DK174053B1 - Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer - Google Patents

Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer Download PDF

Info

Publication number
DK174053B1
DK174053B1 DK198802053A DK205388A DK174053B1 DK 174053 B1 DK174053 B1 DK 174053B1 DK 198802053 A DK198802053 A DK 198802053A DK 205388 A DK205388 A DK 205388A DK 174053 B1 DK174053 B1 DK 174053B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
star
explosion
dendrimer
star explosion
conjugate
Prior art date
Application number
DK198802053A
Other languages
English (en)
Other versions
DK205388D0 (da
DK205388A (da
Inventor
Michael J Fazio
David M Hedstrand
Donald A Tomalia
Roberta C Cheng
Donald A Kaplan
Ian A Tomlinson
William J Kruper
Original Assignee
Dow Chemical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25407923&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK174053(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dow Chemical Co filed Critical Dow Chemical Co
Publication of DK205388D0 publication Critical patent/DK205388D0/da
Publication of DK205388A publication Critical patent/DK205388A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK174053B1 publication Critical patent/DK174053B1/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A61K47/6885—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy the conjugate or the polymer being a starburst, a dendrimer, a cascade
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/005—Dendritic macromolecules

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Disinfection, Sterilisation Or Deodorisation Of Air (AREA)

Description

i DK 174053 B1
Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af tætte stjernepolymerer som bærere for farmaceutiske materialer. I de senere år er polymerer, der omtales som tætte stjernepolymerer eller stjerneeksplosionspolymerer, blevet udviklet. Det har 5 vist sig, at størrelsen, faconen og egenskaberne hos disse tætte stjernepolymerer eller stjerneeksplosionspolymerer molekylært kan skræddersys til at kunne benyttes til specialiserede slutanvendelser. Stjerneeksplosionspolymerer har signifikante fordele, som kan tilvejebringe et middel til tilførsel af høje 10 koncentrationer af båret materiale pr. polymerenhed, styret afgivelse, målrettet afgivelse og/eller flere arter af afgivelse eller anvendelse.
I sit bredeste aspekt angår den foreliggende opfindelse poly-15 merkonjugatmaterialer omfattende tætte stjernepolymerer eller stjerneeksplosionspolymerer i forbindelse med ønskede materialer {i det følgende vil disse po1 ymerkonjugater hyppigt blive omtalt som "stjerneeksplosionskonjugater" eller "konjugater"), fremgangsmåder til fremstilling af disse konjugater, en fremgangsmåde til 20 fremstilling af en stjemeeksplosionspolyethylenimin og en fremgangsmåde til rensning af.en stjerneeksplosionsdendrimer.
Konjugaterne ifølge opfindelsen er egnede til brug inden for en række forskellige anvendelser, hvor specifik afgivelse ønskes, 25 og de er særlig egnede til afgivelse af biologisk aktive stoffer. I en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse består stjerneeksplosionskonjugaterne af en eller flere stjerneeksplosionspolymerer i forbindelse med et eller flere bioaktive stoffer.
30
Stjerneeksplosionskonjugaterne frembyder signifikante fordele i forhold til andre hidtil kendte bærere som følge af stjerne-ekseplosionspolymerernes fordelagtige egenskaber. Stjerneeksplosionspolymerer udviser en molekylær opbygning, der er ka-35 rakteriseret ved regelmæssig dendritisk forgrening med radial symmetri. Disse radialt symmetriske molekyler omtales som havende "stjerneeksplosionstopologi". Disse polymerer fremstilles på en måde, som kan tilvejebringe koncentriske dendritiske 2 DK 174053 B1 lag eller rækker rundt om en initiatorkerne. Stjerneeksplosionstopologien opnås ved hjælp af den ordnede samling af organiske gentagelsesenheder i koncentriske, dendritiske lag eller rækker rundt om en initiatorkerne. Dette opnås ved ind-5 føring af mangfoldighed og selvgentagelse (inden for hvert lag eller række) på en geometrisk gradvis måde gennem et antal molekylære generationer. De resulterende høj funkt ional i serede molekyler har været kaldt "dendri merer" med henvisning til deres forgrenede (træ-1ignende) struktur samt deres oligomere 30 natur. Udtrykkene stjerneeksplosionsoligomer og stjerneeksplo-sionsdendrimer er således indeholdt i udtrykket stjerneeksplo-s i onspolymer. Topologiske polymerer, med størrelses- og faconstyrede områder, er dendrimerer, som er covalent broforbundet via deres reaktive terminale grupper, der omtales som stjerne-15 eksp1 osions-"broforbundne dendrimerer". Udtrykket broforbun det dendrimer er også indeholdt i udtrykket "stjerneeksplosionspolymer" .
Den følgende beskrivelse af tegningens figurer hjælper til 20 forståelse af den foreliggende opfindelse.
Fig. 1 viser forskellige generationer af stjerneeksplosions-dendr i merer.
25 Fig. 2A viser en dendrimer med usymmetriske (uens) grenforbinde 1 ser.
Fig. 2B viser en dendrimer med symmetriske (ens) grenforbinde 1 ser .
30
Fig. 3 viser dendrimerstørrelser i forhold til antistofdimen-s ioner.
Fig. 4 viser carbon- 13-rotationsgitter-relaksations tider (T^) 35 for aspirin, der er i nkorporeret i forskellige dendrimergene-rationer (eksempel 1).
Fig. 5 viser resultaterne af den dynamiske analyse af eksempel 2.
3 DK 174053 B1
Fig. 6 viser indflydelsen af generation 6,5 dendrimer på dialysehastigheden af pseudoephedrin ved pH 9,5 fra eksempel 2.
Fig. 7 viser virkningen af dendrimerhyd rolyse på permeabili-5 teten af pseudoephedrin ifølge eksempel 3.
Eksempel 8 viser sammenligning af procent salicylsyre, der er frigjort i receptorrummet i nærværelse af stjerneeksplosionspolymer (generation = 4,0) ved pH 5,0 og 6,65, med salicylsy-10 rekontrol, eksempel 4.
Fig. 9 viser sammenligning af procent salicylsyre, der er mistet fra donorrummet, med stjerneeksplosionspolymer (generation = 4,0) i receptorrummet ved pH 8,0, med salicylsyreindhold, 15 eksempel 4.
Fig. 10 viser sammenligning af procent salicylsyre, der er mistet fra donorrummet i nærværelse af stjerneeksplosionspol ymer (generation = 4,5), med salicylsyrekontrol, eksempel 4.
20
Stjerneeksp1 os ionspo1 ymererne er illustreret i fig. 1, hvori I betegner en in i tiatorkerne (i denne fig. er en trifunktio-nel initiatorkerne vist ved hjælp af tegningen længst til venstre), Z betegner en term i nal gruppe, der første gang er vist 25 ved hjælp af den anden tegning fra venstre, omtalt som en stjerneforgrenet oligomer, A, B, C, D og E betegner særlige molekylære generationer af stjerneeksplosionsdendrimerer, og (A)n, (B)n, (C)n, (D)n 09 (E)n betegner broforbundne stjerne- eksplosionsdendrimerer.
30
Stjerneeksplosiondendrimererne er enkeltmolekylære aggregater, der har tre fremtrædende arkitektoniske træk, nemlig (a) en initiatorkerne, (b) indre lag (generationer, 6) sammensat af gentagelsesenheder, der radialt er knyttet til initiatorker-35 nen, og (c) en ydre overflade af terminal funktional itet (dvs.
terminale funktionelle grupper), der er knyttet til den yderste generation. Størrelsen og faconen af stjerneeksplosions-dendrimermolekylet og de funktionelle grupper, der findes i 4 DK 174053 B1 dendrimermolekylet, kan styres ved valg af initiatorkernen, antallet af generationer (dvs. lag eller rækker), der benyttes til frembringelse af dendrimeren, og valget af de gentagelsesenheder, der benyttes til hver generation. Eftersom dendrime-5 rerne let kan isoleres ved enhver særlig generation, tilvejebringes et middel til opnåelse af dendrimerer med ønskede egenskaber.
Valget af stjerneeksplos ionsdendr i merkomponenterne påvirker 10 dendrimerernes egenskaber. Typen af initiatorkerne kan påvirke dendrimerfaconen, idet der f.eks. frembringes (afhængigt af valget af initiatorkerne ) sfæroidformede dendrimerer, cylindriske eller stangformede dendrimerer, el 1 ipsoidformede dendrimerer eller svampeformede dendrimerer. Rækkevis opbygning 15 af generationer (dvs. generationsantal og størrelsen og naturen af gentagel sesegenhederne) bestemmer dendrimerernes dimensioner og naturen af deres indre.
Som følge af at stjerneeksplosionsdendrimerer er forgrenede 20 polymerer indeholdende dendritiske grene med funktionelle grupper fordelt på grenenes periferi, kan de fremstilles med en række forskellige egenskaber. F.eks. kan de i fig. 2A afbildede makromoleky1 er og stjerneeksp1 os ionsdendrimererne, såsem de i fig. 2S sfbxldødc, 11 dvc ucsxsmtc som 25 følge af grenlængden. Den i fig. 2A viste dendrimertype (såsom Denkwalter, US patentskrift nr. 4.289.872) har usymmetriske (uens segment) grenforbindelser, ydre (dvs. overflade-) grupper (repræsenteret ved Z1), indre molekyldele (repræsenteret ved Z), men meget mindre indre hulrum. Den i fig. 2B viste fo-30 retrukne dendrimertype har symmetriske (ens segment) grenfor bindelser med overfladegrupper (repræsenteret ved Z'), to forskellige indre molekyldele (repræsenteret ved henholdsvis X og Z) med indre hulrum, som varierer som funktion af generationen (G). Dendrimererne, såsom de i fig. 2B afbildede, kan gennem 35 tilstrækkeligt mange generationer nå frem til fuldstændig at omslutte og indeholde hulrum til opnåelse af en enhed med et overvejende hult indre og en meget stor overf 1adetæthed. Når stjerneeksplosionsdendrimerer er kommet gennem tilstrækkelig 5 DK 174053 B1 mange generationer, udviser de også "stjerneeksp 1 os i ons tæt pakning", hvor dendrimeroverfladen indeholder tilstrækkelig mange terminale molekyldele, så at dendrimeroverf1aden bliver tæt og omslutter hulrum inden i dendrimerens indre. Denne tæt-5 hed kan frembringe en molekylær niveaubarriere, som kan anvendes til styring af diffusion af materialer ind i eller ud af dendrimerens indre.
Dendrimerernes overfladekemi kan styres på en forudbestemt 10 måde ved udvælgelse af en gentagelsesenhed, som indeholder den ønskede kemiske funktionalitet, eller ved kemisk modifikation af alle eller en del af overf1adefunktiona1 i teterne til frembringelse af nye overf 1adefunktionaliteter. Disse overflader kan enten være målrettet mod specifikke steder eller bragt til 15 at modstå optagelse af bestemte organer eller celler, f.eks. ved hjælp af reticu1oendothelia1e celler.
I en alternativ anvendelse af stjerneeksplosionsdendrimererne kan dendrimererne sammenknyttes med sig selv til frembringel-20 se af polydendriti ske molekyldele (stjerneeksplosions-"brofor-bundne dendrimerer"), som også er egnede som bærere.
Endvidere kan dendrimererne fremstilles således, at de får afvigelser fra ensartet forgrening i særlige generationer, hvor-25 ved der således tilvejebringes et middel til at tilføre den- drimeren diskontinuiteter (dvs. afvigelser fra ensartet forgrening på bestemte steder inden i dendrimeren) samt forskel-1 ige egenskaber.
30 De i stjerneeksplosionskonjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse benyttede stjerneeksplosionspolymerer kan fremstilles i overensstemmelse med i og for sig kendte metoder, f.eks. som omhandlet i US patentskrift nr.. 4.587.329.
35 Dendrimerer kan fremstilles med meget ensartet størrelse og facon og mest vigtigt muliggøre et stort antal funktionelle grupper pr. overfladearealenhed på dendrimeren, og de kan have et stort antal funktionelle grupper pr. molekylær volumenenhed 6 DK 174053 B1 sammenlignet med andre polymerer, der har den samme molekylvægt, samme kerne og monomer komponenter og samme antal kerneforgreninger som stjerneeksplosionspolymererne. De tætte stjerneeksplosionpolymerers forøgede tæthed af funktionelle 5 grupper kan muliggøre, at en større mater i alemængde kan bæres pr. dendrimer. Eftersom antallet af funktionelle grupper på dendrimereme kan styres på overfladen og inden i det indre, tilvejebringes der også et middel til styring af mængden af bioaktivt stof, der kan afgives pr. dendrimer. I en særlig fo-10 retrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse er stjerneeksplosionspolymererne, især stjerneeksplosionsdendri-mererne, målrettede bærere for bioaktive stoffer, der er i stand til at afgive de bioaktive stoffer til en bestemt målorganisme eller til en bestemt determinant eller et bestemt 15 sted i en målorganisme.
Der kan anlægges en analogi mellem stjerneeksplosionsdendrime-rer af tidlig generation {dvs. generation = 1-7) og klassiske sfæriske miceller. Analogien dendrimer - miceller blev udledt 20 ved sammenligning af træk, som de havde til fælles, såsom facon, størrelse og overflade.
Tabel I
Parameter Regulære klassiske Stjerneeksplosi- 2 5 _ micel ler_ onsdendr i merer facon sfærisk sfærisk
størrelse 20-50A 17-67A
(d i ameter) overfladeaggre- 4-202 Z=6-192 (Z er an- gationstal tallet af overfla- 30 grupper)(generati on = 2-7) areal/overf1ade- 130-80Å2 127-75A2 gruppe (A2) (1A = 10"1 nm; 1A2 = 10"2 nm2) 3 5 I tabel I blev faconen verificeret ved hjælp af scanning transmission electron micrographs (STEM)-mikroskopi og målinger af egenviskositet (n). Størrelsen blev verificeret ved må- 7 DK 174053 B1 linger af egenviskositet (η) og størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC). Overf ladeaggregat ionstallene blev verificeret ved hjælp af titrimetri og højfelt-NMR. Areal/overfladegruppe blev beregnet ud fra SEC-hydrodynamiske målinger.
5
De første fem generationer af stjerneeksplosionspolyamidoamin ( PAMAM)-dendri me rer er mi kroområder , som meget tæt efterligner klassiske sfæriske miceller i næsten enhver henseende (dvs. facon, størrelse, antal overfladegrupper samt areal/ 10 overflade-grupper). En stor forskel består imidlertid i, at de er covalent fastgjort og robuste sammenlignet med den dynamiske ækvi1 ibrerende natur af miceller. Denne forskel er en signifikant fordel ved anvendelse af disse mikroområder som indkapslingsinstrumenter.
15
Efterhånden som yderligere koncentriske generationer tilføjes udover fem, finder en sammentrængning af overfladen sted. Denne sammentrængning kan føre til forøgede barriereegenskaber ved overfladen og manifesterer sig som et mindre overfladeare-20 al pr. hoved (overf1ade)-gruppe som vist i tabel II.
25 30 35 8 DK 174053 B1
CM
σι -« -t -<
C*- CO o CM <0 I
t— CO CO Tt CM I
CO O CM ~ I
ΙΟ τί . CO CD
<71 C- C- CO L
rH ro 4) σ>
CM C
Ti CM -et !“ tr- to *« m I *— cm ·< co c- c- i *ro
Ti CM CD *-< xt » I E
eo co · c— · t-
co c— CO <U
CO rH .V
tf) CM -I- i-i Tt Tt I M-
Tf co CM CO 1 (5
N IC) ·< (31 < - I L
c— σι c— o co σι cn
T-Η co to · t- O
τί Tf v T-l <0 ε o CO CM £-
tO «I CM -t I
to to t* O «* <0 I tfl C to (J) ' CO CM CM ' ! 0)» O v—i cn co cn o tf) l
•1- CM · «-« i— <U
4j CO 41 TJ
itl t, L ^ <0 41 3 T3
C <71 ·« CM 1 r— C
Cl s—t O ·"* CM 1 CJtO
σι 00 to Ti Ti Tt LO 1 TS·*-» LO Ti CM Ti - 3 1/1 trt o o o t-ι ι/i ~o 3 ι-T LO r-1 ri CO Φ ··”
1/1 ««£ l/l X
et L O f— O
n Cl - O C
> CM CM Tt t— C- Cl r- et st tO CM S- — O 2Z. CO CD ' <1 Q > n Rj C- Tt i-< CM CM · V Γ <0 L tJ *i Tf t~i O t—i i—i i-ι tf) +^ (-+-> CM r-t ro CO »-< u
C_ lf> M- >« CO
0 co <o — ε
E -t O C
•r- CM CM *< C71 O- (X
L 1—I ·< Mt ΜΪ C- P— CO
T3 CM *“< CM CM t- T f- W — I
C CO ι-l Ti CM 1-1 CM CM CO ‘I-ICMO
Cl CM ti) t-( ri C“ O O ri Ό i i-< · *
1 Tf -O rH II
Σ 01
< CO > « CO
Σ —I ·« < Tt CM CM Tt CM +-» TI C «-Ι
Cl U) CO ·< < CO - E Σ|Σ CM <D t— - CO ΓΗ » O O '—'
CO LO CO CO CM t- +JCM
1-1 C— Γ-1 *-< Tf tf) 41 E
. 01 «Λ C
i-ι n L
4) CM
Tt CM CM Tt (O 11 H I
LO Ti Tt Tt Tf Tt I_ t/1 O
r-tCOC-» ID CM » tO +-1-1- i—< cm o to cm cm - αΐΌ
H CO H ι-i I—I E O II
t—i CO C
CO ·>- O CM
Ό E tl
H
i 0) T)
41 IC O
Ό 1— I— E cn E C
CO CO t- CO 41 -r- E
Li- OlOlttlllr- E +> 01 M- +-> LE LQ. i— <0 41 ι-l
CLfMDl CO -i- (0 Q. 41 CLI
oai w * o 4) L 0)3 E t- >0)0 •r- > * > L UJ XI n T3 L 41 *O C— T-+ +j o l i— 4i(/) ro c ro o tj a. o xi
to 4) >+-> I— 411—1 CO, E t_-i- II
Li- Ol -V 4) - M- TJ S- NI <0 3 3 Ό I-
«1(00.01 E-H L L 4+ L L >(0K
c +-> 3 i— ro i- tu - «i· cn oi — r i «-* 01CL O -I- M0 > L >L *+- I 3 otooi e ό E oa oa <o ni jc * 9 DK 174053 B1
For eksempel har am i nterm i nerede generationer 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 og 9,0 formindskede overf 1adearealer på henholdsvis 104, 92, 73, 47 og 32A2 pr. Z-gruppe. Denne egenskab svarer til en overgang fra en mindre sammentrængt micellelignende overflade 5 til en mere sammentrængt bi-lag/monolag-barrierelignende overflade, der normalt er forbundet med vesikler (liposomer) eller membraner af Langmuir-Blodgett-typen.
Hvis denne overfladesammentrængning finder sted, skulle æn-10 dringen i fysiske egenskaber og morfologi blive iagttaget, efterhånden som generationerne steg fra mellemgenerationen (6-8) til de mere fremrykkede generationer (9 eller 10). Scanning transmission electron mikrograferne (STEM) for generationerne = 7,0, 8,0 og 9,0 blev opnået efter fjernelse af metha-15 nolopløsningsmidlet fra hver af prøverne til opnåelse af farveløse, lysegule faste film samt farvning med osmiurntetraoxid.
Den forudsagte morfologiske ændring fandt sted på trinnet generation G = 9,0. Mikroområderne ved generation = 9,0 måler ca. 33 A i diameter og er omgivet af en farveløs rand, der er 20 ca. 2 5 A tyk. Tilsyneladende er methanolisk opløsningsmiddel blevet indesluttet indenfor den 25A ydre membranlignende barriere til opnåelse af det mørkt farvede indre. Ved generation = 9,0 opfører stjerneeksplosions-PAMAM'en sig således topologisk som en vesikel (liposom). Denne stjerneeksplosionspolymer 25 er imidlertid af en mindre størrelsesorden og meget monodis-pers sammenlignet med en liposom. De omhandlede dendrimerer kan følgelig anvendes til molekylær indkapsling af opløsningsmiddelfyldte hulrum på så meget som ca. 33A i diameter (volumen ca. 18.000A3) eller mere. Disse prototyper af micellestør-30 relse viser sig at opføre sig ligesom en covalent fastgjort liposom på dette fremrykkede generationstrin. Denne opførsel gør disse prototyper i stand til at fungere som lægemiddelafgivende stoffer eller som bærere for ikke-chelaterende radio-nuklider i stjerneeksplosions-anti stofkonjugater til behand-35 ling af forskellige pattedyrsygdomme.
Dendrimerer, der er egnede til anvendelse i konjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse, indbefatter de tætte stjerne 10 DK 174053 B1 polymerer eller stjerneeksplosionspolymerer, der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.507.466, nr. 4.558.120, nr. 4.568.
737 og nr. 4.587.329.
5 Den foreliggende opfindelse angår især et stjerneeksplosions- konjugat, som omfatter mindst én stjerneeksplosionspolymer knyttet til mindst ét båret farmaceutisk materiale. Stjerne-eksplosionskonjugater liggende inden for den foreliggende opfindelses rammer indbefatter sådanne repræsenteret ved form-10 len: (P)x * (M)y (I) hvori hvert P betegner en dendrimer, x betegner et helt tal, 15 der er 1 eller større end 1, hvert M betegner en enhed (f.eks. et molekyle, atom, ion og/eller en anden grundenhed) af et båret farmaceutisk materiale, idet nævnte bårede farmaceutiske materiale kan være det samme bårede materiale eller et forskelligt båret farmaceutisk materiale, idet det bårede farma-20 ceutiske materiale fortrinsvis er et bioaktivt stof, y repræsenterer et helt tal, der er 1 eller større end 1, og * angiver, at det bårede farmaceutiske materiale er forbundet med dendr i meren.
25 Foretrukne stjerneeksplos ionskonjugater med formlen (I) er sådanne, hvori M-er et læaenn d^ei, et radionuklid, en chelatdan- ner > et chelateret metal, et toxin, et antistof, et . antistof fragment., et antigen, en signaldanner, en signalreflektor eller en signalabsorber, idet sådanne foretrækkes, hvori x = 1, og y = 2 eller mere.
30
Indbefattet er endvidere stjerneeksplosionskonjugater med formlen (I), hvori stjerneeksplosionsdendrimererne er covalent sammenknyttede, stjerneeksplosionsbroforbundne dendrimerer, eventuelt via forbindelsesgrupper, så at der dannes polyden-35 dritiske aggregater (dvs., hvor x > 1). Anvendelser af disse stjerneeksplosionsbroforbundne dendrimerer indbefatter topisk styrede frigørelsesmidler, strålingssynovektomi og andre.
11 DK 174053 B1
Som heri benyttet betyder "forbundet med", at det eller de hårede materialer kan indkapsles eller indesluttes i dendrime-rens kerne, dispergeres helt eller delvis gennem dendrimeren eller knyttes eller bindes til dendrimeren, eller enhver kom-5 bination deraf. Forbindelsen mellem det eller de bårede materialer og dendrimeren eller dendrimererne kan eventuelt benytte forbindelsesled og/eller afstandsstykker til at lette fremstillingen eller anvendelsen af stjerneeksplosionskonjugater. Egnede forbindelsesgrupper er grupper, der knytter en målret-10 fer (dvs. T) til dendrimeren (dvs. P) uden signifikant at forringe målretterens effektivitet eller effektiviteten af noget andet båret materiale eller nogle andre bårede materialer (dvs. M), der findes i stjerneeksplos ionskonjugatet. Disse forbindelsesgrupper kan være fraspaltelige eller ikke-fraspal-15 telige og anvendes typisk til at undgå sterisk hindring mellem mål-retteren og dendrimeren, idet forbindelsesgrupperne fortrinsvis er stabile (dvs. ikke-fraspaltelige). Eftersom stjerneeksplosionsdendrimerernes størrelse, facon og funktionelle gruppetæthed kan styres strengt, er der mange måder, 20 hvorpå det bårede materiale kan knyttes til dendrimeren.
F.eks. (a) kan der være forbindelser af covalent, coulomb i sk, hydrofob eller chelateringstype mellem det eller de bårede materialer og enheder eller entiteter, typisk funktionelle grupper, der befinder sig ved eller nær ved dendrimerens overfla-25 de, (b) kan der være forbindelse af covalent, coulombisk, hydrofob eller che1 ater ingstype mellem det eller de bårede materialer og molekyldele, der befinder sig inden i dendrimerens indre, (c) kan dendrimeren være fremstillet til at have et indre, der er overvejende hult og således muliggør fysisk 30 indeslutning af de bårede materialer inden i det indre (hul rum), hvorved frigørelsen af det bårede materiale eventuelt kan styres ved sammentrængning af dendrimerens overflade med diffusionsstyrende molekyldele, eller (d) kan forskellige kombinationer af de ovenfor nævnte fænomener anvendes.
Dendrimerer, her repræsenteret ved "P", indbefatter de tætte stjernepolymerer, der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.507.465, nr. 4.558.120, nr. 4.568.737 eller nr. 4.587.329.
35 12 DK 174053 B1 Bårede farmaceutiske materialer, heri betegnet ved "M", som er egnede til anvendelse i stjerneeksplosionskonjugaterne, indbefatter hvilke som helst materialer til in vivo eller in vitro anvendelse til diagnostisk eller terapeutisk behandling, der 5 kan forbindes med den tætte stjernedendrimer uden i mærkbar grad at forstyrre dendrimerens fysiske integritet, f.eks. lægemidler som antibiotika, analgetika, hypertensive midler, cardiotoni ske midler og lignende, såsom acetaminaphen, acyclovir, alkeran, amikacin, ampicillin, aspirin, bisantren, bleo-10 mycin, neocardi ostat in, chloroambuci1, chloramphenicol, cyta-rabin, daunomycin, doxorubicin, f1 uorouraci 1, gentamycin, ibu-profen, kanamycin, meprobamat, methotrexat, novantron, nystatin, oncovin, phenobarbi ta 1, polymyxin, probucol. procarbabi-zin, rifampin, strptomycin, spectinomycin, symmetrel, thiogu-15 anin, tobramycin, trimethoprim og valban; samt toxiner, såsom difteritistoxin, gelonin, exotoxin A, abrin, modecc i n, r i c i n eller toksiske fragmenter deraf; metalioner, såsom alkali- og jordalkalimetallerne; rad ionuklider, såsom de der er dannet ud fra actinider eller lanthanider eller andre lignende over-20 gangsgrundstoffer eller ud fra andre grundstoffer, såsom 67Cu, 90y, lllln, 131i, 186Ref 105Rhi 99mTe, 67Ga, 153Sm, 159Gd, l75Ybf 17?Lu, 88Y, 166Ho, H^In, l°9Pd, 82Rb, l94Ir, l40Ba, l49Pm, l"Au, l40La og l88Re; s igna1dannere, såsom fluorescerende enheder; signal reflektorer, såsom paramagnetiske enhe-25 der, f.eks. Fe, Gd og Mn; chelateret metal, såsom ethvert af de anførte metaller, uanset om de er radioaktive, når de er forbundet med en chelatdanner, eller ikke; signalabsorbere, såsom elektronstråleopaliserende midler; antistoffer inklusive monoklonale antistoffer og ant i-idiotype-antistof fer ,· anti-30 stoffragmenter; hormoner; biologiske reaktionsmodifikatorer, såsom inter1eukiner , interferoner, vira og virale fragmenter; diagnostiske opaliserende midler samt fluorescerende molekyl-dele. Bårede farmaceutiske materialer indbefatter uddrivnings-midler, såsom che1atdannere, antigener, antistoffer eller 35 hvilke som helst molekyldele, der selektivt er i stand til at uddrive terapeutiske eller diagnostiske stoffer.
De bårede farmaceutiske materialer er fortrinsvis bioaktive stoffer. Som heri benyttet betegner "bioaktiv" en aktiv enhed, 13 DK 174053 B1 såsom et molekyle, et atom, en ion og/eller en anden enhed, der er i stand til at påvise, identificere, inhibere, behandle, katalysere, bekæmpe, dræbe, forbedre eller modificere en målenhed, såsom et protein, et glycoprotein, et lipoprotein, 5 et lipid, en målcelle, et målorgan, en målorganisme [f.eks. en mikroorganisme eller et dyr (inklusive pattedyr, såsom mennesker)] eller en anden måldel.
Stjerneeksplosionskonjugaterne med formlen (I) fremstilles ved 10 omsætning af P med M, sædvanligvis i et egnet opløsningsmiddel og ved en temperatur, der letter foreningen af det bårede materiale (M) med stjerneeksplosionsdendrimeren (P).
Egnede opløsningsmidler er opløsningsmidler, hvori P og M er i 15 det mindste delvis blandbare, og som er indifferente over for dannelsen af konjugat. Hvis P og M er i det mindste delvis indbyrdes blandbare, behøves intet opløsningsmiddel. Om ønsket kan blandinger af egnede opløsningsmidler anvendes. Eksempler på sådanne egnede opløsningsmidler er vand, methanol, ethanol, 20 chloroform, acetonitril, toluen, dimethylsulfoxid og dimethyl-formamid.
Reaktionbetingelserne for dannelsen af stjerneeksplosionskon-jugatet med formlen (I) afhænger af den pågældende dendrimer 25 (P), det bårede farmaceutiske materiale (M) og naturen af den
dannede binding (*). Hvis f.eks. P er PEI (polyethylenimin)-stjerneeksplosionsdendrimeren med en met hyl enearboxy1atoverflade, og M er et radionuklid, f.eks. yttrium, udføres reaktionen ved stuetemperatur i vand. Hvis imidlertid P er ester-30 termineret polyamid (PMAM)-stjerneeksplosionsdendrimer, og M
er aspirin, så udføres reaktionen ved stuetemperatur i chloroform. Temperaturen.kan typisk ligge i intervallet fra stuetemperatur til tilbagesvalingstemperatur. Valget af det pågældende opløsningsmiddel og temperaturen vil umiddelbart fremgå for 35 fagmanden på området.
Forholdet M:P vil afhænge af størrelsen af dendrimeren og mængden af båret materiale. F.eks. er det molære forhold (mol- 14 DK 174053 B1 forhold) mellem ethvert ionisk H og P sædvanligvis 0,1-1.000:1, fortrinsvis 1-50:1, og mere foretrukket 2-6:1.
Vægtforho1 det mellem ethvert lægemiddel eller toxin M og P er sædvanligvis 0,1-5:1 og fortrinsvis 0,5-3:1.
5 Når M er et radionuklid, er der tre måder at fremstille stjer-neeksplos ionskonjugatet på, nemlig: (i) P kan anvendes som en chelatdanner. F.eks. vil en methylencarboxylatoverflade-PEI eller -PAMAM chelatere et metal som yttrium eller indium. (2) 10 Et chelat kan covalent bindes til P. En ami ntermi neret PEI-stjerneeksplosionsdendrimer kan f.eks. omsættes med l-(p-iso-thiocyanatobenzy1)diethy 1 entri am i npentaeddikesyre og derpå chelateres, eller et kompleks, såsom rhodiumchlorid, der er chelateret med isothiocyanatobenzyl-2,3,2-tet, kan bringes til 15 omsætning. (3) Et forchelateret radionuklid kan associeres med P ved hjælp af hydrofob eller ionisk reaktion.
Særlig foretrukne stjerneeksplosionskonjugater er de konjuga-ter, der indeholder en målretter (her betegnet "T"), og som er 20 repræsenteret ved formlen:
(T)e * (P)x * (M)y UD
hvori hvert T repræsenterer en målretter, e betegner et helt 25 tal, der er 1 eller større end 1, og P, x, *, M og y er som defineret i det foregående.
Foretrukne blandt stjerneeksplosionskonjugaterne med formlen (II) er de, hvori M er et lægemiddel, et radionuklid, en che-30 latdanner, et chelateret metal, toxin, en signaldanner, en signalreflektor eller en signalabsorber. Foretrukne konjugater er også de konjugater, hvori e=l eller 2, og de, hvori x=l og y=2 eller mere. Særlig foretrukne konjugater er de, hvori x=l, e=2, y=2 eller mere, og M og T er forbundet med polymeren via 35 de samme eller forskellige forbindelsesled.
Stjerneeksplosionskonjugaterne med formlen (II) fremstilles enten ved at danne T * P og derpå tilføje M eller ved danne!- 15 DK 174053 B1 se af P * M og derpå tilføje T. Hver af reaktionerne udføres ved temperaturer, der ikke er skadelige for den pågældende konjug atkomponent og i nærværelse af et egnet opløsningsmiddel, når det er påkrævet. Til styring af pH anvendes puffere 5 eller tilsætning af egnet syre eller base. Reaktionsbetingelserne afhænger af typen af dannet forbindelse (*), den benyttede stjerneeksplosionsdendrimer (P), det bårede farmaceutiske materiale (M) og målretteren (T). Når f.eks. T er et mono-klonalt antistof, og M er et radionuklid, frembringes T*P-for-10 bindeisen ved hjælp af en funktionel gruppe, såsom et isothio-cyanat i vand eller i vand indeholdende en organisk modifika-tor, såsom acetonitril eller d i methyl formatin' d . Kon jugeri ngen foretages sædvanligvis i en puffer ved pH 7-10, fortrinsvis pH 8,5-9,5. Det dannede konjugat chelateres derpå med et ra-15 dionuklid, såsom yttriumacetat, fortrinsvis ved stuetempera tur. Alternativt kan P og M chelateres, sædvanligvis i vand, før konjugering til T. Konjuger i ngen med T udføres i en egnet puffer.
20 Forholdet T:P er fortrinsvis 1:1, især når T er et antistof eller fragment. Forholdet M:P vil være som før.
Målrettere, der er i stand til at målrette stjerneeksplosions-konjugaterne, er enheder, der ved anvendelse i stjerneeksplo-25 s ionskonjugaterne ifølge opfindelsen resulterer i at i det mindste en del af stjerneeksp1 os ionskonjugaterne afgives til et ønsket mål {f.eks. et protein, glycoprotein, lipoprotein, lipid, en målcelle, et målorgan, en målorganisme eller en anden måldel), og som indbefatter antistoffer, fortrinsvis mono-30 klonale antistoffer, anti stoffragmenter, såsom Fab, Fab1, F(ab')2~fragmenter eller hvilke som helst andre anti stoffragmenter med den nødvendige målspecificitet, hormoner, biologiske reaktionsmodif ikatorer, epitoper, kemiske funktional ite-ter, der udviser målspecificitet, og lignende.
35
Antistofferne eller ant i stoffragmenterne, der kan anvendes i foretrukne heri beskrevne stjerneeksplosionskonjutater, kan fremstilles ved hjælp af velkendte metoder. Højspecifikke mo- 16 DK 174053 B1 noklonale antistoffer kan fremstilles ved hjælp af velkendt hybridi ser ingsteknik , se f.eks. Kohier og Milstein (1975, Nature 256:495-497, og 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519). Sådanne antistoffer har normalt en meget specifik reaktivitet.
5 I de målrettede antistof-stjerneeksplosionskonjutater kan anvendes antistoffer rettet mod ethvert antigen eller hapten.
Selv om konventionelle polyklonale antistoffer kan anvendes, frembyder monokTonale antistoffer flere fordele. Hvert mono-10 klonalt antistof er meget specifikt for en enkelt epitop. Endvidere kan store mængder af hvert monoklonalt antistof fremstilles. De ifølge den foreliggende opfindelse benyttede antistoffer kan rettes mod f.eks. tumorer, bakterier, svampe, vira, parasitter, mycoplasma, differentierings- og andre cel-15 1emembrananti gener, patogene overf 1adeantigener, toxiner, en zymer, allergener, lægemidler og hvilke som helst biologiske aktive molekyler. For en mere fuldstændig liste over antigener henvises til US patentskrift nr. 4.193.983.
20 Det kan være ønskeligt at knytte flere antistoffer eller fragmenter til dendrimeren og i bestemte tilfælde at tilknytte antistoffer af forskellige specificiteter. F.eks. kan der udformes et bifunktionelt konjugat, som har evnen til at lokalisere og binde til en tumor og derpå uddrive cirkulerende oytotok— 25 siske, diagnostiske eller biostatiske forbindelser.
I tilfælde af fravær af en målretter (eller om ønsket i nærværelse af en målretter) kan som følge af antallet af funktionelle grupper, der kan lokaliseres ved eller nær ved overfla-30 den af dendrimeren, alle eller en væsentlig del af sådanne funktionelle grupper gøres anioniske, kationiske, hydrofobe eller hydrofile med henblik på effektivt at hjælpe afgivelsen af stjerneeksplosionskonjugatet til et ønsket mål med den modsatte ladning eller til et hydrofobt eller hydrofilt kompati-3 5 be 11 må 1.
Fremstilling af konjugaterne med formlen (II) under anvendelse af p sammen med et beskyttet greb (handle) (S) tilsigtes også 17 DK 174053 B1 som fremgangsmåde til fremstilling af konjugaterne med formlen (II) . Reaktionsskemaet er vist nedenfor: S*p fyldning^ S*P*M afbeskyttelse ^ P*M 5 T*P*M binding_ hvor S*P betegner den beskyttede dendrimer, S*P*M betegner den beskyttede dendrimer, konjugeret med M, 10 P*M betegner dendrimeren konjugeret med M (stjerneeksp1 os ions-konjugat), og T*P*M betegner stjerneeksp1 os ionskonjugatet bundet til en målretter.
15 Egnede opløsningsmidler kan benyttes, som ikke påvirker P*M.
Når f.eks. S er t-butyloxycarbony1, kan S fjernes ved hjælp af vandig syre.
Foretrukne er også stjerneeksplosionskonjugater, hvori polyme-20 ren er tilknyttet direkte eller via forbindelsesled. Disse stjerneeksplosionskonjugater er repræsenteret ved formlen II: E (T) e - (C 1 ) f ] g * (P)x * [(C’)h - (M)y]k (III) 25 hvori hvert C repræsenterer den samme eller forskellige forbindelsesgrupper, hvert C’’ betegner den samme eller forskellige forbindelsesgrupper, g og k hver især betegner et helt tal, der er 1 eller større 30 end 1, f og h hver især betegner et helt tal, der er 0 eller større end 0, - angiver en covalent binding i tilfælde, hvor en forbindelsesgruppe er til stede, og 35 P, x, *, M, y, T og e er som defineret i det foregående.
Foretrukne blandt stjerneeksplosionskonjugaterne med formlen (III) er de, hvori M er et radionuklid, lægemiddel, toxin, en 18 DK 174053 B1 s ignaldanner, en signalreflektor eller en s i g na 1 absorber. Foretrukne er også de konjugater, hvori x = l. Særlig foretrukne konjugater er de, hvori x, e, f, h og y hver er 1, og g er en eller roere, og hvert k individuelt er 2 eller mere. Mest fore-5 trukne er de konjugater, hvori x, e, f, h, y og g hver er l, og k er 2 eller mere. Særlig foretrukne er også de stjerneeks-plosionskonjugater, hvori M betegner et bioaktivt stof, såsom et radionuklid, et lægemiddel eller toxin.
10 Egnede forbinde 1 sesgrupper, som er repræsenteret ved C'1, er grupper, som knytter det bårede farmaceutiske materiale til dendrimeren uden på signifikant måde at forringe effektiviteten af det bårede farmaceutiske materiale eller effektiviteten af den eller de målrettere, der er til stede i stjerneeksplo-15 s ionskonjugatet. Disse forbindelsesgrupper skal være stabile (dvs. ikke-fraspaltelige) eller kunne fraspaltes afhængigt af det bårede farmaceutiske materiales aktivitetsmåde, og de anvendes typisk med henblik på at undgå sterisk hindring mellem det bårede farmaceutiske materiale og polymeren.
20
Mest foretrukne er konjugater, hvori dendrimeren direkte eller via en forbindelsesgruppe eller forbindelsesgrupper er knyttet til et antistof eller antistoffragment. Polymeren i disse foretrukne konjugater kan endvidere om ønsket enten direkte el-25 ler via en eller flere forbindelsesgrupper knyttes til et eller flere andre bårede materialer, fortrinsvis en radio isotop. Sådanne stjerneeksplosionskonjugater er repræsenteret ved formlen: 30 [{antistof)e - (C’)f]g * (Ρ)χ * C(C'')h - (M)y]k (IV) hvori hvert antistof betegner et antistof eller antistoffragment, der er i stand til at reagere med en ønsket epitop, - angiver en covalent eller coulombisk binding i tilfælde, 35 hvor en forbindelsesgruppe er til stede, og P, x, * , Μ, T, e, y, C', C1', g, k, f og h er som defineret i det foregående.
19 DK 174053 B1
Til den ovennævnte syntese af stjerneeksp1 os ionsdendri me rer (P), som har en funktionel gruppe, der står til rådighed for binding (C eller C'') til en målretter (T), kræver den foretrukne fremgangsmåde, at den reaktive funktionalitet beskyttes 5 som en syntetisk forløber. Denne beskyttelse foretrækkes, fordi den muliggør syntese af dendrimerer eller konjugater af meget høj kvalitet. Denne fremgangsmåde muliggør kemisk binding af en enhed af båret farmaceutisk materiale (M) til stjerne-eksplosionsdendrimerens (P) terminale funktionelle grupper på 10 måder, som ellers også ville resultere i reaktion med en tilknyttende funktionelt gruppe og således gøre det umuligt at tilknytte til målretteren (T). Efterfølgende afbeskyttelse eller syntetisk omdannelse til den ønskede tilknyttende funktionelle gruppe gør det således muligt for stjerneeksplosionskon-15 jugatet at blive knyttet til målretteren.
En af de foretrukne "funktionelle grupper til tilknytning" (i det følgende omtalt som et "greb") er en ani1 inmoleky1 de 1 .
Denne gruppe foretrækkes, fordi den kan anvendes direkte til 20 binding til målretteren, eller også kan den let modificeres til andre funktionelle grupper, der er egnede til omsætning med målretteren, f.eks. isothiocyanat, isocyanat, sem i th iocar-bazid, semicarbazid, bromacetamid, jodacetamid og maleimid.
An i 1 inmo1eky1 de 1 en foretrækkes også som et greb til tilknyt-25 ning til målretterne, fordi den let kan beskyttes til anvendelse i stjerneeksplosionsdendrimersyntese, eTler nitrogruppen kan anvendes som en forløber, der kan omdannes til den ønskede am inofunktion ved slutningen af syntesen.
30 Der findes et antal beskyttelsesgrupper, som er egnede til beskyttelse af ani lino-aminofunktional i teten under stjerneeks-plosionsdendrimersyntese. (Se Theodora W. Green, Protective Groups In Organic Synthesis, pub. John Wiley & Son, New York, 1981). En foretrukken klasse af beskyttelsesgrupper er de ne-35 denfor viste carbamater.
20 DK 174053 B1 O- 5
Mange carbamater har været benyttet til beskyttelse af aminer.
De mest foretrukne carbamater til stjerneeksplosionsdendrimer-syntese er t-butoxycarbamat, R = -0(0113)3. Af beskyttel se opnås ved hjælp af mild syrehydrolyse. Foretrukket er også benzyl-10 carbamatbeskyttelsesgruppen, R = -CH 2~(θ) som foretrækkes, når dendrimeren er følsom over for syrehydrolyse. Afbeskyttelse opnås ved hjælp af katalytisk hydrogene-15 ring. Foretrukket er også 9-f1uorenylmethylcarbamat R= -CH2\ 20 ©
Phthalimidbeskyttelsesgruppen er også et foretrukket eksempel n *'Ό-ί,Η2 3'-0S()§) · ff o
Andre til aminer benyttede beskyttelsesgrupper, som er vel-30 kendte fra 1 itteraturen, kunne også anvendes i dette synteseskema. De ovennævnte præferencer anføres kun som illustrative eksempler, men er ikke de eneste beskyttelsesgrupper, som kan anvendes. Enhver beskyttelsesgruppe, som er stabil under reaktionsbetingelserne og kan fjernes uden at ændre stjerneeksplo-35 sionsdendrimerens integritet, kan anvendes.
En alternativ fremgangsmåde indebærer omsætning af et aktiveret arylhalogenid, f.eks. 4-ni trofluorbenzen, med en amino- 21 DK 174053 B1 funktion på det til konjugering bestemte middel, f.eks. stjer-neeksplosionspolyethyleniminer (PEI), og efterfølgende katalytisk hydrogenering af nitrogruppen til anilinfunktionaliteten med henblik på efterfølgende konjugering. Den er særlig anven-5 delig til midler, f.eks. polyaminer, der kræver yderligere modifikation før anvendelse, som følge af nitrophenylfunktio-nalitetens relative kemiske indifferenthed over for alle ikke-reducerende reaktionsbetingelser. De mere almindelige bifunktionelle bindingsmidler, f.eks. aktive estere eller diisocya- 10 nater, som er reaktive under et stort antal reaktionsbetingelser, og som ville gøre dem uanvendelige til konjugering, indbefatter :
° O
0 U 0 Ji 0 "ΙΊ ; f >M0CCHpCKr\O/“ Μ Π 5
V ^ V
20 O
° >\NC0
|| NCO
O
30 Opfindelsen indbefatter også anvendelsen af ni trosubstituerede arylsulfonylhalogenider til opnåelse af sulfonamider, f.eks.
35 22 DK 174053 B1 /=\ °2?r—(\ // so?:c 5
Fordelen ved denne fremgangsmåde i forhold til kendte fremgangsmåder til indføring af en aminophenylgruppe til konjuge-ring er, at den finder sted på et sent trin i syntesen. Gan-sow et al., US patentskrift nr. 4.472.509, indførte i sin 10 fremgangsmåde nitrophenylgruppen på det første trin i en lang synteseprocedure, der derved har begrænsninger med hensyn til den kemi, der står til rådighed. Denne fremgangsmåde indfører også et greb, der er tydeligt forskelligt fra resten af molekylet. Manabe et al. nævnede, at ringåbningen af ravsyreanhy-15 drid ved hjælp af tilbageværende aminer resulterede i en koblingsgruppe, ved hjælp af hvilken konjugering til et antistof var mulig. Denne fremgangsmåde frembragte imidlertid ingen midler til differentiering mellem eventuelle ikke-chelaterede steder på polymeren, eftersom de chelatdannende grupper var de 20 samme som tilknytningsgruppen.
Den ovenfor nævnte fremgangsmåde kan indføre en aminophenyl-funktionalitet i ethvert stof indeholdende en am inogruppe, som derpå konjugeres med et bioaktivt stof, f.eks. et monok Tonalt 25 antistof eller et enzym. Stoffet kan konjugeres ved hjælp af oxidativ kobling til kulhydrater på det bioaktive stof, f.eks. antistof. Aminophenylgruppen kan også omdannes til et isothio-cyanat eller isocyanat til efterfølgende omsætning med de vedhængende aminogrupper tilhørende lysinrester på det bioaktive 30 stof.
Den her omhandlede fremgangsmåde tilvejebringer også direkte chelatering af lantham'der med st jerneeksplosionsdendrimerer , fortri nsvis ved hjælp af PEI-acetatdendrimer . I modsætni ng 35 hertil anfører Denkwalter, US patentskrift nr. 4.289.872, at blot anbringelse af acetater på overfladen fungerer. Den her omhandlede reaktion viser imidlertid, at PEI-acetat fungerer meget bedre end PAMAM, dvs. at overfladen af iminodiacetater 23 DK 174053 B1 kun er en del af historien, idet grund skelettets natur samt forgrening også er meget vigtig. PEI-acetatet har bedre chela-teringsegenskaber end PAMAM-acetatet.
5 * — C02e ^ Lco2e ίο ' _co2®
PEI
15 „ « —co2®
0 II
1_C02^ i—C02e 20 l li _λΛ ø
^ 0 2 PAMAM
25 Foretrukne blandt stjerneeksplosionskonjugaterne med formlen (IV) er de, hvori M er et radionuklid, lægemiddel, toxin, signalgenerator, s igna1 reflektor eller signalabsorber. Foretrukne er også de konjugater, hvori x=l. Særlig foretrukne er de kon-jugater, hvori x, e, f, h og y hver er 1, og g er en eller me- 30 re, og hvert k individuelt er 2 eller mere. Mest foretrukne er de konjugater, hvori x, e, f, h, y og g hver er 1, og k er 2 eller mere. Også særlig foretrukne er de stjerneeksplosions-konjugater, hvori "antistof" repræsenterer et monoklonalt antistof eller et ep i topbindenden fragment deraf, og især fore- 35 trækkes de, hvori M betegner et bioaktivt stof, såsom et radionuklid, lægemiddel eller toxin.
Stjerneeksplosionskonjugaterne kan benyttes til en række forskellige diagnostiske anvendelser in vitro eller in vivo, så- 24 DK 174053 B1 som radio immunana 1yse, elektronmikroskopi, enzymbundne immuno-sorbentanalyser, kernemagnetisk resonansspektroskop i, kontras t b i 11 eddanne 1 se og immunoscintografi, til analytiske anvendelser, til terapeutiske anvendelser som bærer af antibio-5 tika, radionuklider, lægemidler eller andre stoffer, der er egnede til anvendelse ved behandling af sygdomst ilstande, såsom cancer, autoimmunsygdomme. forstyrrelser i centralnervesystemet, infektiøse sygdomme og hjerteforstyrrelser, eller de kan anvendes som udgangsmaterialer til fremstilling af andre 10 anvendelige stoffer.
Den foreliggende opfindelse angår også stjerneeksplosionskon-jugatsammensætninger, hvori stjerneeksp1 os ionskonjugaterne er bragt til at indgå sammen med andre egnede bærere. Stjerneeks-15 plosionskonjugatsammensætni ngerne kan eventuelt indeholde an dre aktive bestanddele, additiver og/eller fortyndingsmidler.
Den foretrukne stjerneeksplosionspolymer til anvendelse i stjerneeksplos ionskonjugaterne ifølge den foreliggende opfin-20 delse er en polymer, der kan beskrives som en stjerneeksplo-sionspolymer, der har mindst en gren (i det følgende betegnet en kernegren), fortrinsvis to eller flere grene, der udgår fra en kerne, hvilken gren har mindst en terminalgruppe, forudsat at (1) forholdet mellem termina 1 grupper og kernegrenene er 25 større end 1, fortrinsvis 2 eller mere, (2) tætheden af termi nalgrupper pr. volumenenhed i polymeren er mindst 1,5 gange tætheden af en udvidet konventionel stjernepolymer med lignende kerne og monomere molekyldele og en molekylvægt samt et antal kernegrene, der kan sidestilles dermed, idet hver af så-30 danne grene i den udvidede konventionelle stjernepolymer bærer kun en terminal gruppe, og (3) et molekylært volumen, der ikke er mere end ca. 80% af nævnte udvidede konventionelle stjernepolymers molekylære volumen bestemt ved dimensionsundersøgelser under anvendelse af graduerede Corey-Pau1 ing mole-35 kylære modeller. Som heri benyttet betyder udtrykket "tæt", når det modificerer "stjernepolymer" eller "dendrimer", at den har et mindre molekylært volumen end en udvidet konventionel stjernepolymer, der har den samme molekylvægt. Den udvidede 25 DK 174053 B1 konventionelle stjernepolymer, som anvendes som grundlag for sammenligning med den tætte stjernepolymer, er en, som har den samme molekylvægt, samme kerne og monomere komponenter og samme antal kernegrene som den tætte stjernepolymer. Med "udvi-5 det” menes, at den konventionelle stjernepolymers individuelle grene er forlænget eller strakt til deres maksimale længde, f.eks., da sådanne grene eksisterer, når stjernepolymeren er fuldstændig solvateret i et i deelt opløsningsmiddel for stjernepolymeren. Selv om antallet af terminale gruppe er større 10 for det tætte stjernepo1ymermo1eky1e end i det konventionelle stjernemolekyle, er endvidere termina 1 gruppernes kemiske struktur den samme.
Dendrimerer, der anvendes i konjugaterne ifølge den forelig-15 gende opfindelse, kan fremstilles ved hjælp af i og for sig kendte fremgangsmåder. De ovennævnte dendrimerer, de forskellige coreaktanter og kerneforbindelser samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf kan være som defineret i US patentskrift nr. 4.587.329.
20
Dendrimererne til anvendelse i konjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse kan have terminal grupper, som er tilstrækkelig reaktive til at undergå additions- eller substitutions-reaktioner. Eksempler på sådanne terminalgrupper indbefatter 25 amino, hydroxy, mercapto, carboxy, alkenyl, ally!, vinyl, ami-do, halogen, urinstof, oxiranyl, aziridinyl, oxazolinyl, imid-azolinyl, sulfonat, phosphonat, isocyanat og isothiocyanat. Terminalgrupperne kan modificeres for at gøre dem biologisk indifferente, f.eks. for at gøre dem ikke-immunogene, eller 30 for at undgå uspecifik optagelse i leveren, milten eller et andet organ. Dendrimererne afviger fra konventionelle stjerneeller stjerneforgrenede polymerer i den henseende, at dendrimererne har en større koncentration af terminalgrupper pr. enhed af molekylært volumen end tilfældet er for konventionelle 35 udvidede stjernepolymerer, der har et tilsvarende antal kernegrene og en tilsvarende kernegrenslængde. Tætheden af terminalgrupper pr. enhedsvolumen i dendrimeren er således sædvanligvis mindst 1,5 gange tætheden af term i nal grupper i den kon- 26 DK 174053 B1 vent i one 11e udvidede stjernepolymer, fortrinsvis mindst 5 gange og mere foretrukket mindst 10 gange samt mest foretrukket fra 15 til 50 gange. Forholdet mellem termi na 1 grupper pr. kernegren i den tætte polymer er fortrinsvis mindst 2, mere fore-5 trukket mindst 3 og mest foretrukket fra 4 til 1024. Ved en given polymermolekylvægt er den tætte stjernepolymers molekylære volumen fortrinsvis mindre end 70 vo1umen%, mere foretrukket fra 16 til 60 og mest foretrukket fra 7 til 70 volu-men% af den konventionelle udvidede stjernepolymers molekylæ-10 re volumen.
Foretrukne dendrimerer til anvendelse i konjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret som havende en monovalent eller polyvalent kerne, der er covalent bundet til 15 dendritiske grene. En sådan ordnet forgrening kan illustreres ved hjælp af følgende rækkefølge, hvori G angiver antallet af generationer: 20 25 30 35 27 DK 174053 B1 G = 1 G = 2 \ 1 / \ ' 1 Λ /\
10 / H
G = 3
15 N
20 N·^" «Λ ,/\ /\ /\ /\ /\ /\ 25
Matematisk kan forholdet mellem antallet (#) af terminale grupper på en dendritisk gren og antallet af generationer af grenen angives som følger:
# af terminale grupper pr. dendritisk gren * NrG
30 ~Z~ hvori G er antallet af generationer, og Nr er gentagel sesenhedmult i pi i c i teten, der er mindst 2 som i tilfælde af aminer.
Det samlede antal termina 1 grupper i dendrimeren bestemmes af følgende:
# af terminale grupper pr. dendrimer = NcNrG
35 —2— hvori G og Nr er som ovenfor defineret, og Nc repræsenterer kerneforbindelsens valens (ofte betegnet kernefunktional itet).
28 DK 174053 B1 Følgelig kan dendri mererne ifølge den foreliggende opfindelse angives i sin komponentdele som følger: (kerne) { (gentagelsesenhed)NrG_i terminaldel NrG)fgc 5 Nr-1 hvori kernerne, den terminale del, G og Nc er som ovenfor defineret, og gentagelsesenheden har en valens eller funktiona-litet på Nr + 1, hvor Nr er som ovenfor defineret.
10 En copolymer dendrimer, som er en foretrukken dendrimer til opfindelsens formål, er en særlig forbindelse, der er opbygget af polyfunkt ionel le monomerenheder i en meget forgrenet (dendritisk) orden. Dendrimermo1eky1 et fremstilles ud fra en polyfunktionel initiatorenhed (kerneforbindelse), polyfunk-15 tionelle gentagelsesenheder og terminale enheder, der kan være de samme som eller forskellige fra gentagelsesenhederne. Kerneforbindelsen angives ved formlen (T)(Zc)nc, hvori (?) betegner kernen, Zc betegner de funktionelle grupper, som er bundet til (7), og Nc betegner kernefunktional i teten, som fortrinsvis 20 er 2 eller mere, mest foretrukket 3 eller mere. Dendrimermole-kylet omfatter således en polyfunktionel kerne, © , der er bundet til et antal (Nc) funktionelle grupper, Zc, som hver er knyttet til den monofunktionelle hale af en gentagelsesenhed, χΐγΐ (Z -) jijl, af den første generation, og hver af Z-grupperne i 25 gentagelsesenheden tilhørende én generation er bundet til en monofunktionel hale af en gentagelsesenhed tilhørende den næste generation, indtil den terminale generation er nået.
29 DK 174053 B1 ket 2, 3 eller 4, som repræsenterer multipliciteten af det poly funkt i one 11e hoved tilhørende gentagelsesenheden i den første generation. Generisk angives gentagelsesenheden ved hjælp af formlen χίγ1’ (Z1* )ni , hvori "i" betegner den pågældende gene-5 ration fra den første til generationen t-1. I det foretrukne dendrimermolekyle er således hver Zl tilhørende den første generation gentagelsesenhed forbundet med en X2 i en gentagelsesenhed tilhørende den anden generation osv. gennem generationerne, så at hver Z i-gruppe i en gentagelsesenhed 10 X1 V* (Z ^) fli i generation nr. "i" er forbundet med halen {X +1) af gentagelsesenheden tilhørende generationen nr. "i+1". Den sidste eller terminale i et foretrukket dendrimermolekyle omfatter terminale enheder, XtYt(Zt)fgt, hvori t repræsenterer den terminale generation, og X*, Y*, Zt og N* kan være de sam-15 me som eller forskellige fra χΐ , Y-* , X^ og Ν'* , med den undtagelse, at der ikke er nogen efterfølgende generation bundet til Z*-grupperne, og N* kan være mindre end 2, f.eks. 0 eller 1. Den foretrukne dendrimer har derfor en en molekylær formel angivet ved (©““Off1 N=nHn ' 'V All' er' 25 . . „ .
hvor 1 er 1 til 1 hvori symbolerne er som defineret i det foregående, n-funktionen er produktet af alle værdierne mellem dens fastsatte grænser.
30 π Nn = (N1)(N2)(M3).-.(Ni-2H?ii-l) n= 1 som er antallet af gentagelsesenheder, Χ'ΐγ1 (Z^ )ni , omfatter 35 således den i'ende generation af én dendritisk gren, og når i er 1, da er 30 DK 174053 B1 n° = 1 n 1 I copolymere dendrimerer varierer gentagelsesenheden i én ge-5 nerat ion fra gentagelsesenheden i mindst én anden generation.
De foretrukne dendrimerer er meget symmetriske som illustreret i de i det følgende beskrevne strukturformler. Foretrukne dendrimerer kan omdannes til funktionaliserede dendrimerer ved kontakt med et andet reagens. Omdannelse af hydroxyl i den 10 terminale generation til ester ved omsætning med et syrechlo-rid fører f.eks. til en terminalt funktional i teret esterden-drimer. Oenne funktionalisering behøver ikke at blive udført til det teoretiske maksimum som defineret af antallet af til rådighed stående funktionelle grupper, og en funktiona1 i seret 15 dendrimer har således ikke nødvendigvis høj symmetri eller en nøjagtigt defineret molekylær formel som tilfældet er for den foretrukne dendrimer.
I en homopolymer dendrimer er alle gentagelsesenhederne, 20 χίγί (Z’ )|gi, identiske. Eftersom værdierne af alle N1 er ens (defineret som Nr), formindskes produktfunktionen angivende antallet af gentagelsesenheder til en simpel eksponentiel form. Den molekylære formel kan defor angives i enklere form som: 25 (Θ«0)θΓ(Χΐ 11 30 hvori i = 1 til t-1.
Denne form viser stadig forskellen mellem de forskellige generationer i, som hver består af NcNr{(1_U gentagelsesenheder 35 χίγ1’ (Z1 . Ved at kombinere generationerne til ét udtryk op nås : 31 DK 174053 B1 0(ZC)N ) \ C N^1*1 )-1\ /NcNr^t"1> 5 eller / / . \ 10 /_ \l \ I ^ (©<2°)HjVir!fr(zP}»r) i|rU·,).1, X‘--- Nr-1 Λ0 kerne gentagelsesenhed terminal enhed 15 hvori ΧγΥγ(Ζγ)νγ er den gentagelsesenhed, som anvendes i alle generationer i.
Hvis en polymerforbindelse vil passe ind i disse ovenfor an-20 førte formler, da er polymeren følgelig en stjerneeksplosionspolymer. Omvendt, hvis en polymerforbindelse ikke vil passe ind i disse ovenfor anførte formler, da er polymeren ikke en stjerneeksplosionspolymer. Til bestemmelse af, hvorvidt en polymer er en stjerneeksplosionspolymer, er det altså ikke nød-25 vendigt at kende den fremgangsmåde, ved hjælp af hvilken den blev fremstillet, men kun hvorvidt den passer til formlerne. Formlerne viser også dendrimerers generationer (G) eller rækkevise opbygning.
30 Der findes tydeligvis flere måder til bestemmelse af forholdet mellem materiale (M) og dendrimer (P), som afhænger af hvorledes og hvor associeringen af P*M finder sted. Når der sker indre indkapsling, er vægtforholdet M:P sædvanligvis 10:1, fortrinsvis 8:1, mere foretrukket 5:1 og mest foretrukket 3:1.
35 Forholdet kan være så lavt som 0,5:1 til 0,1:1. Når indre støkiometri anvendes, er vægtforholdet M:P det samme som ved indre indkapsling. Når ydre støkiometri bestemmes, mol/mol-for-holdet M:P givet ved hjælp af følgende formler: 32 DK 174053 B1 _M :_P____ (A) 5 NcNtNrG~l 1 (B) 3 NcNtNrG“l 1 (C) 1 NcNtNrG“l 1 5 hvor Nc betyder kernemu11i pi i c i teten, N* betyder terminalgrup-pemultipliciteten, og Nr betyder grenforbindelsesmult i pi i ci -tet. Udtrykket NcNtNrG"l vil resultere i antallet af Z-grup-per. Således kan f.eks. (A) blive resultatet, når proteiner, 10 enzymer eller højt ladede molekyler findes på overfladen·. (B) ovenfor, når den er aspirin eller capronsyre, og (C) ovenfor, når overfladeestergrupper omdannes til carboxyl at i oner eller -grupper, 15 Andre strukturer af forskellige dimensioner kan selvsagt let fremstilles af fagmanden på området ved passende variering af de benyttede dendrimerkomponenter og antallet af generationer.
En groft gradueret sammenligning mellem tre forskellige den-dri merrækker og et IgG-antistof ses i fig. 3. I rækken af teg-20 ni nger angivet ved hjælp af fig. 3(B) viser I stjerneeksplo-sionspolyamidoaminerne (PAMAM), II viser stjerneeksplosions-polyetheme (PE), og III viser stjerneeksplosionspolyethylen-iminerne (PEI). På en måde svarende til den i fig. 1 viste har alle tre rækker (I, ϊϊ og ill) i ni t i atorkernen vist som af-25 bildningen længst til venstre, medens den næste afbildning fra venstre viser stjerneforgreningsoligomeren, og de resterende afbildninger viser stjerneeksp1 os ionso 1 igomererne og de respektive broforbundne stjerneeksplosionsdendrimerer. Det kan ses, at i disse rækker af graduerede afbildninger er dendr i -30 merdimens ionerne tættere ved og i virkeligheden mindre end de dimensioner, der er angivet for IgG-antistoffet i fig. 3(A). IgG-ant i stof f et er vist længst til venstre i fig. 3. Målestoksforholdet er 1 mm = 2,3 A. I fig. 3(A) er det variable område vist ved (A), det konstante område ved (B), og kul-35 hydrattilknytningsstederne ved (C). Tilnærmelsesvise mål vist i fig. 3 er (1) er 35-40 A, (2) er 70 A, og (3) er 60A . Disse dimensionsmæssige egenskaber foretrækkes i tilfælde, hvor målretning indebærer afgang fra det vaskulære system. Dendrimer- 33 DK 174053 B1 diametre på 125 Ångstrøm-enheder eller mindre er derfor særlig foretrukne, da de kan muliggøre afgang fra det vaskulære system til målorganer, der betjenes af kontinuerte eller fe-nestrerede kapillarer. Disse dimensioner er betydningsfulde, 5 eftersom de er små sammenlignet med størrelsen af en potentiel må 1 komponent, såsom et antistof (se fig. 3). En lineær polymer af tilsvarende molekylvægt ville have en rotationsradius (i sin fuldt udstrakte form), som ville være meget større end dendrimeren med samme molekylvægt. En lineær polymer af denne 10 type ville forventes på uheldig måde at påvirke de molekylære genkendelsesegenskaber hos mange accepterede må 1 komponenter.
Det er også ønskeligt, at konjugaterne har minimalt molekylært volumen med henblik på ikke at modvirke f.eks. blodudtrædning ved kobling af Fab, Fab' eller et andet passende anti-15 stoffragment til dendrimerer med lille molekylært volumen.
Dendrimerer er ønskelige til afgivelse af radionuklider eller stærkt paramagnetiske metalioner til tumorsteder som følge af deres evne til at chelatere et antal metalioner i et lille 20 rumvolumen. Kobling til antistoffer eller antistoffragmenter, der er specifikke for tumorer, kan afgive et antal metaller pr. antistof i forbindelse med kun en enkelt modifikation af ant i stoffet.
25 Binding af målrettere til dendrimerer er et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse. I foretrukne udføre 1 sesformer for opfindelsen, især når der ønskes anvendt et antistof som en målretter, kan en reaktiv funktionel gruppe, såsom en carbo-xylgruppe, en sulfhydrylgruppe, en reaktiv aldehydgruppe, et 30 reaktivt olefinisk derivat, en isothiocyanatgruppe, en isocy-anatgruppe, en aminogruppe, et reaktivt arylhalogenid eller et reaktivt alkylhalogenid, hensigtsmæssigt anvendes på dendrimeren. De reaktive funktionelle grupper kan frembringes på dendrimeren ved anvendelse af kendte metoder, f.eks.:
(1) Anvendelse af en heterofunktionel initiator (som udgangsmateriale til syntetisering af dendr i nieren), som i sig har inkorporeret funktionelle grupper af forskellig reaktivitet. I
35 34 DK 174053 B1 en sådan heterofunktionel initiator vil mindst en af de funktionelle grupper fungere som et initiatorsted for dendrimer-dannelse, og mindst en af de andre funktionelle grupper vil stå til rådighed for binding til en målretter, men vil være 5 ude af stand til at initiere dendrimersyntese. F.eks. muliggør anvendelse af beskyttet anilin yderligere modifikation af NH2~ grupper i molekylet uden omsætning af anilinets NH2-
Den funktionelle gruppe, som vil stå til rådighed for binding 10 til en målretter, kan være en del af i n i t i atormol eky let i en hvilken som helst af tre former, nemlig: (a) I den form, hvori den vil blive benyttet til binding med mål retteren. Dette er muligt, når intet af de involverede syn- 15 tesetrin i dendrimersyntesen kan resultere i omsætning ved dette center.
(b) Når den funktionelle gruppe, der anvendes til binding til målretteren, er reaktiv i de i dendrimersyntesen involverede 20 syntesetrin, kan den beskyttes ved anvendelse af en beskyttelsesgruppe, som gør gruppen ureaktiv over for de involverede synteseprocedurer, men kan selv let fjernes på en måde, der ikke ændrer integriteten af resten af mak romo 1eky1 et.
25 (c) I det tilfælde, at ingen simpel beskyttelsesgruppe kan dannes for den reaktive funktional itet, der skal anvendes til binding med målretteren, kan en syntetisk forløber anvendes, som er ureaktiv ved alle de i dendrimersyntesen benyttede synteseprocedurer. Efter afslutning af syntesen skal denne funk-30 tionelle gruppe være let at omdanne til den ønskede bindingsgruppe på en måde, der ikke ændrer integriteten af resten af molekylet.
(2) Ved kobling (covalent) af den ønskede reaktive funktionel-35 le gruppe på en forinden dannet dendrimer, skal det benyttede reagens indeholde en funktionalitet, som er let at omsætte med dendrimerens terminale funktionelle grupper. Den funktionelle gruppe, der til sidst skal anvendes til binding med det mål- 35 DK 174053 B1
rettende middel, kan foreligge i sin endelige form, som en beskyttet funkt ional itet eller som en syntetisk forløber. Formen, hvori denne bindende funktionalitet anvendes, afhænger af dens integritet under synteseproceduren, der skal anvendes, og 5 det endelige makromoleky1 es evne til at modstå hvilke som helst betingelser, der er nødvendige til at gøre denne gruppe i stand til binding. F.eks. anvender den foretrukne vej til PEI
10
Eksempler på heterofunktionelle initiatorer til anvendelse un-15 der (1) ovenfor indbefatter følgende illustrative eksempler: 20 o.
„ \ \
Κ2ΪΙ QJ) )— CHsCH
30 CMHCHpCHpMHp // 0 35 36 DK 174053 B1 _ Nh'2 H2N -nSM’ CH2NK2
10 O
A H .
q '^.CNHCH2CH2NH2 15 CNKCKjCHgi^ 20 2 y , / 5
(CH3)3C0CN!r-^O^- CH2CH
2 5 'CH2»K2 35 37 DK 174053 B1 _ CH2NH2 CH2NK2 10 02M CH2CH2NH2 i 20 ^K2NH2
°2(i_^Q^>_cH2CH
CH2MK2 25 ^K2CH2NH2 --v Cii2NC*i2Cn2Nn2
30 0SM-\O/-^H
CH2 i| CH 2C H 2 MK 2 CH2CH2NH2 35 38 DK 174053 B1
Der findes flere kemi'er af særlig vigtighed: 1) Stjerneeksplos ionspolyamidoamiders ("PAMAM") kemi; 2) Stjerneeksplosionspolyethyleniminers ("PEI") kemi; 5 3) PEI-stjerneeksplos ionsforbindelse med en overflade af PAMAM; og 4) Stjerneeksplosionspolyetheres ("PE") kemi.
Modifikationer af dendrimeroverf1adefunktiona1iteterne kan 10 tilvejebringe andre anvendelige funktionelle grupper, såsom følgende: -opo3h2, -po3h2, -po3h(-D, -po3(-2), ~C02("I) , -so2h, — S02^~^^, —S03H, —SO3^ 1^» -NR^R2, — R®, -OH, "OR 1, -NH2, per-15 fluoreret alkyl, -CNHRl, -C0H, O 0 .«», 4¾ 20 N / \ r3· Hu 25 (CHz,n\,J} ’ vO ’ h3 n -(cSj)n ir hvori R betegner alkyl» aryl eller hydrogen,
Ri betegner alkyl, aryl, hydrogen eller 30 (CH2)n f ^ -N x ; ^ (c:-:2)n ^ R2 betegner alkyl, aryl eller 35 39 DK 174053 B1 ^ (ca2)n
-N X
^ (CH2)n ^ 5 R3 betegner -OH, -SH, -C02H, -S02H eller -S03H, R4 betegner alkyl, aryl, alkoxy, hydroxyl, mercapto, carboxyl, nitro, hydrogen, brom, chlor, jod eller fluor, r5 betegner a 1 kyl, 10 X betegner NR, 0 eller S, og n betegner det hele tal 1, 2 eller 3, polyethere, eller andre immuno-ufølsomme molekyldele.
Valget af funktionel gruppe afhænger af den pågældende slut-15 anvendelse, hvortil dendrimeren er bestemt.
Binding af antistoffer til dendrimerer er et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse. Antistofferne eller anti stoffragmenterne bindes typisk til dendrimeren ved hjælp af velkendte 20 metoder, såsom tilknytning mellem en funktionel gruppe på dendrimeren og molekyldele, såsom kulhydrat-, amino-, carboxyl-eller su1fhydry1funktiona1 iteter, der findes i antistoffet eller anti s tof fragmentet. I nogle tilfælde kan forbindelsesgrupper anvendes som forbindelsesled eller afstandsstykker 25 mellem dendrimeren og antistof eller antistoffragment. Dendri-merens tilknytning til antistoffet eller antistoffragmentet bør foretages på en måde, der ikke på signifikant måde generer antistoffets eller anti stoffragmentets immunoreaktivitet, dvs. ved binding af antistoffet eller antistoffragmentet via 30 en funktionalitet i antistoffet eller anti stoffragmentet, som ikke er en del af antigen-genkendelsesstedet og -bindingsstedet .
De følgende eksempler illustrerer opfindelsen yderligere, men 35 må ikke opfattes som en begrænsning af opfindelsens rammer. De med bogstav betegnede eksempler vedrører fremstilling af udgangsmaterialer, medens de nummererede eksempler angår fremstilling af produkter.
40 DK 174053 B1
Eksempel A: Fremstilling af 2-carboxamido-3-(4’-nitropheny1)~ propanamid.
p-nitrobenzylmalonat-diethylester (2,4 g, 8,13 mmol ) blev op-5 løst i 35 ml methanol. Opløsningen opvarmedes til 50-55°C under omrøring, og en strøm af vandfri ammoniak blev boblet gennem opløsningen i 64 timer. Opløsningen blev afkølet, og det hvide, f1okkulerende produkt blev filtreret fra og rekrystal-liseret fra 225 ml kogende methanol til opnåelse af 1,85 g 10 (7,60 mmol) bisamid i 96% udbytte (smeltepunkt = 235,6°C (d)).
Formlen blev bekræftet ved hjælp af MS, ^H og *3C NMR-spek-troskopi, 15 Analyse: Beregnet for C10H11O4N3
C Η N
Teoretisk: 50,63 4,69 17,72
Fundet: 50,75 4,81 17,94 20
Eksempel 8: Fremstilling af i-amino-2-(aminomethyl)-3-(41-ni- trophenyl)propan.
2-carboxamido-3-(4'-nitrophenyl)propanamid (2,0 g, 8,43 mmol) 25 blev opslæmmet i 35 ml tør tetrahydrofuran under en nitrogenatmosfære og under omrøring. Til denne blanding sattes boran/ tetrahydrofuran-kompleks (106 ml, 106 mmol) ved hjælp af en sprøjte. Reaktionsblandingen blev derpå opvarmet til tilbagesvaling i 48 timer, i løbet af hvilken tid det suspenderede 30 amid opløstes. Opløsningen afkøledes, og tetrahydrofuranen blev fjernet under vakuum under anvendelse af en rotationsfordamper. Det rå produkt og boranresten blev opløst i 50 ml ethanol, og denne opløsning blev renset med vandfri hydrogen-chloridgas. Opløsningen opvarmedes under tilbagesvaling i 1 35 time, og opløsningsmidlet blev fjernet under vakuum. Det rå hydrochloridsalt blev opløst i 15 ml deioniseret vand og ekstraheret med to 50 ml portioner methylenchlorid. Det vandige lag afkøledes i et isbad under et argonlag, og 50% natriumhy- 41 DK 174053 B1 droxid blev langsomt tilsat indtil basisk pH = li#?· Det basiske vandige lag blev ekstraheret med fire 2 5 ml portioner methylenchlorid, og disse kombinerede ekstrakter blev inddam-pet (rotationsfordamper) til opnåelse af 1,45 g gulfarvet 5 olie. Denne olie findeltes med diethylether (50 ml) og filtreredes under tryk gennem en kort s i 1 i kagel søj1e (kvalitet 62 Aldrich). Søjlen blev vasket med 100 ml ether, og de kombinerede filtratet vakuum inddampes til opnåelse af 1,05 g (5,02 mmol) af titeldiaminen som en klar olie (smeltepunkt = 275-10 278eC(d) bis-HCl-salt).
Formlen blev bekræftet ved hjælp af MS-, ^H- og l^c-NMR spektroskop! .
15 Analyse: Beregnet for Cioh17n3°2c12
C Η N
Teoretisk: 42,57 6,07 14,89
Fundet: 43,00 6,14 15,31 20
Eksempel C: Fremstilling af 1-am i no-2-(aminomethy1)-3-(41 -ami - nophenylJpropan.
Boran/tetrahydrofuran-opløsning (70 ml, 70 mmol) blev under 25 nitrogen ved hjælp af en kanylenål sat til en kolbe indeholdende 4-amino-benzylmalonamid (1,5 g, 7,24 mmol) under omrøring. Opløsningen blev bragt til tilbagesvaling i 40 timer.
Den farveløse opløsning blev afkølet, og overskud af tetrahy-drofuran blev fjernet ved hjælp af rotationsfordampning under 30 efterladelse af en klar gelatinøs olie. Methanol (50 ml) blev forsigtigt sat til olien under mærkbar gasudvikling. Tørt hy-drogenchlorid blev boblet gennem suspensionen til frembringelse af opløsning, og opløsningen blev derpå opvarmet under tilbagesvaling i 1 minut. Methanol/HCl blev rotationsfordampet, 35 og det resulterende hydrochloridsalt blev atter ført gennem den samme opløsnings/ti 1 bagesval ingsprocedure. Det opnåede hydrochloridsalt blev opløst i 10 ml vand og afkølet i et isbad under argon. Koncentreret natriumhydroxid (50¾) blev langsomt 42 DK 174053 B1 tilsat under omrøring indtil pH = 11. Den vandige portion blev derpå ekstraheret med 2 x 100 ml portioner chloroform, som blev kombineret og filtreret gennem en kort si 1ikagelprop uden tørring. Opløsningsmidlet fjernedes under vakuum (rotations-5 fordamper) til opnåelse af titel forbindelsen (0,90 g, 5,02 mmol) i 70% udbytte (Rf = 0,65 - CHCl 3/Me0H/NH40H kone. - 2/2/1). Formlen blev bekræftet ved hjælp af Ih og 13C-NMR og benyttet uden yderligere rensning.
10 Eksempel D: Fremstilling af 6-(4-aminobenzyl)-l,4,8,ll-tetra- aza-5,7-dioxoundecan.
4-aminobenzylmalonat-dimethylester (2,03 g, 8,43 mmol) blev opløst i 10 ml methanol. Denne opløsning blev dråbevis sat til 15 en omrørt opløsning af frisk destilleret ethylendiamin (6,00 g, 103,4 mmol) i 10 ml methanol under nitrogen i løbet af 2 timer. Den klare opløsning omrørtes i 4 dage, og tyndt 1agskro-matografisk (TLC) analyse viste fuldstændig omdannelse af d i -ester (Rf = 0,91) til bisamidet (Rf ® 0,42 - 20% kone. NH4OH/ 20 80% ethanol). Dette materiale var stærkt ninhydrinpositivt.
Methanolen og overskud af diamin blev fjernet på en rotationsfordamper, og det resulterende hvide, faste stof blev vakuumtørret (1Q-1 mm, 50°C) natten over til opnåelse af et råt produkt (2,45 g, 8,36 mmol) i 99% udbytte. En analytisk prøve 25 blev rekrystal 1 iseret fra chlorof orm/hexan, smeltepunkt =* 160-1610 C. De massespektrale data, ΪΗ- og 13C-NMR-data stemte overens med den foreslåede formel.
Eksempel E: Omsætning af mesylaziridin med l-amino-2-(amino- 30 methyl)-3-(4-nitrophenyl)propan.
l-amino-2-(ami nomethyl )-3-(4-nitropheny1)propan (400 mg, 1,91 mmol, > 96% ren) blev opløst i 10,5 ml absolut ethanol under nitrogen. Mesylaziridin (950 mg, 7,85 mmol) blev sat til den 35 omrørte diaminopløsning som et fast stof. Reaktionsblandingen omrørtes ved 25eC i 14 timer under anvendelse af en magnetisk omrører, og i løbet af dette tidsrum dannedes en hvid, gummiagtig rest på kolbens sider. Ethano len dekanteredes fra, og 43 DK 174053 B1 resten blev findelt med en anden 15 ml portion methanol til fjernelse af eventuelt uomsat aziridin. Det gummiagtige produkt blev vakuumtørret (101 mm, 25®C) til opnåelse af tetra-kismethy1 sulfonamidet (1,0 g, 1,44 mmol) i 75¾ udbytte {Rf = 5 0,74 - NH40H/ethanol 20/80). Formlen blev bekræftet ved hjælp af lH-spektroskopi og 13C-kernemagnetisk resonansspektroskop i (NMR).
Eksempel F; Fremstilling af 2-(4-nitrobenzy1)-1,3-(bis-N,N-2-10 aminoethyl)diaminopropan.
Det rå methylsulfonamid (650 mg, 0,94 mmol) blev opløst i 5 ml nitrogenrenset, koncentreret svovlsyre (98%). Denne opløsning blev holdt under nitrogen og opvarmet til 143-146°C i 27 mi-15 nutter under kraftig omrøring. En ringe mørkning iagttoges, og den afkølede opløsning blev udhældt i en omrørt etheropløs-ning (60 ml). Den udfældede hvide saltkage blev filtreret fra og øjeblikkelig opløst i 10 ml deioniseret vand. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til pH = 11 med 50% NaOH under argon 20 og under afkøling. Den resulterende opløsning blev blandet med 90 ml ethanol, og de udfældede uorganiske salte blev filtreret fra. Opløsningsmidlet blev fjernet den rå amin under formindsket tryk, og til den resulterende lysebrune olie sattes 190 ml toluen under nitrogen. Blandingen omrørtes kraftigt, og 25 vand blev fjernet ved hjælp af azeotropisk destillation (Dean-Strak-udski11 er), indtil den tilbageværende toluen fik en lysegul farve (30-40 ml tilbage i beholderen). Toluenen afkøle-des og dekanteredes fra de mørke, vanskeligt behandlelige rester og salt. Denne opløsning blev befriet for opløsn i ngsmid-30 del i vakuum, og den resulterende lysegule olie blev vakuumtørret (0,2 mm, 35®C) natten over til opnåelse af 210 mg af produktet (60%), som blev karakteriseret ved hjælp af MS, *H og 13C NMR.
35
Eksempel G: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer (in deholdende et anilinderivat) på en halv generation repræsen teret ved hjælp af følgende skema: 44 DK 174053 B1 5 0 0 /—\ R 11 H2N-(0 VCH2CH(CNHCH2CH2NH2)2 H2C = CHCCCHav v_v —cwzm'
Forbindelse nr. 1 10 0 0 /—\ 11 11 H2N-\0 >-CH2CH(CNHCH2CH2N(CH2CH2C0CH3) 2) 2
Forbindelse nr. 2
Methyl aery 1 at (2,09 g, 24 mmol) blev opløst i methanol (15 1 5 ml). Forbindelsen 6-(4-aminobenzy1)-l,4,8,11-tetraaza-5,7-di-oxoundecan (1,1 g, 3,8 mmol) (dvs. forbindelse nr. 1, fremstillet som beskrevet i eksempel D) blev opløst i methanol (10 ml) og blev langsomt i løbet af 2 timer og under kraftig omrøring sat til methylacrylatopløsningen. Reaktionsblandingen om- 20 rørtes i 48 timer ved omgivelsernes temperatur. Opløsningsmidlet fjernedes på rotationsfordamperen under bibeholdelse af temperaturen under 40°C. Esteren (forbindelse nr. 2) opnåedes som en gul olie (2,6 g). Ingen carboxylethylering af anilinfunktionen iagttoges.
25
Eksempel H: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer (in deholdende en anilindel) af første generation angivet ved hjælp af følgende skema: 30
Forbindelse nr. 2 + H2NCH2CH2NH2 CTfJOfl * 0 0 r~\ 11 11 ^2^"\0/~CH2^^ (cnhch2ch2n ( ch2ch2cnhch2ch 2nh2 )2)2 35 Forbindelse nr. 3
Esteren (forbindelse nr. 2) (2,6 g, 3,7 mmol) blev opløst i methanol (100 ml). Oenne blev forsigtigt sat til en kraftigt 45 DK 174053 B1 omrørt opløsning af ethylendiamin {250 g, 4,18 mol) og methanol (100 ml) med en sådan hastighed, at temperaturen ikke steg til over 40 * C. Efter fuldstændig tilsætning omrørtes reaktionsblandingen i 28 timer ved 35-40eC (varmekappe). Efter 28 5 timer kunne ingen estergrupper påvises ved hjælp af infrarød spektroskop!. Opløsningsmidlet fjernedes på en rotationsfordamper ved 60eC. Overskuddet af ethylendiamin blev fjernet under anvendelse af en ternær azeotrop af toluen-methanol-ethy-lendiamin. Til slut blev alt tilbageværende toluen fjernet 10 azeotropisk sammen med methanol. Fjernelse af al methanolen resulterede i 3,01 g af produktet (forbindelse nr. 3) som et orange glasagtigt fast stof.
Eksempe1 I: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer (in- 15 deholdende en anilindel) af halvanden genereation angivet ved hjælp af følgende skema: 0
R
Forbindelse nr. 3 + H?C=CHC0CH3 20 -CTT^DH-> 0 0 0 H2N-^yCH2CH(CNHCH2CH2N(CH2CH2CNHCH2CH2N(CH2CH2C0CH3)2)2)2 25 Forbindelse nr. 4
Aminen (forbindelse nr. 3) (2,7 g, 3,6 mmol) opløstes i methanol (7 ml) og blev langsomt i løbet af 1 time sat til en om-rørt opløsning af methylacrylat (3,8 g, 44 mmol) i methanol (15 ml) ved omgivelsernes temperatur. En svag opvarmning af 30 opløsningen iagttoges under tilsætningen. Man lod opløsningen omrøre ved omgivelsernes temperatur i 16 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet på rotationsfordamperen ved 40eC. Efter fjernelse af alt opløsningsmidlet og overskuddet af methylacrylat opnåedes esteren (forbindelse nr. 4) i 4,7 g udbytte som en 35 orange olie.
46 DK 174053 B1
Eksempel J: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer (in deholdende en anilindel) på en halv generation angivet ved hjælp af følgende skema: 5
O
h2naOVcH2CH(CH2NH2) 2 + H2C = CHC0CH3 ^ W -*
Forbindelse nr. 5 10 ° H2N-yo)>-CH2CH(CH2N (CH2CH2C0CH3)2)2 Forbindelse nr. 6
Triaminen (forbindelse nr. 5, denne forbindelses fremstilling 15 er vist i eksempel C) (0,42 g, 2,3 mmol) opløstes i methanol (10 ml) og blev dråbevis i løbet af 1 time sat til methylacry-lat (1,98 g, 23 mmol) i methanol (10 ml). Han lod blandingen omrøre ved omgivelsernes temperatur i 48 ti mer. Opløsni ngsmidlet blev fjernet på rotationsfordamperen, idet temperaturen 20 blev holdt på højst 40"C. Overskuddet af methylacrylat blev fjernet ved hjælp af gentagne azeotropiske destillationer sammen med methanol. Esteren (forbindelse nr. 6) blev isoleret som en orange olie (1,24 g).
Eksempel K: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer (in- 2 5 deholdende en anilindel) på en generation angivet ved hjælp af følgende skema: 30 35 47 DK 174053 B1
Forbindelse nr. 6 + H2NCH2CH2NH2 -CTTJDH-> 0 j—v ® h2NaO)‘ch2ch(ch2n(ch2ch2cnhch2ch2nh2) 2) 2 5 '—
Forbindelse nr. 7
Esteren (forbindelse nr. 6) (1,24 g, 2,3 mmol) blev opløst i methanol (50 ml) og blev dråbevis i løbet af 2 timer sat til ethylendiamin (73,4 g, 1,22 mol) i methanol (100 ml). En ringe 10 eksoterm iagttoges, og kraftig omrøring blev opretholdt. Opløsningen henstilledes til omrøring ved omgivelsernes temperatur i 72 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet på rotationsfordamperen ved 60eC. Overskuddet af ethyl end iamin fjernedes ved anvendelse af en ternær azeotrop af toluen-methanol-ethylendi-15 amin. Til slut fjernedes alt tilbageværende toluen sammen med methanol, og nedpumpning derefter med en vakuumpumpe i 48 timer resulterede i aminen (forbindelse nr. 7) (1,86 g) som en gul/orange olie.
20 Eksempel L: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer (in deholdende en anilindel) på halvanden generation angivet ved hjælp af følgende skema:
Forbindelse nr. 7 + H2C=CHC0CH3 25 -> 0 0 /—\ 11 " H2N\0)-CH2CH(CH2N(CH2CH2CNCH2N (CH2CH2C0CH3)2)2)2
Forbindelse nr. 8 30 Aminen (forbindelse nr. 7) (1,45 g, tilbageværende spor af methanol) blev opløst i methanol (100 ml) og blev langsomt i løbet af 1% time sat til en omrørt opløsning af methylacrylat (5,80 g) i methanol (20 ml). Man lod opløsningen omrøre i 24 timer ved stuetemperatur. Fjernelse af opløsningsmidlet efter-35 fulgt af gentagne azeotropiske destillationer sammen med methanol muliggjorde fjernelse af hele overskuddet af methyla-crylat. Efter nedpumpning med en vakuumpumpe i 48 timer isole-redes esteren (forbindelse nr. 8) som en orange olie (2,50 g, 1,8 mmol).
48 DK 174053 B1
Eksempel M: Hydrolyse af 4,5 generation dendrimer og fremstilling af calciumsalt.
4,5 generation PAMAM (estertermineret, initieret fra NH3) 5 (2,11 g, 10,92 mækv.) blev opløst i 25 ml methanol, og dertil sattes 10% NaOH (4,37 ml, 10,92 mækv.) (pH = 11,5-12). Efter 24 timer ved stuetemperatur var pH-værdien ca. 3,5. Efter yderligere 20 timer blev opløsningen inddampet på rotationsfordamper, 20 ml toluen blev tilsat, og der blev atter inddam-10 pet på rotationsfordamper.
Den resulterende olie blev opløst i 25 ml methanol og udfældet som en hvid gummi efter tilsætning af 75 ml di ethyl ether. Væsken blev dekanteret fra, og gummien blev inddampet på rota-15 ti onsfordamper til opnåelse af et meget fint off-white pulver, som efter yderligere tørring resulterede i 2,16 g produkt (98% udbytte). Ingen estergrupper fandtes ved NMR og infrarød analyse .
20 Natriumsaltet af 4,5 generation PAMAM (estertermineret, initieret fra NH3) blev erstattet med calciumsaltet via dialyse. Natriumsaltet (1,03 g) blev opløst i 100 ml vand og ført gennem hule fiberdialyserør (afskæringsværdi = 5.000) med 3 ml/ minut. Det ydre af røret Diev noidt nedsænket i 6% CaCl2 — op— 25 løsning. Denne procedure blev derpå gentaget.
Den resulterende opløsning blev atter dialyseret, denne gang mod vand, hvilket blev gentaget to yderligere gange.
30 Inddampn i ng resulterede i 0,6 g vådt fast stof, som blev optaget i methanol (ikke fuldstændig opløseligt) og derpå tørret til opnåelse af 0,45 g off-white krystaller.
C3$9^5920141N91Ca24, beregnet - 10,10% Ca++
Molekylvægt = 9.526,3, beregnet = C-4432,1, H-601,8, 0-2255,9, N-1274,6, Ca-961,9) 35 49 DK 174053 B1
Teoret i sk: C-46,5, H-6,32, N-13,38, Ca-10,10
Fundet: C-47,34, H-7,00, N-13,55, Ca-8,83
Eksempel N: Fremstilling af dendrimerer med terminale carbo- 5 xylatgrupper.
Halvgenerat ions-stjerneeksplosionspolyami doami ner blev hydrolyseret til omdannelse af deres terminale methyl estergrupper til carboxyl ater. Dette frembragte sfæroide molekyler med ne-10 gative ladninger spredt på periferien. De hydrolyserede dendrimerer lå i intervallet fra 0,5 generation (3 carboxylater) til 6,5 generation (192 carboxy1 ater).
Produkterne kunne dannes som Na+-, K+-, Cs+- eller Rb+-salte.
15
Eksempel 0; N-t-butoxycarbony1-4-aminobenzylmalonat-dimethyl-ester.
4-aminobenzylmalonat-dimethylester (11,62 g, 49 mmol) blev op-20 løst i 50 ml t-butanoltvand (60:40) under omrøring. Di-t-but-oxydicarbonat (19,70 g, 90 mmol) blev tilsat, og reaktionsblandingen blev omrørt natten over. Butanolen blev fjernet på rotationsfordamperen, hvilket resulterede i en gul suspension af produktet i vand. Ekstraktion i methylenchlorid, tørring 2 5 (MgS04) og i nddampn i ng resulterede i en gul olie (21,05 g, forurenet med di-t-butoxydicarbonat). Rekrysta11 i sat ion fra 2-propanol:vand (75:25) resulterede i bleggule krystaller (11,1 g, 33 mmol, 67%). Formlen blev bekræftet ved hjælp af 13C-NMR, og renhed blev kontrolleret ved hjælp af HPLC-analy-30 se ("Spherisorb" 0DS-1, 0,05M H3PO4 pH 3: CH3CN 55:45). Materialet blev benyttet uden yderligere rensning.
Eksempel P: N-t-butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzy1)-l,4,8,ll-te- traaza-5,7-dioxoundecan.
N-t-butoxycarbony 1-4-am i nobenzylmalonat-d i methyl ester (88,82 g, 26 mml), der var fremstillet ifølge eksempel 0, blev opløst i 50 ml methanol. Denne opløsning blev dråbevis (2 timer) sat 35 50 DK 174053 B1 til en opløsning af frisk det i lieret ethylendiamin (188 g, 3,13 mol) og 20 ml methanol under en nitrogenatmosfære. Man lod opløsningen omrøre i 24 timer. Ethylendiamin/methanolop-løsningen fjernedes på rotationsfordamperen. Produktet oplø-5 stes i methanol, og toluen blev tilsat. Op 1csningsmidde1fjer-nelse på rotationsfordamperen resulterede i det rå produkt som et hvidt, fast stof (10,70 g forurenet med ethylendiamin).
Prøven blev delt i to prøver til rensning. Azeotropisk fjernelse af ethylendiamin sammen med toluen under anvendelse af 10 en soxhlet-ekstraktør med sulfonerede ionbytterperler i det poseagtigt lukkede rør til opfangning af ethylendiaminen resulterede i delvis dekomponer ing af produktet under dannelse af en brun olie. Det resterende produkt blev isoleret som et hvidt, fast stof fra toluenen ved afkøling (2,3 g, ca. 50%).
15 Analyse af en 10% opløsning i methanol ved hjælp af gaskromatografi (søjle, "Tenax" 60/80) viste ingen påviselig ethylendiamin i prøven (<0,1%). Den anden fraktion blev opløst i methanol til opnåelse af en 10% opløsning (efter vægt) og renset for ethylendiaminen ved hjælp af omvendt osmose under anven-20 delse af methanol som opløsningsmiddel. (Den benyttede membran var en "Filmtec" FT-30 i en tynd ’•Amicon” TCIR-kana 1 separator, idet ethylendiaminen går gennem membranen). Produktet blev isoleret som et hvidt, fast stof (2,7 g), hvori ingen påvise-liae mænader ethvlenriiam in kunne findes wed Gaskromatoorafi .
25 13ς NMR-dataene og HPLC-analyse ("Spheri sorb" ODS-1, 0,05 M
H3PO4 pH 3:CH3CN 55:45) stemte overens med den foreslåede formel. Produktet blev benyttet uden yderligere rensning.
Eksempel Q: Fremstilling af en stjerneeksplosionsdendrimer på 30 en halv generation ud fra N-t-butoxycarbony1-6-(4-am i noben-zy1)-1,4,8,ll-tetraaza-S,7-dioxoundecan.
N-t-butoxycarbony1-6-(4-am i nobenzyl )-1,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioxoundecan (5,0 g, 13 mmol), der var fremstillet ifølge eksem-35 pel P, blev opløst i 100 ml methanol. Methylacrylat (6,12 g, 68 mmol) blev tilsat, og opløsningen blev omrørtes ved omgivelsernes temperatur i 72 timer. Reaktionen måltes ved hjælp af HPLC ("Spheri sorb" ODSI, acetonitril: 0,04 ammoniumacetat 51 DK 174053 B1 40:60) til optimering af omdannelsen til det ønskede produkt. Opløsningen inddampedes til 30% faststof indhold, og methyl-acrylat (3,0 g, 32 mmol) blev tilsat. Reaktionsblandingen blev omrørt ved omgivelsernes temperatur, indtil ingen delvis al -5 kylerede produkter kunne påvises ved hjælp af HPLC (24 timer). Fjernelse af opløsningsmidlet ved 30°C ved hjælp af rotations-fordampning og nedpumpning til 1 mm Hg i 24 timer resulterede i produktet som en gul, viskos olie i et udbytte på 7,81 g.
13C NMR-dataene stemte overens med den foreslåede formel. Pro-10 duktet blev benyttet uden yderligere rensning.
Eksempel R: Fremstilling af en stjerneeksplosionsdendrimer på en hel generation ud fra N-t-butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzyl)-1,4,8,ll-tetraza-5,7-dioxoundecan.
15
Halvgenerationsproduktet (eksempel Q) (7,70 g, 10,45 mmol) blev opløst i 75 ml methanol og dråbevis i løbet af 2 timer sat til en omrørt opløsning af ethylendiamin (400 ml, 7,41 mol) og methanol (50 ml). Reaktionsblandingen blev omrørt ved 20 omgivelsernes temperatur i 48 timer. Ethylendiaminen og metha-nolen blev fjernet ved rotationsfordampning til opnåelse af en gul olie (11,8 g forurenet med ethylendiamin). Produktet blev opløst i 90 ml methanol og renset for ethylendiaminen ved hjælp af omvendt osmose ("Filmtec" FT-30 membran og tynd "Ami-25 con" TCIR-kanalseparator, methanol som opløsningsmiddel). Ef ter 48 timer kunne ingen ethylendiamin påvises ved hjælp af gaskromatografi (søjle, "Tenax" 60/80). Fjernelse af opløsningsmidlet på rotationsfordamperen efterfulgt af nedpumpning på en vakuumledning i 24 timer resulterede i produktet som et 30 gult, glasagt igt fast stof (6,72 g). Analyse ved hjælp af HPLC, PLRP-S-søjle, acetonitri 1:0,015M NaOH, 10-20% gradient i 20 minutter) og 13c NMR-analyse stemte overens med den foreslåede formel .
35 52 DK 174053 B1
Eksempel S: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer på halvanden generation ud fra N-t-butoxycarbony1-6-(4-aminoben-zy 1)-1/4,8,ll-tetraaza-5,7-dioxoundecan.
5 Etgenerationsproduktet (eksempel R) (2,14 g, 25 mmol) blev opløst i 12,5 ml methanol, og methylacrylat (3,5 g, 39 mmol) i 5 ml methanol blev tilsat. Opløsningen omrørtes ved omgivelsernes temperatur i 48 timer, idet reakt i onens forløb blev målt ved hjælp af HPLC ("Spherisorb" 0DS-1, acetonitri 1:0,04M ammo-10 niumacetat, 60;40). En ringe aliqot mængde af methylacrylat blev tilsat (3,5 g, 39 mmol), og reaktionsblandingen blev om rørt ved omgivelsernes temperatur i yderligere 72 timer. Fjernelse af opløsningsmidlet på rotationsfordamperen resulterede i produktet som en gul olie (3,9 g) efter nedpumpning natten 15 over med en vakuumpumpe. Produktet blev benyttet uden yderligere rensning.
Eksempel T: Fremstilling af en stjerneeksplosionspolymer på to fulde generationer ud fra N-t-butoxycarbonyl-6-(4-aminoben-20 zy1)-1,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioxoundecan.
Halvandengenerationsproduktet (eksempel S) (3,9 g, 2,5 mmol) blev opløst i 50 ml methanol og blev dråbevis i løbet af 2 timer sat til en omrørt opløsning af ethylendiamin (600 g, 10 25 mol) og methanol (50 ml). Opløsningen blev omrørt ved omgivelsernes temperatur under en nitrogenatmosfære i 96 timer. Ethy-1 end iaminen/methanolen blev fjernet på rotationsfordamperen til opnåelse af et gult, glasagtigt fast stof (4,4 g, forurenet med ethy1 end i am in). En 10% opløsning af produktet blev 30 fremstillet i methanol og renset for ethylendiamin ved hjælp af omvendt osmose (som membran benyttedes en "Filmtec" FT-30 i en tynd "Amicon" TCIR-kanalseparator), indtil ingen ethylendiamin kunne påvises ved hjælp af gaskromatografi (søjle, "Tenax" 50/80). Fjernelse af opløsningsmidlet resulterede i 35 produktet som et gult, glasagtigt fast stof (3,52 g). 13C NMR-data og HPLC-analyse (PLRP-S-søjle, acetonitri 1:0,015M NaOH, 10 til 20% gradient på 20 minutter) stemte overens med den foreslåede formel.
53 DK 174053 B1
Eksempel U: Omsætning af togenerationsstjerneekslosionspolyme-ren med bromeddikesyre til opnåelse af en methylencarboxylat-termineret stjerneeksplosionsdendrimer.
5 Andengenerationsproduktet (eksempel T) (0,22 g, 0,13 mmol) blev opløst i 15 ml deioniseret vand, og temperaturen blev indstillet til 40,5eC. Bromeddikesyre (0,48 g, 3,5 mmol) og 1ithiumhydroxid (0,13 g, 3,3 mmol) blev opløst i 5 ml deioniseret vand og sat til reaktionsblandingen. Reaktionsblandin-10 gens pH-værdi blev omhyggeligt holdt ved 9 under anvendelse af en pH-stat (titrering med 0, IN NaOH) ved 40,5°C natten over.
Måling ved hjælp af omvendt fase HPLC ("Spherisorb" 0DS-l-søj-le, elueringsmiddel 0,25M H3PO4, pH 3 [NaOH]: acetonitril 85: 15) bekræftede syntesen af overvejende en enkelt komponent.
15
Eksempel V: Fremstilling af en isothiocyanatfunktionaliseret methylen-carboxylattermineret andengenerations-stjerneeksplo-sionsdendrimer.
20 5 ml af en 2,8 mM opløsning af den methy1encarboxy1attermine- rede andengenerations-stjerneeksplosionsdendrimer (eksempel U) blev fortyndet med 20 ml vand, og pH-værdien blev indstillet til 0,5 med koncentreret saltsyre. Efter en time ved stuetemperatur blev blandingen analyseret ved hjælp af HPLC til veri-25 ficering af fjernelsen af butoxycarbony 1 gruppen og derpå behandlet med 50% natriumhydroxid til at indstille pH-værdien til 7. En pH-stat (titrering med 0,1N NaOH) blev benyttet til at holde pH-værdien ved 7, og 225 μΐ thiophosgen blev tilsat.
Efter 15 minutter ved stuetemperatur blev blandingens pH-vær-30 di indstillet til 5 med IN HC1. Blandingen blev vasket med chloroform (20 ml x 2) og derpå koncentreret på en rotationsfordamper ved formindsket tryk. Den udvundne rest på 0,91 g er en blanding af isothiocyanatet og salte.
35 54 DK 174053 B1
Eksempel W: Fremstilling af anderigenerations-stjerneeksplosi- onspolyethylenimin-methansulfonamid.
Til en opløsning af 125 g N-methansulfonylaziridin i 50 ml 5 ethanol sattes 25,0 g tris(2-aminoethyl)amin. Opløsningen blev omrørt ved stuetemperatur i 4 dage. Vand blev sat til reaktionsblandingen efter behov til opretholdelse af opløsningens homogenitet. Opløsningsmidlet blev fjernet ved destillation under vakuum til opnåelse af andengenerations-stjerneeksplo-10 sions-PEI-methansulfonamidet som et gult glas (161 g).
Eksempel X: Fraspaltning af methansulfonamider til dannelse af andengenerati ons-stjerneeksplosi onspolyethylen imin.
15 En opløsning af 5,0 g andengenerations-stjerneeksplosions-PEI-methansul fonamid fra eksempel W i 20 ml 38% HC1 blev lukket inde i en glasampul. Ampullen blev opvarmet til 160*C i 16 timer og derpå afkølet i et isbad og åbnet. Opløsningsmidlet fjernedes ved destillation under vakuum, og resten blev opløst 20 i vand. Efter indstilling af opløsningens pH-v*rdi til mere end eller lig med 10 med 50% NaQH blev opløsningsmidlet fjernet ved destillation under vakuum. Toluen (150 ml) blev sat til resten, og blandingen opvarmedes til ti lbagesva1 ing under en Dean-Stark-udski 11 er, indtil intet yderligere vand kunne 25 fjernes. Opløsningen blev filtreret til fjernelse af salte, og filtratet inddampedes under vakuum til opnåelse af 1,9 g an-dengenerations-stjerneeksplosions-PEI som en gul olie.
Eksempel Y; Fremstilling af tredjegenerations-stjerneeksp1 o-30 sionspolyethylenimin-methansulfonamid.
Til en opløsning af 10,1 g andengenerations-stjerneeksplosi-ons-PEI fra eksempel X i 100 ml ethanol sattes 36,6 g N-me-thansulfonylaziridin. Opløsningen blev omrørt ved stuetempe-35 ratur i 1 uge. Vand blev tilsat efter behov til opretholdelse af opløsningens homogenitet. Opløsningsmidlet blev fjernet ved destillation under vakuum til opnåelse af tredjegenerations-st jerneksplosions-PEI-methansulfonamid som et gult glas (45,3 g).
55 DK 174053 B1
Eksempel Z: Fraspaltn ing af methansulfonamider til dannelse af tredjegenerations-stjerneeksplosionspolyethylenimin.
Methansulfonamidgrupperne tilhørende tredjegenerations-stjer-5 neeksplosions-PEI-methansulfonamid (5,0 g) fra eksempel Y blev fjernet ved hjælp af den samme procedure som beskrevet for andengenerationsmaterialet i eksempel X til opnåelse af 2,3 g tredjegenerations-stjerneeksplosions-PEI som en gul olie, 10 Eksempel AA; Omsætning af en tredjegenerat i ons-stjerneeksplosions polyethylenimin med 4-f 1 uor-ni trobenzen.
Tredjegenerati ons-stjerneeksplos ionspolyethy1enimi nen (eksem-pel Z) (1,06 g, 1,2 mmol) blev opløst i 12 ml absolut ethanol.
15 (4-f1uor)-nitrobenzen (120 μΐ, 1,2 mmol) blev tilsat, og reak tionsblandingen blev opvarmet under tilbagesvaling natten over. Opløsningsmidlet blev fjernet på rotationsfordamperen, og den lysegule olie opløstes i vand. Den vandige opløsning blev vasket med chloroform til fjernelse af al uomsat (4-flu-20 or)-nitrobenzen. Fjernelse af vandet resulterede i produktet som en dybgul olie (0,80 g). 13C NMR-spektret stemte overens med den foreslåede formel. (Intet forsøg blev gjort på at bestemme naturen af den statistiske fordeling). Produktet blev benyttet uden yderligere rensning.
25
Eksempel BBt Omsætning af nitrophenylderivatet af tredjegene-rations-stjerneeksplosionspolyethyleniminen med glycolonitri 1.
NitrophenyIderivatet af tredjegenerati ons-stjerneeksplosions-30 polyethyleniminen (eksempel AA) (0,80 g) blev opløst i 20 ml deioniseret vand. Natriumhydroxid (2,80 g, 50% vægt/vægt) blev sat til den omrørte opløsning, og opløsningen blev renset med nitrogen, idet luftning fandt sted gennem en natriumhydroxid-gasvasker. Glycolonitri1 (2,85 ml af en 70% vandig opløsning) 35 blev tilsat ved omgivelsernes temperatur. Dannelse af et gult præcipitat blev iagttaget efter nogle få minutter. Efter 2 timer blev temperaturen langsomt forøget til tilbagesvalingstemperatur, og opløsningen blev holdt ved tilbagesvaling under 56 DK 174053 B1 nitrogenrensning i 24 timer. Fjernelse af vandet resulterede i produktet som et gult, fast stof, der var forurenet med glycol syre og natriumhydroxid. 13c NMR-spektret stemte overens med den foreslåede formel. Produktet blev benyttet uden yder-5 ligere rensning.
Eksempel CC: Hydrogener i ng af ni trophenyIder ivatet til den aminophenylmethylencarboxylatterminerede tredjegenerat ions- stjerneeksplos ionspolyethylen imin .
10
Det gule fast stof fra eksempel BB (1,70 g) blev opløst i 10 ml deioniseret vand, idet opløsningens resulterende pH-værdi var ca. 11. Palladium på trækul (200 mg 5¾ Pd/C) blev sat til reaktionsblandingen i en Parr-glasrystef 1 aske. Reakt ionsbi an-15 dingen blev bragt under et hydrogentryk på 275 kPa og rystet ved omgivelsernes temperatur i et Parr-hydrogeneringsapparat i 6 timer. Reaktionsblandingen blev filtreret gennem et 0,5M Mi 11iporefi 1 ter til fjernelse af Pd/C, opløsningsmidlet fjernedes under vakuum, og der blev gelfiltreret gennem en "Bio- 20 gel” P2 harpiks (25 g kvældet med vand). Syrning med HC1 resulterede i en orangebrun opløsning, som blev renset med nitrogen natten over. Fjernelse af opløsningsmidlet under vakuum resulterede i produktet som hydrochloridsaltet, der var et blegbrunt fast stof (3,98 g, forurenet med Nåd og glycolsyre, 25 maksimal teoretisk produktmængde 1,15 g). Produktet blev be nyttet uden yderligere rensning.
Eksempel DD; Fremstilling af 4-isothiocyanatophenyl-methylen-carboxylattermi neret tredjegenerati ons-stjerneeksplos ionspoly-30 ethylenimin.
Produktet fra eksempel CC (3,98 g) blev opløst i 15 ml deioniseret vand, og en aliqot mængde (2,5 ml) af denne opløsning blev fortyndet med 10 ml vand. Opløsningens pH-værdi blev ind-35 stillet til 7 med natriumhydroxid. En pH-stat (titrering med IN NaOH) blev benyttet til at holde pH-værdien, og 200 μΐ thiophosgen blev tilsat. Efter 10 minutter blev blandingens pH-værdi indstillet til 4 med saltsyre. Vand blev fjernet på 57 DK 174053 B1 en rotationsfordamper ved formindsket tryk (en ringe mængde n-butanol blev tilsat til hindring af skumning). Resten blev vasket med methylenchlorid og derpå tørret. Det rå produkt (0,95 g), en blanding af isothiocyanat (0,14 g) og salte, blev benyt-5 tet uden yderligere rensning.
Eksempel EE: Fremstilling af en methylencarboxylattermineret andengenerations-stjerneeksplosionspolyamidoamin (initieret fra ammoniak).
10 Ånde ngenerations-stjerneeksplos i onspolyami doaminen (2,71 g, 2.6 mmol) og bromeddikesyre (4,39 g, 31,6 mmol) blev opløst i 30 ml deioniseret vand, og pH-værdien indstilledes til 9,7 med 5N NaOH under anvendelse af en pH-stat. Reaktionsblandingen 15 blev holdt ved denne pH-værdi i en halv time, og temperaturen blev langsomt forøget til 60®C og blev holdt ved 60eC i 3 timer ved konstant pH. pH-værdien blev hævet til 10,3, og reaktionsblandingen forblev under styring i pH-staten ved omgivelsernes temperatur natten over. Reaktionsblandingen blev opvar-20 met under tilbagesvaling i yderligere 4 timer inden oparbejdning. Fjernelse af opløsningsmidlet og fjernelse af de sidste spor af vand med methanol ved azeotrop destillation resulterede i produktet som et bleggult pulver (8,7 g, forurenet med natriumbromid). *3C NMR-spektret stemte overens med den fore-25 slåede formel (med nogen forurening som følge af en ringe mængde fej1 mater i a 1e som resultat af nogen monoa 1ky1 er ing).
Eksempel FF: Fremstilling af en methylencarboxylattermineret andengenera ti ons-stjerneeksplos ionspolyethy1 en imi n (initieret 30 fra ammoniak).
Andengenerations-stjerneeksplosionspolyethylen i minen (2,73 g, 6.7 mmol) fra eksempel X og bromeddikesyre (11,29 g, 81 mmol) blev opløst i 30 ml deioniseret vand. pH-værdien blev langsomt 35 forøget til pH 9,5 under bibeholdelse af temperaturen under 30®C. Temperaturen blev langsomt hævet til 55®C, og reaktionsblandingens pH-vardi blev holdt ved 9,5 i 6 timer ved hjælp af en pH-stat (titrering med 5N NaOH). pH-værdien blev hævet til 58 DK 174053 B1 10,2 og holdt ved denne pH-værdi natten over. Fjernelse af opløsningsmidlet på rotationsfordamperen og azeotropisk fjernelse af de sidste spor af vand under anvendelse af methanol resulterede i produktet som et gult pulver (17,9 g, forurenet 5 med natriumbromid). 13C NMR-spektret stemte overens med den foreslåede formel (med nogen forurening som følge af en ringe mængde fej1 mater i a 1e som resultat af nogen monoalkylering).
Eksempel GG; Fremstilling af en 3,5-, 4,5-, 5,5- og 6,5-gene-10 rat ions-stjerneeksplosions-PAMAM.
Til en 10 vægt* methanolisk opløsning af 2,46 g tredjegenera-tions-stjerneeksplosions-PAMAM sattes 2,32 g methy1acrylat.
Denne blanding lod man henstille ved stuetemperatur i 64 ti-15 mer. Efter fjernelse af opløsningsmiddel og overskud af me- thylacrylat udvandtes 4,82 g produkt (105% af det teoretiske).
Fremstilling af højere %-generations-stjerneeksplosions-PA- · MAM'er: 20 4,5-, 5,5- og 6,5-generationer blev fremstillet som ovenfor beskrevet uden nogen signifikante forskelle i reaktantkoncentrationer, reaktant-molforhold eller reaktionstider.
25 Eksempel HH: Fremstilling af en 4-, 5- og 6-generations-stjer-neeksplos ions-PAMAM.
Til 2000 g forinden destilleret ethylendiamin sattes 5,4 g 4%-generations-stjerneeksplosions-PAMAM som en 15 vægt* opløs-30 ning i methanol. Denne lod man henstille ved stuetemperatur i 48 timer. Methanolen og det meste af den overskydende ethylendiamin lod man fjerne ved hjælp af rotationsfordampning under vandsugervakuum ved en temperatur under 60eC. Den samlede vægt af udvundet produkt var 8,07 g. Gaskromatografi viste, at pro-35 duktet stadig indeholdt 34 vægt* ethylendiamin på dette tidspunkt. En 5,94 g portion af dette produkt blev opløst i 100 ml methanol og ultrafiItreret til fjernelse af den tilbageværende ethylendiamin. Filtreringen blev foretaget under anvendelse 59 DK 174053 B1 af en "Amicon" TC1R tyndkanalrecirkulat ionsseparator, der var udstyret med en "Amicon" YM2-membran. En in-line trykreduktionsventil blev benyttet til at holde et tryk på 380 kPa på tværs af membranen. De 100 ml blev først koncentreret til 15 5 ml ved at presse udelukkende en opløsningsmiddelstrøm gennem membranen. Efter denne indledningsvise koncentrering blev strømmen omdannet til en retentatrecirkulationsarbejdsmåde med konstant volumen i 18 timer. Efter denne tid blev 60 ml methanol ført gennem membranen til udvinding af produkt, der stadig 10 fandtes i modulet og dermed forbundne rørdele. Produktet blev befriet for opløsningsmiddel, og 2,53 g femtegenerations-stjerneeksplosions-PAMAM blev udvundet. Analyse ved hjælp af gaskromatografi viste, at 0,3% restethylendiamin forblev i produktet.
15
Fremstilling af generation 4 og 6 foregik som ovenfor anført, idet den eneste forskel er vægtforholdet mellem ethylendiamin og udgangsmateriale. Til fremstilling af fjerde generation var dette forhold 200:1, og til sjette generation var dette for-20 hold 730:1.
Eksempel 1: Inkorporering af 2-(acetyloxy)benzoesyre (aspirin) i stjerneeksplosionsdendrimerer.
25 En i vid udstrækning accepteret metode til at fastslå, hvorvidt et "sondemolekyle" er indeholdt i det indre af en micelle, består i at sammenligne dens carbon-13-rotationsgitterrelaksationstider (T 2 ) i et ikke-mi cel li seret medium i forhold til i et micelliseret medium. En væsentlig formindskelse i Tj 30 for det micel 1iserede medium er tegn på "sondemolekyle"-inkor-porering i micellen. Eftersom stjerneeksplosionsdendrimerer er "covalent fikserede" mi cel!eanaloger, blev denne T^-relaksati-onstidsmetode benyttet til at fastslå den grad/det omfang, hvori forskellige molekyler af farmaceutisk type var tilknyt-35 tet stjerneeksplosionspolyamidoaminer. I det følgende eksempler blev Τχ-værdier for (acetyloxy)benzoesyre (I) (aspirin) bestemt i opløsningsmiddel (CDC139 og derpå sammenlignet med Tj-værdier i CDCI3 ved forskellige [I:deridrimer]-molforhold.
60 DK 174053 B1 I nkorporer ing af aspirin (I) i forskellige stjerneeksplosions-polyamidodendrimerer som funktion af generation.
Forskellige halvgenerations {esterterm i nerede, initieret fra 5 NH3)-stjerneeksplosionspolyamidoamindendrimerer (G = 0,5 -* 5,5) blev kombineret med 2-(acetyloxy)benzoesyre i CDC13 til opnåelse af syre:tertiær amin-forhold = 1,0, En afsætning af T1-værdier for 2-(acetyloxy)benzoesyre mod generation af tilsat stjerneeksplosionsdendrimer (se fig. 4, hvor · repræsente-10 rer C-4, Π betegner C-6, og o betegner C-5, viser, at T1 når et minimum i løbet af generationsintervallet 2,5 -► 5,5 for carbonatomerne 4, 5 og 6 i 2-(acetyloxy)benzoesyre. Dette viser tilknytning af 2-(acetyloxy)benzoesyre i dendrimererne (G » 2,5 -» 5,5) og bekræfter yderligere, at polyamidoaminden-15 drimerer (Gen « 2,5 eller større) kan fungere som bærermolekyler.
Eksempel 2: Frigørelse af pseudoephedrin fra stjerneeksplosi onsdendrimer - PAMAM.
20
Pseudoephedrin (0,83 mg/ml) og PAMAM-stjerneeksplosionsden-drimer [1,0 mg/ml; G « 6,5; termina 1 gruppe (Z) = 192 (methyl-ester)] blev opløst i deioniseret destilleret vand, og donorfasens pH-værui blev indstillet til 5,5 med natriumhydroxid-25 opløsning og opbevaret ved stuetemperatur i ca. 12 timer. Opløsning af pseudoephedrin alene blev behandlet på den samme måde (kontrol). Lægemiddeldendrimeropløsningen blev opbevaret ved 40eC i 8 timer efter det første forsøg, og dynamisk dialyse blev udført. Den benyttede dialysemembran var en "Spectra/ 30 Por" Ί, MWCO 1.000, der var 28,6 mm i diameter, i spektrum-se-parationsceller (halvcellevolumen 5 og 10 ml, celledimensioner: 38 mm diameter for begge cellerne, og celledybden på 10 og 20 mm for henholdsvis 5 og 10 ml celler).
35 Prøver blev analyseret ved hjælp af en HPLC-procedure, der var udviklet til pseudoephedr inbeti ngel ser, der er som følger.· Søjle: "uBondapak" C-18
Mobil fase: pH 3,2-phosphatpuffer plus acetonitril (80:20) 61 DK 174053 B1
Strømningshastighed: 0,3 ml/minut Påvisning: UV ved 210 nm
Retentionstid: 13,3 minutter.
5 Dialysemembranen blev vasket med deioniseret vand og blev holdt neddykket i receptorfasen i mindst 12 timer før anvendelse. Dialysemembranen blev placeret mellem donorrummet og receptorrummet, og receptorrummet blev omrørt med lille magnetisk rotationsstang. Kendte volumener af donor- og receptor-10 opløsninger blev indført i de respektive rum, og overførsel af pseudoephedrin til receptorrummet blev fulgt som funktion af tid. For at opretholde synkebetingelser blev hele receptorfasen periodisk fjernet (hvert 30. minut) og erstattet med frisk receptorfase. Mængden af pseudoephedrin blev analyseret i prø-15 ver af receptorfasen. Forsøg blev udført ved stuetemperatur (22*C). Receptorfasen var almindeligt deioniseret destilleret vand.
Resultaterne af dynamisk analyse er vist i fig. 5. I fig. 5 20 betegner · kun pseudoephedrin (kontrol), (7) betegner pseudo-ephedrin plus dendrimeren, og © betegner pseudoephedrin plus dendrimeren ved 40*C, 8 timer før dialyse. Det vil fremgå, at i nærværelse af G = 6,5-dendrimer i donorrummet er pseuodo-ephedrins dialysehastighed formindsket. Lagring af donoropløs-25 ningen ved 40°C viser sig yderligere at formindske dialysehastigheden .
Forsøget blev gentaget med lavere koncentrationer (forholdet mellem antal lægemiddelmolekyler og antallet af terminale 30 grupper blev holdt på det samme). G = 6,5-dendrimer 120 μ/ml, pseudoephedrin 100 μ/ml (122 μ/ml salt).
Dynamisk dialyse af pseudoephedrin (alene) ved denne lavere koncentration var næsten identisk med dialysen ved højere kon-35 centration. Fig. 6 sammenfatter resultaterne af dette forsøg, hvor · betegner kun pseudoephedrin (kontrol), og o betegner pseudoephedrin plus dendrimer.
Eksempel 3 62 DK 174053 B1
Proceduren ifølge eksempel 2 blev gentaget under anvendelse af de nedenfor anførte modifikationer.
5
Receptorfase: pH 7,4 phosphatpuffer
Donorfase: pH 7,4 phosphatpuffer plus lægemiddel og dendri- mer i følgende forhold: 10 1. G 6,5 : lægemiddel :: 1:192 2. G 5,5 : lægemiddel :: 1: 96 3. G 4,5 : lægemiddel :: 1: 48 4. G 6,5H: lægemiddel :: 1:192 5. G 5,5H: lægemiddel :: 1: 96 15 6. G 4,5H: lægemiddel :: 1: 48
De ovennævnte donorfasesammensætninger plus pseudoephedrin alene blev underkastet dynamisk dialyse. Bogstavet "H" efter dendrimergenerationstallet står for hydrolyseret dendrimer.
20 Hydrolyse blev gennemført ved hjælp af den i eksemplerne M og N beskrevne procedure.
Resultaterne af disse forsøg er sammenfattet i fig. 7, hvor donor- og receptorrummet indeholdt pH 7,4 phosphatpuffer. For 25 pseudoephedrin alene (P) er tre forsøgs middelkurve afsat (vist ved den fuldt optrukne linie), og et typisk forløb fra de andre forsøg er vist. I fig. 7 betegner de følgende symbo-ler dendrimeren tilhørende den angivne generation.
30 35
Tabel III
63 DK 174053 B1
Symbol Dendrimergeneration Q 5,5 5 φ B, 5 3 4,5
Θ 5,5H
O 6,5H
φ 4,5H
10
Pseudoephedrin viser sig ikke at associere med dendrimeren (uhydrolyseret) ved pH 7,4. Hydrolyse af de terminale funktionelle grupper til carboxylatform har en dramatisk virkning på dialysehastigheden (formindskelse). Generationstallet viser 15 sig ikke at påvirke dialysehastigheden.
Eksempel 4; Indvirkningsundersøgelser af salicylsyre sammen med PAMAM-stjerneeksplos i onsdendri merer.
20 Dette eksempel vurderede salicylsyres indvirkningsegenskaber sammen med PAMAM-stjerneeksplosionsdendrimerer. Disse dendri-merer bestod af en ammoniakinitieret kerne med gentagelsesenheder afledt af N-(2-aminoethyl)acrylamid. Begge fulde (amin-terminerede funktioner) og halv-(esterterminalgrupper)genera-25 tionspolymerer blev medtaget ved undersøgelserne. Forholdet mellem salicylsyre og stjerneeksplosionsdendrimerer, der blev benyttet ved forsøgene, resulterede i tilnærmelsesvis ét sali-cylsyremolekyle til én terminal amin-funktionel gruppe for helgenerationspolymerer. Ved halvgenerationspolymerundersøgel-30 sen blev det samme forhold benyttet med indstillinger foretaget for polymeren med højere molekylvægt.
Forsøgene blev udført ved stuetemperatur under anvendelse af en statisk 1igevægtscelledialysemetodik. Statiske "spektrum"-35 dialyseceller (halvt cellevolumen, 10 ml), der var separeret ved hjælp af "SpectraPor” 6-membraner (molekylvægt-afskæringsværdi * 1.000), blev benyttet til alle forsøg. Transport af salicylsyre blev målt som funktion af tid ved fjernelse af 64 DK 174053 B1 aliqot mængder fra de pågældende cellerum og analyseret ved hjælp af HPLC-analyse under anvendelse af en U.V.-detektor ved 296 nm ("Bondupak" C-18 søjle, eluering af mobil fase af ace-tom'tril/Ο,ΙΜ phosphatpuffer (pH 3,2) med et forhold på 20:80 5 (V/V), indstillet til en strømningshastighed på 30 ml/time).
10 ml af en opløsning indeholdende 1 mg/ml salicylsyre og 2,5 mg/ml stjerneeksplosionspolymer (Gen 4,0), der var indstillet til pH 6,65 og 5,0 med HC1-opløsning, blev placeret i dialyse-10 cellens donorrum, og et tilsvarende volumen renset vand, der var indstillet til de samme pH-værdier, blev anbragt i receptorrummet. Transport af salicylsyre til receptorrummet blev målt. Resultaterne er anført i fig. 8. I fig. 8 er den frie syre angivet ved ·, syren plus generation 4,0 dendrimer, pH 15 6,65 er vist ved 0, og syren plus generation 4,0 dendrimer, pH
5,00, er vist ved hjælp af O-
Som følge af den lavere procentiske ionisering af amingrupper-ne på polymeren ved pH 6 kan et større omfang af indvirkning 20 med salicylsyre forventes ved pH 5, hvilket ville resultere i en mindre mængde transporteret forbindelse ved den lavere pH-værdi. Resultaterne anført i fig. 8 viser en meget mindre procentdel salicylsyre transporteret i nærværelse af polymer ved begge undersøgte pH-værdier sammenlignet med sal icy1syrekon-25 trolundersøgelsen. Det iagttages også, at mere salicylsyre transporteres ved pH 6,65 end ved pH 5,0 som forudsagt. Dataene viser en omsætning af stjerneeksplosionspolymeren med salicylsyre, der kan styres ved hjælp af pH. Forsinkede frigørelsesegenskaber medføres også af dataene, eftersom salicylsy-30 remængderne i nærværelse af polymer fortsætter med at stige efter det tilnærmelsesvise 12-timers ligevægtspunkt, der blev iagttaget ved kontrolundersøgelsen.
For yderligere at undersøge vekselvirkningsegenskaberne for 35 salicylsyre sammen med stjerneeksplosionspolymerer (Gen = 4,0) udførtes et forsøg ved pH 8,0. Undersøgelsens udformning afveg fra den tidligere beskrevne ved, at kun salicylsyreopløsnin-gen (1 mg/ml), indstillet til pH 8,0, blev anbragt i donorrum- 65 DK 174053 B1 met, og at polymeropløsningen {2,5 mg/ml) blev placeret i receptorrummet. Tab af salicylsyre fra donorrummet blev målt som tidligere beskrevet. Resultaterne af forsøget er angivet i fig. 9. I fig. 9 er den frie syre betegnet ved og syren 5 plus generation 4,0 dendrimer ved pH 8,0 er angivet ved --Δ---.
Som vist i fig. 9 afviger ligevægtsegenskaberne for salicylsyre i donorrummet med stjerneeksplosionspolymerer i receptor-10 rummet fra sal icylsyre-kontrol undersøgel sen. Baseret på molekylernes ioniseringsegenskaber ved pH 8,0 forventes en omsætning på tilnærmelsesvis 6-7%. Det iagttagne reaktionsomfang er angivet som værende af størrelsen 4-5%. Den mindre iagttagne associering kan skyldes forsøgsvariationer eller en 15 ioniseringskonstant på mindre end 1.
Dette forsøg viser en optagelse eller fjernelse af fri salicylsyre fra systemets kontinuerte fase ved hjælp af polymeren.
Denne virkningstype kunne resultere i undertrykkelse af mole-20 kylers reaktivitet, hvilket antyder, at en mulig egenskab af chelaterende type er forbundet med polymererne.
Salicylsyres indvirkningsegenskaber ved pH 6,65 på en halv-generationsstjerneeksplosionspolymer (Gen = 4,5) med ester- 25 terminerede funktionelle grupper blev bedømt. Salicylsyre (1 mg/ml) blev kombineret med stjerneeksplosionspolymer (Gen = 4,5) i en mængde på 3,6 mg/ml ved pH 6,65. 10 ml af opløsningen blev anbragt i donorrummet, og transport fra donorrummet blev målt som tidligere beskrevet. Resultaterne er anført i 30 fig. 10. I fig. 10 er den frie syre angivet ved hjælp af -·-, og syren plus polymeren er angivet ved hjælp af o .
Under disse forsøgsbetingelser forudsiges ingen ladnings indvirkning at finde sted, eftersom de tertiære amingrupper er 35 ikke-ioniserede ved pH 6,65. Som vist i fig. 10 er tabet af salicylsyre i nærværelse af polymer (Gen = 4,5) i løbet af de første 10 dialysetimer praktisk taget identisk med tabet ved sal icylsyre-kontrol undersøgel sen.
66 DK 174053 B1
De følgende iagttagelser er foretaget ud fra dataene vist i dette eksempel: (1) Hel generation PAMAM-stjerneeksplosionspolymerer fungerer 5 som en bærer for salicylsyre.
(2) Hel generation PAMAM-stjerneeksplosionspolymerer har forsinket frigørelsesfunktionalitet for salicylsyre.
10 (3) Hel generation PAMAM-stjerneeksplosionspolymerers bærer- egenskaber for salicylsyre kan styres ved hjælp af pH.
Eksempel 5: Påvisning af multipel chelatering af jern ved hjælp af en natriumprop ionattermineret sjettegenerations-15 stjerneeksplos ionspolyarn i doam in.
Den natri umpropionatterminerede sjettegenerati onspolyami doamin (initieret fra ammoniak) (97,1 mg, 2,45 mol) blev opløst i 2,5 ml deioniseret vand. Tilsætning af 0,5 ml 0,5N HC1 formindske-20 de pH-vardien til 6,3. Ferrichlorid blev tilsat (0,5 ml, 0,1 2M opløsning, 0,051 mmol), hvilket producerede et lysebrunt gelatinøst præcipitat. Ved opvarmning til 60®C i % time blev det gelatinøse præcipitat opløseligt, hvilket resulterede i en homogen orange opløsning. Opløsningen blev filtreret gennem 25 "Biogel" P2-acrylamidgel {10 g, 2 gange), idet der isoleredes et orange bånd (fri for ha 1 ogen idforuren ing) . Fjernelse af opløsningsmidlet under vakuum resulterede i produktet som en o-range film (30 mg). Analyse stemte overens med chelatering af ca. 20 mol ferriioner pr. mol stjerneeksp1 os ionsdendri mer.
30 35
Tabel IV
67 DK 174053 B1
Fundet _______Teoretisk____
Na4Fe20H128SB Na5Fe20Hl27SB NagFe20H126SB Na 0,39, 0,24 0,25 0,31 0,38 5 (0,31 0,1%)
Fe 3,14, 3,11 3,05 3,05 3,04 (3,12 0,02%) C 47,11 49,87 49,84 49,81 H 7,33 7,31 7,30 7,29 N 14,81 14,49 14,48 14,47 0 ---- 25,03 25,02 25,01 10 Molekylvægt 36632,23 36654,21 36375,18 SB « C152iH2467N3790573*
Disse resultater bekræfter chelatering af 20±2 mol ferriioner pr. mol stjerneksplosionsdendrimer.
1 5
Eksempel 6: Fremstilling af et produkt indeholdende mere end et rhodiumatom pr. stjerneeksplosionspolymer.
2,5 Gen PAMAM (estertermineret, initieret fra NH3) (0,18 g, 0,087 mmol) og RhCl3,3H20 (0,09 g, 0,3 mmol) blev blandet i 20 dimethylformamid (DMF) (15 ml) og opvarmet til 70*C i 4 timer. Opløsningen blev højrød, og det meste af rhodiumet blev optaget. Det uomsatte rhodium blev fjernet ved filtrering, og opløsningsmidlet fjernedes på rotationsfordamperen. Den dannede olie var chlorformopløselig. Den blev vasket med vand og tør-25 ret (MgS04) før fjernelse af opløsningsmiddel til opnåelse af en rød olie (0,18 g). NMR-spektret blev registreret i CDC13, og kun mindre forskelle blev iagttaget mellem den chelaterede og uchelaterede stjerneeksplosionspolymer. Fortynding af noget af denne CDC^-opløsning med ethanol efterfulgt af NaBH4~til-sætning resulterede i rhodiumudfældning. RhCl3,3H20 er uopløselig i chlorform og i chlorform-stjerneeksplosi onspol ymeropløsning, hvilket således bekræfter chelatering.
35 68 DK 174053 B1
Eksempel 7: Fremstilling af et produkt indeholdende Pd, der er chelateret til en stjerneeksplosionspolymer.
3,5 Gen PAMAM (estertermineret, initieret fra NH3) (1,1 g, 5 0,24 mmol) blev opløst under omrøring i acetonitril (50 ml).
Palladiumchlorid (0,24 g, 1,4 mmo 1) blev tilsat, og opløsningen opvarmedes til 70-75eC (vandbad) natten over. PdCl2 blev optaget i stjerneeksplosionspolymeren. Efter fjernelse af opløsningsmidlet bekræftede NMR i CDC13, at chelatering havde 10 fundet sted. Fortynding af CDClg-opløsningen med methanol og tilsætning af NaBH4 resulterede i udfældning af palladiumet.
Det chelaterede produkt (1,23 g) blev isoleret som en brun 0-1 i e.
15 Eksempel 8: Påvisning af multipel chelatering af yttrium ved hjælp af en methylencarboxylattermineret andengenerations-stjerneeksplosionspolyethylenamin ved transchelatering af y t-tri umacetat.
20 Det methy1encarboxylatterminerede stjerneeksplosionspolyethy-leniminmateriale (0,46 g, 52,5% aktivt, tilbageværende natri-umbromid, 0,18 mmol aktiv stjerneeksplosionsdendrimer) fra eksempel FF blev opløst i 4,5 ml deuteriumoxid. Den resulterende pH-værdi var 11,5-12. En opløsning af yttriumacetat d iév rrem — 25 stillet ved opløsning af yttriumchlorid (0,15 g, 0,5 mmol) og natriumacetat (0,41 g, 0,5 mmol) i 1,5 ml deuteriumoxid (2,9 mol yttrium pr. mol dendrimer). Aliqot mængder på 0,5 ml af yttriumacetatopløsn ingen blev sat til dendrimeropløsningen, og NMR-spektrene registreredes ved 75,5 MHz.
30 13C NMR spektret for yttriumacetat viser to resonanser, 184,7 ppm for carboxylcarbonatomet og 23,7 ppm for methy1carbonato-met, sammenlignet med 182,1 og 14,1 ppm for natriumacetat, og 177,7 og 20,7 ppm for eddikesyre (Sadtler 13c NMR-standard-35 spektre). Måling af positionerne for disse bånd viser chela-teringsgraden med stjerneeksplosionsdendrimeren. Det mest informative signal for stjerneeksplosionsdendrimeren, som er tegn på chelatering, er a-CH2 (tilhørende den i chelatering 69 DK 174053 B1 involverede methylencaboxylatgruppe), som forekommer ved 58,4 ppm i den uchelaterede dendrimer, og 63,8 ppm i den chelate-rede dendrimer. Efter chelatering med yttrium forkortes rotations gitterrelaksationstiderne for <x-CH2 som forventet fra 5 0,42 ± 0,01 s til 0,14 ± 0,01s, hvilket er tegn på chelatering.
Efter tilsætning af 0,5 ml af yttriumacetatopløsningen til stjerneeksplosionsdendrimeren viste alt yttrium sig at blive chelateret af dendrimeren, hvilket blev bekræftet af signaler-10 ne for acetatet, som er signalet for natriumacetat. Den samme iagttagelse blev gjort ved tilsætning af en anden 0,5 ml ali-qot mængde af yttriumacetatopløsningen. Efter tilsætning af en tredje aliqot mængde yttriumacetat viste ikke alt yttriumet sig at blive optaget som stjerneeksplos ionschel atet, og ace-15 tat-carboxy1 resonansen viste sig at skifte til 183,8 ppm, hvilket viser, at noget af yttriumet var blevet forbundet med acetatet. Det integrerede areal af de chelaterede-CH2~grupper på dendrimeren steg, hvilket viser, at noget af det tredje molækvivalent tilsat yttrium i virkeligheden var blevet chela-20 teret med dendrimeren. Disse resultater viser, at dendrimeren kan chelatere fra 2-3 yttriumioner pr. dendrimermolekyle.
Eksempel 9: Påvisning af multipel chelatering af yttrium ved hjælp af en methylencarboxylattermineret andengenerations-25 stjerneeksplosionspolyamidoamin ved hjælp af tranchelatering fra yttriumacetat.
De samme eksperimentelle metoder blev benyttet ved denne undersøgelse som blev benyttet til eksempel 8. Det methylen-car-30 boxylatterminerede stjerneeksplos ionspolyamidami nmat er i ale (0,40 g, 62,5¾ aktivt, tilbageværende natriumbromid, 0,12 mmol) blev opløst i 4-5 ml deuteriumoxid. Den resulterende pH-værdi var 11,5-12, som blev sænket til 9,4 med 6N HC1 før forsøget. En opløsning af yttriumacetat blev fremstillet ved op-35 løsning af yttriumchlorid (0,1125 g, 0,37 mmol) og natriumacetat (0,0915 g, 1,1 mmol) i 1,5 ml deuteriumoxid, således at hver 0,5 ml af opløsningen indeholder 1 molækvivalent metal.
70 DK 174053 B1
De første to molækvivalenter tilsat yttriumacetat blev fuldt ud chelateret af stjerneeksplosionpolyamidoaminen. Ved tilsætning af et tredje molækvivalent yttrium fandt udfældning af produktet sted, og ingen NMR-data kunne derfor opnås. Signa-5 lerne, som gav det meste information om chelatering ved hjælp af stjerneeksplos ionsdendr imeren, var signalerne fra de to carbonatomer stødende op til det chelaterende nitrogen. De kemiske skift af disse carbonatomer i den ikke-chelaterede den-drimer forekom ved 59,1 ppm for a-CH2~gruppen og ved 53,7 ppm 10 for det første methylencarbonatom i grundskelettet. Efter che-altering blev disse to resonanser iagttaget at skifte nedefter til henholdsvis 60,8 og 55,1 ppm. Trans-chelateringen viser, at to metalioner let kan chelateres pr. dendrimermolekyle, men at produktet fælder ud af opløsning efter chelatering af en 15 vis ukendt brøkdel af et tredje molækvi valent.
Eksempel 10: Påvisning af multipel chelatering af 90Y ved hjælp af en methylencarboxylattermineret andengenerations-stjerneeksplosi onspolyethyl en i mi n.
20
Standardopløsning af yttriumchlorid (3 x ΙΟ-2 m tilsat ikke-bærertilsat 9®Y) og methylencarboxylattermineret andengenera-tions-stjerneeksplosionspolyethylenimin (6 x 10"2 M) blev fremstillet. Disse blev omsat sammen ved forskellige metal: 25 stjerneeksplosionspolymerforhold i HEPES-puffer. Kompleksudbyttet blev bestemt ved hjælp af ionbytningskromatografi under anvendelse af "Sephadex” G50-ionbytterperler, idet der blev elueret med 10% NaCl:NH40H, 4:1, ved pH 10. Ikke-kompleksdan-net metal fjernes på søjlen, idet kompleksdannet metal elue-30 res. Udbytter opnåedes ved sammenligning af den eluerede radioaktivitet med radioaktiviteten på søjlen under anvendelse af en tæller med prøvekanal.
35
Tabel V
71 DK 174053 B1
Chelatering af 2,5 Gen. PEI-acetat med 5 Vol. Y+3 Vo1. PEI Vol. HEPES M:L teore- % kom- M:L, fundet __ _ _ tisk pleks__ 5 30 370 0,1 110 0,1 10 30 360 0,2 101 0,2 20 30 350 0,4 95 0,4 10 30 35 340 0,5 97 0,5 30 30 340 0,5 102 0,5 60 30 310 1,0 99 1,0 120 30 250 2,0 100 2,0 180 30 180 3,0 94 2,8 15 250 30 120 4,1 80 3,3 300 20 80 7,5 44 3,3 300 20 70 5,0 40 2,0 300 20 70 5,0 41 2,0 20 Alle volumener i tabel V er anført i mikroliter.
Indenfor forsøgenes nøjagtighed viser disse resultater, at det 2,5 Gen. stjerneeksplosions-PEI-acetat kan chelatere mellem 2 og 3 metaller pr. polymer under opnåelse af et opløseligt kom-25 pleks.
Eksempel 11: Konjugering af 4-isothiocyanatophenyl-methylen- carboxylattermineret t redjegenerat ions-stjerneeksplosionspoly-ethylenimin med IgG monoklonalt antistof.
30
Isothiocyanatet , 10 mg (50 pmol), fra eksempel OD blev opløst i 500 μΐ 3 mM indiumch1 or id, som var blevet tilsat radioaktivt indium-l11-chlor id, og pH-værdien blev indstillet til 9 med 660 μΐ IN NaOH. Aliqot mængder af helt monoklonalt antistof 35 IgG CC-46 blev derpå blandet med aliqot mængder af den chela-terede stjerneeksplosionspolymer. Blandingen blev rystet og derpå henstillet i 18 timer. Blandingerne blev derpå analyseret ved hjælp af HPLC (søjle DuPont "Zorbax Biosphere" GF-250; 72 DK 174053 B1 e1ueringsmidde1 0,25M natriumacetat, pH 6) og en UV-detektor ved 254 nm samt en radioaktivitetsdetektor. Resultaterne er vist i tabel VI.
5 Tabel VI
Stjerneeksplosions-IgG-konjugater _1 _2 _3 _4 10 IgG-opløsning {μ 1 ) 20 20 20 20
Opløsning af chelateret 5 20 50 100 stjerneeksplosionspolymer (μ1) % radioaktivitet på IgG 6 5 5 3 % konjugeret IgG 2 7 17 22 15
Eksempel 12; Konjugering af 4-isothiocyanatophenyl-methylen-carboxylattermineret tredjegenerations-stjerneeksplosionspolyet hyl en i mi n med IgG monoklonalt antistof.
20 Isothiocyanatet fra eksempel DD, 4 mg {20 pmol) blev blandet med 200 μΐ 3 mM indiumchlorid (60 pmol). En 20 μΐ aliqot mæng de af opløsningen blev derpå tilsat radioaktivt i ndium-111-chlorid, og pH-værdien blev indstillet til 9 ved tilsætning af 30 μΐ IN NaOH og 10 μΐ 0,iN HC1 . Indiurachelatet blev blandet 25 med 150 μΐ CC-49 helt antistof IgG, 10 mg/ml i 50 mM HEPES- puffer ved pH 9,5. Efter 18 timer ved stuetemperatur blev antistoffet udvundet ved hjælp af præparativ HPLC (søjle DuPont "Zorbax Biosphere" GF 250; elueringsmiddel 0,25 m natriumacetat, pH 6) og en UV-detektor ved 254 nm samt en radioaktivi-30 tetdetektor. Det udvundne antistof blev koncentreret på en "Amicon"-membran og udvekslet i PBS-puffer (phosphatpufferet saltopløsning, pH 7,4, som indeholder 0,12 M NaCl, 2,7 mM KC1 og 10,0 mM phosphat). Det udvundne antistof havde en specifik aktivitet på ca. 0,5 pci/100pg.
35 73 DK 174053 B1
Eksempel 13: Lokalisering in vivo af 1111 n-mærket stjerneeks- plos ions-an ti stofkonjugat.
Anvendeligheden af det ifølge eksempel 12 fremstillede mærke-5 de stjerneeksplosions-antistofkonjugat blev demonstreret ved måling af materialets optagelse i et humant tumor-fremmed-transplantat i en athymisk mus. Athymiske hunmus blev subkutant podet med den humane colon-carcinomacellelinie LS-174T (ca. 4 x 106 celler/dyr). Ca. to uger efter podning blev hvert 10 dyr injiceret via halevenen. Musene blev dræbt efter 17 og 48 timer (5 dyr på hvert tidspunkt), tumoren og udvalgt væv blev fjernet og vejet, og radioaktivitet blev målt i en gammatæller. Efter 17 timer havde 13,5¾ af den injicerede dosis pr. gram væv samlet sig ved tumoren. Efter 48 timer havde 21,6¾ af 15 den injicerede dosis pr. gram væv samlet sig ved tumoren.
20 25 30 35

Claims (29)

74 DK 174053 B1 Patentkrav.
1. Stjerneeksplosionskonjugat, kendetegnet ved, at 5 det omfatter mindst en stjerneeksplosionspolymer i forbindelse med mindst en enhed af mindst et båret farmaceutisk materiale.
2. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stjerneksplosionspolymeren er en stjerneeksplosionsdendrimer. 10
3. Konjugat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at mindst et af de bårede farmaceutiske materialer er et lægemiddel, et radionuklid, et chelater ingsmidde1, et chelateret metal, et toxin, et antistof, et antistof fragment, et antigen, 15 en signalfrembringer, en signalreflektor eller en signalabsorber .
4. Konjugat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der findes mindst to forskellige bårede materialer, hvoraf mindst 20 det ene er en målretter, ogmindst et af dem er et bioaktivt stof.
5. Konjugat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at mål-retteren er en entitet, der er specifik for en eller flere 25 mål receptorer, og at det bioaktive stof er et radionuklid, et lægemiddel eller et toxin.
6. Konjugat ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at målretteren er et polyklonalt antistof eller et fragment 30 deraf.
7. Konjugat ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at målretteren er et monoklonalt antistof eller et fragment deraf. 35
8. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den-driroeren indeholder diskontinuiteter. 75 DK 174053 B1
9. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge krav 1 med formlen: (P)x * (M)y (I) 5 kendetegnet ved, at hvert P betegner en dendrimer, X betegner et helt tal, der er 1 eller mere end 1, hvert M betegner en enhed af et båret farmaceutisk materiale, hvilket bårede farmaceutiske materiale kan være det samme bårede farmaceutiske materiale eller et forskelligt båret farmaceutisk 10 materiale, y betegner et helt tal, der er 1 eller mere end 1, og * ang i ver, at det bårede farmaceutiske materiale er forbundet med dendrimeren.
10 O
10. Konjugat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at M 15 er et lægemiddel, et radionuklid, et chelate- ringsmiddel, et chelateret metal, et toxin, et antistof, et antistoffragment, et antigen, en signalfrembringer, en signalreflektor eller en s ignalabsorber.
11. Konjugat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at x=l, og at y=2 eller mere.
12. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge krav 9, k e n d e - tegnet ved, at det molære forhold mellem ethvert ionisk 25. og Per 0,1-1.000:1.
13. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge krav 9, kende tegnet ved, at vægtforholdet mellem ethvert lægemiddel eller toxin M og P er 0,1-5:1. 30
14. Fremgangsmåde til fremstilling af et stjerneeksplosionskonjugat ifølge krav 9 med formlen (P)x * (M)y (I) 35 hvori hvert P betegner en dendrimer, x betegner et helt tal, der er 1 eller mere end 1, hverifcM betegner en enhed af et båret farmaceutisk materiale, idet nævnte bårede farmaceutiske materiale kan være det samme bårede farmaceutiske materiale DK 174053 B1 76 eller et forskelligt båret farmaceutisk materiale, y betegner et helt tal, der er 1 eller større end 1, og * angiver, at det bårede farmaceutiske materiale er forbundet med dendrimeren, kendetegnet ved, at P omsættes med M, sædvanligvis i et egnet opløsningsmiddel, ved en temperatur, der letter as-5 socieringen af det bårede materiale (M) med stjerneeksplosi-onsdendrimeren (P).
15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det egnede opløsningsmiddel er vand, methanol, ethanol, chloroform, acetonitril, toluen, dimethylsulfoxid eller dime- 10 thylformamid.
16. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge ethvert af kravene 1-11, kendetegnet ved, at også mindst et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel eller mindst en farmaceutisk acceptabel bærer er til stede deri. 15
17. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge krav 16, k e n d e -tegnet ved, at også andre aktive bestanddele er til stede deri.
18. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge ethvert af kravene 1-11, 16 og 17 til anvendelse som et diagnostisk middel.
19. Stjerneeksplosionskonjugat ifølge ethvert af kravene 1-11, 16 og 17 til anvendelse som en farmaceutisk bærer. 77 DK 174053 B1
20. Fremgangsmåde til fremstilling af et stjerneeksplosions-konjugat med formlen t(T)e - (C')f]g * (P)x * l(CM)h - (M)y3k (I”) hvori hver C betegner den samme eller forskellige forbindel-5 sesgrupper, C11 betegner den samme eller forksellige forbindelsesgrupper, g og k hver individuelt betegner et helt tal, der er 1 eller større end 1, f og h hver individuelt betegner et helt tal, der 0 eller større end 0, 10. angiver en covalent binding i tilfælde, hvor en forbindel sesgruppe er til stede, hvert P betegner en dendrimer, x betegner et helt tal, der er 1 eller større end 1, T betegner en målretter, hvert M betegner en enhed (f.eks. et molekyle, et atom, en ion 15 og/eller en anden grundenhed) af et båret farmaceutisk materiale, hvilket bårede farmaceutiske materiale kan være det samme bårede farmaceutiske materiale eller et forskelligt båret materiale, idet det bårede farmaceutiske materiale fortrinsvis er et bioaktivt stof, y betegner et helt tal, der er l eller større end 1 og * angiver, at det bårede farmaceut i ske materiale er forbundet med dendrimeren, kendetegnet ved, at den omfatter omsætning af P, som har reaktive molekyldele, med en forbindelsesgruppe, såsom en anilindel, der kan have NH2~gruppen beskyttet. 78 DK 174053 B1
21. Fremgangsmåde til fremstilling af et stjerneeksplosions-konjugat som defineret i krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter omsætning af P, der har reaktive molekyldele, med en forbindelsesgruppe, såsom en anilindel, der kan have 5 NH2-gruppen beskyttet.
22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at beskyttelsesgruppen har formlen 1° .-. 0 hvori R er -C(CH3)3, p Å -2-(J - .U.r SjQ) .
23. Fremgangsmåde ifølge krav 21 kendetegnet ved, at P også har en forbindelsesgruppe (greb) tilknyttet med formlen 25 X (°2n) 'é 30 hvori n er 1 eller 2, og X er F, Cl, Br, I, S02C1, og når n er 1, N02~gruppen findes i para-stil1 ingen.
24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, 35 at forbindelsesgruppen er 4-fluornitrobenzen.
25. Fremgangsmåde til fremstilling af et stjerneeksplosions-konjugat som defineret i krav 1, kendetegnet ved. 79 DK 174053 B1 at den omfatter omsætning af P, der har reaktive dele, med en anilindel, som kan have NH2~gruppen beskyttet ved hjælp af et N-phthalimid med formlen O 5 il Y®
26. Fremgangsmåde til fremstilling af et stjerneeksplosions-konjugat som defineret i krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter omsætning af P, som har reaktive dele, med en 15 anilindel, som kan have NH2-gruppen beskyttet ved hjælp af en hvilken som helst til aminer benyttet beskyttelsesgruppe, der er i ndi fferent under de til stjerneeksplos ionssyntese benyttede betingelser.
27. Fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspo- lyethylenimin, kendetegnet ved, at den omfatter omsætning af et stjerneeksplosionspolyethyleniminmethansulfon-amid med saltsyre. 2 5
28. Fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplos ionsden- drimer, hvori et opløsningsmiddel er til stede, kende-t e g n e t ved, at den omfatter fjernelse af opløsningsmidlet ved hjælp af ultrafiltrering under anvendelse af en membran . 30
29. Fremgangsmåde til fremstilling af et stjerneeksplosions-konjugat ifølge krav 1, ved hvilken stjerneeksplosionspol ymeren er en stjerneeksplosionsdendrimer, og det bårede materiale er et lanthanid, kendetegnet ved, at den omfatter 35 chelatering af lanthanidet med et stjerneeksplosionspolyethy-1 en imi nacetat.
DK198802053A 1986-08-18 1988-04-14 Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer DK174053B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89745586A 1986-08-18 1986-08-18
US89745586 1986-08-18
PCT/US1987/002074 WO1988001178A1 (en) 1986-08-18 1987-08-18 Starburst conjugates
US8702074 1987-08-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK205388D0 DK205388D0 (da) 1988-04-14
DK205388A DK205388A (da) 1988-06-14
DK174053B1 true DK174053B1 (da) 2002-05-13

Family

ID=25407923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198802053A DK174053B1 (da) 1986-08-18 1988-04-14 Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0271180B2 (da)
JP (6) JPH0757735B2 (da)
KR (1) KR970011151B1 (da)
AT (1) ATE89743T1 (da)
AU (2) AU609051B2 (da)
BR (3) BR8707431A (da)
DE (1) DE3786000T3 (da)
DK (1) DK174053B1 (da)
ES (1) ES2054678T5 (da)
FI (2) FI103410B (da)
GR (1) GR3024215T3 (da)
HK (1) HK54396A (da)
HU (2) HU209252B (da)
IE (1) IE61356B1 (da)
IL (1) IL83567A (da)
MX (1) MX169992B (da)
MY (1) MY102878A (da)
NO (1) NO176306C (da)
NZ (1) NZ221484A (da)
WO (3) WO1988001178A1 (da)
ZA (1) ZA876114B (da)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5560929A (en) * 1986-08-18 1996-10-01 The Dow Chemical Company Structured copolymers and their use as absorbents, gels and carriers of metal ions
US5914095A (en) * 1989-04-07 1999-06-22 Salutar, Inc. Polychelants containg amide bonds
DE69022542T2 (de) * 1989-05-26 1996-05-02 Akzo Nobel Nv Chelatierungsmittel zur bindung von metallionen zu proteinen.
US5808003A (en) * 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
US5292868A (en) * 1989-05-26 1994-03-08 Akzo N.V. Chelating agents for attaching metal ions to proteins
DE3930674A1 (de) * 1989-09-11 1991-03-21 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle chelatbildner zur komplexierung von tc- und re-isotopen, verfahren zu ihrer herstellung und darstellung von konjugaten daraus sowie deren verwendung in diagnostik und therapie
DE3938992A1 (de) * 1989-11-21 1991-05-23 Schering Ag Kaskadenpolymer-gebundene komplexbildner, deren komplexe und konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel
AU642980B2 (en) * 1990-03-21 1993-11-04 Quest International B.V. Ultilization of enzymes
GB9021671D0 (en) * 1990-10-05 1990-11-21 Unilever Plc Delivery of agents
AU641736B2 (en) * 1990-03-21 1993-09-30 Quest International B.V. Delivery of agents
AU642979B2 (en) * 1990-03-21 1993-11-04 Quest International B.V. Utilization and delivery of enzymes
IL99234A (en) * 1990-08-27 1994-05-30 Michigan Molecular Inst Non-cross-linked multi-branch polymers and their preparation
GB9112536D0 (en) * 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
FR2688508A1 (fr) * 1992-03-13 1993-09-17 Guerbet Sa Nouveau produit de contraste iode, son procede de preparation et son utilisation comme agent de contraste.
US5871713A (en) * 1991-12-04 1999-02-16 Guerbet S.A. Macromolecular polyamine iodine-containing compound, process for its preparation and its use as a contrast agent
CA2125188A1 (fr) * 1991-12-04 1993-06-10 Dominique Meyer Nouveau compose macromoleculaire polyamine iode, son procede de preparation et son utilisation comme agent de contraste
CA2118130A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Jean M. J. Frechet Dendritic based macromolecules and method of production
US5387617A (en) * 1993-01-22 1995-02-07 The Dow Chemical Company Small cell foams and blends and a process for their preparation
US5898005A (en) * 1993-02-24 1999-04-27 Dade Behring Inc. Rapid detection of analytes with receptors immobilized on soluble submicron particles
US6121056A (en) * 1993-02-24 2000-09-19 Dade Behring Inc. Random detection of antigens with antibodies immobilized on soluble submicron particles
WO1994019693A1 (en) * 1993-02-24 1994-09-01 Baxter Diagnostics Inc. Immobilization of specific binding assay reagents
FR2703055B1 (fr) * 1993-03-22 1995-07-07 Guerbet Sa Nouveaux composés polyiodés, leur préparation et leur utilisation en tant que produits de contraste pour la radiologie .
KR100361933B1 (ko) 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
US7097839B1 (en) 1993-10-26 2006-08-29 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
FI955320A7 (fi) * 1994-03-07 1995-11-24 Univ Michigan Bioaktiivisia ja/tai kohdennettuja dendriimikonjugaatteja
AU750411B2 (en) * 1994-03-07 2002-07-18 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
GB9407812D0 (en) * 1994-04-20 1994-06-15 Nycomed Salutar Inc Compounds
NL9400880A (nl) * 1994-05-27 1996-01-02 Dsm Nv Samenstelling bestaande uit een dendrimeer en een in het dendrimeer opgesloten actieve stof, een werkwijze voor de bereiding van een dergelijke samenstelling en een werkwijze voor het vrijstellen van de actieve stof.
NL9401886A (nl) * 1994-05-27 1996-01-02 Dsm Nv Samenstelling bestaande uit een dendrimeer en een in het dendrimeer opgesloten actieve stof, een werkwijze voor de bereiding van een dergelijke samenstelling en een werkwijze voor het vrijgeven van de actieve stof.
AUPM623994A0 (en) * 1994-06-15 1994-07-07 Biomolecular Research Institute Limited Antiviral dendrimers
WO1996019240A1 (en) * 1994-12-21 1996-06-27 Novartis Ag Oligonucleotide-dendrimer conjugates
FR2734268B1 (fr) * 1995-05-19 1997-07-04 Centre Nat Rech Scient Nouveaux dendrimeres fonctionnels a terminaisons phosphorees et leur procede de preparation
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6083708A (en) * 1995-08-11 2000-07-04 Dade Behring Inc. Polypeptide: dendrimer complexes
US5658574A (en) * 1995-10-13 1997-08-19 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. Cleansing compositions with dendrimers as mildness agents
NL1001753C2 (nl) * 1995-11-28 1997-05-30 Dsm Nv Samenstelling omvattende een kunststof en een additief.
DE19625982A1 (de) * 1996-06-28 1998-01-02 Wella Ag Kosmetisches Mittel zur Haarbehandlung mit Dendrimeren
DE69833186T2 (de) * 1997-01-13 2006-09-14 The Dow Chemical Company, Midland Nanoverbundmaterial von dendritischen polymeren
WO1998056427A1 (en) * 1997-06-12 1998-12-17 Mitsubishi Chemical Corporation Novel contrast media
DE19728954C1 (de) * 1997-06-30 1999-04-22 Schering Ag Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
FR2790642A1 (fr) * 1999-03-08 2000-09-15 Aventis Cropscience Sa Nouvelles compositions pesticides et/ou regulatrices de croissance
AU5522600A (en) * 1999-06-29 2001-01-22 Dako A/S Detection using dendrimers bearing labels and probes
BR0013171A (pt) 1999-07-29 2002-05-28 Epix Medical Inc Agentes multimericos para formação de imagem de objetivação através de ligação multi-local
FI19991705A7 (fi) * 1999-08-11 2001-02-12 Neste Chemicals Oy Antimikrobinen hyperhaaroittunut polymeerikoostumus
FR2797563A1 (fr) * 1999-08-18 2001-02-23 Rhodianyl Composes biocides et leur utilisation dans des polymeres thermoplastiques
US6991778B2 (en) * 1999-12-10 2006-01-31 Nitrosci Use of dendrimers polyl-functionalized with nitroxide groups as contrast enhancing agents in MRI imaging of joints and injectable compositions comprising them
DK1268716T3 (da) 2000-04-07 2008-01-02 Shell Int Research Fremgangsmåde til inhibering af gashydrattilstopning af ledninger
US6471968B1 (en) * 2000-05-12 2002-10-29 Regents Of The University Of Michigan Multifunctional nanodevice platform
CU23011A1 (es) * 2000-11-03 2004-12-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Método de obtención de estructuras antigénicas quemétodo de obtención de estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada específica y su potencian la reactividad cruzada específica y su uso en formulaciones uso en formulaciones
RU2280672C2 (ru) 2001-06-14 2006-07-27 Шелл Интернэшнл Рисерч Маатсхаппий Б.В. Способ солюбилизации асфальтенов в углеводородной смеси и смесь для осуществления способа
TWI221406B (en) 2001-07-30 2004-10-01 Epix Medical Inc Systems and methods for targeted magnetic resonance imaging of the vascular system
GB0209022D0 (en) 2002-04-19 2002-05-29 Imp College Innovations Ltd Compounds
US7696393B2 (en) 2002-09-03 2010-04-13 Shell Oil Company Method and compositions for inhibiting formation of hydrocarbon hydrates
EP1525890A1 (en) 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
CN1930304B (zh) * 2003-11-21 2016-01-06 Anp技术公司 不对称支化的聚合物缀合物和微阵列检测
BRPI0510093B8 (pt) * 2004-04-20 2022-12-27 Dendritic Nanotechnologies Inc polímeros dendríticos
US7985424B2 (en) 2004-04-20 2011-07-26 Dendritic Nanotechnologies Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
JP5329755B2 (ja) 2004-08-13 2013-10-30 日本曹達株式会社 多分岐ポリマー
US20090104119A1 (en) * 2004-08-25 2009-04-23 Majoros Istvan J Dendrimer Based Compositions And Methods Of Using The Same
DE602005006704D1 (de) 2004-11-08 2008-06-26 Fujifilm Corp Verwendung eines Mittels zur Beseitigung vom Sauerstoff
CN101065466B (zh) 2004-11-24 2013-02-13 国际壳牌研究有限公司 改进含有蜡和其它烃的混合物的流动性的方法
JP2008545621A (ja) * 2005-04-20 2008-12-18 デンドリティック ナノテクノロジーズ，インコーポレイテッド 強化された拡大性と内部官能基性をもった樹枝状ポリマー
US7575687B2 (en) * 2005-08-16 2009-08-18 Ge Osmonics, Inc. Membranes and methods useful for caustic applications
US8436103B2 (en) 2005-09-07 2013-05-07 Nippon Soda Co., Ltd. Star polymer and method of producing the same
WO2007061896A1 (en) 2005-11-17 2007-05-31 Zogenix, Inc. Delivery of viscous formulations by needle-free injection
CN101484488B (zh) 2006-07-11 2012-02-01 日本曹达株式会社 星形聚合物及其制造方法
US20080020043A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Marc Gingras Dendrimer-Drug Conjugates
US8268347B1 (en) 2006-10-24 2012-09-18 Aradigm Corporation Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile
US8658148B2 (en) 2007-06-22 2014-02-25 Genzyme Corporation Chemically modified dendrimers
KR101176813B1 (ko) 2007-08-31 2012-08-24 닛뽕소다 가부시키가이샤 스타 폴리머의 제조 방법
WO2009151687A2 (en) 2008-03-12 2009-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
AU2009241847B2 (en) 2008-04-28 2014-07-10 Zogenix, Inc. Novel formulations for treatment of migraine
US8889635B2 (en) 2008-09-30 2014-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
WO2010054321A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disorders and/or inflammatory disorders
CN102917699A (zh) 2009-10-13 2013-02-06 密执安大学评议会 树枝状聚合物组合物和合成方法
WO2011053605A1 (en) * 2009-10-26 2011-05-05 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Peham dendrimers for use in agriculture
US8912323B2 (en) 2009-10-30 2014-12-16 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
CN102858367B (zh) 2010-02-26 2014-12-17 国立大学法人长崎大学 抗原或药物递送复合物
US9402911B2 (en) 2011-12-08 2016-08-02 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
US9921205B2 (en) 2012-11-13 2018-03-20 Chevron U.S.A. Inc. Method for determining the effectiveness of asphaltene dispersant additives for inhibiting or preventing asphaltene precipitation in a hydrocarbon-containing material subjected to elevated temperature and presssure conditions
GB201405660D0 (en) * 2014-03-28 2014-05-14 Gama Healthcare Ltd A liquid disinfecting composition
KR20180095871A (ko) * 2015-12-16 2018-08-28 프리오스타 피티와이 엘티디 덴드리머 및 그의 배합물
US10907473B2 (en) 2017-11-14 2021-02-02 Chevron U.S.A., Inc. Low volume in-line filtration methods for analyzing hydrocarbon-containing fluid to evaluate asphaltene content and behavior during production operations
CN109287624A (zh) * 2018-10-08 2019-02-01 威海晨源分子新材料有限公司 一种树枝状聚酰胺-胺在农药中的应用
JP2022517193A (ja) 2019-01-03 2022-03-07 アイオンパス， インク． イオンビームイメージングのための組成物および試薬
JP7436838B2 (ja) * 2020-05-20 2024-02-22 藤倉化成株式会社 抗体－デンドリマー複合体を用いるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法
CN114292217A (zh) * 2021-12-31 2022-04-08 安源基因科技(上海)有限公司 生物活性交联剂、生物交联物、试剂盒及应用
GB202412414D0 (en) 2024-08-23 2024-10-09 Univ Bradford Methods for treating cancer

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4289872A (en) * 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
IL64277A0 (en) * 1981-11-11 1982-02-28 Basht Ltd Apparatus for removal of integrated circuits from circuit boards
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
GB2122641B (en) * 1982-06-07 1986-08-06 Otto A Gansow Metal chelate conjugated monoclonal antibodies where in the metal is an emitter
US4507466A (en) * 1983-01-07 1985-03-26 The Dow Chemical Corporation Dense star polymers having core, core branches, terminal groups
US4558120A (en) * 1983-01-07 1985-12-10 The Dow Chemical Company Dense star polymer
US4631337A (en) * 1983-01-07 1986-12-23 The Dow Chemical Company Hydrolytically-stable dense star polyamine
US4606907A (en) * 1984-07-02 1986-08-19 The Dow Chemical Company Bone seeking Tc-99m complexes of phosphonate derivatives of polyamidoamines
US4599400A (en) * 1984-12-18 1986-07-08 The Dow Chemical Company Star/comb-branched polyamide
US4694064A (en) * 1986-02-28 1987-09-15 The Dow Chemical Company Rod-shaped dendrimer

Also Published As

Publication number Publication date
FI981807L (fi) 1998-08-24
FI103410B1 (fi) 1999-06-30
BR8707432A (pt) 1988-11-01
HU209252B (en) 1994-04-28
DK205388D0 (da) 1988-04-14
FI105693B (fi) 2000-09-29
HU220205B (hu) 2001-11-28
JPH072840B2 (ja) 1995-01-18
DE3786000T3 (de) 1997-08-21
DE3786000D1 (de) 1993-07-01
HK54396A (en) 1996-04-03
FI881768L (fi) 1988-04-15
FI981807A0 (fi) 1998-08-24
JPH06220190A (ja) 1994-08-09
NO176306B (no) 1994-12-05
KR880701564A (ko) 1988-11-03
KR970011151B1 (ko) 1997-07-07
IE872210L (en) 1988-02-18
AU609051B2 (en) 1991-04-26
DE3786000T2 (de) 1993-09-02
MY102878A (en) 1993-03-31
WO1988001180A1 (en) 1988-02-25
JPH069778A (ja) 1994-01-18
JPS63501876A (ja) 1988-07-28
AU7715987A (en) 1988-03-03
NO881639L (no) 1988-06-15
FI103410B (fi) 1999-06-30
ES2054678T5 (es) 1997-09-16
ATE89743T1 (de) 1993-06-15
HUT55245A (en) 1991-05-28
EP0271180B1 (en) 1993-05-26
NO176306C (no) 1995-03-15
ZA876114B (en) 1989-04-26
JPS63502350A (ja) 1988-09-08
JP2771404B2 (ja) 1998-07-02
AU638153B2 (en) 1993-06-17
EP0271180A1 (en) 1988-06-15
FI881768A0 (fi) 1988-04-15
WO1988001178A1 (en) 1988-02-25
WO1988001179A1 (en) 1988-02-25
DK205388A (da) 1988-06-14
IL83567A (en) 1992-02-16
JPH0757735B2 (ja) 1995-06-21
JPH0757736B2 (ja) 1995-06-21
GR3024215T3 (en) 1997-10-31
BR8707433A (pt) 1988-11-01
AU8139191A (en) 1991-10-03
EP0271180B2 (en) 1997-06-18
JPH06219966A (ja) 1994-08-09
JP2848218B2 (ja) 1999-01-20
IL83567A0 (en) 1988-01-31
JPH07108860B2 (ja) 1995-11-22
JPS63501878A (ja) 1988-07-28
BR8707431A (pt) 1988-11-01
IE61356B1 (en) 1994-11-02
MX169992B (es) 1993-08-04
NZ221484A (en) 1991-01-29
ES2054678T3 (es) 1994-08-16
HU9303379D0 (en) 1994-03-28
NO881639D0 (no) 1988-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK174053B1 (da) Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer
US5338532A (en) Starburst conjugates
US5527524A (en) Dense star polymer conjugates
US6312679B1 (en) Dense star polymer conjugates as dyes
EP0699079B1 (en) Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates comprising genetic materials
CA2788736C (en) Polyanionic multivalent macromolecules for intracellular targeting of proliferation and protein synthesis
CA1316456C (en) Starburst conjugates
KR970011150B1 (ko) 스타버스트 콘쥬게이트
AU768662B2 (en) Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired