電気泳動分離及びＥ．
コリの形質転換は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ（１９７９）６８に記載されている。酵母プ
ロトプラストの形質転換は本質上、Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９７８）２７５：１０４に記戟されている方
法により行うことができる。
【００１５】形質転換に有用なＥ．コリ株には、Ｘ１７
７６；Ｋ１２ストレイン２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１
４４６）；ＲＲ１及びＨＢ１０１が含まれる。遺伝子型
（ａ，ａｄｅ２，ａｄｅ６，ｌｅｕ２，ｌｙｓｌ，ｔｒ
ｐｌ，ｃａｎｌ）を有する酵母株ＸＶ６１０−８ｃ、及
び遺伝子型（Ｌｅｕ２，Ｔｒｐ１，Ｈｉｓ４，ＣＹＣ１
−１ＣＹＰ３−１）を有するＧＭ−３Ｃ−２株〔Ｆａｙ
ｅ，Ｇ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（１９８１）７８：２２５８〕を酵母の形質転換に典型
的に使用することができる。しかしながら、実質上すべ
ての酵母菌株が形質転換のために有用であると理解すべ
きである。細胞は、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ，コールド・スプリングハーバー・ラボラトリ
ー，コールスプリングハーバー，ニューヨーク（１９７
２）に記載されている方法に従って増殖せしめ、そして
選択することができる。酵母は次の培地の増殖せしめる
ことができる。ＹＥＰＤ培地は１（Ｗ／Ｖ）％の酵母エ
キストラクト、２（Ｗ／Ｖ）％のペプトン、及びグルコ
ースを含有し、プレート培地の場合にはさらに３（Ｗ／
Ｖ）％の寒天を含有する。ＹＮＢ＋ＣＡＡ培地は１ｌ中
６．７ｇのイーストニトロゲンベース（ｙｅａｓｔ ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ）（ディフコ・ラボラトリー
ス，ミネアポリス，ミネソタ）、１０ｍｇのアデニン、
１０ｍｇのウラシル、５ｇのカサミノ酸（ＣＡＡ）（デ
ィフコ）及び２０ｇのグルコースを含有し、プレート培
地の場合にはさらに３０ｇの寒天を含有する。トリプト
ファン栄養要求性の選択は、形質転換される株のトリプ
トファン以外のすべての増殖要求因子が補完された、
６．７ｇのイーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）
を含有するプレート上で行うことができる。
７６；Ｋ１２ストレイン２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１
４４６）；ＲＲ１及びＨＢ１０１が含まれる。遺伝子型
（ａ，ａｄｅ２，ａｄｅ６，ｌｅｕ２，ｌｙｓｌ，ｔｒ
ｐｌ，ｃａｎｌ）を有する酵母株ＸＶ６１０−８ｃ、及
び遺伝子型（Ｌｅｕ２，Ｔｒｐ１，Ｈｉｓ４，ＣＹＣ１
−１ＣＹＰ３−１）を有するＧＭ−３Ｃ−２株〔Ｆａｙ
ｅ，Ｇ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（１９８１）７８：２２５８〕を酵母の形質転換に典型
的に使用することができる。しかしながら、実質上すべ
ての酵母菌株が形質転換のために有用であると理解すべ
きである。細胞は、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ，コールド・スプリングハーバー・ラボラトリ
ー，コールスプリングハーバー，ニューヨーク（１９７
２）に記載されている方法に従って増殖せしめ、そして
選択することができる。酵母は次の培地の増殖せしめる
ことができる。ＹＥＰＤ培地は１（Ｗ／Ｖ）％の酵母エ
キストラクト、２（Ｗ／Ｖ）％のペプトン、及びグルコ
ースを含有し、プレート培地の場合にはさらに３（Ｗ／
Ｖ）％の寒天を含有する。ＹＮＢ＋ＣＡＡ培地は１ｌ中
６．７ｇのイーストニトロゲンベース（ｙｅａｓｔ ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ）（ディフコ・ラボラトリー
ス，ミネアポリス，ミネソタ）、１０ｍｇのアデニン、
１０ｍｇのウラシル、５ｇのカサミノ酸（ＣＡＡ）（デ
ィフコ）及び２０ｇのグルコースを含有し、プレート培
地の場合にはさらに３０ｇの寒天を含有する。トリプト
ファン栄養要求性の選択は、形質転換される株のトリプ
トファン以外のすべての増殖要求因子が補完された、
６．７ｇのイーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）
を含有するプレート上で行うことができる。
【００１６】例１．酵母グリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のクロ
ーニング 酵母ＧＡＰＤＨコード配列を含有する相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）を次のようにして調製した。
フェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のクロ
ーニング 酵母ＧＡＰＤＨコード配列を含有する相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）を次のようにして調製した。
【００１７】酵母Ａ３６４Ａ株からポリＡ＋ＲＮＡを分
離した。ＡＭＶ逆転写酵素（ｒｅｖａｒｓｅ ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ）及びＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを用いて２重鎖ｃＤＮＡを合成した。デオキシヌクレ
オチドターミナルトランスフェラーゼ（ｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ）を用いて２重鎖ｃＤＮＡ分子にポリ−ｄｃ−
ティルを付加した。ポリ−ｄｃ−ティルを付加したｃＤ
ＮＡをポリ−ｄＧ−ティルを付加したｐＢＲ３２２にア
ニーリングし、そしてこれを用いてＥ．コリＨＢ１０１
を形質転換した。１０００個の形質転換体を、ラベルさ
れたポリＡ＋ＲＮＡへのコロニーハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングし、そしてサブセットを、制限
酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によりさらに試験し
た。集団から、ＧＡＰＤＨ配列を含有する３個のコロニ
ーを分離した。１つのクローン（ＰｃＧＡＰ−９）が約
１２００塩基対（ｂｐ）の挿入部を含有しており、これ
をその後の研究に使用した。
離した。ＡＭＶ逆転写酵素（ｒｅｖａｒｓｅ ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ）及びＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを用いて２重鎖ｃＤＮＡを合成した。デオキシヌクレ
オチドターミナルトランスフェラーゼ（ｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ）を用いて２重鎖ｃＤＮＡ分子にポリ−ｄｃ−
ティルを付加した。ポリ−ｄｃ−ティルを付加したｃＤ
ＮＡをポリ−ｄＧ−ティルを付加したｐＢＲ３２２にア
ニーリングし、そしてこれを用いてＥ．コリＨＢ１０１
を形質転換した。１０００個の形質転換体を、ラベルさ
れたポリＡ＋ＲＮＡへのコロニーハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングし、そしてサブセットを、制限
酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によりさらに試験し
た。集団から、ＧＡＰＤＨ配列を含有する３個のコロニ
ーを分離した。１つのクローン（ＰｃＧＡＰ−９）が約
１２００塩基対（ｂｐ）の挿入部を含有しており、これ
をその後の研究に使用した。
【００１８】Ｂｌａｔｔｎｅｒ．Ｆ．Ｒ．等、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（１９７７）１９６：１６１〜１６９に従って、
全酵母ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａにより部分消化した
後に得られた断片をλファージ・シャロン（Ｃｈａｒｏ
ｎ）２８に挿入することによって酵母遺伝子ライブラリ
ーを調製した。ＧＡＰＤＡコード配列を含有する複数の
断片を、ｐｃＧＡＰ−９由来のラベルＤＮＡを用いてフ
ァージライブラリーをスクリーニングすることにより分
離した。これらのクローンの内の１つの酵母ＧＡＰＤＨ
遺伝子を、２．１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ｐＧＡＰ
−１）、（図１参照）として、又は３．５ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ断片（ｐＧＡＰ−２）としてｐＢＲ３２２でサブク
ローニングした。これらのクローンからＧＡＰＤＨプロ
モーター活性断片を分離した。約８００ｂｐのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＨｈａＩ断片を約３５０ｂｐのＨｈａＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片に連結した。得られた１０６１ｂｐ Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片をゲル電気泳動により分離し、そして
ｐＢＲ３２２中でクローニングし（ｐＧＡＰ−３４
７）、そして配列を決定した（図２参照）。
ｎｃｅ（１９７７）１９６：１６１〜１６９に従って、
全酵母ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａにより部分消化した
後に得られた断片をλファージ・シャロン（Ｃｈａｒｏ
ｎ）２８に挿入することによって酵母遺伝子ライブラリ
ーを調製した。ＧＡＰＤＡコード配列を含有する複数の
断片を、ｐｃＧＡＰ−９由来のラベルＤＮＡを用いてフ
ァージライブラリーをスクリーニングすることにより分
離した。これらのクローンの内の１つの酵母ＧＡＰＤＨ
遺伝子を、２．１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ｐＧＡＰ
−１）、（図１参照）として、又は３．５ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ断片（ｐＧＡＰ−２）としてｐＢＲ３２２でサブク
ローニングした。これらのクローンからＧＡＰＤＨプロ
モーター活性断片を分離した。約８００ｂｐのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＨｈａＩ断片を約３５０ｂｐのＨｈａＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片に連結した。得られた１０６１ｂｐ Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片をゲル電気泳動により分離し、そして
ｐＢＲ３２２中でクローニングし（ｐＧＡＰ−３４
７）、そして配列を決定した（図２参照）。
【００１９】例２．ＨＢｓＡｇの発現において活性を有
するＧＡＰＤＨプロモーターを含有する酵母ベクターの
構成 酵母中でＨＢＶ表面抗原を発現するための、ＧＡＰＤＨ
プロモーター断片を用いるプラスミドベクター（ｐＨＢ
Ｓ−５６ＧＡＰ３４７／３３）を、図３に示すようにし
て構成した。
するＧＡＰＤＨプロモーターを含有する酵母ベクターの
構成 酵母中でＨＢＶ表面抗原を発現するための、ＧＡＰＤＨ
プロモーター断片を用いるプラスミドベクター（ｐＨＢ
Ｓ−５６ＧＡＰ３４７／３３）を、図３に示すようにし
て構成した。
【００２０】ｐＧＡＰ−３４７をＳｐｈＩにより全消化
し、次にＨｉｎｄＩＩＩにより部分消化することによ
り、ＧＡＰＤＨプロモーターの約１０６０ｂｐとｐＢＲ
３２２の約５３０ｂｐを有する約１７００ｂｐのＳｐｈ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。この１７００ｂｐのＳ
ｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＧＡＰＤＨプロモーター断片
を、８４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
（ＨＢｓＡｇコード領域、２６塩基の５′非コード領域
及び１２８ｂｐの３′非コード領域を含有し、ｐＨＢＳ
−５６から得られたもの）に連結し、そして次に３５０
ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片（ｐＨＢＳ−５６
から分離され、ＡＤＨ−１終結領域を含有する）と連結
した。２９００ｂｐのＳｐｈＩ断片（カセット）を分離
し、そしてあらかじめＳｐｈＩにより消化されたｐＨＢ
Ｓ−５６にクローニングした。プラスミドｐＨＢＳ−５
６（ＡＴＣＣ受入Ｎｏ．４００４７）は係属中の米国特
許出願Ｎｏ．４０２，３３０，１９８２年７月２７日出
願、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｒｕ
ｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ Ｙｅａｓｔ」に記載され
ており、そして酵母ｌｅｕ２遺伝子及びｐＢＲ３２２の
ａｍｐ耐性座を伴う領域のほかに完全な２ミクロンプラ
スミドを含有する。プロモーター、遺伝子及び終結領域
が正しく方向付けられている得られたプラスミド（ｐＨ
ＢＳ−５６ＧＡＰ３４７／３３）を分離し、そしてこれ
を用いて酵母ＡＢ１０２株（ＭＡＴａ，ｐｅｐ４−３，
ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｕｒａ３−５２，ｈ
ｉｓ４−５８０，ｃｉｒ°）、又は２１５０−２−３株
（ＭＡＴａ，ａｄｅｌ，ｌｅｕ２−０４，ｃｉｒ°）を
形質転換した。ＡＢ１０２株は２ミクロンプラスミドの
キュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）によりＳＦ６５７−９ｃ
から誘導されたものである。２１５０−２−３株はワシ
ントン大学におけるＬｅｌａｎｄ Ｈａｒｔｗｅｌｌ氏
のコレクションに由来する。
し、次にＨｉｎｄＩＩＩにより部分消化することによ
り、ＧＡＰＤＨプロモーターの約１０６０ｂｐとｐＢＲ
３２２の約５３０ｂｐを有する約１７００ｂｐのＳｐｈ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。この１７００ｂｐのＳ
ｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＧＡＰＤＨプロモーター断片
を、８４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
（ＨＢｓＡｇコード領域、２６塩基の５′非コード領域
及び１２８ｂｐの３′非コード領域を含有し、ｐＨＢＳ
−５６から得られたもの）に連結し、そして次に３５０
ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片（ｐＨＢＳ−５６
から分離され、ＡＤＨ−１終結領域を含有する）と連結
した。２９００ｂｐのＳｐｈＩ断片（カセット）を分離
し、そしてあらかじめＳｐｈＩにより消化されたｐＨＢ
Ｓ−５６にクローニングした。プラスミドｐＨＢＳ−５
６（ＡＴＣＣ受入Ｎｏ．４００４７）は係属中の米国特
許出願Ｎｏ．４０２，３３０，１９８２年７月２７日出
願、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｒｕ
ｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ Ｙｅａｓｔ」に記載され
ており、そして酵母ｌｅｕ２遺伝子及びｐＢＲ３２２の
ａｍｐ耐性座を伴う領域のほかに完全な２ミクロンプラ
スミドを含有する。プロモーター、遺伝子及び終結領域
が正しく方向付けられている得られたプラスミド（ｐＨ
ＢＳ−５６ＧＡＰ３４７／３３）を分離し、そしてこれ
を用いて酵母ＡＢ１０２株（ＭＡＴａ，ｐｅｐ４−３，
ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｕｒａ３−５２，ｈ
ｉｓ４−５８０，ｃｉｒ°）、又は２１５０−２−３株
（ＭＡＴａ，ａｄｅｌ，ｌｅｕ２−０４，ｃｉｒ°）を
形質転換した。ＡＢ１０２株は２ミクロンプラスミドの
キュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）によりＳＦ６５７−９ｃ
から誘導されたものである。２１５０−２−３株はワシ
ントン大学におけるＬｅｌａｎｄ Ｈａｒｔｗｅｌｌ氏
のコレクションに由来する。
【００２１】例３．酵母中、ＧＡＰＤＨプロモーターの
コントロール下でのＨＢｓＡｇの合成（プラスミドｐＨ
ＢＳ−５６ＧＡＰ３４７／３３） プラスミドｐＨＢＳ５６−３４７／３３を含有するＡＢ
１０２株の培養物１００ｍｌを、６５０ｎｍにおける光
学濃度が１になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共
に攪拌し、そして遠心分離によって細胞片を除去するこ
とにより無細胞溶解物を調製した。ＨＢｓＡｇをアボッ
ト アウスリアＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ Ａｕｓｒｉａ Ｉ
Ｉ）ラジオイムノ アッセイにより測定し、そして蛋白
質濃度をクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌ
ｕｅ）結合法により測定した。結果を第１表に示す。こ
の結果は、ＧＡＰＤＨプロモーターが、酵母における蛋
白質の発現のためにＡＤＨ−１プロモーターに比べて約
５倍効果的であることを示している。
コントロール下でのＨＢｓＡｇの合成（プラスミドｐＨ
ＢＳ−５６ＧＡＰ３４７／３３） プラスミドｐＨＢＳ５６−３４７／３３を含有するＡＢ
１０２株の培養物１００ｍｌを、６５０ｎｍにおける光
学濃度が１になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共
に攪拌し、そして遠心分離によって細胞片を除去するこ
とにより無細胞溶解物を調製した。ＨＢｓＡｇをアボッ
ト アウスリアＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ Ａｕｓｒｉａ Ｉ
Ｉ）ラジオイムノ アッセイにより測定し、そして蛋白
質濃度をクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌ
ｕｅ）結合法により測定した。結果を第１表に示す。こ
の結果は、ＧＡＰＤＨプロモーターが、酵母における蛋
白質の発現のためにＡＤＨ−１プロモーターに比べて約
５倍効果的であることを示している。
【００２２】 酵母ＡＢ１０２株の代りに酵母２１５０−２−３株を使
用し例３を反復することにより同様の結果が得られた。
用し例３を反復することにより同様の結果が得られた。
【００２３】例４．酵母ピルベートキナーゼ遺伝子のク
ローニング ピルベートキナーゼ遺伝子を補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ）によりクローニングした。酵母ピルベー
トキナーゼマイナス変異株を、野性型酵母ゲノム性ＤＮ
Ａを含有する組換ＹＥｐ２４プラスミドのプールにより
形質転換した。酵母Ｓ ２８８Ｃ株（遺伝子型：ＳＵＣ
２，ｍａｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１）、及びＰｙＫ１−５
株（遺伝子型：ａ，ａｄｅ１，ｌｅｕ１，ｍｅｔ１４，
ｕｒａ３，ＰｙＫ１−５）をカリホルニア大学（バー
クレー）、生物物理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、酵母遺伝子貯蔵センター
（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ）から得た。使用した酵母遺伝子バンクは、Ｓ２８
８Ｃ株由来の全ＤＮＡのＳａｕ３Ａ部分分解物を「シャ
トル」ベクターＹＥｐ２４のＢａｍＨＩ部位にクローニ
ングしたものから成る。ベクターＹＥｐ２４は、細菌に
おける選択及び増殖のためのｐＢＲ３２２配列、酵母に
おける選択のための酵母ＵＲＡ３遺伝子、及び酵母にお
けるプラスミドの複製及び分離（Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏ
ｎ）を保証するための酵母２μサークルのＥｃｏＲＩ断
片を含有する。このプールは、全酵母ゲノムを代表する
のに十分な独立の組換プラスミドを含む。
ローニング ピルベートキナーゼ遺伝子を補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ）によりクローニングした。酵母ピルベー
トキナーゼマイナス変異株を、野性型酵母ゲノム性ＤＮ
Ａを含有する組換ＹＥｐ２４プラスミドのプールにより
形質転換した。酵母Ｓ ２８８Ｃ株（遺伝子型：ＳＵＣ
２，ｍａｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１）、及びＰｙＫ１−５
株（遺伝子型：ａ，ａｄｅ１，ｌｅｕ１，ｍｅｔ１４，
ｕｒａ３，ＰｙＫ１−５）をカリホルニア大学（バー
クレー）、生物物理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、酵母遺伝子貯蔵センター
（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ）から得た。使用した酵母遺伝子バンクは、Ｓ２８
８Ｃ株由来の全ＤＮＡのＳａｕ３Ａ部分分解物を「シャ
トル」ベクターＹＥｐ２４のＢａｍＨＩ部位にクローニ
ングしたものから成る。ベクターＹＥｐ２４は、細菌に
おける選択及び増殖のためのｐＢＲ３２２配列、酵母に
おける選択のための酵母ＵＲＡ３遺伝子、及び酵母にお
けるプラスミドの複製及び分離（Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏ
ｎ）を保証するための酵母２μサークルのＥｃｏＲＩ断
片を含有する。このプールは、全酵母ゲノムを代表する
のに十分な独立の組換プラスミドを含む。
【００２４】ＰｙＫ１−５株における変異はＰｙＫ１及
びＵＲＡ３座にあるので、この株はグルコースを含有す
る培地又はウラシルを含有しない培地には増殖すること
ができない。この株をＹＥｐ２４ゲノムライブラリーに
よって形質転換し、そしてウラシルを含有せずグルコー
スを含有する培地に増殖することができる形質転換体を
選択することにより、ピルベートキナーゼ遺伝子含有す
るＹＥｐ２４を獲得した細胞が選択される。３．５×１
０８個のＰｙＫ１−５酵母細胞を１０μｇのＹＥｐ２４
組換体プラスミドプールＤＮＡで形質転換することによ
り、ウラシルの非存在下及びグルコースの存在下で増殖
する５個の独立した形質転換体を得た。
びＵＲＡ３座にあるので、この株はグルコースを含有す
る培地又はウラシルを含有しない培地には増殖すること
ができない。この株をＹＥｐ２４ゲノムライブラリーに
よって形質転換し、そしてウラシルを含有せずグルコー
スを含有する培地に増殖することができる形質転換体を
選択することにより、ピルベートキナーゼ遺伝子含有す
るＹＥｐ２４を獲得した細胞が選択される。３．５×１
０８個のＰｙＫ１−５酵母細胞を１０μｇのＹＥｐ２４
組換体プラスミドプールＤＮＡで形質転換することによ
り、ウラシルの非存在下及びグルコースの存在下で増殖
する５個の独立した形質転換体を得た。
【００２５】これらの形質転換体の挿入ＤＮＡを制限酵
素分析により特徴付けることにより、これらが重複する
ＤＮＡ挿入部を含有することが示された。発明者は１つ
の形質転換体、すなわち７．０ｋｂの挿入部（ｉｎｓｅ
ｒｔ）を含有するｐＰｙｋ９．１に注目した。この挿入
部中のピルベートキナーゼ遺伝子の位置を、ピルベート
キナーゼｍＲＮＡであると予想される約１．７ｋｂのｍ
ＲＮＡにハイブリダイズする挿入部特異的制限断片を決
定することにより決定した。ＰｙＫ遺伝子の位置決定
を、挿入ＤＮＡの対応領域をサブクローニングし、そし
てＰｙＫ１−５変異株中の機能の補完を観察することに
より確認した。４．４ｋｂ挿入部上にＰｙＫ遺伝子を含
有するサブクローンｐＰｙＫ９．１．１の配列を決定
し、そして発現プラスミドの構成において使用した。
素分析により特徴付けることにより、これらが重複する
ＤＮＡ挿入部を含有することが示された。発明者は１つ
の形質転換体、すなわち７．０ｋｂの挿入部（ｉｎｓｅ
ｒｔ）を含有するｐＰｙｋ９．１に注目した。この挿入
部中のピルベートキナーゼ遺伝子の位置を、ピルベート
キナーゼｍＲＮＡであると予想される約１．７ｋｂのｍ
ＲＮＡにハイブリダイズする挿入部特異的制限断片を決
定することにより決定した。ＰｙＫ遺伝子の位置決定
を、挿入ＤＮＡの対応領域をサブクローニングし、そし
てＰｙＫ１−５変異株中の機能の補完を観察することに
より確認した。４．４ｋｂ挿入部上にＰｙＫ遺伝子を含
有するサブクローンｐＰｙＫ９．１．１の配列を決定
し、そして発現プラスミドの構成において使用した。
【００２６】例５．酵母ピルベートキナーゼ遺伝子の配
列 １つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｅｎ ｒｅ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）中の１４９７ヌクレオチド、
５′非翻訳領域の９１１ヌクレオチド、及び３′非翻訳
領域の４７７ヌクレオチドを含むＰｙＫ遺伝子の合計２
８８５ヌクレオチドの配列を決定した（図４参照）。こ
の遺伝子は４９９アミノ酸のポリペプチドをコードし、
単量体分子量５４，６０８ダルトンをもたらし、これは
酵母ＰｙＫの予想値とよく一致する。ヌクレオチド配列
から誘導されるアミノ酸組成も、分離された酵母蛋白質
から測定されたそれとよく一致する。ヌクレオチド配列
からカルボキシ末端がバリンであることが予想され、こ
れは酵母ピルベートキナーゼについて見出されている。
列 １つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｅｎ ｒｅ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）中の１４９７ヌクレオチド、
５′非翻訳領域の９１１ヌクレオチド、及び３′非翻訳
領域の４７７ヌクレオチドを含むＰｙＫ遺伝子の合計２
８８５ヌクレオチドの配列を決定した（図４参照）。こ
の遺伝子は４９９アミノ酸のポリペプチドをコードし、
単量体分子量５４，６０８ダルトンをもたらし、これは
酵母ＰｙＫの予想値とよく一致する。ヌクレオチド配列
から誘導されるアミノ酸組成も、分離された酵母蛋白質
から測定されたそれとよく一致する。ヌクレオチド配列
からカルボキシ末端がバリンであることが予想され、こ
れは酵母ピルベートキナーゼについて見出されている。
【００２７】例６．ピルベートキナーゼプロモーター領
域を用いる酵母発現プラスミドの構成 ２つの異なる構成ｐＨＢＳ１６ＰｙＫ及びｐＨＢＳ５６
ＰｙＫを調製した。方法の概略を図５に示す。
域を用いる酵母発現プラスミドの構成 ２つの異なる構成ｐＨＢＳ１６ＰｙＫ及びｐＨＢＳ５６
ＰｙＫを調製した。方法の概略を図５に示す。
【００２８】ｐＢＲ３２２中にクローニングされた酵母
ＰｙＫ遺伝子を含有するプラスミドｐＰｙＫ９，１．１
を、ｘｂａＩにより消化し、そして突出した末端をＤＮ
ＡポリメラーゼＩを用いてデオキシヌクレオチドにより
満たした。この生成物をＢａｍＨＩで消化することによ
り、ＰｙＫプロモーター及びＰｙＫコード領域からの８
塩基を含有する２１２ｂｐのＢａｍＨＩ−平滑末端断片
を最終的に分離した。この断片を、あらかじめＮｃｏＩ
で消化しＤＮＡポリメラーゼを用いて満たしそしてＢａ
ｍＨＩで消化したプラスミドｐＨＢＳ−６〔ｐＢＲ３２
２中でクローニングされたＨＢｓＡｇ遺伝子（５′非コ
ード領域が除去されている）を含有する〕に連結した。
Ｅ．コリを形質転換した後、ｐＨＢＳ−６ｐｙＫを分離
した。このプラスミドは、ＨＢｓＡｇコード配列と同位
相で融合した３個の余分のアミノ酸をコードするコドン
ＡＴＧＴＣＴＡＧ ＣＡＴＧと共にＰｙＫプロモーター
を含有する。ｐＨＢＳ−６ＰｙＫをＢａｍＨＩを用いて
完全消化し、そしてＥｃｏＲＩにより部分消化すること
によりＨＢｓＡｇ遺伝子に融合したＰｙＫプロモーター
を含有する１７５０ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片
を分離した。この１７５０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩによりｐＨＢＳ−１６〔ＡＴＣＣ Ｎｏ．
４００４３、酵母中のアデノウイルスプロモーター（Ａ
ｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｙｅａ
ｓｔ）と題して１９８２年１１月１８日に出願された米
国特許出願Ｎｏ．４４２，６８７に記裁されているプラ
スミド（引用によりこの明細書に組入れる）〕を消化し
た後に得られた大断片に連結し、そしてこれを用いて
Ｅ．コリを形質転換した。酵母発現プラスミドｐＨＢＳ
−１６ＰｙＫを得た。ｐＨＢＳ−１６ＰｙＫを、Ｓｐｈ
Ｉ及びＸｂａＩで完全消化し、そして１２００ｂｐ Ｓ
ｐｈＩ−ＸｂａＩ断片（ｐＢＲ３２２の２００ｂｐ，Ｐ
ｙＫプロモーター及びＨＢｓＡｇ遺伝子の５′領域の１
００ｂｐを含有する）を分離した。この１２００ｂｐ
ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片を、ＨＢｓＡｇ遺伝子の３′末
端及びＡＤＨ−１ターミネーターを含有する１０７０ｂ
ｐ ＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片（ｐＨＢＳ−５６から分
離）に連結した。ＳｐｈＩで消化した後、ＰｙＫプロモ
ーター、ＨＢｓＡｇ遺伝子及びＡＤＨ−１ターミネータ
ーを含有するＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ ２３００ｂｐ断片
（カセット）を分離した。このカセット断片を、Ｓｐｈ
Ｉによりあらかじめ消化したｐＨＢＳ−５６中にクロー
ニングした。酵母発現プラスミドｐＨＢＳ−５６ＰｙＫ
を得た。このプラスミドを用いて酵母ＡＢ１０２株（例
２を参照）又は２１５０−２−３株（例２を参照）を形
質転換した。
ＰｙＫ遺伝子を含有するプラスミドｐＰｙＫ９，１．１
を、ｘｂａＩにより消化し、そして突出した末端をＤＮ
ＡポリメラーゼＩを用いてデオキシヌクレオチドにより
満たした。この生成物をＢａｍＨＩで消化することによ
り、ＰｙＫプロモーター及びＰｙＫコード領域からの８
塩基を含有する２１２ｂｐのＢａｍＨＩ−平滑末端断片
を最終的に分離した。この断片を、あらかじめＮｃｏＩ
で消化しＤＮＡポリメラーゼを用いて満たしそしてＢａ
ｍＨＩで消化したプラスミドｐＨＢＳ−６〔ｐＢＲ３２
２中でクローニングされたＨＢｓＡｇ遺伝子（５′非コ
ード領域が除去されている）を含有する〕に連結した。
Ｅ．コリを形質転換した後、ｐＨＢＳ−６ｐｙＫを分離
した。このプラスミドは、ＨＢｓＡｇコード配列と同位
相で融合した３個の余分のアミノ酸をコードするコドン
ＡＴＧＴＣＴＡＧ ＣＡＴＧと共にＰｙＫプロモーター
を含有する。ｐＨＢＳ−６ＰｙＫをＢａｍＨＩを用いて
完全消化し、そしてＥｃｏＲＩにより部分消化すること
によりＨＢｓＡｇ遺伝子に融合したＰｙＫプロモーター
を含有する１７５０ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片
を分離した。この１７５０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩによりｐＨＢＳ−１６〔ＡＴＣＣ Ｎｏ．
４００４３、酵母中のアデノウイルスプロモーター（Ａ
ｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｙｅａ
ｓｔ）と題して１９８２年１１月１８日に出願された米
国特許出願Ｎｏ．４４２，６８７に記裁されているプラ
スミド（引用によりこの明細書に組入れる）〕を消化し
た後に得られた大断片に連結し、そしてこれを用いて
Ｅ．コリを形質転換した。酵母発現プラスミドｐＨＢＳ
−１６ＰｙＫを得た。ｐＨＢＳ−１６ＰｙＫを、Ｓｐｈ
Ｉ及びＸｂａＩで完全消化し、そして１２００ｂｐ Ｓ
ｐｈＩ−ＸｂａＩ断片（ｐＢＲ３２２の２００ｂｐ，Ｐ
ｙＫプロモーター及びＨＢｓＡｇ遺伝子の５′領域の１
００ｂｐを含有する）を分離した。この１２００ｂｐ
ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片を、ＨＢｓＡｇ遺伝子の３′末
端及びＡＤＨ−１ターミネーターを含有する１０７０ｂ
ｐ ＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片（ｐＨＢＳ−５６から分
離）に連結した。ＳｐｈＩで消化した後、ＰｙＫプロモ
ーター、ＨＢｓＡｇ遺伝子及びＡＤＨ−１ターミネータ
ーを含有するＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ ２３００ｂｐ断片
（カセット）を分離した。このカセット断片を、Ｓｐｈ
Ｉによりあらかじめ消化したｐＨＢＳ−５６中にクロー
ニングした。酵母発現プラスミドｐＨＢＳ−５６ＰｙＫ
を得た。このプラスミドを用いて酵母ＡＢ１０２株（例
２を参照）又は２１５０−２−３株（例２を参照）を形
質転換した。
【００２９】例７．酵母中ＰｙＫプロモーターの制御下
でのＨＢｓＡｇの合成 プラスミドｐＨＢＳ−５６ＰｙＫを含有するＡＢ１０２
株の培養物１００ｍｌを６５０ｎｍにおいて光学濃度が
１〜２になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共に攪
拌し、そして細胞片を遠心分離によって除去することに
より無細胞溶解物を得た。アボット・アウスリアＩＩ、
ラジオイムノアッセイによりＨＢｓＡｇを測定し、そし
てクーマシーブルー結合法により蛋白質濃度を測定し
た。結果を第２表に示す。
でのＨＢｓＡｇの合成 プラスミドｐＨＢＳ−５６ＰｙＫを含有するＡＢ１０２
株の培養物１００ｍｌを６５０ｎｍにおいて光学濃度が
１〜２になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共に攪
拌し、そして細胞片を遠心分離によって除去することに
より無細胞溶解物を得た。アボット・アウスリアＩＩ、
ラジオイムノアッセイによりＨＢｓＡｇを測定し、そし
てクーマシーブルー結合法により蛋白質濃度を測定し
た。結果を第２表に示す。
【００３０】
【００３１】酵母ＡＢ１０２株の代りに酵母２１５０−
２−３株を用い、例７の方法を反復することにより同様
の結果が得られた。この発明を特定の具体例と関係させ
て記載したが、この発明の範囲内において、他の種々の
変法や応用を行うことができよう。
２−３株を用い、例７の方法を反復することにより同様
の結果が得られた。この発明を特定の具体例と関係させ
て記載したが、この発明の範囲内において、他の種々の
変法や応用を行うことができよう。
【図１】ＧＡＰＤＨプロモーター断片の分離及び連結を
示す。
示す。
【図２】ＧＡＰＤＨプロモーターのＤＮＡ配列を示す。
【図３】ＧＡＰＤＨプロモーターを含有する酵母発現プ
ラスミドの構成を示す。
ラスミドの構成を示す。
【図４】ピルベートキナーゼ（ＰｙＫ）遺伝子のヌクレ
オチド配列を示す。
オチド配列を示す。
【図５】ＰｙＫプロモーター領域を含有する酵母発現プ
ラスミドの構成を示す。
ラスミドの構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 スティーブン ローゼンベルグ アメリカ合衆国，カリフォルニア，オーク ランド，フルートベイル アベニュ 3861 (72)発明者 パブロ ディー．ティー．バレンツェラ アメリカ合衆国，カリフォルニア，サンフ ランシスコ，アッパー テラス ナンバー ３ 455
Claims (6)
- 【請求項１】 （ａ）コードセグメントを酵母発現ベク
ターに挿入し、このベクターが酵母グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの５′末端からの
コドンを実質上含有しない酵母グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター由来のＤ
ＮＡセグメントを含んで成り、前記プロモーターが挿入
されたＤＮＡコードセグメントの５′末端に隣接しそし
て該プロモーター内で開始される転写が前記コードセグ
メントを包含するように方向付けられており、このよう
にしてコードセグメント発現ベクターを得る段階、及
び、 （ｂ）このコードセグメント発現ベクターにより酵母細
胞を形質転換する段階を含んで成る、酵母中でＤＮＡコ
ードセグメントを発現する方法。 - 【請求項２】 前記酵母発現ベクターが、挿入されたＤ
ＮＡコードセグメントの３′末端に連結されたターミネ
ーターをさらに含んで成る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記酵母発現ベクターが細菌細胞複製開
始点をさらに含んで成り、そして細菌細胞中で複製する
ことができる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記ターミネーターが酵母アルコールデ
ヒドロゲナーゼＩターミネーターから成る請求項３記載
の方法。 - 【請求項５】 前記ターミネーターが酵母ＧＡＰＤＨタ
ーミネーターから成る請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 前記ターミネーターが酵母ＰｙＫターミ
ネーターである請求項３記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46858983A | 1983-02-22 | 1983-02-22 | |
| US468589 | 1983-02-22 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59026172A Division JPS59210888A (ja) | 1983-02-22 | 1984-02-16 | 酵母発現ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268984A true JPH05268984A (ja) | 1993-10-19 |
| JPH0724594B2 JPH0724594B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=23860419
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59026172A Granted JPS59210888A (ja) | 1983-02-22 | 1984-02-16 | 酵母発現ベクター |
| JP4200091A Expired - Lifetime JPH0724594B2 (ja) | 1983-02-22 | 1992-06-17 | 酵母発現ベクターの発現方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59026172A Granted JPS59210888A (ja) | 1983-02-22 | 1984-02-16 | 酵母発現ベクター |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP0329203B1 (ja) |
| JP (2) | JPS59210888A (ja) |
| AT (3) | ATE93894T1 (ja) |
| CA (2) | CA1341302C (ja) |
| DE (3) | DE3486431T3 (ja) |
| DK (1) | DK173604B1 (ja) |
| SG (1) | SG48422A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
| JPS5936699A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | シヤトルベクタ− |
| US5422267A (en) * | 1984-05-22 | 1995-06-06 | Robert R. Yocum | Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene |
| EP0173997A1 (en) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines and their preparation |
| DE3587307T2 (de) * | 1984-12-06 | 1993-09-02 | Fina Research | Transformierte hefen die lysozym produzieren, fuer diese transformation zu verwendende plasmide und deren verwendung. |
| EP0211767B1 (en) * | 1985-08-05 | 1991-03-06 | Merck & Co. Inc. | Method for increasing recombinant protein production in yeast species of the genus saccharomyces |
| JPH0655155B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1994-07-27 | 株式会社ミドリ十字 | 蛋白質の製造方法 |
| ES2028779T3 (es) * | 1985-10-03 | 1992-07-16 | Green Cross Corporation | Promotor de levadura y procedimiento para preparar proteina heterologa. |
| DK162900C (da) * | 1985-10-24 | 1992-05-11 | Danisco | Fremgangsmaade til ekspression af gener i gaer samt dna-fragment, rekombineret dna-segment og plasmider, hvor disse indgaar til brug ved udoevelse af fremgangsmaaden |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| JPS62236496A (ja) * | 1986-04-07 | 1987-10-16 | Green Cross Corp:The | ＨＢｓＡｇの製造方法 |
| US4839283A (en) * | 1986-12-30 | 1989-06-13 | Zymogenetics, Inc. | Method of expressing alpha-1-antitrypsin in yeast |
| EP0299242A3 (en) * | 1987-06-22 | 1989-01-25 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
| CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
| AU644619B2 (en) | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
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| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| JPH08510240A (ja) | 1993-05-12 | 1996-10-29 | カイロン コーポレイション | Ｃ型肝炎ウイルスｅ２／ｎｓ１領域の保存モチーフ |
| US5629167A (en) | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
| JPH08173170A (ja) * | 1994-05-25 | 1996-07-09 | Kirin Brewery Co Ltd | キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現 |
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