DK174522B1 - Fremgangsmåde til isolering af vævsfaktorinhibitor (TFI) og anvendelse af en således opnået vævsfaktorinhibitor til fremstilling af et antithrombotisk lægemiddel - Google Patents

Description

DK 174522 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af en koagulationsinhibitor betegnet vævsfaktorinhibitor (TFI) og anvendelsen af en således opnået vævsfaktorinhibitor til fremstilling af et antithrombotisk lægemiddel.

Koagulering, der forekommer i pattedyrblod, omfatter to adskilte systemer - de 5 såkaldte indre og ydre systemer. Sidstnævnte system aktiveres, når blod udsættes for vævsthromboplastin (faktor III), i det efterfølgende betegnet vævsfaktor (TF). Vævsfaktor er et lipoprotein, der frembringes i plasmamembranen af mange celletyper, og hvor hjernen og lungerne er specielt rige herpå. Ved at komme i kontakt med TF danner plasmafaktor VII eller dens aktiverede form, 10 faktor Vila, et calcium-afhængigt kompleks med TF og aktiverer herefter proteo-lytisk faktor X til faktor Xa og faktor IX til faktor IXa.

Tidligere undersøgelser over reguleringen af TF-initieret koagulering viste, at inkubation af TF (i urensede vævsthromboplastin-præparater) med serum hæmmede dens aktivitet in vitro og forhindrede dens dødbringende virkning, 15 når den blev infunderet i mus. Indgående undersøgelser af Hjort, Scand. J. Clin.

Lab. Invest. 9, Suppl. 27, 76-97 (1957) bekræftede dette, og yderligere arbejde inden for dette område førte til den konklusion, at en hæmmende del i serum genkendte faktor VII-TF-komplekset. I overensstemmelse med denne hypotese er de kendsgerninger, at hæmningen af TF, der forekommer i plasma, kræver 20 tilstedeværelsen af Ca2+ (der også er nødvendig for bindingen af faktor Vll/Vlla til TF), og at hærmningen kan forhindres og/eller vendes om ved chelatering af divalente kationer med EDTA. Nyere undersøgelser har nu vist, at ikke alene faktor Vila, men også katalytisk aktiv faktor Xa og en yderligere faktor er nødvendig for frembringelsen af TF-hæmningen i plasma eller serum. Se Broze og 25 Miletich, Blood 69, 150-155 (1987) og Sander et al., Ibid. 66, 204-212 (1985).

Denne yderligere faktor, heri defineret som vævsfaktor-inhibitor (TFI), findes i barium-absorberet plasma og synes at være associeret med lipoproteiner, da TFI-funktionel aktivitet skiller ud med den lipoproteinfraktion, der flyder, dersom serum centrifugeres til en tæthed på 1,21 g/cm3 Ifølge Broze og Miletich, supra, 30 udskiller HepG2-celler (en human hepatomacellelinie) en hæmmende gruppe med samme egenskaber som TFI til stede i plasma.

I Proceedings of the National Academy of Science (USA) 84, 1886-1890, beskrives isolering af en vævsfaktorinhibitor (TFI) som er produceret af HepG2- 2 DK 174522 B1 hepatoma-celler. Der isoleres en vævsfaktorinhibitor som har en molekylvægt på 38 000 - 39 000 og en aminosyresammensætning som vist i artiklens tabel 2 i

Det har nu vist sig at den vævsfaktorinhibitor (TFI) som bl.a. kan isoleres fra HepG2-hepatoma-celler, har følgende egenskaber: 5 A. den eksisterer i to former, TFh, der vandrer ved ca. 37 000-40 000 dalton, og TFb der vandrer ved cirka 25 000-26 000 dalton, bestemt ved natrium-dodecyl-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS PAGE), B. den har en delvis N-terminal aminosyresekvens som følger: 1 15 10 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-lle-lle-Thr-Asp-Thr-Glu 16 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala hvori X-X ikke er blevet bestemt, og C. den udviser hæmmende virkning over for faktor Xa.

15 Denne TFI er blevet isoleret i højt oprensede former, hvori den ikke eksisterede i celle- og vævskilder, hvorfra den er opnået. Det vil sige, den er blevet fremstillet i rensede former, der i det væsentlige er fri for andre proteiner og fri for andre cellulære bestanddele og vævsdele.

Denne TFI udviser biologisk aktivitet, hvorfor den kan anvendes inden for medi-20 cinen ved undersøgelser af koagulationens forløb. Specielt kan denne TFI anvendes terapeutisk som en koagulationsinhibitor og som anti-thrombotisk middel.

TFI udskilt af HepG2-celler der er dyrket i næringsdyrkningssubstrat er fortrinsvis blevet isoleret i det væsentlige ved den nedenfor beskrevne tretrins-metode: 25 A. CdCb-udfældning, B. Faktor Xa-"Affi-Gel 15"-affinitetskromatografi af det resolubiliserede bundfald og 3 DK 174522 B1 C. "Superose 12"-gel-filtrering af fraktionerne fra affinitetskromatografien indeholdende TFI-aktivitet.

Ved en alternativ isoleringsmetode inaktiveres faktor Xa i trin B ved binding til isopropylphosphat (ϊΡ^Ρ), "Sephadex® G-75" anvendes som gel-5 filtreringsmaterialet i trin C, og et fjerde trin D udføres på følgende måde: D. Mono Q-ionbytter-kromatografi af fraktionerne fra gelfiltreringen indeholdende TFI-aktivitet.

Ved de foregående metoder er HepG2 en velkendt og udbredt tilgængelig human hepatomacellelinie, hvis etablering og karakteristika er beskrevet i US pa-10 tentskrift nr. 4 393 133. Prøver af denne cellelinie er også tilgængelige fra den permanente samling i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, under accessionsnummeret ATCC HB 8065.

Andre velegnede cellekilder for TFI er for eksempel SK-HEP-1 -celler (ATCC HTB 52), Chang-leverceller (ATCC CCL 13), endotheliale celler og pattedyr-15 blodsera.

HepG2-cellerne kan dyrkes ved cirka 37 °C i almindeligt næringsdyrkningssub-strat for at udtrykke TFI. Et foretrukket substrat er Earle’s modificerede essentielle substrat (EMEM), der er kommercielt tilgængeligt. Andre passende kommercielt tilgængelige substrater er fx beskrevet af Helen J. Morton, In Vitro 6(2), 20 89-108 (1970). Disse næringsdyrkningssubstrater indeholder aminosyrer, mine raler, kulhydrater, vitaminer og er ofte forstærket med pattedyrsera, som fx fetalt bovint serum eller kalveserum, og forskellige vækstfaktorer. Som anvendt heri dyrkes HepG2-celler fortrinsvis først i serumholdigt substrat og overføres derefter til serumfrit substrat tilsat vækststimulerende mængder af transferrin, selen, 25 insulin, levercelle-vækstfaktor og lactalbuminhydrolysat.

CdCb-bundfaldet dannet i trin A ovenfor fortyndes fortrinsvis med samme volumen af en pufferopløsning inden påførsel på en affinitetskromatografisøjle i trin 1, Pufferopløsningen bør omfatte en vandig opløsning af et biologisk acceptabelt puffermateriale indstillet til en pH-værdi på cirka 7,5. Anvendelsen af 0,05 30 M Tris-HCl er et eksempel herpå. En i det væsentlige lignende puffer kan herefter anvendes til at ækvilibrere affinitetskromatografisøjlen.

4 DK 174522 B1 "Affi-Gel® 15" der anvendes i trin B, er en kommercielt tilgængelig, aktiveret affinitetsbærer fremstillet som en N-hydroxysuccinimidester af en derivatiseret tværbundet agarosegel.

"Superose® 12" og "Sephadex® G-75" der anvendes i gelfiltreringstrinnet C, er 5 kommercielt tilgængelige kugleformede geler fremstillet ved tværbinding af dex-tran med epichlorhydrin. De foretrukne superfine kvaliteter har en diameter af størrelsesordenen cirka 20-50 pm.

Inden påførsel på gelfiltreringssøjlen koncentreres fraktionerne fra affinitetskromatografien indeholdende TFI-aktivitet i trin B fortrinsvis, fx ved ultrafiltrering, 10 for at reducere mængden af opløsning, der skal arbejdes med, og søjlen kan ækvilibreres med 1M NaSCN, pufret til pH ca. 7,5.

Ved en alternativ isoleringsmetode efter gelfiltreringstrinnet C udfældes fraktionerne indeholdende TFI-aktivitet fortrinsvis med acetone, og bundfaldet resolu-biliseres herefter til påhældning på Mono Q-søjlen. Denne søjle kan ækvilibre-15 res med 6M urinstof, pufret til pH ca. 8,3.

Mono Q anvendt i trin D er en kommercielt tilgængelig, stærk anionbytterhar-piks, baseret på en hydrofil polymer i kugleform, diameter cirka 10 pm, med ladede kvaternære aminogrupper.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en speciel fremgangsmåde til isole-20 ring af vævsfaktorinhibitor (TFl) fra det konditionerede medium af en levercellelinie, hvilken fremgangsmåde er særegen ved at det konditionerede medium underkastes immunoaffinitetsrensning med anti-TFI-peptid-lg rejst over for et peptidantigen omfattende aminosyresekvensen:

Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-lle-lle-Thr-Asp-Thr-25 Glu-Leu-Pro-Pro-leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe.

Skønt særlige metoder til isolering af TFl er beskrevet heri, kan den pågældende TFl naturligvis være produceret på forskellig vis. TFI-proteinet kan således fremstilles ved almindelig rekombinant DNA-teknologi. Nylige fremskridt inden for biokemien og inden for den rekombinante DNA-teknologi har gjort det muligt 30 at syntetisere specifikke proteiner, fx enzymer, under kontrollerede betingelser, 5 DK 174522 B1 uafhængigt af den organisme, hvorfra de normalt isoleres. Disse biokemiske syntesemetoder anvender enzymer og subcellulære komponenter af de prote-insyntetiserende systemer i levende celler, enten in vitro i cellefri systemer eller in vivo i mikroorganismer. I begge tilfælde er hovedelementet tilvejebringelse af 5 en deoxyribonucleinsyre (DNA) med specifik sekvens, der indeholder den nødvendige information til at specificere for den ønskede aminosyresekvens. En sådan specifik DNA-sekvens betegnes et gen. Kodeforholdene hvorved en deoxyribonucleotidsekvens anvendes til at specificere aminosyresekvensen af et protein, er velkendte og arbejder efter et fundamentalt sæt af principper. Se 10 for eksempel Watson, "Molecular Biology of the Gene", 3. udgave, Benjamin-Cummings, Menlo Park, Calif., 1976.

Et klonet gen kan anvendes til at specificere aminosyresekvensen af proteiner syntetiseret af in vitro systemer. RNA-dirigerede protein-syntetiserende systemer er velkendte. Dobbeltstrenget DNA kan induceres til at frembringe mRNA in 15 vitro med efterfølgende særdeles korrekt translation af RNA-sekvensen til protein.

Det er nu muligt at isolere specifikke gener eller dele heraf fra højere organismer, som fx mennesker og dyr, og overføre generne eller fragmenterne til mikroorganismer, som fx bakterier eller gær. Det overførte gen opformeres og 20 propageres,efterhånden som den transformerede mikroorganisme opformeres.

Som en følge heraf er den transformerede mikroorganisme i besiddelse af evnen til at fremstille det ønskede protein eller gen, som det koder for, fx et enzym, og herefter overføre evnen til afkommet. Se for eksempel Cohen og Boyer, US patentskrift nr. 4 237 224 og 4 468 464.

25 Opfindelsen beskrives nu nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser elueringsprofilen efter iP^P-humant-faktor Xa "Affi-Ger-affinitetskromatografi af et koncentreret TFI-præparat isoleret fra HepG2-celler, der er en udførelsesform for opfindelsen, fig. 2 er en grafisk afbildning, der viser elueringsprofilen efter Sephadex G-75 30 gelfiltrering af en koncentreret prøve fra de TFI-aktive fraktioner fra fig. 1, 6 DK 174522 B1 fig. 3 er en grafisk afbildning, der viser elueringsprofilen efter Mono Q ionbyt-terkromatografi af en koncentreret prøve fra de TFI-aktive fraktioner fra fig. 2, fig. 4 viser SDS PAGE af en renset TFI-prøve fra fig. 3, fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser en sammenligning af renset TFl fra fig. 3 5 og normalt humant serum ved et TFI-assay, fig. 6 er en grafisk afbildning, der viser den hæmmende virkning af det rensede TFl fra fig. 3 på faktor Xa sammenlignet med dens manglende virkning på thrombin, fig. 7 er en grafisk afbildning som viser den hurtige hæmning af TF-aktivitet med 10 det rensede TFl fra fig. 3 i nærværelse af faktor Vila, faktor Xa og Ca2+, fig. 8 er en grafisk afbildning, der viser elueringsprofilen efter bovin faktor Xa-"Affi-Ger'-affinitetskromatografi af et koncentreret TFI-præparat isoleret fra HepG2-celler i en anden udførelsesform for opfindelsen, fig. 9 er en grafisk afbildning, der viser elueringsprofilen efter "Superose 12"-15 gelfiltrering af en koncentreret prøve fra de TFI-aktive fraktioner i fig. 8, fig. 10 viser SDS-PAGE af en reduceret, renset TFI-prøve fra fig. 9, fig. 11 viser SDS-PAGE af en ikke-reduceret renset TFI-prøve fra fig. 9, fig. 12(A) viser SDS-PAGE af TFl isoleret fra Chang-leverceller (bane 2), SK-HEP-I (bane 3 og 4) og HepG2-celler (bane 5 og 6) ved immunoaffinitetskroma-20 tografi i yderligere udførelsesformer for opfindelsen med standard-molekylmar-kører angivet i bane 1, og fig. 12(B) viser Western-blot-metoden (elektroforetisk overførsel) på nitrocellulosepapir og farvning med Xa efterfulgt af autoradiografi af elektroforetisk adskilte proteiner fra banerne 2, 3, 4 og 6 i fig. 12(A) i henholdsvis banerne 1, 2, 3 25 og 4.

For at illustrere særligt foretrukne udførelsesformer for opfindelsen nærmere udførtes følgende eksempler. I eksempel 1 er TFl isoleret ved hjælp af firetrinsmetoden, og i eksempel 2 ved hjælp af tretrins-metode fra konditioneret substrat af HepG2-ce)Jer som tidligere beskrevet. I eksempel 3 isoleres TF I fra adskillige cellekilder ved immunoaffinitetskromatografi.

7 DK 174522 B1 EKSEMPEL 1

Materialer 5 "Affi-Gel 15" og lavmolekylære standarder til polyacrylamid-elektroforese blev indkøbt fra Bio-Rad Laboratories. Na125l (bærerfrit) blev leveret af New England Nuclear, og "lodo-Gen" blev leveret af Pierce Chemical Co. "Sephadex® G-75 superfine" og en Mono Q-søjle blev leveret af Pharmacia Inc. Earle’s modificerede essentielle substrat (EMEM) og fetalt bovint kalveserum blev skaffet fra KC 10 Biological, Inc. (Lenexa, KS), og levercellevækstfaktor blev skaffet fra Miles Laboratories. Bovint serumalbumin, phenylmethylsulfonylfluorid, diisopropylfluor-phosphat (iPr2P-F), acrylamid, methylenbis(acrylamid), kaninhjernecephalin, transferrin, selen, insulin, lactalbuminhydrolysat, HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonsyre), MOPS (3-[N-morpholino]propansulfonsyre) og 15 Trizma-base [Tris(hydroxymethyl)aminoethan] blev leveret af Sigma Chemical Co. Alle andre kemikalier var af reagenskvalitet eller bedre og blev leveret af Fisher Scientific Co. eller af Sigma. Faktor X-deficient humant plasma blev leveret af George King Biomedical (Overland Park, KS). Serumprøver fra raske bloddonorer blev leveret af det amerikanske Røde Kors (St. Louis, MO).

20 HepG2-celler blev skaffet fra American Type Culture Collection.

Proteiner

Et urenset præparat af TF blev fremstillet og grundigt vasket med EDTA [Broze og Miletech, Blood 69,150-155 (1987); Broze og Majerus, J. Biol. Chem. 255, 1242-1247 (1980)]. Faktor X-koaguleringsprotein fra Russell’s hugormegift 25 (XCP), antithrombin Illa, faktor Vila og human faktor X blev renset som beskrevet af Broze og Miletech, supra; Broze et al., J. Biol. Chem. 260, 10917 (1985); Peterson og Blackburn, J. BioI. Chem. 260, 610-615 (1985); og Miletech, Broze og Majerus, Methods Enzymol. 80, 221-228 (1981). Faktor Xa blev fremstillet ud fra renset faktor X ved inkubation med insolubiliseret Z koagulant-protein og 30 inaktiveret med iPr2P-F [Broze og Miletech, supra; Bajaj et al., Prep. Biochem.

11, 397-412 (1981)]. iPr2P-faktor Xa blev fasthæftet til "Affi-Gel 15" med en slut- 8 DK 174522 B1 koncentration på ca. 2 mg/ml pakket gel under anvendelse af producentens instruktioner (MOPS-puffer, pH 7,5).

Undersøgelse

En tretrins-undersøgelsesmetode for TF-hæmning anvendtes under rensnings-5 metoden nedenfor. [Broze og Miletech, supra].. I det første trin blev 10 μΐ faktor Vila (1 g/ml), 10 μΙ faktor X (10 μg/ml)1 10 μΙ CaCl2(40 mM), 10 μΙ antithrombin Ilia (650 ug/ml), 50 μΙ af prøven, der skulle undersøges, fortyndet i TBSA-puffer (0,1 M NaCI/ 0,05 M Tris-HC!, pH 7,5, indeholdende bovint serumalbumin i 1 mg/ml) og 10 μΙ urenset, EDTA-vasket TF (10 vol./vol.-procent) inkuberet ved 10 stuetemperatur. Efter 30 minutter blev en 10 μΙ prøve fortyndet 100 gange i TBSA-puffer med 5 mM CaCl2- 50 μΙ af denne fortyndede prøve, 50 μΙ faktor Vila (1 ug/ml), 50 μΙ CaCI2(25 mM) og 50 μΙ faktor X (10 ug/ml) blev derefter inkuberet ved 37 °C. Efter 10 minutters forløb tifsattes 50 af en blanding indeholdende 10 dele faktor X-manglende plasma og 1 del kaninhjernecephalin-15 lagerreagens (fremstillet som beskrevet af Bell og Altone, Nature 174, 880 (1954) og rekonstitueret som angivet i instruktionerne fra producenten, Sigma) og tiden for den første koageldannelse bestemtes med hjælp af et fibrometer (Baltimore Biological Laboratory, Cockeyville, MD).

Blandinger, hvori TBSA i stedet for prøven var inkuberet i det første trin, tjente 20 som kontroller. Koncentrationen af urenset TF i undersøgelsen udvalgtes til at frembringe en kontrolkoaguleringstid på 35-40 sekunder. Antitbrombin Illa var inkluderet i undersøgelsesmetoden for at formindske virkningen af faktor Xa dannet under første trins-inkubationen på koaguleringstiden fremkommet i det tredje trin af undersøgelsen. Den relative TFI-aktivitet beregnedes ud fra en 25 standardkurve konstrueret ved at afsætte (på log-log-papir) forlængelsen i sekunder af koaguleringstiden i forhold til kontrolværdierne mod slutkoncentratio-nen af normalt sammenhældt serum (50 donorer) i forsøgets første trin. Denne standardkurve frembringer et lineært respons fra 1 -10 % (vol./vol.) serumkoncentrationer. En enhed TFI-aktivitet defineredes som den, der indeholdtes i 1 ml 30 normalt sammenhældt serum. Undersøgelsesresultaterne fra kromatografifraktionerne er udtrykt som koaguleringstider og er ikke omregnet til enheder/ml.

NaDodSCVPAGE udførtes i 15v% geler (4 % stabelgel) som beskrevet af Laemmli, Naturen (London) 227, 680-685 (1970). Reducerede prøver opvarme- 9 DK 174522 B1 des til 100 °C i 5 minutter i nærvær af 10 % 2-mercaptoethanol inden elektrofo-rese. TFI ekstraheredes efter NaDodSCWPAGE ved at udskære banen fra gelen, lade den henstå i 0,1 M NaCI/0,05 TrisHCI, pH 7,5, i 30 minutter, opskære den i 2 mm sektioner og inkubere hver skive natten over i 100 i M NaSCN/0,05 5 M Tris-HC1, pil 7,5/0,025% Lubrol PX (et biologisk ikke-ionisk detergent bestående af et ethylenoxidkondensat affed alkohol) indeholdende bovint serumalbumin i 0,5 mg/ml. En 1:50 fortynding i TB$A af det ekstraherede materiale undersøgtes herefter som beskrevet ovenfor for TF-hæmning. Western-blot udførtes som beskrevet af Broze, Hickmanog Miletich, J. din. Invest. 76, 937-946 10 (1985) under anvendelse af 125l-mærket faktor Xa som proben. Aminosyre- sammensætningen af renset TFI (110 pmol) bestemtes, efterfulgt af 24 timers hydrolyse i 6 M HCI ved 110 ®C på en "Beckman® 6300" autoanalysator med post-søjle ninhydrin-derivatisering.

Cellekultur 15 HepG2-celler blev dyrket i plast- eller glas-rulleflasker (850 cm2). Efter indledende podning dyrkedes cellerne i EMEM med ikke-essentielle aminosyrer og penicillin (I03 enheder/ml), streptomycin (100 ug/ml), amphotericin (250 ng/ml), natriumpyruvat (100 mM), L-glutamin (200 mM) og 5 % fetalt bovint serum og 5 % kalveserum, idet substratet blev udskiftet to gange om ugen. Efter 2 ugers 20 forløb fjernedes substratet indeholdende serum, og cellerne blev forsigtigt vasket med EMEM og herefter dyrket i serumfrit substrat bestående af de samme bestanddele som angivet ovenfor plus transferrin (5 ug/ml), selen (5 ng/ml), insulin (5 rig/ml), levercellevækstfaktor (20 pg/ml), lactoalbuminhydrolysat (5 mg/ml) og HEPES (25 mM). Det konditionerede substrat blev fjernet og erstattet 25 med frisk serumfrit substrat to gange om ugen. HepG2-cellerne kan opretholdes under disse betingelser i >3 måneder.

Automatiseret Edman-nedbrydnings-kemi anvendtes til at bestemme den NH2-terminale proteinsekvens af renset TFI. En Applied Biosystems, Inc., model 470A gasfasesekvenser (Foster City, CA, USA) anvendtes til nedbrydningerne 30 (Hunkapiller et al., Methods Enzymol. 91, 399-413 (1983). De respektive PTH-aminosyre-derivater blev identif iceret ved RP-HPLC-analyse på on-line-måde under anvendelse af en Applied Biosystems, Inc., model I20A PTH Analyzer udstyret med en Brownlee 2,1 mm I.D. PTH-Cte-søjle.

ΙΟ DK 174522 B1

Elektroblot-metoden anvendtes på prøven for at sekvensere bånd isoleret direkte fra SDS-PAGE. De anvendte metoder var som beskrevet af Aebersold et al., J. Biol. Chem. 261, 4229-4238 (1986). Under anvendelse af disse sekvense-ringsmetoder kunne de første to N-terminale aminosyrer ikke fastslås, men ami-5 nosyrerne 3-27 bestemtes som følger: 1 15 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-lle-lle-Thr-Asp-Thr-Glu 16 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lus-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala

10 Rensning af TFI

Hvis ikke andet er angivet, udførtes oprensningen ved stuetemperatur. Opresningsmetoden er sammenfattet nedenfor som et 4-trins skema i tabel 1.

DK 174522 B1 +i + +| il s i i o _ s ® n ΰ

U> “I T- N. CO

.En, LO τ- CD CO

*= Q) w' w* -w* V) 2* T- lo o o C fe 'f ifi ® o

2 S O) ΙΟ το. LO CM

o 10 Φ

.o O CO 00 O CO

β o' o σ> CM CM T- Ό «” Φ +i ο ο) in ^

s Ε « II

51 ® Ν ί g5 £ φ °0 Ά * c 0 ο οο ο ο ο τ,ι © fee co ιο ο ^ J5 _ Q. φ T-OCO-CDw li- CO τ- CD α ra I" F « T* vi_ ~ <0 _j ro Ξ; o) = I f «$ g oooosf S III i ssfcS|| $ 3 £ ^ cl + q. 8 8 f 8 , ο β on-oo ο o © % Ο O 00 L-*- I? Sg ’ 11¾ o- ^ cl -S g. e I *- c W m co fe φ O 3 c E « © ^ *-•fc 2 2 © ©

© © CO

w >, >* © © .5 ο Ε5 ·σ ·° I ϋ « ifl| η, ε - C Ο* Q.

% d)tf)<!P tj ~ 2 c£ r ^ fe C © © c © © O -g 2 © jq p -g χ c σ) co

© $ σ> © >< © -Q

~ o » φ ©rair 1 ?Ε«?1σ B> £ € 2 o S %, g- § § 3 δ « SI i ? I f Ϊ5 12 DK 174522 B1

Den detaljerede oprensningsmetode var som følger.

A. Cadmiumchloridudfældnina

HepG2-celle serum-frit konditioneret substrat (4 liter) blev centrifugeret efter tilsætning af phenylmethylsulfonylfluorid (slutkoncentration 0,1 mM) og NaN3 5 (slutkoncentration 0,05 vægt/vol.-%) ved 2500 x g i 30 minutter for at fjerne af-faidspartikler. CdCb (1,0 M) tilsattes herefter til en slutkoncentration på 5 mM, og blandingen omrørtes i 15 minutter. Bundfaldet der indeholdt TFI-aktiviteten, blev fracentrifugeret (2500 x g i 30 minutter), og den supernatante del smidt væk. Pillen opløstes med 40 ml 0,5 EDTA/5 mM iPr2P-F, pH 9,5, og dialysere-10 des herefter grundigt over for TS-puffer (0,1 M NaCI/0,05 M Tris HCI/0,1 mM phenylsulfonylfluorid/0,5 mM EDTA/0,02% NaN3, pH 7,5).

B. iPr?-faktor Xa-"Affi-Gel 15"-kromatoQrafi

Det dialyserede præparat klaredes ved centrifugering (10.000 x g i 15 minutter) og påhæidtes en søjle af iPr2P-faktor Xa-”Affi-Gel 15” ækvilibreret i RS-puffer.

15 Gelen blev vasket med startpuffer, og det bundne materiale elueret med 2 M NaSCN/0,05 M Tris-HCI, pH 7,5/0,05% Lubrol PX/0,02% NaNs/0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (fig. 1). Fraktioner indeholdende TFI-aktivitet blev hældt sammen og koncentreret til ca. 1 ml under anvendelse af en YM5 hydrofil ultra-filtreringsmenbran (Amicon).

20 C. Gelfiltrerino oa acetonedelipidation

Den koncentrerede prøve påførtes en søjle af "Sephadex G-75 superfine" bragt i ligevægt i 1 M NaSCN/0,05 M Tris-HCI, pH 7,5/0,05% Lubrol PX/0,02 %

NaN3/0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (fig. 2). Fraktioner indeholdende TFI-aktivitet blev hældt sammen og blandet med 8 volumener acetone. Efter 30 mi-25 nutters forløb blev bundfaldet opsamlet ved centrifugering (10 000 x g, 20 minutter, 10 °C).

D. Mono Q ionbvtterkromatoarafi

Acetonebundfaldet blev solubiliseret med 1,0 ml 6 M urinstof/0,02 M Tris-HCI/0,05% Lubrol PX, pH 8,3 og påført en Mono Q-søjle bragt i ligevægt i 30 samme puffer. Søjlen fremkaldtes med en 30 ml lineær gradient fra startpuffer 13 DK 174522 B1 til 6 M urinstof/0,5 M Tris-HCI/0,05% Lubrol PX, pH 8,3 (fig. 3). Fraktioner indeholdende TFI-aktivitet blev hældt sammen som vist i fig. 3, koncentreret til ca. 1 ml (YM5, Amicon), dialyseret over for 1 M NaSCN/0,05 M Tris-HCI/0,05%

Lubrol PX, pH 7,5 og opbevaret ved 4 °C.

5 TFI's egenskaber

NaDodSCVPAGE af det rensede TFI viste et dominerende bånd ved molekylvægt 38 000 (ureduceret) eller 39.000 (reduceret) (fig. 4). Ekstraktion af gelskiver efter NaDodSOVPAGE af en ureduceret prøve af det rensede præparat viste at hæmmende virkning vandrede sammen med det Coomassie-farvede 10 bånd. Som ventet genkendtes det samme bånd med l125-mærket faktor Xa ved immunoblot (resultater ikke vist). Aminosyresammensætningen af den rensede TFI er angivet i tabel 2 nedenfor. Den rensede TFI viste sig at være lig med den hæmmende faktor som er tilstede i serum ved at den krævede faktor VII, faktor X og Ca2+ for udtrykkeisen af aktivitet (Broze og Miletich, supra) (Tabel 3 ne-15 denfor), og fortyndinger af den rensede TFI frembragte en linie parallel med linien for den normale humane serumstandardkurve (fig. 5).

Inkubation af den rensede TFI (250 mg/ml) med faktor Xa (25 ng/ml) førte til tab af Xa koagulationsaktivitet ved et funktionelt bio-assay (fig. 6). Denne hæmmende virkning af TFI var ikke en generel egenskab rettet mod alle serinprotea-20 ser, da thrombin var fuldstændigt upåvirket ved inkubation med TFI (fig. 6).

Under tilstedeværelse af faktor Vila, faktor Xa og Ca2+ frembragte TFI meget hurtig hæmning af TF-aktivitet med en tilsyneladende ty, på 20 sekunder (fig. 7). Tilsætning af heparin (0,5 enheder/ml) til blandingerne accelererede begyndelseshastigheden af hæmningen tre gange (t% = 6 sekunder). Hæmning af tilsyne-25 ladende TF-aktivitet med TFI påvirkedes ikke ved tilsætning af antithrombin Illa (65 μg/ml) til reaktionsblandingen.

14 DK 174522 B1 TABEL 2

Aminosvresammensætnina af TFI

Aminosyre Forkortelse Mol pr, 38 000 g protein

Asparaginsyre Asp 40

Threonin Thr 20

Serin Ser 19

Glutaminsyre G!u 44

Prolin Pro 15

Glycin Gly 33

Alanin Ala 19

Cystein Cys 13*

Valin Val 12

Methionin Met +

Isoleucin Ile 15

Leucin Leu 27

Tyrosin Tyr 10

Phenylalanin Phe 20

Histidin us 5

Lysin Lys 26

Arginin Arg 18

Tryptophan _Tjrg___ND_ ND = ikke bestemt * Cystein-værdi efter 24 timers hydrolyse; permyresyreoxidation udførtes ikke.

5 + Methionin blev oxideret under hydrolyse; intet blev detektere!.

TABEL 3

Krav om faktor VII, faktor X og Ca2* for udtrykkeisen af aktivitet af renset TFI

Udelukkelse fra første trin* Koaguleringstid+, sek.

10 Ingen 95,3 faktor X 40,2 faktor Vila 41,3

Ca2~{5 mM EDTA) 40,8

Kontrol_ 37,7_ 15 * Se beskrivelse af TFI-undersøgelsen ovenfor.

+Re$ultaterne af gennemsnit af dobbeltforsøg. S lutkoncentration en af TFI var 10 ng/ml i det første trin af undersøgelsen.

15 DK 174522 B1

De funktionelle egenskaber ved TFI isoleret fra HepG2-konditioneret substrat ovenfor illustreredes på følgende måde.

Koaaulationsundersøaelser

Faktor Xa-hæmning med TFI. Reaktionsblandinger indeholdende renset TFI 5 (250 ng/ml), faktor Xa (25 ng/ml) og enten EDTA (1 mM) eller CaCI2 (5 mM) og en 1:40 fortynding af en stamopløsning af kaninhjernecephalin (fremstillet som angivet i de publicerede instruktioner fra Sigma) i TBSA (0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 7,5,1 mg/ml bovint serumalbumin) inkuberedes ved stuetemperatur. Til forskellige tidspunkter tilsattes en 100 μΙ sub-prøve til en fibrometerkop, 10 der allerede indeholdt 50 μΙ CaCb (25 mM) og 50 μΙ kaninhjernecephalin (1:10 fortynding af stamopløsningen) ved 37 °C. 50 μΙ faktor X-deficient plasma tilsattes herefter umiddelbart, og tiden for koageldannelse bestemtes på et fibrome-ter (BBL, Cockeyville, MD.USA). Faktor Xa-aktivitet bestemtes ved at sammenligne koaguleringstideme med en standardkurve konstrueret under anvendelse 15 af fortyndinger af Xa i samme inkubationsblandinger, men uden TFI.

Thrombin-haemnina af TFI

Reaktionsblandinger indeholdende TFI (400 ng/ml) og thrombin (0,5 enhe-der/ml, 180 ng/ml) blev inkuberet ved stuetemperatur i TBSA. Til forskellige tidspunkter tilsattes en 100 μΙ sub-prøve til 100 μΙ 0,15 M NaCI, 6,6 g/l PEG-6000, 20 10 mM imidazol, 10 mM CaCb, pH 7,4, opvarmet til 37 °C. 50 μΙ fibrinogen (2 mg/ml) tilsattes umiddelbart herefter, og tiden for koageldannelse bestemtes på et fibrometer. Relativ thrombin-aktivitet bestemtes under anvendelse af en standardkurve, der var konstrueret med fortyndinger af thrombin.

Hæmning af TF med TFI

25 100 μΙ af en blanding indeholdende faktor Vila (200 ng/ml), faktor Xa (200 ng/ml), CaCl2(8 mM) og TF (2 vol./vol.-%), der var inkuberet ved stuetemperatur i 1 minut, tilsattes til 100 μΙ TBSA indeholdende TFI (600 ng/ml) med eller uden antithrombin Illa (130 μς/ml) og heparin (1 enhed/ml). Til forudbestemte tidspunkter herefter blev en 10 μΙ prøve udtaget og fortyndet 100 gange i TBSA 30 med 5 mM CaCb- Af praktiske hensyn henstod de fortyndede prøver fra tidligere tidsudtagninger, indtil den sidste 1 minuts prøve var blevet opnået, og heref- 16 DK 174522 B1 ter undersøgtes alle for rest-TF-aktivitet under anvendelse af en 2-trins undersøgelsesmetode. 50 μΙ faktor Vila (1 μς/ηιΙ), 50 μΙ CaCl2(25 mM), 50 μΙ fortyndet prøve og 50 μΙ faktor X (10 pg/ml) blev inkuberet ved 37 °C. Efter 1 minuts forløb tilsattes 50 μΙ af en blanding indeholdende 10 dele faktor X-def icient 5 plasma og 1 del kaninhjernecephalin-stamreagens (fremstillet som angivet af Sigma), og tiden for koageldannelse bestemtes med et fibrometer. Da denne TF-undersøgelsesmetode involverer en fortynding af prøven fra den oprindelige inkubationsblanding og en yderligere 1-2 minutters inkubation, betragtes de afledte hæmningsstørrelser som "tilsyneladende" størrelser.

10 Resultaterne af ovennævnte præparative arbejde i laboratoriemålestok, der førte til isoleringen og den funktionelle afprøvning af det rensede TFI, er yderligere eksemplificeret ved den detaljerede beskrivelse af tegningens fig. 1-7.

Fia 1. Denne figur viser iPr2P-faktor Xa-"Affi-Gel"-affinitetskromatografi. Det dialyserede TFl-præparat (ca. I00 ml) efter CdCI2-udfældning og ekstraktion på-15 førtes en 1.5 x 40 cm søjle af iPr2P-faktor Xa-"Affi-Gel 15" ækvilibreret i 0,1 M NaCI/0,05 M Tris-HCI, pH 7,5/0,5 mM EDTA/0,02% NaNa/0,1 mM phenyl-methylsulfonylfluorid. Efter vask med startpuffer fortyndedes TFI med 2 M NaSCN/0,05 M Tris-HCI, pH 7,5/0,05 % Lubrol PX/0,1 mM phenylmethylsulfo-nylfluorid. Strømningshastigheden var 3 ml/ time, og fraktionsstørrelsen var 4 20 ml. Prøver fortyndedes 500 gange til TFI-undersøgelse. Fraktionerne 66-70 blev hældt sammen.

Fig, 2. Denne figur viser "Sephadex G-75 superfine"-geifiltreringen. Den koncentrerede prøve (ca. 1 ml) fra iPr2P-faktor Xa-"Affi-GeP'-kromatografi påførtes en 1 x 120 cm søjle af "Sephadex G-75 superfine". Strømningshastigheden var 25 1,5 ml/time, og fraktionsstørrelsen var 1 ml. Prøver fortyndedes 2 000 gange til TFI-undersøgelse. Fraktionerne 34-41 blev hældt sammen.

Fia. 3. Denne figur viser Mono Q-ionbytterkromatografien. Efter acetoneudfældning solubiliseredes TFI med 6 M urinstof/0,02 M Tris-HCI, pH 8,3/0,05 %

Lubrol PX og påførtes en 1 ml Mono Q-søjle ækvilibreret i samme puffer. Efter 30 vask med startpuffer fremkaldtes søjlen med en 30 ml gradient fra startpuffer til slutpuffer (6 M urinstof/0,5 M Tris-HCI, pH 8,3, 0,05 % Lubrol PX). Strømningshastigheden var 20 ml/h, og fraktionsstørrelsen var 1 ml. Prøver fortyndedes 17 DK 174522 B1 2 000 gange til TFI-prøvning. Horisontal fed streg angiver fraktioner, der er hældt sammen.

Fia. 4. Denne figur viser NaDodSOVPAGE af renset TFI. Renset TFI (3,75 pg pr. bane) underkastedes NaDodSOV PAGE enten ureduceret (2 baner) eller ef-5 ter reduktion med 10% 2-mercaptoethanol (1 bane). (Øvre del) En af banerne indeholdende ureduceret TFI blev udskåret fra gelen og skåret i skiver, og TFl-aktiviteten ekstraheredes til undersøgelse. (Nedre del) Coomassie-blåfarvning af reduceret (R) og ureduceret (U) TFI. Start er til venstre.

Fia. 5. Denne figur viser en sammenligning af renset TFI og normalt humant se-10 rum ved TFI-assay. Fortyndinger af renset TF! blev undersøgt ved det funktionelle TFI-assay og sammenlignet med en standardkurve, der var konstrueret under anvendelse af normalt humant serum. Y-aksen er forlængelsen af koaguleringstiden i forhold til kontrolværdien (39 sekunder), og X-aksen er slutkon-centrationen af TFI (·, i ng/ml) eller normalt humant serum (o, i % vol./vol.) i 15 det første trin af assayet.

Fig. 6. Denne figur viser virkningen af TFI på faktor Xa og thrombin. Reaktionsblandinger indeholdende renset TFI og enten Xa eller thrombin blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Til forudbestemte tider blev prøver udtaget og undersøgt for rest-enzymaktivitet ved bioassay. □-□, thrombin; · -- ·, Xa; o-o, Xa 20 med phospholipider og C a2*. I kontrolblandinger, der manglede TFI, var der intet tab af Xa- eller thrombinaktivitet (ikke vist).

Fio. 7. Denne figur viser hæmningen af vævsfaktor (TF) med TFI. Blandinger indeholdende Vila (100 ng/ml), Xa (100 ng/ml), Ca2+ (4 mM), TF (1 % vol./vol.), TFI (300 ng/ml) med eller uden antithrombin Illa (65 μg/ml) og heparin (0,5 en-25 heder/ml) blev fremstillet ved stuetemperatur. Til forudbestemte tidspunkter blev prøver udtaget, fortyndet og undersøgt for tilbageværende TF-aktivitet. o-o, uden antithrombin Illa eller heparin; V-V, med heparin, men uden antithrombin Illa; □-□, med antithrombin Illa, men uden heparin; Δ-Δ, med antithrombin Illa og heparin; åbne symboler på den øverste horisontale linie (100 % akti-30 vitet) repræsenterer de respektive inkubationsblandinger uden TFI.

I8 DK 174522 B1 EKSEMPEL 2

Isolering af TFI fra det konditionerede substrat af HepG2-celler udførtes som beskrevet i eksempel 1, bortset fra følgende variationer: 1. Isolering udførtes i det væsentlige ved 3-trins metoden i stedet for den tidli- 5 gere definerede 4-trins metode.

2. Ved CdCb-udfældningen, trin A, anvendtes et andet puffersystem (se nedenfor), og dialysen blev udeladt.

3. Faktor Xa-”Affi-Gel 15"-affinitetskromatografi i trin B under anvendelse af bovin faktor Xa uden binding til iPr2P i stedet for den humane faktor Xa 10 bundet til iPr2P.

4. "Superose 12"-gel anvendtes i stedet for "Sephadex G-75"-gel ved gelfiltreringen i trin C.

Detaljeret beskrivelse af disse ændringer er angivet nedenfor:

HepG2-celle serumfrit konditioneret substrat (4 liter) centrifugeredes ved 2500 x 15 g i 30 minutter for at fjerne småstykker. CdCh (1,0 M) blev herefter tilsat til en slutkoncentration på 10 mM, og blandingen omrørtes i 30 minutter. Bundfaldet, der indeholdt TFI-aktiviteten, opsamledes ved centrifugering (10.000 x g i 20 minutter), og den supematante del bortkastedes. Pelleten opløstes i 80 ml 0,5 N EDTA, 100 Kl enheder/ ml aprotonin (Sigma)., pil 9,5, og det uopløselige mate-20 riale fjernedes ved centrifugering (10.000 x g i 20 minutter).

Bovin faktor X-rensnina

Bovin faktor X blev oprenset fra bariumsulfateluatet af bovint plasma (Sigma Chemical Co., $t. Louis). 40 enheder (hver fra 1 liter plasma) af eluatet blev genopslæmmet i 1,6 liter H20, og pH blev indstillet til 6,0 med HCI. Tørt benza-25 midin tilsattes til en slutkoncentration på 1 mM, og blandingen blev centrifugeret ved 10.000 x g og 4 eC for at fjerne uopløseligt materiale. Prøven blev herefter påført (100 ml/time) en 5 x 95 cm søjle af DEAE-"Sepharose", der var bragt i ligevægt i 0,02 M natriumcitrat, 1 mM benzamidin, 0,02% NaN3, pH 6,0 ved 4 °C. Efter vask af søjlen med 2 liter udgangspuffer blev den fremkaldt med en 15 19 DK 174522 B1 liter gradient fra startpuffer til 0,8 M NaCI, 0,02 M natriumcitrat, 1 mM benzami-din, 0,02% NaN3, pH 6,0. Fraktioner indeholdende bovin faktor Xi og X2, der eluerede efter protein C, men inden protein Z, blev slået sammen, koncentreret til ca. 40 ml (PM10, Amicon, Lexington, MA) og dialyseret i 0,1 M MOPS, pH 5 7,5. Udbyttet var 68 mg renset faktor X. Faktor Xa frembragtes ved aktivering af faktor X med usolubiliseret XCP (faktor X-koagulantprotein fra Russell's hugormegift).

Bovin faktor Xa-''Affi-Gel"-affmitetskromatoQrafi

Prøven blev fortyndet med samme volumen 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 10 7,5, 0,2% Lubrol PX og påførtes med en strømningshastighed på 4 ml/time en 2 ml søjle af "Sepharose 4 B"-agarose forbundet i serie med en 3 ml søjle af bovin faktor Xa-"Affi-Gei" der var bragt i ligevægt med 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,1% Lubrol PX. Søjlerne blev vasket med 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,1% Lubrol (20 ml) og derefter med 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-15 HCI, pH 7,5, 2% Lubrol PX (20 ml). "Sepharose 4 Β''-præ-søjlen blev herefter fjernet fra kredsløbet, og den bovine faktor Xa-''Affi-Gel"-søjle vasket yderligere med 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 7,5, 2% β-octylglucosid (20 ml) og elue-redes med 0,5 M benzamidin, 0,05 14 Tris-HCI, pH 7,5, 2 % 8-octylglucosid. Fraktioner indeholdende TFI, bestemt ved TFI-undersøgelse, blev slået sam-20 men (fig. 8, fraktionerne 62-66) og koncentreret til ca. 0,4 ml under anvendelse af en YM5 membran (Amicon Corp., Danvers, Mass., USA). Den store mængde A28o > de eluerede fraktioner skyldes benzamidin.

"Superose 12"-Qel-filtrerinQ

Den koncentrerede prøve (ca. 0,4 ml) påførtes to 25 ml ''Superose 12"-søjler 25 forbundet i serie, der var bragt i ligevægt i 1 M NaSCN, 2 % 8-octylglucosid, 0,02 M MOPS, pH 7,9. Søjlerne blev fremkaldt med udgangspuffer med en gennemstrømningshastighed på 0,3 ml/minut. Fraktionerne 27-31 indeholdende TFI-aktivitet blev identi iceret og hældt sammen (fig. 9).

Karakterisering af TFI

30 SDS-PAGE-natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese af det reducerede rensede TFI-mateniale afslørede et diffust bånd med en tilsyneladende 20 DK 174522 B1 molekylvægt på 39 000 dalton, dersom der farvedes med sølvnitrat. Eluering af gelskiver viste, at funktionel TFI-aktivitet vandrede sammen med proteinbåndet (fig. 10).

Western-blot oa farvning med 125l-Xa 5 . Det rensede materiale binder faktor X. Den sammenhældte TFI-mængde fra "Superose 12"-kromatografi blev underkastet SDS-PAGE og overført elektroforetisk til nitrocellulose. Efterfølgende inkubation af nitrocellulosen med l25l-Xa viste, at det rensede protein binder faktor Xa (fig. 11)

Resultaterne af ovennævnte præparative arbejde i laboratoriemålestok i ek-10 sempel 2 fører til isolering af renset TFI, og er nærmere beskrevet i omtalen af tegningens fig. 8 til 11.

Fig. 8. Denne figur viser den bovine faktor Xa-"Affi-Gel”-affinitetskromatografi. Fraktionerne 1 til 60 havde et volumen på 4 ml og fraktionerne60 til 70 havde et volumen på 1 ml. Absorbans (A280) er vist som · ; TFI-aktivitet af 1000 15 gange fortyndede prøver som 0-0.

Fig. 9. Denne figur viser "Superose 12"-gel-filtreringen. Fraktionerne 27-31 indeholdende TFI-aktivitet blev hældt sammen og opbevaret ved -4 0C. Absorbans (A280) er vist som en fuldt optrukken linie; TFI-aktivitet af 1.000 gange fortyndet prøve er vist som 0-0, 20 Fig. 10 viser SDS-PAGE af reduceret, renset TFI. Den rensede TFI (2 pg) blev underkastet NaDodSCVPAGE efterfulgt af reduktion med 10% 2-mercaptoetha-nol og sølvfarvning. Molekylvægt-markører i kilodalton er angivet i den venstre bane. Den højre bane viser et diffust bånd af reduceret TFI med en tilsyneladende molekylvægt på 39 000 dalton.

25 Fio. 11 viser SDS PAGE af ureduceret renset TFI på det øvre blot, hvor det rensede TFI (2 pg) blev underkastet NaDodSCVPAGE og sølvfarvning. Det nedre 125l-Xa-blot viser det ureducerede TFI (1 μg) elektroforetisk overført til nitrocellulose, farvet med 125l-Xa og autoradiograferet. Den øvre del af figuren viser TFI-aktiviteten af ekstraherede celleskiver efter SDS-PAGE af 1 pg TFI.

21 DK 174522 B1 EKSEMPEL 3

Isolering af TFI fra adskillige cellekilder, specielt Chang-leverceller, SK-HEP-I-celler og HepG2-celler udførtes ved immunoaffinitetskromatografi hvorved der som immunogenet anvendtes et syntetisk peptid med aminosyresekvensen 3-5 25 af det tidligere beskrevne modne TFI, på følgende måde:

Immunisering

Et TFI-peptid indeholdende en sekvens svarende til aminosyresekvensen 3-25 af det modne TFI blev syntetiseret under anvendelse af Biosystem's fastfase-peptidsyntesemetode. TFI-peptidet (5 mg) blev konjugeret til 10 mg albueskæl-10 hæmocyanin med glutaraldehyd. To New Zealand hvide kaniner immuniseredes hver ved intradermal injektion med et homogenat indeholdende 1 ml Freund komplet adjuvans og 1 ml af konjugatet (200 pg TFI-peptid). En måned senere blev kaninerne hver boostet med et homogenat indeholdende 1 ml Freund ukomplet adjuvans og 1 ml af konjugatet (100 pg TFI-peptid). Antiserum blev 15 indsamlet hver uge herefter. Booster-injektioner blev udført en gang om måneden, indtil kaninerne afblødtes efter 3 måneder.

Isolering af anti-TFI-Deptid-lo

Det syntetiske TFI-peptid (3 mg) kobledes til 0,8 g CNBr-aktiveret "Sepharose® 4B" under anvendelse af producentens metode (Pharmacia). For at isolere spe-20 cifikt antistof blev sammenhældt antiserum (15 ml) blandet med samme volumen af en opløsning (PNBT) indeholdende PBS, 0,4 M NaCI, 0,1 M benzamidin og 1 % "Triton® X-100" og kromatograferet på TFI-peptid-'‘Sepharose 4B"-søjlen ved stuetemperatur. Søjlen blev vasket med 30 ml PNBT-opløsning og herefter med den samme opløsning uden 'Triton X-100". Det bundne antistof 25 blev elueret med 0,1 M glycin/HCI, pH 2,2, neutraliseret umiddelbart ved tilsætning af 1/10 volumen 1 M Tris-OH og dialyseret grundigt over for saltvandsopløsning. Omtrent 6,5 mg anti-TFI-peptid-lg blev isoleret fra 15 ml antiserum.

Cellekultur

Chang-lever-, SK hepatoma- og HepG2-celler blev dyrket til sammenflydning i 30 Dulbecco’s modificerede Eagle’s substrat (DMEM) tilsat 10 % fetait bovint se- 22 DK 174522 B1 rum, 50 enheder/ml penicillin og 50 μοΛηΙ streptomycin i 175 cm2 kolber. Fem kolber indeholdende hver slags celler blev trypsinbehandlet og anvendt til at pode en 10-kammers cellefabnik (Nunc). Efter sammenflydning (ca. 1 uge) blev cellerne vasket to gange med PBS og inkuberet i et serumfrit substrat. Det se-5 rum-fri substrat bestod af DMEM tilsat 0,5 % lactalbumin-hydrolysat, 50 enhe-der/ml aprotinin, ITS præmix (insulin-transferrin-selen, Collaborative Research product), 20 ng/ml levercelle-vækstfaktor (glycyl-histidyl-lysin) og 100 ng/ml phorbol-12-myristat-13-acetat. Det serumfri substrat blev ombyttet med frisk substrat hver tredje dag. Cellerne kan holdes under disse betingelser i >2 må-10 neder. De sammenhældte konditionerede substrater blev indstillet til 0,02 %

NaN3 og 0,01 % "Triton X-100" og opbevaret ved 4 °C. Visse substrater blev koncentreret 20 til 100 gange ved ultrafiltrering under anvendelse af Amicon's YM30 spiralmembransystem.

Immunoaffinitetsrensnina af TFI

15 Isoleret anti-TFI-peptid-lg (20 mg) blev koblet til 2 g CNBr-aktiveret "Sepharose 4B" efter producentens instruktioner. Lejevolumenet af gelen var 7 ml. For at isolere TFI blev det konditionerede substrat (ukoncentreret eller koncentreret) fra Chang-lever-, SK-hepatoma- eller HepG2-celler kromatograferet på anti-TFI-peptid-lg-”Sepharose 4B"-søjlen med en hastighed på 2 ml/minut i kulden, indtil 20 signifikant TFl-aktivitet kom tilsyne i gennemløbet. Søjlen blev herefter vasket med 70 ml PNBT og 70 ml af samme opløsning uden "Triton X-100". Det bundne TFI blev elueret med 0,1 M glycin/HCI, pH 2,2, og koncentreret til omtrent 0,6 ml ved vakuumdialyse over for 0,1 M glycin/HCI, pH 2,2.

Resultater: 25 Ved immunoaffinitetskromatograf i på en anti-TFI-peptid-lg-"Sepharose 4B"-søjle isoleredes TFI fra en række leverafledte cellelinier, Chang-lever, SK-hepatoma og HepG2-heptaoma. Fig. 12(A) viser SDS-PAGE af proteinerne, der eiueredesfra anti-TFI-peptid-lg-"Sepharose"-søjlen. I forskellige præparationer observeres noget forskellige proteinprofiler. I visse præparationer er et 40 kDa-30 protein det eneste hovedprotein (bane 4 og 5); i andre findes et antal protein-bånd sammen, og et 38 kDa-protein er et dominerende bånd i stedet for 40 kDa-proteinet. For at fastslå, hvilke proteiner, der er TFI-relaterede, udførtes 125l-Xa-bindingsundersøgelsen. De isolerede TFI-prøver blev underkastet elek- 23 DK 174522 B1 troforese i en 12 % SDS-polyacrylamidgel, og proteinerne overførtes herefter ved elektroforetisk blot til et nitrocellulosepapir og undersøgtes for 125l-Xa-bindingsaktivitet. Det viste sig, at tre hovedbånd med tilsyneladende molekylvægte på 40, 38 og 25 kDa er i besiddelse af t25l-Xa-bindingsaktivitet, mens 5 andre bånd ikke er i besiddelse heraf. (Fig. 12(B)). Sekvensanalyse af 38 kDa-båndet fra SK-hepatoma-celleme viser, at det har den samme aminoterminale sekvens som den 40 kDa TFI der blev isoleret fra HepG2-celler i eksempel 1 ovenfor. Baseret på immunoaffinitet, aminosyresekvensering og ,25I-Xa-bindingsstudier viser det sig, at 40, 38 og 25 kDa-inhibitorerne kan afledes fra 10 det samme molekyle.

Resultaterne af ovennævnte præparative arbejde i laboratoriemålestok, der førte til isolering af TFI fra adskillige cellekilder ved immunoaffinitetskromatografi er nærmere beskrevet i den detaljerede omtale aftegningens fig. 12(A) og 12(B).

Fig. 12. Denne figur viser SDS-PAGE af immunoaffinitetsisoleret TFI og scree-15 ning af 125l-Xa-bindingsaktivitet. (A) SDS-PAGE. Elektroforese udførtes på en 12 % polyacrylamidgel. Bane 1, molekylvægtmarkører; bane 2, Chang-lever-TFI; bane 3, SK-hepatoma-TFI (præparation 1); bane 4, SK-hepatoma-TFI (præparation 2); bane 5, HepG2-TFl (præparation 1); bane 6, HepG2-TFl (præparation 2). (B) Screening af 125l-Xa-bindingsaktivitet. Prøver blev underkastet 20 elektroforese på en 12 % polyacrylamidgel. Proteinerne blottes elektroforetisk over på et nitrocellulosepapir under anvendelse af "Bio-Rad Trans-Blot"®-apparatet og metoden. Efter overførslen blev nitrocellulosepapiret først forsigtigt rystet i PBB-opløsning (PBS indeholdende 5 mg/ml BSA og 2,5 mg/ml bovint gammaglobulin) og derpå i PBB-opløsning indeholdende 400 ng/ml 125l-Xa, 25 hver ved stuetemperatur i 1 time. Herefter blev nitrocellulosepapiret tørret og autoradiograferet i 3 dage under anvendelse af Kodak XAR-5 film. Bane 1, Chang-lever-TFI; bane 2, SK-hepatoma-TFI (præparation 1); bane 3, SK-hepatoma-TFI (præparation 2) og bane 4, HepG2-TFI (præparation 2).

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til isolering af vævsfaktorinhibitor (TF|) fra det konditionerede medium af en levercellelinie, kendetegnet ved, at det konditionerede medi-5 um underkastes immunoaffinitetsrensning med et anti-TFl-peptid-lg rejst over for et peptidantigen omfattende aminosyresekvensen: Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-lle-He-Thr-Asp-Thr- Glu-Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det konditionerede me dium er opnået ved dyrkning af Chang leverceller eller SK-HEP-1 celler i kultur.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at immunoaffinitets-rensningen udføres som immunoaffinitetskromatografi på en anti-TFI-peptid-lg- 15 "Sepharose® 4B"-søjle.

4. Anvendelse af vævsfaktorinhibitor opnået ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 til fremstilling af et antithrombotisk lægemiddel.