JPH06181771A - 新規なヒトｉ型インターフェロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 本発明は、新規なＩ型インターフェロン、及
びそのＮ−グリコシル化誘導体を提供すること。 【構成】 完全に精製されたグリコシル化された、また
はグリコシル化されていないアミノ酸１６８〜１７４個
インターフェロン、及びそれらを含有する医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＩ型インターフ
ェロンおよびこれを含有する医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロンは、一部は重複し、一
部は分岐した生物学的活性によって特徴づけられるヒト
細胞における内因性のいくつかの蛋白質につけられた造
語である。これらの蛋白質は生体の免疫応答を修飾し、
ウイルスにする防御に寄与するものと考えられている。
たとえば、インターフェロンは大きく３種に、すなわち
α，βおよびγ−インターフェロンに分類されている。
また、インターフェロンは、２種の型、すなわちＩ型イ
ンターフェロンおよびＩＩ型インターフェロンにも分類
される。

【０００３】Ｉ型インターフェロンはさらに、α−イン
ターフェロンおよびβ−インターフェロンに分類され
る。これらは、共通の先駆蛋白質に由来するものと思わ
れる。一方、ＩＩ型インターフェロンはγ−インターフ
ェロンと命名され、Ｉ型インターフェロンとは無関係で
ある。

【０００４】βおよびγ−インターフェロンはヒトでは
ただひとつの亜種が知られている〔たとえば、オーノほ
か（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ）：プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・サイエンシス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第７８巻、５３
０５〜５３０９（１９８１）；グレーほか（Ｇｒａｙｅ
ｔ ａｌ）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９５
巻、５０３〜５０８（１９８２）；タヤほか（Ｔａｙａ
ｅｔ ａｌ）：イーエムビーオー・ジャーナル（ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）、１／８、９５３〜９５８（１
９８２）参照〕。

【０００５】一方、α−インターフェロンについては数
種の亜種が記載されている〔たとえば、フィロソフィカ
ル・トランスアクションズ・オブ・ザ・ロイアル・ソサ
イアティー・オブ・ロンドン（Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．
Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．）、第２９９巻、７〜２８（１
９８２）参照〕。成熟α−インターフェロンは各亜種間
の最大分岐２３％、アミノ酸長約１６６個であることが
明らかにされている。異常に高い分子量〔ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動により２６，０００：ゴーレ
ン（Ｇｏｒｅｎ，Ｐ．）ほか：バイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）、第１３０巻、２７３〜２８０（１９８
３）〕をもつα−インターフェロンも報告されている。
このインターフェロンはＩＦＮ−α２６Ｋと呼ばれてい
て、特異的な抗ウイルスおよび抗細胞活性はこれまで知
られているもののうち最高である。

【０００６】現在まで知られているインターフェロンは
各種の疾患に対して有効なものと考えられているが、多
くの他疾患ではほとんどあるいは全く効果がみられない
〔たとえばポーレッジ（Ｐｏｗｌｅｄｇｅ）：バイオテ
クノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８
４年３月、２１５〜２２８頁、インターフェロン・オン
・トライアル（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｏｎ Ｔｒｉａ
ｌ）参照〕。

【０００７】インターフェロンはまた、副作用に難点が
ある。たとえば、第１相試験に基づいて安全性が確信さ
れていた組換えα−インターフェロンの抗癌性に対する
臨床試験では、約５０００万単位の用量で、たとえば、
急性の錯乱状態、手足が動かなくなる関節痛、ひどい疲
労および食欲不振、失見当識、けいれんおよび肝毒性の
随伴が認められた。

【０００８】１９８２年にフランス政府は、インターフ
ェロン服薬中の癌患者に致命的な心臓発作がみられたの
ち、臨験の中止を指示した。最近の米国における臨床試
験でも少なくとも２例の心臓に対する副作用による死亡
例が報告されている。少なくとも一部の副作用、たとえ
ば発熱、倦怠は、インターフェロン分子自体に固有のも
ので、混入した不純物によるものではないことが次第に
明らかになってきた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】インターフェロンに対
する大きな期待と、副作用を減弱させたさらに新しいイ
ンターフェロン様分子の発見に対する願望から、本発明
者らはそのような新規物質の探索および製造に着手し
た。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、リーダーペプ
チドを含有してもよいある種の新規Ｉ型インターフェロ
ン、およびそのＮ−グリコシル化誘導体（本明細書にお
いてはω−インターフェロンまたはＩＦＮ−ωと呼ぶ）
であって、アミノ酸１６８〜１７４個、好ましくは１７
２個を含有し、これまで公知のα−インターフェロン亜
種に比べて分岐３０〜５０％、好ましくは４０〜４８
％、β−インターフェロンに比べて分岐約７０％であ
り、一方、α−インターフェロンと類似の有効性を示す
がこれらの分子の公知の治療上の多くの欠点を示さない
新規インターフェロンを提供するものである。

【００１１】すなわち、本発明は、完全に精製されたグ
リコシル化されていない、またはグリコシル化された新
規インターフェロン、それをコードする遺伝子配列、な
らびにその配列を含有する組換え分子に関するものであ
り、およびまた上述の遺伝子配列を含有する発現ビーク
ル、たとえばプラスミド、ならびに発酵または組織培養
法によりこの新規インターフェロンを産生できる各種宿
主、たとえば微生物または組織培養宿主に関するもので
ある。

【００１２】好ましい態様においては、本発明は、以下
の式を有するω−インターフェロンおよび相当する遺伝
子配列を提供する：

【００１３】

【化４】

【００１４】１１１番目の配列ＧＧＧ（Ｇｌｙをコード
する）はＧＡＧ（ｇｌｕをコードする）に置換すること
もできる。好ましい分子としては、７８番目のアミノ酸
がＮ−グルコシル化されている誘導体も包含される。上
述の２種のω−インターフェロンは、たとえば下記式で
示されるリーダーペプチドを含有していてもよい：

【００１５】

【化５】 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly

【００１６】本発明における新規なω−インターフェロ
ンおよびそれをコードするＤＮＡ配列は以下の方法で得
られる。ヒトＢ細胞リンホイド系、たとえばナマルワ細
胞〔クライン（Ｋｌｅｉｎ，Ｇ．）ほか：インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ）、第１０巻、４４（１９７２）参照〕は
ウイルス、たとえばセンダイウイルス処置によって刺激
され、α−およびβ−インターフェロンを同時に産生す
る。この過程で、生成したｍＲＮＡをナマルワ細胞から
単離すると、次にこれはｃＤＮＡ合成の鋳型として使用
できる。クローニング過程でのインターフェロン特異的
配列の収率を増大させるため、ｍＲＮＡプレパレーショ
ンを庶糖濃度勾配により、各ｍＲＮＡ分子の長さに応じ
た領域に分離する。

【００１７】１２Ｓ付近（ｍＲＮＡの塩基長約８００〜
１，０００）の領域のｍＲＮＡを集めるのが好ましい。
α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンに特
異的なｍＲＮＡはこの領域に集まる。この勾配領域から
のｍＲＮＡを水で沈殿、溶解させ、濃縮する。ｃＤＮＡ
ライブラリーの調製には主として、文献公知の方法を用
いる〔たとえば、ドウワーキン−ラッスル（Ｄｗｏｒｋ
ｉｎ−Ｒａｓｔｌ，Ｅ．）ほか：ジャーナル・オブ・イ
ンターフェロン・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２／４、５
７５〜５８５（１９８２）参照〕。ｍＲＮＡにはオリゴ
−ｄＴを加えてプライマーをつける。ついで４種のデオ
キシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＡＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）および逆転写酵素を適当な緩
衝溶液を用いて加え、４５℃で１時間、ｃＤＮＡを合成
させる。

【００１８】クロロホルム抽出およびゲルカラム、たと
えばセファデックス５０によるクロマトグラフィーで、
ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドを精製する。アルカリ
処理（０．３Ｍ ＮａＯＨ，５０℃、１時間）によりＲ
ＮＡを加水分解し、酢酸ナトリウム溶液によって中和し
たのちにエタノールでｃＤＮＡを沈殿させる。適当に緩
衝した溶液中、４種のデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェートおよび大腸菌ＤＮＡ−ポリメラーゼＩを加えて二
重鎖合成を実施する。

【００１９】この間、ｃＤＮＡはその３′末端における
ヘアピン構造の生成により、鋳型としてと同時にプライ
マーとしても使用する（１５℃、６時間）〔エフトラテ
ィアディス（Ｅｆｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ）ほか：セル
（Ｃｅｌｌ）、第７巻、２７９（１９７６）参照〕。フ
ェノール抽出、セファデックスＧ５０クロマトグラフィ
ーおよびエタノール沈殿後、適当な溶液中で、一重鎖に
特異的なエンドヌクレアーゼＳ１でＤＮＡを処理する。
ヘアピン構造および二重鎖に変換されなかったｃＤＮＡ
はすべて分解される。

【００２０】クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
後、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を庶糖濃度勾配上、大
きさによって分離する。次のクローニング工程において
は、新規インターフェロンをコードする完全な配列を含
むクローンのみが得られる確率を高めるために、６００
ｂｐ以上の大きさのｄｓＤＮＡのみを用いるのが好まし
い。長さ６００ｂｐ以上のｄｓＤＮＡをエタノール沈殿
および水への溶解により勾配から濃縮する。

【００２１】得られたｄｓＤＮＡ分子の数を増加させる
ため、初めに、ｄｓＤＮＡを適当なベクター中に置き、
ついでバクテリア、大腸菌内に導入する。使用するベク
ターとしてはプラスミドｐＢＲ３２２〔ボリバー（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ，Ｆ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２巻、
９５（１９７７）〕が好ましい。このプラスミドは主と
して、レプリコンと２種の選択マーカーを含んでいる。
これは宿主に、抗生物質アンピシリンおよびテトラサイ
クリンに対する抵抗性（Ａｐ^r ，Ｔｃ^r ）を付与する。
β−ラクタマーゼに対する遺伝子（Ａｐ^r ）は制限酵素
ＰｓｔＩに対する認識配列を含んでいる。したがって、
ｐＢＲ３２２はＰｓｔＩで切断できる。

【００２２】重複３′末端は、適当に緩衝化した溶液
中、あらかじめ混合した量のｄＧＴＰとともに、末端デ
オキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によ
り延長される。同時に、ｄｓＤＮＡは、３′末端でｄＣ
ＴＰを用い、酵素ＴｄＴにより同様に延長される。プラ
スミドとｄｓＤＮＡのホモポリマー末端は相補性で、両
者を適当な濃度比により、適当な塩、緩衝液および温度
条件下に混合すれば、ハイブリダイゼーションが起こる
〔ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｔ）ほか：メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｒｏｇｙ）、第６８巻、４１〜５０（１９８
０）〕。

【００２３】大腸菌ＨＢ１０１株〔遺伝子型Ｆ−、ｈｓ
ｄｓ２０（ｒ−Ｂ，ｍ−Ｂ）ｒｅｃＡ１３、ａｒａ−１
４、ｐｒｏ Ａ２、ｌａｃ Ｙ１、ｇａｌ Ｋ２、ｒｐ
ｓＬ２０（ｓｍｒ）、ｘｙｌ−５、ｍｔｌ−１、ｓｕｐ
Ｅ４４、ｌａｍｂｄａ−）は、ＣａＣｌ₂ 溶液での洗
浄により、組換えベクター−ｄｓＤＮＡ分子での形質転
換に備える。コンピーテントな大腸菌ＨＢ１０１をＤＮ
Ａと混合し、０℃でインキュベーション後、かくして得
られたプラスミドＤＮＡに４２℃で２分間熱ショックを
与え、形質転換を行う〔ダガート（Ｄａｇｅｒｔ，
Ｍ．）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６巻、２３〜２８
（１９７９）〕。

【００２４】形質転換されたバクテリアを次に、テトラ
サイクリン含有プレート上にひろげる（１０μｇ／ｍ
ｌ）。ベクターないしは組換えキャリアー分子（Ｔ
ｃ^r ）を受けた大腸菌ＨＢ１０１のみが、この寒天上で
生育できる。β−ラクタマーゼ遺伝子へのｄｓＤＮＡの
導入によりβ−ラクタマーゼに関する情報は破壊される
ので、組換えベクター−ｄｓＤＮＡ分子は宿主に、遺伝
子型Ａｐ^s Ｔｃ^r を与える。

【００２５】クローンを次に５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む寒天板に移す。約３％のみが生育し、これは
クローンの９７％にｄｓＤＮＡ分子が挿入されたことを
意味する。０．５μｇのｄｓＤＮＡから出発して３０，
０００以上のクローンが得られた。この２８，６００の
クローンを別々に、栄養培地、１０μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンおよびグリセリンを含むマイクロタイター板
のカップに移した。クローンが生育したのち、プレート
を−７０℃に保持して貯蔵した（ｃＤＮＡライブラリ
ー）。

【００２６】新規なインターフェロン遺伝子含有クロー
ンについてｃＤＮＡライブラリーを検索するため、解凍
したのちクローンをニトロセルロースフィルターに移
す。このフィルターをテトラサイクリン含有栄養寒天培
地上に置く。バクテリアのコロニーを生育させたのち、
バクテリアのＤＮＡをフィルター上に固定した。

【００２７】プローブとしては、ＩＦＮ−α２−Ａｒｇ
の遺伝子を含むクローンｐＥＲ３３のインサートを有利
に使用できる〔ラッスル（Ｒａｓｔｌ，Ｅ）ほか：ジー
ン（Ｇｅｎｅ）、第２１巻、２３７〜２４８（１９８
３）ヨーロッパ特許出願第０，１１５，６１３号参照〕
ニックトランスレーションにより、ＤＮＡ−ポリメラー
ゼＩ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびα−³²Ｐ−
ｄＣＴＰを用い、ＤＮＡのこの部分を放射能により標識
する。ニトロセルロースフィルターは最初、放射性サン
プルを加えないで、緩和ハイブリダイゼーション条件下
に前処理し、ついで放射性サンプルを加えて１６時間ハ
イブリダイズする。ついでフィルターを同様に、緩和条
件下に洗浄する。

【００２８】この緊縮性の低いハイブリダイゼーション
および洗浄により、インターフェロンα２−Ａｒｇを含
むクローンのみでなく、これまで知られているα−イン
ターフェロンとはかなり異なる配列を有するインターフ
ェロンを含む他のクローンも得られる。乾燥後、フィル
ターをＸ線フィルムに暴露する。背景レベルより明らか
に高い黒化効果はインターフェロン特異性配列をもつク
ローンの存在を示す。

【００２９】放射能シグナルは質的に一定しないので、
陽性のクローンまたは陽性結果が疑われるような反応を
示すクローンを小規模に培養する。プラスミドＤＮＡ分
子を単離し、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化
し、アガロースゲル上電気泳動により大きさで分離する
〔バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ほか：ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ． Ａｓｉｄ． Ｒ
ｅｓ．）、第７巻、１５１３（１９７９）〕。

【００３０】アガロースゲル中のＤＮＡを、サザーン法
によってニトロセルロースフィルターに移す〔サザーン
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ． Ｍ．）：ジャーナル・オブ
・モルキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉ
ｏｌ．）、第９８巻、５０３〜５１７（１９７５）〕。
このフィルター中で、ＤＮＡを、放射性、ＩＦＮ遺伝子
含有、変性サンプルとハイブリダイズさせる。陽性コン
トロールとしては、インターフェロンα２−Ａｒｇに対
する遺伝子を含むプラスミド１Ｆ７（ＤＳＭ番号２３６
２でＤＳＭに寄託）を用いる。

【００３１】オートラジオグラムから、２種のクロー
ン、Ｅ７６Ｅ９およびＰ９Ａ２が、非緊縮、緩和条件下
にインターフェロンα２Ａｒｇの遺伝子とハイブリダイ
ズした配列を含むことが明らかであった。クローンＥ７
６Ｅ９およびＰ９Ａ２のｄｓＤＮＡインサートについて
さらに詳細を知るため、これらのクローンのプラスミド
を大規模に製造した。ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレ
アーゼ、たとえばＡｌｕＩ、Ｓａｕ３Ａ、ＢｇｌＩＩ、
ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩおよびＨａｅＩＩＩで消化する。
生成した断片をアガロースゲル中で分離する。相当する
サイズマーカー、たとえばｐＢＲ３２２の制限エンドヌ
クレアーゼ、ＨｉｎｆＩまたはＨａｅＩＩＩによる消化
で得られた断片との比較により、断片のサイズを決定で
きる。

【００３２】スミスとバーンスタイルのマッピング法に
より、これらの断片の配列を決定できる〔スミス（Ｓｍ
ｉｔｈ，ＨＯ）ほか：ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．）、第３巻、２
３８７〜２３９８（１９６７）〕。かくして得られた制
限酵素地図（図１および図２）から、驚くべきことに、
クローンＥ７６Ｅ９およびＰ９Ａ２のインサートはこれ
まで知られていないインターフェロン遺伝子、すなわち
ω−インターフェロン遺伝子を含むことが発見された。

【００３３】ω−インターフェロンに関するこの情報
は、ｃＤＮＡインサートを適当な制限エンドヌクレアー
ゼで消化するために利用することができる。この断片を
バクテリオファージＭ１３ｍｐ９〔メッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ，Ｊ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１９巻、
２６９〜２７６（１９８２）〕のｄｓＤＮＡ型（複製
型）にリゲートさせ、サンガーのジデオキシ法〔サンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ）ほか：プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナルアカデミー・サイエンシズ・オブ・ユナ
イテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）第７４巻、
５４６３〜５４６７（１９７７）〕を用いて配列を決定
する。組換えファージの一重鎖ＤＮＡを単離する。

【００３４】合成オリゴマーの結合後、４種の別個のプ
レパレーションについて、大腸菌からのＤＮＡ−ポリメ
ラーゼの大断片（クレノウ断片）を用いて第二鎖合成を
行う。４個の部分反応のそれぞれに、４種のジデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ）の１種を加える。これに
より、特定のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート
に関して相補性の塩基が鋳型ＤＮＡ中にたまたま生じた
場所で、統計的に分布した鎖の切断が起こる。放射標識
ｄＡＴＰも使用する。合成反応を停止させたのち、生成
物を変性させ、単一鎖ＤＮＡ断片を変性ポリアクリルア
ミドゲル中、大きさにより分離する〔サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ）ほか：エフイービーエス・レターズ（ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．）、第８７巻、１０７〜１１１（１９
７８）〕。

【００３５】このゲルを次にＸ線フィルムに暴露する。
このオートラジオグラムから、組換えＭ１３ファージの
ＤＮＡ配列を読みとることができる。各種組換えファー
ジのインサートの配列は適当なコンピュータプログラム
によって解析処理する〔ステイドン（Ｓｔａｄｅｎ，
Ｒ）：ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．）、第１０巻、４７３１〜４７５
１（１９８２）〕。

【００３６】図１および図２には配列決定の方法を示
す。図３はクローンＰ９Ａ２のインサートのＤＮＡ配列
を、図４はクローンＥ７６Ｅ９のインサートのＤＮＡ配
列を示す。非暗号ＤＮＡ鎖は５′→３′の方向にそれか
ら誘導されるアミノ酸配列とともに示す。

【００３７】ω（Ｇｌｕ）−インターフェロンに関する
クローンＥ７６Ｅ９の単離ＤＮＡは塩基対長８５８で
３′非翻訳領域を有する。成熟ω（Ｇｌｕ）−インター
フェロンをコードする領域はヌクレオチド９からヌクレ
オチド５２４までである。ω（Ｇｌｙ）−インターフェ
ロンに対するクローンＰ９Ａ２の単離ｃＤＮＡは塩基対
長８７７、成熟ω−インターフェロンをコードする配列
はヌクレオチド８からヌクレオチド５２３までである。
Ｐ９Ａ２の場合、３′非翻訳領域はポリＡセグメントま
でである。

【００３８】成熟ω−インターフェロンをコードするＤ
ＮＡ配列はクローンＥ７６Ｅ９およびＰ９Ａ２中に完全
に含有される。成熟ω（Ｇｌｕ）−およびω（Ｇｌｙ）
−インターフェロンのＮ末端はいずれもアミノ酸、シス
テイン−アスパラギン酸−ロイシンで始まる。全く驚く
べきことに、上述の２種の成熟ω−インターフェロンは
アミノ酸長１７２で、これは他の公知のインターフェロ
ンの長さ、すなわちα−インターフェロンのアミノ酸長
１６６（または１６５）と異なっている。また驚くべき
ことに、２種のω−インターフェロンは７８番目のアミ
ノ酸（アスパラギン−メチオニン−スレオニン）がＮ−
グリコシル化されている。

【００３９】クローンＥ７６Ｅ９とＰ９Ａ２のＤＮＡを
比較すると１ヶ所だけ相違がある。１１１番目のアミノ
酸をコードするクローンＥ７６Ｅ９のトリプレットはＧ
ＡＧでグルタミン酸をコードする。このトリプレットは
クローンＰ９Ａ２ではＧＧＧでグリシンをコードする。
したがって、２種のω−インターフェロン蛋白質はアミ
ノ酸１個がたがいに相違し、以下ω（Ｇｌｕ）−インタ
ーフェロン（７６Ｅ９）およびω（Ｇｌｙ）−インター
フェロン（Ｐ９Ａ２）と呼ぶ。２種のω−インターフェ
ロンを従来公知のヒトα−インターフェロン亜種と比較
すると次のとおりである。

【００４０】

【表１】 ────────────────────────────────── ω α ────────────────────────────────── 蛋白質のアミノ酸の長さ １７２ １６６^* Ｎ−グリコシル化位置 ７８ − ^** ──────────────────────────────────

【００４１】^* インターフェロンαＡは１６５個しか
アミノ酸をもたない。^** インターフェロンαＨは７５の位置がグリコシル化
されている場合がある。〔ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ，
Ｄ）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９０巻、
２０〜２６（１９８１）〕。

【００４２】プラスミドＥ７６Ｅ９をもつ大腸菌ＨＢ１
０１およびプラスミドＰ９Ａ２をもつ大腸菌ＨＢ１０１
ドイツ微生物寄託機関（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＤＳ
Ｍ，ゲッティンゲン）にそれぞれＤＳＭ３００３および
ＤＳＭ３００４の番号で１９８４年４月３日寄託され
た。

【００４３】新しく発見されたクローンがインターフェ
ロン様の活性を産生することを証明するため、クローン
Ｅ７６Ｅ９を培養し、たとえばバクテリアの分解物を蓄
積させ、ついでプラーク減少試験を行う。期待どおり、
バクテリアはインターフェロン様活性を産生した（例３
参照）。さらに、２種の新たに発見されたインターフェ
ロンが新しいインターフェロン族に属するものであるこ
とを証明するため、ナマルワ細胞からすべてのＤＮＡを
単離し、各種の制限エンドヌクレアーゼで消化させた。

【００４４】この方法で、クローンＰ９Ａ２およびＥ７
６Ｅ９のｃＤＮＡでコードされる遺伝子の数を知ること
ができる。この目的で、得られたＤＮＡ断片をアガロー
スゲル上でサザーン法〔サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）
ほか：ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー
（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．）、第９８巻、５０３〜
５１７（１９７５）〕を用いて分離し、ニトロセルロー
スフィルター上に置き、比較的ストリンジェントな条件
下に、放射標識したクローンＰ９Ａ２の特異的ＤＮＡと
ハイブリダイズさせる。プラスミドＰ９Ａ２およびｐＥ
Ｒ３３からのＤＮＡとのハイブリダイゼーションで得ら
れた結果を図５のａに示す。

【００４５】各レーンには、消化した各種ＤＮＡサンプ
ルを示す記号を付してある（Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｈ＝Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｓ＝ＳｐｈＩ、Ｐ＝Ｐｓ
ｔＩ、Ｃ＝ＣｌａＩ）。フィルターの左側半分はα−イ
ンターフェロン遺伝子プローブ（“Ａ”）と、右側半分
はクローンＰ９Ａ２のｃＤＮＡインサート（“Ｏ”）と
ハイブリダイズさせた。α−インターフェロン遺伝子プ
ローブまたは新規インターフェロン遺伝子プローブとハ
イブリダイズしたバンドのセットは異っている。２種の
異なるプローブの交差ハイブリダイゼーションは相当す
るレーンを調べても検出できなかった。

【００４６】図５のｂにはクローンＰ９Ａ２のｃＤＮＡ
とハイブリダイゼーションに用いた断片とを例示する。
一部の制限酵素の認識部位を示してある（Ｐ＝Ｐｓｔ
Ｉ、Ｓ＝Ｓａｕ３Ａ、Ａ＝ＡｌｕＩ）。プローブは３個
の可能性あるＰｓｔＩ断片のうち２個しか含んでいな
い。ハイブリダイゼーションパターンは、約１３００塩
基体（ｂｐ）のただ１個のハイブリダイズ断片しか示さ
ず、これは相同性遺伝子に属する。１２０ｂｐの小断片
はゲルの外側まで移動した。遺伝子の５′部に属するバ
ンドは、プローブがこの領域を含まないので発見できな
い。少なくとも６個の異なるバンドがＰｓｔＩのレーン
中に発見できる。

【００４７】これは、新しい配列に関する他のいくつか
の遺伝子がヒトゲノム中に存在することを意味する。こ
れらの遺伝子は１個もしくは２個以上のＰｓｔＩ認識部
位が存在するのであれば、少なくとも、もう３個の遺伝
子が単離できるものと期待される。これらの遺伝子は、
プラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミド
ベクター中に含まれるヒト遺伝子ライブラリーからのハ
イブリダイゼーションによって単離するのが好ましいも
のと思われる（例４ｅ参照）。

【００４８】この点において、本発明によるω−インタ
ーフェロンは特に記述する２種の成熟インターフェロン
を包含するのみでなく、ＩＮＦ−ω活性が影響されない
で残ったこれらのポリペプチドの任意の修飾をも包含す
るということができる。これらの修飾としては、活性に
影響を与えないＮ末端またはＣ末端からの分子の短縮、
アミノ酸残基の他の残基との交換、不活性または活性の
他の分子へのこの分子の化学的または生化学的方法によ
る結合がある。後者の例としては、１種もしくは２種以
上のω−インターフェロンおよび／または公知のα−ま
たはβ−インターフェロンから調製されるハイブリッド
分子を挙げることができる。

【００４９】新規なインターフェロン、とくにω（Ｇｌ
ｙ）−およびω（Ｇｌｕ）−インターフェロンのアミノ
酸およびヌクレオチド配列と、すでに報告されているα
−インターフェロンおよびβ−インターフェロンのアミ
ノ酸およびヌクレオチド配列〔ワイスマン（Ｗｅｉｓｓ
ｍａｎｎ，Ｃ）ほか：フィロソフィカル・トランスアク
ションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイアティ・オブ・
ロンドン（Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ．
Ｌｏｎｄ．）、第２９９巻、７〜２８（１９８２）；ウ
ルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ）ほか：ジャーナル・オ
ブ・モルキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ．）、第１５６巻、４６７〜４８６（１９８
２）；タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ）ほか：プロ
シーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・サイ
エンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・
アメリカ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．）、第７７巻、４００３〜４００６（１９８０）；
トコドロ（Ｔｏｋｏｄｏｒｏ，Ｋ）ほか：イーエムビー
オー・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ）、第３巻、６６９〜
６７０（１９８４）〕との差を比較できるように、相当
する配列が対になるように配置し、各位置での差を数え
る。

【００５０】図７に示す結果は、クローンＰ９Ａ２およ
びＥ７６Ｅ９のＤＮＡ配列はＩ型インターフェロン（た
とえばαおよびβ−インターフェロン）の配列と関係が
あることを示している。また、各α−インターフェロン
と新規な配列との間のアミノ酸配列の差は４１．６％以
上、４７．０％以下であることも明らかである。新規な
両配列および各α−インターフェロンの配列と、β−イ
ンターフェロンの配列との間の差は約７０％のオーダー
である。

【００５１】関係遺伝子の全セットの存在を示した例４
の結果を考慮し、またインターフェロンの命名法につい
ての提案〔ビルセック（Ｖｉｌｃｅｃｋ Ｊ）ほか：ジ
ャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー（Ｊ． Ｇｅ
ｎ． Ｖｉｒｏｌ．）、第６５巻、６６９〜６７０（１
９８４）〕を考慮し、クローンＰ９Ａ２およびＥ７６Ｅ
９のｃＤＮＡインサートが、インターフェロン−ωと呼
ぶことにする新しいＩ型インターフェロン群をコードす
るものと考える。

【００５２】また、ω−インターフェロン遺伝子の発現
はＩ型インターフェロンの場合と同様に起こることも明
らかである。α−およびω−インターフェロンの多重遺
伝子族の各メンバーのＳ１マッピング法〔バーク（Ｂｅ
ｒｋ，ＡＪ）ほか：セル（Ｃｅｌｌ）第１２巻、７２１
（１９７７）〕に基づく転写を検討し（例７参照）、ω
−１−ｍＲＮＡの発現はウイルス誘発性であることが明
らかである。この種の遺伝子族の転写産物は約１，００
０個の塩基からわずか数個が異なるのみであるから、各
種ＩＦＮのｍＲＮＡを識別するためにはハイブリダイゼ
ーションだけでは充分に鋭敏な識別基準とはいえない。

【００５３】そのために、９種のα−インターフェロ
ン、インターフェロン−ω１およびβ−インターフェロ
ンのｍＲＮＡ配列を一列に並べる。大文字はトップ配列
に特異的な塩基を示す大文字を用いている。このような
特異的サイトは単純なコンピュータプログラムを用いて
容易に発見できる。このような特異的サイトに始まるト
ップ配列に相補性のハイブリダイゼーションプローブの
みが選ばれたサブタイプのｍＲＮＡと完全にハイブリダ
イズできる。

【００５４】このハイブリダイゼーションプローブがそ
の特異的５′末端で放射標識されていれば、一重鎖特異
性ヌクレアーゼ（好ましくはＳ１ヌクレアーゼ）での分
解に対し保護されている放射標識のみが、プローブが設
計されたインターフェロンサブタイプｍＲＮＡとハイブ
リダイズしたものである。この原理はインターフェロン
の場合に限らず、図８に記載の特異的サイトを有するい
ずれの群の公知配列にも適用できる。

【００５５】上述のサブタイプの特異的サイトは制限サ
イトではない。これは大部分の場合、制限エンドヌクレ
アーゼによるｃＤＮＡの切断ではサブタイプ特異的なハ
イブリダイゼーションプローブを生成できないことを意
味する。したがって、この例で用いたプローブは、上記
特異的サイトでインターフェロン−ω１のｍＲＮＡと相
補性の５′末端で放射標識されたオリゴヌクレオチドを
延長することによって生成させた。図１０は、期待され
たように、ω１−ｍＲＮＡがナマルワ細胞およびＮＣ３
７細胞中で誘発されることを示している。

【００５６】したがって、本発明は上述のω−インター
フェロンを特異的にコードする遺伝子配列のみでなく、
突然変異、欠失、転位または付加によって容易かつ定常
的に得られる修飾をも包含するものである。ヒトω−イ
ンターフェロン（すなわち本明細書に示すような生物学
的活性を有するインターフェロン）をコードする任意の
配列、および実際に示した配列に縮退される任意の配列
も包含される。

【００５７】本発明の技術分野における熟練者には、暗
号領域の縮退ＤＮＡ配列の調製方法は自明であろう。ま
た、本明細書においてＩＦＮ−ωについて示した活性ス
ペクトルを有するポリペプチドをコードする任意の配
列、および本明細書に示した配列（またはその部分）と
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（すな
わち、約８５％、好ましくは約９０％以上のホモロジー
の選択）下にハイブリダイズするポリペプチドをコード
する任意の配列もカバーする。

【００５８】ハイブリダイゼーションは６×ＳＳＣ／５
×デンハード（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液／０．１％ＳＤ
Ｓ中６５℃で実施する。緊縮の程度は洗浄工程で測定す
る。約８５％またはそれ以上のホモロジーをもつＤＮＡ
配列の選択には０．２×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳ／６
５℃の条件が適当であり、約９０％またはそれ以上のホ
モロジーをもつＤＮＡ配列の選択には０．１×ＳＳＣ／
０．０１％ＳＤＳ／６５℃の条件が適当である。

【００５９】これらの条件（０．２×ＳＳＣ）下にコス
ミドライブラリーをスクリーニングすると、ＩＦＮ−ω
１プローブとハイブリダイズする多くのコスミドが発見
される。それから単離される制限酵素断片の配列解析か
ら、真正のＩＦＮ−ω遺伝子（図１１参照）、ならびに
ＩＦＮ−偽ω２、ＩＦＮ−偽ω３およびＩＦＮ−偽ω４
と呼んだ他の３種の関連遺伝子（図１２−１４参照）が
得られる。本発明はこれらの遺伝子およびそれがコード
するペプチドも包含する。

【００６０】ＤＮＡ比較の結果、偽遺伝子はＩＦＮ−ω
遺伝子（インターフェロン−ω１遺伝子）と約８５％の
ホモロジーを示す。さらにＩＦＮ−ω１遺伝子は、転写
されると、ｍＲＮＡが機能インターフェロン蛋白質に対
する情報、すなわち下記式で示される２３個のアミノ酸
長のシグナルペプチドをコードする情報を含み、次に成
熟ＩＦＮ−ω１の１７２個のアミノ酸が連なることを示
している：

【００６１】

【化６】 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly

【００６２】インターフェロン遺伝子は高収率を生じる
条件下に任意の生物体中に導入できる。適当な宿主およ
びベクターは本技術分野の熟練者にはよく知られている
とおりであるが、たとえばヨーロッパ特許出願Ａ０，０
９３，６１９号が参考になる。発現にはとくに原核生物
が好ましい。たとえば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣ
Ｃ番号３１４４６）はとくに有用である。

【００６３】使用できる他の微生物株としては大腸菌Ｘ
１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）がある。上述の
株、ならびに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ^- 、ｌａｍｂｄ
ａ^- 、原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３２５）、枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバチ
ルス、他の腸内バクテリアたとえばサルモネラ（Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）またはセラシ
ア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｅｎｓ）、各種シ
ュードモナド種が使用できる。

【００６４】一般に、宿主細胞と適合性の種から誘導さ
れるレプリコンおよびコントロール配列を含むプラスミ
ドベクターはこれらの宿主と組合せて使用される。この
ベクターははじめから、複製サイト、ならびに形質転換
細胞中で表現型による選択を可能にするマーカー配列を
有する。たとえば、大腸菌は、大腸菌の種から誘導され
るプラスミドｐＢＲ３２２を用いて典型的に形質転換さ
れる〔ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ほか：ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、第２巻、９５（１９７７）〕。

【００６５】ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラ
サイクリン抵抗性の遺伝子を含有し、したがって形質転
換細胞を容易に同定する手段がある。プラスミドｐＢＲ
３２２または他のプラスミドは、発現のために微生物に
よって用いられるプロモーターを含むかまたはそれを含
むように修飾されねばならない。

【００６６】組換えＤＮＡの構築にもっとも一般的に用
いられるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム
〔チャン（Ｃｈａｎｇ）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、第２７５巻、６１５（１９７８）；イタクラ（Ｉ
ｔａｋｕｒａ）ほか：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
第１９８巻、１０５６（１９７７）；ゲーデル（Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２８
１巻、５４４（１９７９）〕およびトリプトファン（ｔ
ｒｐ）プロモーターシステム〔ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ）ほか：ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．）、第８巻、４０５７（１
９８０）；ヨーロッパ特許出願Ａ−０，０３６，７６
６〕がある。

【００６７】これらはもっとも一般的に用いられるもの
であるが、他の微生物プロモーターも発見され、利用さ
れている。たとえば、ＩＦＮ−ωに対する遺伝子配列は
バクテリオファージＬａｍｂｄａ（Ｐ_L ）の左方プロモ
ーターのコントロール下に置くこともできる。このプロ
モーターはコントロール可能な公知プロモーター中最も
強力なもののひとつである。コントロールはｌａｍｂｄ
ａレプレッサーによって生じ、隣接制限サイトは公知で
ある。

【００６８】このレプレッサー遺伝子の熱感受性対立遺
伝子は、完全なＩＦＮ−ω配列を含むベクター上に置く
ことができる。温度を４２℃に上げるとレプレッサーが
不活性化され、プロモーターはその最大レベルで発現す
る。このような条件下に産生されるｍＲＮＡの量は、Ｐ
_L プロモーター由来の新たに合成されたＲＮＡ約１０％
を含む細胞を生じるのに十分である。この方法で、機能
性ＩＦＮ−ω配列がリボソーム結合に隣接して存在し、
ｌａｍｂｄａ Ｐ_L プロモーターの距離は様々のクロー
ンのバンクを確立することができる。これらのクローン
を次にスクリーニングに付し、最高の収率を与えるクロ
ーンを選択する。

【００６９】ＩＦＮ−ω配列の発現および翻訳は、その
非翻訳状態でその生物体と相同性の他のレギュロンのコ
ントロール下に置かれる。たとえばラクトース依存性大
腸菌染色体ＤＮＡは酵素β−ガラクトシダーゼを発現す
ることによってラクトース消化を起こさせるラクトース
もしくはｌａｃオペロンからなる。

【００７０】ｌａｃコントロール要素は、バクテリオフ
ァージｌａｍｂｄａ ｐｌａｃ ５から得られる。これ
は大腸菌に対して伝染性である。ファージのｌａｃオペ
ロンは同じバクテリア種から形質導入によって誘導でき
る。本発明の方法への使用に適したレギュロンはその微
生物の天然プラスミドＤＮＡから誘導できる。ｌａｃプ
ロモーター−オペレーターシステムはＩＰＴＧによって
誘発できる。

【００７１】他のプロモーター−オペレーターシステム
またはその蛋白質も同様に使用できる。たとえばアラビ
ノース−オペレーター、コリシンＥ₁ −オペレーター、
ガラクトース−オペレーター、アルカリホスファターゼ
−オペレーター、ｔｒｐ−オペレーター、キシロースＡ
−オペレーター、ｔａｃ−オペレーター等が使用でき
る。

【００７２】原核生物のほか、真核生物の微生物、たと
えば培養酵母も使用できる。サッカロミセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が真核生
物微生物中では最も一般に使用されているが、他の種の
多くのものが同様に使用される。サッカロミセス中での
発現には、たとえば、プラスミドＹＲｐ７〔スティンク
カム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ほか：ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、第２８２巻、３９（１９７９）；キングス
マン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、
第７巻、１４１（１９７９）；トウシャムパー（Ｔｓｃ
ｈｕｍｐｅｒ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１０巻、
１５７（１９８０）〕およびプラスミドＹＥｐ１３〔ブ
ワッハ（Ｂｗａｃｈ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第８
巻、１２１〜１３３（１９７９）〕が一般的に用いられ
る。

【００７３】プラスミドＹＲｐ７はＴＲＰ１遺伝子を含
有し、これはトリプトファン中での生育能を欠く酵母の
突然変異株、たとえばＡＴＣＣ番号４４０７６に対する
選択マーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムの特性とし
てＴＲＰ１損傷があれば、トリプトファンの非存在下に
おける生育による形質転換の検出のために効果的な環境
を提供する。同様に、プラスミドＹＥｐ１３は酵母ＬＥ
Ｕ２遺伝子を含有し、これはＬＥＵ２−突然変異株を補
足するために使用できる。

【００７４】酵母ベクター中の適当なプロモーター配列
としては、ＡＤＨＩに対する遺伝子の５′−フランキン
グ領域〔アメラー（Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｇ）：メソッズ・
オブ・エンザイモノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１０１巻、１９２〜２０１
（１９８３）〕、３−ホスホグリセレートキナーゼ〔ヒ
ッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ほか：ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．）、第２５５巻、２０７３（１９８０）〕
または他の解糖酵素〔カワサキほか（Ｋａｗａｓａｋｉ
ａｎｄ Ｆｒａｅｎｋｅｌ）：バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．）、第１０８巻、１１０７〜１１１２
（１９８２）〕、たとえばエノラーゼ、グリセロアルデ
ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベート、デカルボキシレース、ホスホフラク
トキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナー
ゼを挙げることができる。

【００７５】適当な発現プラスミドを構築するには、こ
れらの遺伝子に関連する終結配列も、発現させる配列の
３′末端で発現ベクター中にリゲートし、ｍＲＮＡのポ
リアデニレーションと終結を提供する。生育条件によっ
てコントロールされる転写にさらに利点を与える他のプ
ロモータとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ−２、
イソチトクローム−Ｃ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に
関連する分解酵素、上述のグリセロアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、マルトースおよびガラク
トース利用に応答する酵素のプロモーター領域を挙げる
ことができる。

【００７６】接合型酵母の遺伝子座によって調整される
プロモーター、たとえば遺伝子ＢＡＲＩ、ＭＦα１、Ｓ
ＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ５のプロモーターは、温度依
存性のｓｉｖ突然変異〔ライン（Ｒｈｉｎｅ）：博士論
文、オレゴン大学、オレゴン（１９７９）；ヘルスコヴ
ィツほか（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｏｓｈｉｍ
ａ）：酵母サッカロミセスの分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅ
ａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、第１部、１８
１〜２０９（１９８１）コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕を用いた温度調整性シ
ステムに使用できる。これらの突然変異は、酵母のサイ
レントな接合型カセットの発現に直接影響し、したがっ
て間接的に接合型依存性プロモーターに影響する。しか
しながら、一般に、酵母適合性プロモーター、複製開始
および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適当
である。

【００７７】微生物のほかに多細胞動物由来の培養細胞
も宿主として使用できる。原理的には、脊椎動物でも非
脊椎動物でも、任意の起源の培養細胞が利用可能であ
る。しかしながら、脊椎動物細胞での研究に興味が集中
されてきて、最近では培養液中での脊椎動物細胞の増殖
（組織培養）は定常的な操作になってきている〔組織培
養：アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ）、クルーズおよびパターソン（Ｋｒｕｓｅ ａｎ
ｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編（１９７３）〕。

【００７８】このような有用な宿主細胞系の例として
は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ
−７およびＭＤＣＫ細胞系がある。このような細胞に対
する発現ベクターには通常（必要ならば）、オリジンの
複製、発現する遺伝子の前方に位置するプロモーターと
ともに、必要なリボソーム結合サイト、ＲＮＡスプライ
スサイト、ポリアデニレーションサイトおよび転写終結
配列が包含される。

【００７９】哺乳類細胞中で用いるには、発現ベクター
に対するコントロール機能はウイルス性物質によって与
えられる場合が多い。たとえば、一般に用いられるプロ
モーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２由来のもの
であり、またシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の
ものが用いられることがとくに多い。ＳＶ４０の前期お
よび後期エンドプロモーターは、ウイルスからＳＶ４０
ウイルスオリジンの複製〔ファイアース（Ｆｉｅｒｓ）
ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７３巻、１１
２３（１９７８）〕も含む断片としてウイルスから容易
に得られるので、とくに有用である。

【００８０】ウイルスオリジンの複製中にＨｉｎｄＩＩ
ＩサイトからＢｇｌＩサイトの位置の方向に展開する約
２５０ｂｐの配列を包含する限り、大または小ＳＶ４０
断片のいずれも使用できる。さらに、所望の遺伝子配列
と通常関連するプロモーターおよびコントロール配列を
利用することは、このコントロール配列が宿主細胞シス
テムに適合する限り、可能であり、また望ましいことが
多い。

【００８１】複製のオリジンは、たとえばＳＶ４０また
は他のウイルス（たとえば、ポリオーマー、アデノ、Ｖ
ＳＶ、ＢＰＶ等）源から誘導される外因性オリジンを含
むベクターの構築によってもよいし、また宿主の細胞染
色体複製機構によって提供されるものであってもよい。
ベクターが宿主細胞の染色体中に統合化されているので
あれば、後者で十分な場合が多い。

【００８２】しかしながら、遺伝子は発現プラスミドｐ
ＥＲ１０３〔ラッスル−ドウワーキンほか（Ｒａｓｔｌ
ｅ−Ｄｏｗａｒｋｉｎ，Ｅ）ほか：ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、第２１巻、２３７〜２４８（１９８３）およびヨ
ーロッパ特許出願Ａ−０，１５５，６１３；ＤＳＭ番号
２７７３で、１９８３年１２月２０日にＤＳＭに寄託さ
れている〕。このベクターはすべてのレギュロンを含
み、クローン化遺伝子の高発現率を生じる。したがっ
て、本発明ではプラスミドｐＢＲ３２２に属するＥｃｏ
ＲＩ／ＢａｍＨＩ短断片を、下記式で示されるＤＮＡ配
列によって置換した：

【００８３】

【化７】

【００８４】本発明の目的に到達するため、たとえば図
６に従って、以下の操作を使用する。Ｉ．必要な各ＤＮＡ断片の調製 断片ａ） 断片を生成させるためには、ＩＦＮ−ωに対する遺伝子
を含むプラスミド、たとえばプラスミドＰ９Ａ２を制限
エンドヌクレアーゼＡｖａＩＩで消化する。生成したｃ
ＤＮＡインサートをクロマトグラフィーに付して精製し
たのち、これを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよび
ＡｌｕＩで２回再消化し、ついでクロマトグラフィ−お
よび電気溶出によって単離する。この断片は相当するω
−インターフェロン遺伝子の大部分を含有する。たとえ
ば、クローンＰ９Ａ２のω（Ｇｌｙ）−インターフェロ
ン遺伝子断片は次の構造を有する。

【００８５】

【化８】

【００８６】

【化９】

【００８７】断片ｂ） 断片ｂ）を生成させるためには、プラスミドＰ９Ａ２を
制限するエンドヌクレアーゼＩＩで消化する。生成した
ｃＤＮＡインサートをクロマトグラフィ−に付し、精製
したのち、後者を制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで
再消化し、所望の断片１８６ｂｐをクロマトグラフィ−
および電気溶出で単離する。これは以下の構造を有す
る。

【００８８】

【化１０】

【００８９】断片ｃ） 断片ｃ）を生成させるには、プラスミドｐＥＲ３３〔ラ
ッスル−ドウワ−キン（Ｒａｓｔｌ−Ｄｏｗｏｒｋｉ
ｎ，Ｅ．）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２１巻、２３
７〜２４８（１９８３）およびヨーロッパ特許出願Ａ−
０，１１５，６１３参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＰｖｕＩＩで２回消化する。アガロースゲル分画化およ
び精製後に得られ、Ｔｒｐプロモーター、リボソーム結
合サイトおよび開始コドンを含む３８６ｂｐの断片を次
にＳａｕ３Ａで消化する。所望の１０８ｂｐ断片は、ア
ガロースゲル電気泳動、電気溶出およびエルチップカラ
ム精製によって得られる。以下の構造を有する。

【００９０】

【化１１】

【００９１】断片ｂとｃのリゲーション 断片ｂとｃをＴ₄ リガーゼでリゲートし、酵素を破壊し
たのちＨｉｎｄＩＩＩで切断する。リゲートされた断片
は以下の構造を有する。

【００９２】

【化１２】

【００９３】また、プラスミドｐＲＨＷ１０の生成に必
要なこのＤＮＡ断片は合成的に製造したオリゴヌクレオ
チドを用いても製造できる。 式 ５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴ−３′ で示されるオリゴヌクレオチドの５′末端を脱ホスホリ
ル化の状態にしておく。 式 ５′−ＧＡＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＡ−３′ で示されるオリゴヌクレオチドの５′末端を、Ｔ₄ ポリ
ヌクレオチドキナーゼとＡＴＰによりホスホリル化す
る。

【００９４】これら２個のオリゴヌクレオチドをハイブ
リダイズさせると、次のＤＮＡ短断片が得られる。 ５′−ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴ ３′ ３′− ＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＡＧｐ ５′ これは一端にＨｉｎｄＩＩＩの典型的な５′オーバーラ
ップを、他端にＳａｕ３Ａの典型的な５′オーバーラッ
プを生成する。断片はｂ）はウシ小腸ホスファターゼを
用いて脱ホスホリル化する。断片ｂ）と上述の断片を合
し、Ｔ₄ リガーゼを用いて結合させる。

【００９５】リガーゼは少なくも１個の５′−ホスフェ
ート含有末端を要求するので、ＤＮＡの合成ピースが断
片ｂ）と結合するかまたは２個の合成断片がそのＳａｕ
３Ａ末端で結合するかである。生成するこの２種の断片
は長さが異なるので、選択的イソプロパノール沈殿で分
離できる。かくして精製された断片をＴ₄ ポリヌクレオ
チドキナーゼとＡＴＰによりホスホリル化する。

【００９６】ＩＩ．発現プラスミドの製造 ａ） プラスミドｐＲＨＷ１０の製造 発現プラスミドｐＥＲ１０３〔ラッスル−ドウワ−キン
（Ｒａｓｔｌ−Ｄｗｏｒｋｉｎ，Ｅ）ほか：ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、第２１巻、２３７〜２８４（１９８３）およ
びヨーロッパ特許出願Ａ−０，１１５，６１３．ＤＳＭ
番号２７７３でＤＳＭに寄託〕をＨｉｎｄＩＩＩで線状
とし、ついでウシ小腸ホスファターゼで処理した。

【００９７】かくして得られたＤＮＡを単離、精製した
のち、脱ホスホリル化し、ついで断片ｂとｃを結合させ
た断片とリゲートする（両者をＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たのち）。大腸菌ＨＢ１０１を生成したリゲーション混
合物で形質転換したのち、ＬＢアガール＋５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン上で培養する。所望の構造を有するプラ
スミドをｐＲＨＷ１０と命名した。（図６参照）。複製
後、他のプラスミド製造のための中間体として用いた。

【００９８】ｂ） プラスミドｐＲＨＷ１２の製造 ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片と４種のデオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートを、ＢａｍＨＩで切断し
たプラスミドｐＲＨＷ１０に加える。インキュベーショ
ン後、得られた線状の、ブラント末端を有するプラスミ
ドを精製し、ＮｃＯＩで切断する。アガロースゲル電気
泳動、電気溶出およびエルチップ精製〔シュライヘル・
アンド・シュネル社のエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ^TM）カ
ラムを用いて実施〕を用いて得られる大断片ａ）とリゲ
ートする。大腸菌ＨＢ１０１をこのリゲーション混合物
で形質転換し、ＬＢアガール＋５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン上で培養する。この構造を有するプラスミドをｐＲ
ＨＷ１２と命名した（図６参照）。これは所望のω（Ｇ
ｌｙ）−インターフェロンを発現する。

【００９９】たとえば、このようにして得られた細菌培
養液（光学密度：０．６／６００ｎｍ）１Ｌは１×１０
⁶ 国際単位のインターフェロンを含有する。

【０１００】ｃ） プラスミドｐＲＨＷ１１の製造 ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片と４種のデオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートを、ＢａｍＨＩで切断し
たプラスミドｐＲＨＷ１０に加える。インキュベーショ
ン後、得られた線状の、ブラント末端を有するプラスミ
ドを精製し、ＮｃＯＩで切断する。アガロースゲル電気
泳動、電気溶出およびエルチップ精製を用いて得られる
大断片を、アミノ酸（Ｇｌｙ）をコードするＧＧＧコド
ンがＧＡＧコドン（Ｇｌｕ）に置換されただけのプラス
ミドＥ７６Ｅ９から同様にして得られる断片ａとリゲー
トする。

【０１０１】ついで、生成したリゲーション混合物を大
腸菌ＨＢ１０１の形質転換に使用し、ＬＢアガール上で
培養する。所望の構造を有するプラスミドはｐＲＨＷ１
１と命名した（同様に図６参照）。これは所望のω（Ｇ
ｌｕ）−インターフェロンを発現する。

【０１０２】ベクターによる細胞の形質転換は多くの方
法で実施できる。たとえば、カルシウムを用いて実施す
ることができる。これには、細胞をマグネシウム中で洗
浄し、カルシウム中に懸濁した細胞にＤＮＡを加える方
法と、細胞をＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈殿物に暴
露する方法とがある。遺伝子発現後、細胞をトランスホ
ーマント選択培地上に置く。

【０１０３】宿主を適当に形質転換したのち、宿主内で
の遺伝子の発現、ＩＦＮ−ωを発現する条件下での発酵
または細胞培養し、生成物をよく知られたクロマトグラ
フィ−分離操作によって抽出すると、リーディング配列
およびトレーリング配列をもつまたはもたないＩＦＮ−
ωからなる物質が得られる。ＩＦＮ−ωはそのＮ末端に
リーディング配列をもった形で発現して（プレＩＦＮ−
ωの生成）、一部の宿主細胞中ではそれが除去される場
合がある。除去されない場合はリーディングポリペプチ
ドを切断し、成熟ＩＦＮ−ωを生成させる必要がある。

【０１０４】別法として、ＩＦＮ−ωクローンを、微生
物中でプレＩＦＮ−ωでなく直接、成熟蛋白質を産生す
るように修飾することもできる。酵母接合フェロモンの
プレカーサー配列ＭＦ−α−１は融合蛋白の正確な成熟
に、また生成物の生育培地または細胞周辺腔への分泌に
使用することができる。機能性または成熟ＩＦＮ−ωに
相当するＤＮＡ配列はＭＦ−α−１に、開始コドンＡＴ
Ｇから２５６番目のカテプシン様切断部位（ｌｙｓ−ａ
ｒｇの次）で連結することができる〔カージャン（Ｋｕ
ｒｊａｎ）ほか：セル（Ｃｅｌｌ）、第３０巻、９３３
〜９４３（１９８２）〕。

【０１０５】その生物学的活性に基づき、本発明の新規
インターフェロンは、公知のインターフェロンが使用さ
れてきた状態の治療に適当である。たとえば、ヘルペ
ス、ライノウィルス、エイズ感染、ある種の癌等の状態
に使用できる。新規インターフェロンは単独で用いて
も、また他の公知のインターフェロンもしくは他の生物
学的活性物質、たとえばＩＮＦ−α、ＩＬ−２、他の免
疫調節物質等と組合せて使用することもできる。

【０１０６】ＩＮＦ−ωは抗腫瘍または抗ウィルス治療
を要する対象および免疫抑制状態を呈している対象に非
経口的に投与できる。投与量および投与回数はＩＮＦ−
αの臨床試験に最近用いられている用法用量とほぼ同
様、たとえば約（１〜１０）×１０⁶ 単位／日、純度が
１％以上の物質の場合にはたとえば約５×１０⁷ 単位／
日が投与される。

【０１０７】均一な細菌性ＩＦＮ−ωの適当な剤型の例
としては、３ｍｇのＩＦＮ−ωを５Ｎヒト血清アルブミ
ン２５ｍｌに溶解し、この溶液を細菌濾過器に通し、濾
液を無菌的に１００個のバイアルに分ける。純粋なＩＦ
Ｎ−ω ６×１０⁶ 単位を含有する非経口投与用製剤が
得られる。バイアルは使用まで冷所（−２０℃）に保存
するのが好ましい。

【０１０８】本発明の化合物は、公知の方法に従い、医
薬的に有用な組成物を調製するために処方することがで
きる。本発明のポリペプチドは医薬的許容される担体ビ
ークルと合し、混合物とすることができる。適当なビー
クルおよびその処方はマーチン（Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．
Ｗ．）編：レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）の記載が参考になる。ＩＦＮ−ωは適当量のビー
クルと混合し、患者への有効な投与に適した医薬的に許
容される組成物を製造することができる。

【０１０９】

【実施例】次に本発明を実施例によってさらに詳細に説
明するが、これは本発明を例示するものであって本発明
を限定するものではない。例 １ ＩＦＮ配列特異的クローンの発見 ａ） ｃＤＮＡライブラリーの製造 文献〔ドウワ−キン−ラッスル（Ｄｗｏｒｋｉｎ−Ｒａ
ｓｔｌ，Ｅ）ほか：ジャーナル・オブ・インターフェロ
ン・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｄ Ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２／４、５７５〜５８５
（１９８２）〕で知られた方法に従い、ｃＤＮＡライブ
ラリーの確立のために、出発原料としてセンダイ−ウィ
ルス刺激細胞からのｍＲＮＡを用いた。得られた３０，
０００個のクローンをマイクロタイター板のウェルにそ
れぞれ移した。

【０１１０】生育には以下のメジウムを用い、コロニー
を凍結した： トリプトン １０ ｇ 酵母エキス ５ ＮａＣｌ ５ クエン酸ナトリウム（２Ｈ₂ Ｏ） ０．５１ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ７．５ ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．８ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０９ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ０．９ グリセリン ４４ テトラサイクリン塩酸塩 ０．０１ 水を加えて１Ｌとする 各クローンを加えたマイクロタイター板を一夜３７℃で
インキュベートし、ついで−７０℃に保存した。

【０１１１】ｂ） ハイブリダイゼーション試験 ハイブリダイゼーション試験のための出発原料として
は、組換えプラスミドｐＥＲ３３〔ドウワーキン−ラッ
スル（Ｄｗｏｒｋｉｎ−Ｒａｓｔｌ，Ｅ）ほか：ジーン
（Ｇｅｎｅ）、第２１巻、２３７〜２４８（１９８
３）〕を用いた。このプラスミドは成熟インターフェロ
ンＩＦＮ−α２ａｒｇの暗号領域と３′非翻訳領域１９
０塩基を含んでいる。２０μｇのｐＥＲ３３を反応溶液
〔１０ｍｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５
０ｍＭ ＮａＣｌ〕２００μｌ中、ＨｉｎｄＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼ３０単位と３７℃で１時間インキュ
ベートした。

【０１１２】０．５Ｍエチレンジニトリル四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）１／２５容を加え、７０℃に１０分間加熱して反
応を停止した。１／４容の緩衝液〔８０％グリセリン、
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸塩ｐＨ７．８、５０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
０．１％ブロモフェノールブルー〕を５回加えたのち、
生成した断片を１％アガロース中電気泳動に付し、サイ
ズによって分離した〔ゲルおよび電気泳動緩衝液（ＴＢ
Ｅ）：１０．８ｇ／Ｌトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン（Ｔｒｉｓ塩基）、５．５ｇ／Ｌホウ酸、０．９３
ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ〕。

【０１１３】ゲルを０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロミ
ド溶液中インキュベーションしたのち、ＤＮＡストリッ
プを紫外線で可視化し、ＩＦＮ−遺伝子含有ＤＮＡピー
ス（約８００ｂｐ）を含むゲル領域を切り取った。ＤＮ
Ａを１／１０×ＴＢＥ緩衝液中に電気溶出した。ＤＮＡ
溶液をフェノールで１回、エーテルで４回抽出し、１／
１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）ｐＨ５．８お
よび２．５容のエタノールを加えて、−２０℃で水から
ＤＮＡを沈殿させた。遠心分離後、ＤＮＡを７０％エタ
ノールで洗浄し、真空中で５分間乾燥した。ＤＮＡを水
５０μｌに溶解した（約５０μｇ／μｌ）。

【０１１４】ＤＮＡをニックトランスレーションを用い
て放射標識した〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ）ほか：モルキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）の改良法〕。また、５０μｌイ
ンキュベーション溶液は以下の組成とした。５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．８、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ
メルカプトエタノール、ｐＥＲ３３からのＤＮＡインサ
ート１００ｎｇ、１６ｐｇ ＤＮａｓｅＩ、２５μＭ
ｄＡＴＰ、２５μｇｄＧＴＰ、２５μＭ ｄＴＴＰ、２
０μＣｉα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（＞３，０００Ｃｉ／ｍＭ
Ｏｌ）ならびに３単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸
菌）。

【０１１５】インキュベーションは１４℃で４５分間行
った。１容の５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．６の溶液を加え、７０℃に１
０分間加えて反応を終結させた。ＤＮＡをセファデック
スＧ−１００を用いＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
ｐＨ＝８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）へのクロマトグラフ
ィ−により放射標識されなかった部分と分離した。放射
標識サンプルの比活性は約４×１０⁷ ｃｐｍ／μｇであ
った。

【０１１６】ｃ） ＩＮＦ遺伝子含有インサートのため
のクローンのスクリーニング マイクロタイター板のウェル中に凍結した細菌培養液を
解凍した（ａ）。相当する大きさのニトロセルロースフ
ィルター片〔シュライヘル・アンド・シュール社、ＢＡ
８５、孔径０．４５μｍ）をＬＢ−アガール（ＬＢ−ア
ガール：１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、
５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌバクトアガール、２０
ｍｇ／Ｌテトラサイクリン塩酸塩）上に置く。

【０１１７】マイクロタイター板に適合したプランジャ
ーにより各クローンをニトロセルロースフィルターに移
した。バクテリアを一夜３７℃で生育させ、径約５ｍｍ
のコロニーを形成させた。バクテリアを破壊し、ＤＮＡ
を変性するため、ニトロセルロースフィルターを、次の
溶液：（１）０．５Ｍ ＮａＯＨに８分、（２）１ＭＴ
ｒｉｓ ｐＨ＝７．４に２分、（３）１Ｍ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．４に２分、（４）１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．４に４分、あらかじめ浸漬し
たウォットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭろ紙のスタッ
ク上に順次置いた。フィルターを風乾したのち、２時間
８０℃に保持した。

【０１１８】フィルターを、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリ
ウム、ｐＨ＝７．０）、５×デンハルト溶液〔１×デン
ハルト溶液は０．０２％ＰＶＰ（ポルビニルピロリド
ン）に相当〕、０．０２％フィコール（ＭＧ：４０，０
００Ｄ）；０．０２％ＢＳＭ（ウシ血清アルブミン）お
よび０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からな
るハイブリダイゼーション溶液中、６５℃で４時間前処
置した。

【０１１９】（ｂ）で製造したサンプル、各フィルター
あたり約１×１０⁶ ｃｐｍを煮沸して変性し、ハイブリ
ダイゼーション溶液に加えた。ハイブリダイゼーション
は６５℃で１６時間実施した。フィルターを３×ＳＳＣ
／０．１％ＳＤＳにより、６５℃で１時間、４回洗浄し
た。フィルターを風乾し、サランラップ（登録商品
名）、で覆い、コダックＸ−Ｏｍａｔ Ｓ（登録商品
名）フィルムに暴露した。

【０１２０】例 ２ ＩＦＮ−遺伝子含有組換えプラスミド確認のためのサザ
ーントランスファー 陽性反応を示すコロニーまたは陽性反応が疑われるコロ
ニーの培養液５ｍｌをＬ−培地（１０ｇ／Ｌトリプト
ン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｍ
ｇ／Ｌテトラサイクリン塩酸塩）中、３７℃で一夜生育
させた。プラスミドＤＮＡはバーンボイムとドリー（Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅ
ｓ．）第７巻、１５１３（１９７９）〕の改良プロトコ
ールを用いて単離した。

【０１２１】１．５ｍｌ懸濁液中の細胞を遠心分離し、
５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝８．０および４ｍｇ／ｍｌの
リゾチームからなるリゾチーム溶液１００μｌ中０℃に
再懸濁した。室温で５分間インキュベートしたのち、２
容の氷冷０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液を加え、
さらに５分間インキュベーションを続けた。次に氷冷酢
酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）１５０μｌを加え、５
分間インキュベートした。沈殿した細胞成分を遠心分離
した。

【０１２２】ＤＮＡ溶液を１容のフェノール／クロロホ
ルム（１：１）で抽出し、２容のエタノールを加えてＤ
ＮＡを沈殿させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタ
ノールで１回洗浄し、真空中で５分間乾燥した。ＤＮＡ
を５０μｌの（ＴＥ）−緩衝液に溶解した。この１０μ
ｌを反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．
５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）５０μｌ中、ＰｓｔＩ制限エンドヌクレア
ーゼ１０単位により、３７℃で１時間消化した。

【０１２３】１／２５容の０．５Ｍ ＥＤＴＡならびに
１／４容５×緩衝液（例１ｂ参照）を加えたのち、１０
分間加熱し、ついでＤＮＡを１％アガロースゲル（ＴＢ
Ｅ−緩衝液）中電気泳動によって分離した。アガロース
ゲル中のＤＮＡをサザーン法〔サザーン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ，ＥＭ）：ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイ
オロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第９８巻、５０
３〜５１７（１９７５）〕に従ってニトロセルロースフ
ィルターに移した。

【０１２４】ゲルを、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ
ＮａＯＨ溶液中で１時間インキュベートして、ゲル中の
ＤＮＡを変性した。次に、１Ｍ Ｔｒｉｓ×ＨＣｌ ｐ
Ｈ＝８／１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で１時間中性化した。
ＤＮＡを１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５
Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ＝７．０）でニトロセルロー
スフィルターに移した。トランスファー完了後（約１６
時間）、フィルターを６×ＳＳＣ緩衝液中で短時間すす
ぎ、風乾し、最後に８０℃に２時間加熱した。

【０１２５】フィルターを６×ＳＳＣ／５×デンハルト
溶液／０．１％ＳＤＳ（例１ｃ参照）により６５℃で４
時間前処置した。約２×１０⁶ ｃｐｍのハイブリダイゼ
ーションサンプル（例１ｂ参照）を１００℃に加熱して
変性し、ついでハイブリダイゼーション溶液に加えた。
ハイブリダイゼーションは６５℃で１６時間実施した。
次にフィルターを３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液によ
り６５℃で１時間、４回洗浄した。風乾後、フィルター
をサランラップ（登録商品名）で覆い、コダックＸ−Ｏ
ｍａｔ Ｓ（登録商品名）フィルム上に暴露した。

【０１２６】例 ３ クローンＥ７６Ｅ９中インターフェロン活性の検出 クローンＥ７６Ｅ９の培養液１００ｍｌをＬ−培地（１
０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌグルコース、２０ｍｇ／Ｌテトラサ
イクリン塩酸塩）中３７℃で、光学密度Ａ₆₀₀ ＝０．８
になるまで培養した。バクテリアを７，０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ×ＨＣｌ ｐ
Ｈ＝８．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、つ
いで洗浄液１．５ｍｌに再懸濁した。

【０１２７】１ｍｇ／ｍｌのリゾチームと０℃で３０分
間インキュベートしたのち、バクテリア懸濁液の凍結／
解凍を５回くり返した。細胞を４，０００ｒｐｍで１時
間遠心分離してペレット化した。上澄液を滅菌ろ過し、
インターフェロン活性について試験した。使用した試験
法はＶ３細胞および水疱性口内炎ウィルスを用いたプラ
ーク減少試験であった〔アドルフ（Ａｄｏｌｆ，ＧＲ）
ほか：アーカイブズ・オブ・バイロロジー（Ａｒｃｈ．
Ｖｉｒｏｌ．）第７２巻、１６９〜１７８（１９８
２）〕。驚くべきことに、このクローンは初期培養液１
リットルに対し９，０００単位までのインターフェロン
を産生した。

【０１２８】例 ４ 新規配列に関連する遺伝子数を決定するためのゲノムの
サザーンブロット ａ） ナマルワ細胞からのＤＮＡの単離 ナマルワ細胞培養液４００ｍｌをＪＡ２１遠心分離機に
より１，０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞をペレット化
する。生成したペレットをＮＰ４０緩衝液（ＮＰ４０緩
衝液：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．４）に
再懸濁して注意深く洗浄し、再び１，０００ｒｐｍでペ
レツト化する。

【０１２９】得られたペレットを２０ｍｌのＮＰ４０緩
衝液２０ｍｌに再び懸濁し、１ｍｌのＮＰ４０溶液と混
合して細胞壁を破壊する。５分間氷浴中に放置したの
ち、無傷の細胞核を１，０００ｒｐｍで遠心分離してペ
レット化し、上澄液を捨てる。細胞核を５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ／Ｃｌ ｐＨ＝８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび
２００ｍＭ ＮａＣｌからなる溶液１０ｍｌに再懸濁
し、ついで２０％ＳＤＳ１ｍｌを加えて蛋白質を除去す
る。

【０１３０】生成する粘稠な溶液を同量のフェノール
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ ｐＨ＝８．０で飽和）に
より２回、クロロホルムにより２回抽出する。エタノー
ルを加え、遠心分離に付してＤＮＡを沈殿させる。次
に、生成したＤＮＡペレットを７０％エタノールで１回
洗浄し、真空中で５分間乾燥し、ＴＥ緩衝液（ＴＥ緩衝
液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）６ｍｌに溶解する。ＤＮＡの濃度は０．
８ｍｇ／ｍｌである。

【０１３１】ｂ） ナマルワ細胞からのＤＮＡの制限エ
ンドヌクレアーゼ消化 制限エンドヌクレアーゼ消化は、製造業者〔ニュー・イ
ングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）〕の特定した条件に従って実施した。
ＤＮＡ １μｇを容量１０μｌ中、３７℃において、２
時間またはそれ以上、適当な制限エンドヌクレアーゼ２
単位で消化する。制限エンドヌクレアーゼとしては、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ、Ｐ
ｓｔＩおよびＣｌａＩを使用した。各消化実験にＤＮＡ
２μｇを使用する。

【０１３２】消化の完結をモニターするために、１０μ
ｌ（一部）を反応開始時にとり、０．４μｇのｌａｍｂ
ｄａファージ−ＤＮＡと混合する。２時間インキュベー
ションしたのち、これらの部分サンプルをアガロースゲ
ル電気泳動に対し、染色ｌａｍｂｄａファージＤＮＡ断
片のサンプルと比較して消化の完結を調べる。このよう
なチェックを実施したのち、ＥＤＴＡを最終濃度２０ｍ
Ｍになるように加え、溶液を７０℃に１０分間加熱して
反応を停止させる。０．３Ｍ ＮａＡＣ、ｐＨ＝５．６
および２．５容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ
る。−７０℃で３０分間インキュベートしたのち、ＤＮ
Ａをエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機
でペレット化し、７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥
する。生成したＤＮＡをＴＥ緩衝液３０μｌにとる。

【０１３３】ｃ） ゲル電気泳動およびサザントランス
ファー 消化したＤＮＡサンプルをＴＥ緩衝液（１０．８ｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ塩基、５．５ｇ／Ｌホウ酸、０．９３ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ）中０．８アガロースゲルにより、大きさに
応じて分画化する。この目的には、ＤＮＡサンプル１５
μｌを４μｌの負荷緩衝液（０．０２％ＳＤＳ、５×Ｔ
Ｅ緩衝液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％グリセリン、０．
１％ブロモフェノールブルー）と混合し、短時間７０℃
に加熱し、ゲル中に設けたトローフにロードする。

【０１３４】ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し
たＬａｍｂｄａ−ＤＮＡを別個にロードし、ＤＮＡのサ
イズのマーカーとして用いる。ゲル電気泳動は、約１Ｖ
／ｃｍで２４時間行う。ついでＤＮＡを、サザーン法を
用いて、１０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：１５０ｍＭクエン
酸三ナトリウム、１５ｍｌ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０）
で、ニトロセルロースフィルター〔シュライヘル・アン
ド・シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈ
ｕｅｌｌ）社、ＢＡ８５〕に移す。フィルターを室温で
乾燥したのち、８０℃に２時間加熱してＤＮＡをフィル
ターに結合させる。

【０１３５】ｄ） ハイブリダイゼーションプローブ ２０μｇのプラスミドＰ９Ａ２をＡｖａＩＩで切断する
と、全ｃＤＮＡインサートを含有する約１１００ｂｐの
断片が生成する。このＤＮＡ断片をＳａｕ３ＡおよびＡ
ｌｕＩで再び切断し、アガロースゲル電気泳動（図５の
ｂ参照）後に、電気溶出およびエルチップカラムクロマ
トグラフィ−によってＤＮＡ大断片を単離する。生成し
たＤＮＡ（１．５μｇ）を水１５μｌに溶解する。

【０１３６】２０μｇのプラスミドｐＥＲ３３をＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し、このＩＦＮ−α２−Ａｒｇに対する
発現プラスミド〔ラッスル−ドウワーキン（Ｒａｓｔｌ
−Ｄｗｏｒｋｉｎ，Ｅ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第
２１巻、２３７〜２４８（１９８３）〕を２回切断す
る。インターフェロン−α２−Ａｒｇに対する遺伝子を
含有するＤＮＡ小断片をプラスミドＰ９Ａ２の場合と同
様にして単離する。

【０１３７】両ＤＮＡをリグビー（Ｒｉｇｂｙ，ＰＷ
Ｊ）ほか〔ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１１３巻、２３７
〜２５１（１９７７）〕の提案した方法を用いてニック
トランスレーションに付す。ニックトランスレーション
は１×ニック緩衝液（１×ニック緩衝液：５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／Ｃｌ ｐＨ＝７．２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 、
０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰそれぞれ１００μｍｏｌ、
１５０μＣｉ α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ〔アマーシャム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ、３０００Ｃｉ／ｍＭＯｌ〕ならびにＤ
ＮＡポリメラーゼＩ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）〕５単位を含有
する溶液５０μｌ中ＤＮＡ０．２ｇを用いて実施する。

【０１３８】１４℃で２時間反応させたのち、同量のＥ
ＤＴＡ溶液（４０ｍＭＯｌ）を加えて反応を停止させ、
ＴＥ緩衝液中Ｇ５０カラムクロマトグラフィ−に付して
未反応放射性物質を分離する。残った比放射能は約１０
０×１０⁶ ｃｐｍ／μｇ ＤＮＡである。

【０１３９】ｅ） ハイブリダイゼーションおよびオー
トラジオグラフィー ニトロセルロースフィルターを半分に切る。いずれの半
分も、同一セットのトレースと例４ａに述べた制限酵素
であらかじめ処置したナマルワＤＮＡを含有する。この
フィルターを６×ＳＳＣ、５×デンハルト〔１×デンハ
ルト：０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．
０２％ポリビニルプロリドン（ＰＶＰ）、０．０２％フ
ィコール４００〕、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ
変性ウシ胸腺ＤＮＡおよびＥＤＴＡを含む溶液中、６５
℃で２時間、プレハイブリダイズする。

【０１４０】ハイブリダイゼーションは６×ＳＳＣ、５
×デンハルト、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳお
よび約１０×１０⁶ ｃｐｍのニックトランスレートした
ＤＮＡ中、６５℃で１６時間実施する。フィルターの半
分はインターフェロン−α２−Ａｒｇ−ＤＮＡと、他の
半分はプラスミドＰ９Ａ２から単離したインターフェロ
ン−ＤＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーシ
ョン後、両フィルターを２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤ
Ｓからなる溶液により室温で４回、０．２×ＳＳＣおよ
び０．０１％ＳＤＳからなる溶液により６５℃で４５分
間２回洗浄する。ついでフィルターを乾燥し、コダック
Ｘ−Ｏｍａｔ Ｓフィルムに暴露する。

【０１４１】例 ５ 発現プラスミドｐＲＨＷ１２およびｐＲＨＷ１１の製造 予備的説明：発現プラスミドの製造は図６に例示があ
る。制限酵素による消化はすべて酵素の製造業者の指示
に従って実施する。

【０１４２】ａ） プラスミドｐＲＨＷ１０の製造 １００μｇのプラスミドＰ９Ａ２を制限エンドヌクレア
ーゼＡｖａＩＩ（ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ）１００単位で消化する。消化後、７０℃に加熱して
酵素を不活化し、得られた断片を１．４％アガロースゲ
ル上、ＴＢＥ緩衝液（ＴＢＥ緩衝液：１０．８ｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ塩基、５．５ｇ／Ｌホウ酸、０．９３ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ）により、サイズに応じて分画化する。

【０１４３】全ｃＤＮＡインサートを含有するバンドを
電気溶出し、エルチップカラム（シュライヘル・アンド
・シュール）を用いて精製する。得られた２０μｇのう
ちの６μｇを制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ａ（溶液
計１００μｌ２０中単位）でさらに消化する。断片をＴ
ＢＥ緩衝液中２％アガロースゲルを用いて分離する。エ
チジウムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色後、１８９ｂｐの
ＤＮＡ断片を電気溶出し、上述したと同様に精製する
（＝図６の断片ｂ）。

【０１４４】インターフェロン遺伝子にプロモーター、
リボソーム結合サイトおよび開始コドンを結合するた
め、相当するＤＮＡ断片を発現プラスミドｐＥＲ３３
〔ラッスル−ドウワーキン（Ｒａｓｔｌ−Ｄｗｏｒｋｉ
ｎ，Ｅ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２１巻、２３７
〜２４８（１９８３）〕から単離する。この目的のた
め、５０μｇのｐＥＲ３３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＰｖｕＩＩで２回消化し、生成した断片をＴＢＥ緩衝液
中アガロースゲル上に、その大きさにより分画化する。

【０１４５】長さ３８９ｂｐで、Ｔｒｐプロモーター、
リボソーム結合サイトおよび開始コドンを含むＤＮＡ断
片を電気溶出し、エルチップカラムを用いて精製する。
かくして得られた断片を、次にＳａｕ３Ａで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動、電気溶出およびエルチップカラ
ム精製に付すと、所望の断片１０８ｂｐが約１００μｇ
の収量で得られる（＝図６の断片ｃ）。

【０１４６】２０ｎｇの断片ｂを２０ｎｇの断片ｃと、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ ｐＨ＝７．５、１０ｍＭ
ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＡＴＰを含
む溶液中、容量４０μｌで、Ｔ₄ リガーゼ１０単位を用
い、１４℃で１８時間、リゲートさせる。次に７０℃に
加熱して酵素を破壊し、生成したＤＮＡを総容量５０μ
ｌ中、ＨｉｎｄＩＩＩで切断する。

【０１４７】１０μｇの発現プラスミドｐＥＲ１０３
〔ラッスル−ドウワーキン（Ｒａｓｔｌ−Ｄｗｏｒｋｉ
ｎ，Ｅ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２１巻、２３７
〜２４８（１９８３）〕を総容量１００μｌ中Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで線状にする。３７℃で２時間処理したのち、１
容の２×ホスファターゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／
Ｃｌ ｐＨ＝９．２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）とウシ小
腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）１単位を加える。４５℃で
３０分間反応させたのち、さらに１単位のＣＩＰを加
え、さらに３０分インキュベーションを続ける。

【０１４８】かくして得られたＤＮＡをフェノールで２
回、クロロホルムで１回抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ＝５．５）と２．５容のエタノールを加えて沈
殿する。次のリゲーション工程でベクターの再リゲーシ
ョンを防止するため、脱ホスホリル化する。１００ｎｇ
の直線化ｐＥＲ１０３とリゲートした断片ｂとｃ（Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ消化後）をリガーゼ緩衝液を含む１００μｌ
の溶液に加え、Ｔ₄ −ＤＮＡリガーゼを用いて１４℃で
１８時間リゲートする。

【０１４９】コンピーテント大腸菌ＨＢ１０１〔ドウワ
ーキン（Ｄｗｏｒｋｉｎ，Ｅ）ほか：デベロプメンタル
・バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）、第７６巻、４
３５〜４４８（１９８０）〕２００μｌをリゲーション
混合物２０μｌと混合し、氷上で４５分間インキュベー
トする。ついで、４０℃での２分間の熱ショックによ
り、ＤＮＡの取り込みを起こさせる。細胞懸濁液を氷上
でさらに１０分間インキュベートし、最後に５０ｍｇ／
Ｌのアンピシリンを含むＬＢアガール（１０ｇ／Ｌトリ
プトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、
１．５％アガール）に適用する。

【０１５０】得られた２４個のコロニーからのプラスミ
ドをバーンボイムとドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ
Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．）、第７巻、１５１
３〜１５２３（１９７９）〕を用いて単離する。各種の
制限酵素で消化したのち、１個のプラスミドが所望の構
造を示した。これをｐＲＨＷ１０と命名した（図６参
照）。

【０１５１】ｂ） プラスミドｐＲＨＷ１２の製造 約１０μｇのプラスミドｐＲＨＷ１０をＢａｍＨＩで切
断する。ついでＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片お
よび４種のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを加
え、２０分間室温でインキュベートする。得られた線状
の、ブラント末端のプラスミドをフェノール抽出、沈殿
で精製し、容量１００μｌ中制限エンドヌクレアーゼＮ
ｃｏＩで切断する。アガロースゲル電気泳動、電気溶出
およびエルチップ精製により大断片が得られる。断片
ａ）（図６参照）は、Ｐ９Ａ２−ｃＤＮＡインサート
（上述）を含むＡｖａＩＩ断片４μｇをＮｃｏＩおよび
ＡｌｕＩで消化すると得られる。断片ａ）の収量は約２
μｇである。

【０１５２】最終リゲーション工程では、断片ａ）を、
ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩであらかじめ消化したｐＲＨＷ１
０と、容量１０μｌ中、各ＤＮＡ１０ｎｇを用いてリゲ
ートする。ＢａｍＨＩサイトにＡｌｕＩで切断したＤＮ
Ａをリゲートすることにより、ＢａｍＨＩ認識サイトが
保持される。生成したリゲーション混合物で、上述のよ
うにして、コンピーテント大腸菌ＨＢ１０１を形質転換
する。得られた４０個のコロニーのうち１個が選択され
る。これがｐＲＨＷ１２である。

【０１５３】プラスミドを単離し、サンガー法〔サンガ
ー（ＳａＮｇｅｒ，Ｆ）ほか：プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）第７４
巻、５４６３〜５４６７（１９７９）〕を用いてＥｃｏ
ＲＩ／ＢａｍＨＩインサートの配列を決定する。これは
期待の構造を有する。

【０１５４】ｃ）プラスミドｐＲＨＷ１１の製造 これは例５ｂと同様に行う。１μｇのプラスミドｐＲＨ
Ｗ１０をＢａｍＨＩで消化する。生成したＤＮＡの粘着
末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片と４種の
デオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いてブラン
ト末端に変換し、ついで線状化ＤＮＡをＮｃｏＩで切断
する。アガロースゲル電気泳動、電気溶出およびエルチ
ップカラムクロマトグラフィーにより、大断片が得られ
る。

【０１５５】ＮｃｏＩ−ＡｌｕＩ断片はクローンＥ７６
Ｅ９から例５ｂと同様に単離する。次に、１０ｎｇのベ
クター部分を１０ｎｇのｃＤＮＡ部分と、容量１０μｌ
中適当な条件下に、Ｔ₄ リガーゼ１単位を用いてリゲー
トする。生成したＤＮＡ混合物で大腸菌ＨＢ１０１を形
質転換し、得られた４５個のコロニーをアンピシリン含
有ＬＢ板上で選択し、１個のコロニーを選ぶ。これをｐ
ＲＨＷ１１と命名する。相当するクローンを培養したの
ち、プラスミドＤＮＡを単離する。その構造は数種の特
異的制限エンドヌクレアーゼ（ＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ）切断サイトの存
在により証明される。

【０１５６】ｄ）プラスミドｐＲＨＷ１２含有大腸菌Ｈ
Ｂ１０１によるインターフェロン活性の発現 バクテリア培養液１００ｍｌを、トリプトファンを除く
全アミノ酸（各アミノ酸２０μｇ／ｍｌ）、チアミン１
μｇ／ｍｌ、０．２％グルコースおよび２０μｇ／ｍｌ
のインドール−（３）−アクリル酸（ＩＡＡ）、トリプ
トファンオペロンのインデューサーを含むＭ９最小培地
中、６００ｎｍでの光学密度が０．６になるまでインキ
ュベートする。ついでバクテリアを遠心分離（７，００
０ｒｐｍで１０分）してペレット化し、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ／Ｃｌ ｐＨ＝８、３０ｍＭＮａＣｌで１回洗浄
し、最後に同一の緩衝液１．５ｍｌに懸濁する。

【０１５７】氷上、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームと３０分
間インキュベートしたのち、バクテリアの凍結、解凍を
５回くり返す。４０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離し
て細胞屑を除く。上澄液を滅菌ろ過し、ヒトＡ５４９細
胞および脳心筋炎ウイルスを用いたプラーク減少定量法
により、インターフェロン活性を試験する。結果：生成
したバクテリア培養液１リットルは１×１０⁶ 国際単位
のインターフェロンを含有する〔ビリオー（Ｂｉｌｌｉ
ａｕ，Ａ）：アンチバイラル・リサーチ（Ａｎｔｉｖｉ
ｒａｌ Ｒｅｓ．）、第４巻、７５〜９８（１９８
４）〕。

【０１５８】例６ Ｉ型インターフェロンのアミノ酸およびヌクレオチド配
列間の相違の要約 成熟インターフェロンの最初のシスティン残基を、プラ
スミドＰ９Ａ２およびＥ７６Ｅ９のｃＤＮＡインサート
をコードするアミノ酸配列の最初のシスティン残基と一
列に並べて、アミノ酸配列をたがいに比較する。Ｐ９Ａ
２またはＥ７６Ｅ９クローンの特異的配列の間には差が
みられなかったので、この２つの配列は図７ではＩＦＮ
−ωとして示してある。補正したのはインターフェロン
−αＡの４５位におけるギャップの挿入のみで、これは
差として計算した。

【０１５９】ω−インターフェロンの配列と比較する場
合は、通常の１６６個のアミノ酸について考慮した。こ
の値は図７に、クローンＰ９Ａ２およびＥ７６Ｅ９によ
ってコードされるさらに６個のアミノ酸の数とともに示
した。差の百分率は差を１．６６で割って得られた値で
ある。したがって１個のアミノ酸の差は０．６％にな
る。ＩＦＮ−ωのさらに６個のアミノ酸については３．
６％の差があることになるが、これはすでに百分率の値
に含まれている。

【０１６０】β−インターフェロンとの比較は、成熟β
−インターフェロンの３番目のアミノ酸を、成熟α−イ
ンターフェロンの最初のアミノ酸またはプラスミドＰ９
Ａ２およびＥ７６Ｅ９によってコードされる最初のシス
ティンと一列に並べた。したがって、α−インターフェ
ロンとβ−インターフェロンを比較した場合、対応した
最長の構造はアミノ酸１６２個である。α−インターフ
ェロンにもβ−インターフェロンにも各２個の比較され
ないアミノ酸がある。これらは差として計算し、図７で
は別に示したが、百分率の計算には包含させてある。β
−インターフェロンとクローンＰ９Ａ２またはＥ７６Ｅ
９のアミノ酸配列の照合も同様に実施したが、この場合
には対応のないアミノ酸が計１０個である。

【０１６１】ｂ）ヌクレオチド配列の比較 比較される配列を例６ｂと同様にリストする。成熟α−
インターフェロンのＤＮＡの最初のヌクレオチドはシス
ティンをコードする成熟α−インターフェロンのトリプ
レットの最初のヌクレオチドである。プラスミドＰ９Ａ
２またはＥ７６Ｅ９のＤＮＡからの最初のヌクレオチド
もシスティン−１に対するコドンの最初のヌクレオチド
である。β−インターフェロンのＤＮＡからの最初のヌ
クレオチドは第３番目のトリプレットの最初のヌクレオ
チドである。

【０１６２】α−インターフェロンの各ＤＮＡをβ−イ
ンターフェロンのＤＮＡと比較する場合には計４９８個
のヌクレオチドについて比較し、各α−インターフェロ
ンまたはβ−インターフェロンのＤＮＡ配列をプラスミ
ドＰ９Ａ２およびＥ７６Ｅ９のＤＮＡ配列と比較する場
合には５１６個のヌクレオチドについて比較した。ギャ
ップの絶対数を図７におけるテーブルの左側に示し、相
当する百分率はカッコ内に示す。

【０１６３】例７ ウイルス誘発性のω−１−ｍＲＮＡの発現およびＮＣ３
７細胞 ａ）ω−インターフェロン特異的ハイブリダイゼーショ
ンプローブの合成 オリゴヌクレオチドｄ（ＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡ
Ａ）１０ｐＭｏｌをγ− ³²Ｐ−ＡＴＰ（比活性：＞５０
００Ｃｉ／ｍＭｏｌ）およびポリヌクレオチドキナーゼ
１０単位と、総容量１０μｌ（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃ
ｌ ｐＨ＝７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ
ＤＴＴ）中に混合し、３７℃に１時間放置する。つい
で、７０℃に１０分間加熱して反応を停止させる。生成
した放射能標識オリゴヌクレオチドを５ｐＭｏｌのＭ１
３ｐＲＨＷ１２ ｓｓＤＮＡ（図９参照）により、総容
量３５μｌ（１００ｍＭ ＮａＣｌ）中、５０℃に１時
間放置してハイブリダイズする。

【０１６４】室温に冷却したのち、ニックトランスレー
ション緩衝液、４種のデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェートおよび１０単位のクレノウポリメラーゼを加えて
総容量５０μｌ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ ｐＨ＝
７．２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０μｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、ヌクレオチド１ｍＭ）とする。ポリメリゼーション
は室温で１時間行い、７０℃に５分間加熱して反応を停
止させる。反応中、部分的に二重鎖の環状ＤＮＡが得ら
れる。これを、製造業者の指示した緩衝液を用いＡｖａ
ＩＩ２５単位により、総容量５００μｌ中で切断する。
二重鎖領域は均一の大きさに切断される。７０℃に５分
間加熱して反応を停止させる。

【０１６５】ｂ）ウイルス感染細胞からのＲＮＡの製造 １００×１０⁶ 個の細胞（０．５×１０⁶ ／ｍｌ）を１
００μＭｏｌのデキサメサゾンで４８〜７２時間処理す
る。対照にはデキサメサゾンを加えない。インターフェ
ロンを誘導するため、血清を含まないメジウムに細胞を
濃度５×１０⁶／ｍｌになるように懸濁し、２¹⁰単位／
ｍｌのセンダイウイルスを感染させる。

【０１６６】細胞培養液の上清の一部をとり、プラーク
減少定量法（例５ｂ）によりＩＦＮ活性を試験する。ウ
イルス感染６時間後に細胞を遠心分離（１，０００ｇ，
１０分）によって収穫し、５０ｍｌのＮＰ４０緩衝液で
洗浄し（例４ａ）、氷冷したＮＰ４０緩衝液９．５ｍｌ
に再懸濁し、１０％ＮＰ４０緩衝液０．５ｍｌを加えて
氷冷下に５分間おき分解する。核を遠心分離（１，００
０ｘｇ、１０分）によって除去したのち、上澄液に５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、０．５％ザルコシンおよび５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを加えてｐＨ＝８に調整し、−２０℃に保
存する。

【０１６７】上澄液から総ＲＮＡを単離するため、フェ
ノールで１回、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコールで１回、クロロホルム／アミルアルコールで
１回抽出する。水相を５．７モルＣｓＣｌパッド４ｍｌ
の上に層にし、ＳＷ４０ローターで遠心分離し（３５ｋ
ｒｐｍ、２０時間）、抽出液からＤＮＡおよび残った蛋
白質を除去する。生成したＲＮＡペレットを２ｍｌのＴ
Ｅ、ｐＨ＝８．０に再懸濁し、エタノールで沈殿させ
る。沈殿したＲＮＡを５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解さ
せる。

【０１６８】ｃ）インターフェロン−ω ｍＲＮＡの検
出 例７ａ）で製造したハイブリダイゼーションプローブ
０．２μｌを、例７ｂ）に従って製造したＲＮＡ２０〜
５０μｇとともに、エタノールを添加して沈殿させる。
対照としては、プラスミドｐＲＨＷ１２（例５）で形質
転換した大腸菌起源のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮ
Ａ）またはＲＮＡを細胞性ＲＮＡの代わりに加える。生
成したペレットを７０％で洗浄して塩を除き、乾燥し、
８０％ホルムアミド（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ＝
６．８、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）
２５μｌに溶解する。

【０１６９】次にサンプルを１００℃に５分間加熱して
ハイブリダイゼーションサンプルを変成させ、そのまま
温度を５２℃に調整し、この温度で２４時間インキュベ
ートする。ハイブリダイゼーション後、サンプルを氷上
に置き、Ｓ１反応混合物〔４ｍＭ Ｚｎ（Ａｃ）₂ 、３
０ｍＭ ＮａＡｃ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセ
リン、２０μｇＳＳウシ胸腺ＤＮＡ、Ｓ１ヌクレアーゼ
１００単位〕４７５μｌを加える。３７℃で１時間消化
したのち、エタノールで沈殿させて反応を停止させる。

【０１７０】ペレットを６μｌのホルムアミド緩衝液に
溶解し、８Ｍ尿素を含有する６％アクリルアミドゲル上
ＤＮＡ配列決定反応からのサンプルの場合とほぼ同様に
分離する〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ）ほか：プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．）、第７４巻、５４６３〜５４６７（１９７
９）〕。オートラジオグラフィーのためには、乾燥した
ゲルを、−７０℃で、コダックレーンのレギュラー強化
スクリーンを用いてデュポンクロネックスＸ線フイルム
に暴露する。

【０１７１】図１０の説明 レーンＡ〜Ｃ：対照 レーンＡ：２０μｇ ｔＲＮＡ レーンＢ：ｐＥＲ３３からのＲＮＡ１０μｇ（大腸菌−
インターフェロン−α２−Ａｒｇの発現株） レーンＣ：ｐＲＨＷ１２からのＲＮＡ１ｎｇ（大腸菌−
インターフェロン−ω１の発現株） レーンＤ：非処置ナマルワ細胞からのＲＮＡ５０μｇ レーンＥ：ウイルス感染ナマルワ細胞からのＲＮＡ５０
μｇ

【０１７２】レーンＦ：デキサメサゾンで前処置し、ウ
イルスで感染させたナマルワ細胞からのＲＮＡ５０μｇ レーンＧ：非処置ＮＣ３７細胞からのＲＮＡ２０μｇ レーンＨ：ウイルス感染ＮＣ３７細胞からのＲＮＡ２０
μｇ レーンＩ：デキサメサゾンで前処置し、ウイルスで感染
させたＮＣ３７細胞からのＲＮＡ２０μｇ レーンＭ：サイズマーカー（ＨｉｎｆＩで切断したｐＢ
Ｒ３２２）

【０１７３】レーンＢおよびＣは、特異的ＲＮＡがＲＮ
Ａ分子中にある場合にのみ期待されるシグナルが検出で
きることを示している。また、大過剰の異なるＤＮＡが
あってもバックグラウンドシグナルは生じないことも明
らかである（レーンＢ参照）。さらに、ハイブリダイゼ
ーションの相手として用いたｔＲＮＡもシグナルを生じ
ない（レーンＡ参照）。

【０１７４】レーンＧ〜Ｉは、ウイルス感染ＮＣ３７細
胞におけるω１特異的ＲＮＡの誘導を示している。レー
ンＤ〜Ｆは、ナマルワ細胞でもＮＣ３７細胞の場合と基
本的に同じ結果が得られることを示している。この結果
は、相当する細胞上清について測定したインターフェロ
ン力価と平行している。インターフェロン−ω１遺伝子
発現におけるこの挙動は、インターフェロンＩ型遺伝子
から期待されたものと同じである。

【０１７５】例８ ＩＦＮ−ω１をコードする遺伝子またはその関連遺伝子
の単離 ａ）コスミドスクリーニング ヒトコスミドバンク〔コスミドベクターｐｃｏｓ２ Ｅ
ＭＢＬにクローニングしたヒトＤＮＡ（男性）；ポント
カ（Ｐｏｎｓｔｋａ，Ａ）ほか：プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第８１巻、
４１２９〜４１３３（１９８４）；コンプレキシティ：
２×１０⁶ ）について、ＩＦＮ−ωまたは関連遺伝子を
スクリーニングした。

【０１７６】宿主としては、大腸菌ＤＨ１（ｒ_k ^- 、ｍ
_k ⁺ 、ｒｅｃ．Ａ；ｇｙｒＡ９６、Ｓｕｐ．Ｅ）を用い
た。まずＭｇ⁺⁺細胞（平板バクテリア）を調製した。大
腸菌ＤＨ１を０．２％マルトース補充Ｌ−培地（１０ｇ
／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ Ｎａ
Ｃｌ）中一夜生育させる。遠心分離してバクテリアを除
き、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 溶液にとると、光学密度６０
０＝２を示す。この細胞懸濁液５ｍｌを１２．５×１０
⁶ コロニー形成単位のパックされたコスミドとともに３
７℃で２０分間インキュベートする。

【０１７７】次に１０容のＬＢを加え、コスミドにコー
ドされているカナマイシン抵抗性の発現のために懸濁液
を３７℃に１時間保持する。バクテリアを遠心分離して
除き、ＬＢ５０ｍｌに再懸濁し、その２００μｌをとっ
てニトロセルロースフィルター（シュライヘル・アンド
・シュール、ＢＡ８５、径１３２ｍｍ）上に広げ、これ
をＬＢアガール（Ｌ培地中１．５％アガール）プラスカ
ナマイシン上に置く。各フィルターに約１０，０００〜
２０，０００のコロニーが生育する。コロニーを４℃に
保ったニトロセルロースフィルター上でさらにレプリカ
培養する。

【０１７８】コロニーフィルターのセットを例１ｃ）に
記載したと同様に処理する。すなわち、バクテリアを変
性させ、単一鎖ＤＮＡをニトロセルロース上に固定す
る。フィルターを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
＝８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１
％ＳＤＳ溶液中、６５℃で４時間洗浄する。フィルター
を次に、５メデンハルト（例１ｃ参照）、６×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ溶液中、６５℃で２時間インキュベート
し、同一溶液中で、ニックトランスレーションした変性
ＩＦＮ−ω１ ＤＮＡ（クローンｐＲＨＷ１２のＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサート、図６参照）約５０×
１０⁶ ｃｐｍと６５℃で２４時間ハイブリダイズする。

【０１７９】ハイブリダイゼーション後、フィルター
を、まず、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳ溶液中、室温
で３×１０分間、次に０．２×ＳＳＣ、０．０１％溶液
中で３×４５分間洗浄する。フィルターを乾燥し、−７
０℃で増感フイルムを用い、コダックＸ−Ｏｍａｔ Ｓ
フイルムに暴露する。レプレカフィルター上の陽性反応
コロニーをかき落とし、Ｌ培地＋カナマイシン（３０μ
ｇ／ｍｌ）に再懸濁する。この懸濁液から数μｌをと
り、ＬＢアガール＋３０μｇ／ｍｌカナマイシン上にひ
ろげる。得られたコロニーをニトロセルロースフィルタ
ー上でレプリカ培養に付す。

【０１８０】これらのフィルターを前述のように、³²Ｐ
標識ＩＦＮ−ω１−ＤＮＡとハイブリダイズする。ハイ
ブリダイズした各コロニーから、バーンボイムとドリー
（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅ
ｓ．）、第７巻、１５１３（１９７９）〕を用いてコス
ミドを単離する。このコスミドＤＮＡプレパレーション
で大腸菌ＤＨ１を形質転換し、トランスホーマントをＬ
Ｂアガール＋３０μｇ／ｍｌカナマイシン上で選択す
る。

【０１８１】トランスホーマントを再び、陽性反応クロ
ーンについて³²Ｐ放射能標識ＩＦＮ−ω１−ＤＮＡで試
験した。単離されたオリジナル材料に出発する各場合１
個のクローンを選択し、そのコスミドを大規模に産生さ
せる〔クレウエル（Ｃｌｅｗｅｌｌ，ＤＢ）ほか：バイ
オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第９
巻、４４２８（１９７０）〕。単離された３個のコスミ
ドをｃｏｓ９、ｃｏｓ１０およびｃｏｓＢと命名した。

【０１８２】ｂ）ハイブリダイズした断片のＰＵＣ８中
サブクローニング コスミド、ｃｏｓ９、ｃｏｓ１０およびｃｏｓＢ １μ
ｇをＨｉｎｄＩＩＩにより製造業者（ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ）推薦の条件下に切断した。断片を
ＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲ上、電気泳動で分離
し、サザーン法（例４ｃ）によってニトロセルロースフ
ィルターに移す。２個のフィルターをニックトランスレ
ーションに付したω１−ＤＮＡで例４ｄに記載したと同
様にしてハイブリダイズし、洗浄し、暴露する。

【０１８３】各コスミド約２０μｇをＨｉｎｄＩＩＩで
切断し、生成した断片をゲル電気泳動で分離する。予備
試験でω１−ＤＮＡとハイブリダイズした断片を電気溶
出し、エルチップカラム（シュライヘル・アンド・シュ
ール）で精製する。これらの断片をＨｉｎｄＩＩＩ線状
化脱ホスホリル化ＰＵＣ８とリゲートし〔メッシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ）ほか：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第
１９巻、２６９〜２７６（１９８２）〕、大腸菌ＪＭ１
０１（ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、
〔Ｆ′、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃ ｑ ｚ
Ｍ１５〕（たとえば、ピー・エル・バイオケミカルズ）
をリガーゼ反応溶液で形質転換する。

【０１８４】バクテリアを５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ン、２５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ、
シグマ）および２５０μｇ／ｍｌのイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ、シグマ）を
含むＬＢアガール上にひろげる。生成したコロニーの青
色はＰＵＣ８中インサートの非存在を示す。一部の白色
コロニーから小規模にプラスミドＤＮＡを単離し、つい
でＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１％アガロースゲル上で分
離する。

【０１８５】ＤＮＡ断片をニトロセルロースフィルター
上に移し、前述したと同様にして³²Ｐ−ω１−ＤＮＡと
ハイブリダイズする。ｃｏｓ９およびｃｏｓ１０から出
発し、各場合とも１個のサブクローンを選択し、ｐＲＨ
Ｗ２２またはｐＲＨ５７と命名した。ｃｏｓＢからはω
−１プローブとよくハイブリダイズする２個のＤＮＡ断
片をサブクローン化し、ｐＲＨ５１およびｐＲＨ５２と
命名した。

【０１８６】ｃ）配列解析 ＰＵＣ８中に挿入されたＤＮＡはそのベクター部分か
ら、ＨｉｎｄＩＩＩ切断、ついでゲル電気泳動によって
分離する。このＤＮＡ約１０μｇを、反応溶液５０μｌ
中ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを用いてリゲートし、容量をニッ
クトランスレーション緩衝液（例４ｄ）によって３５０
μｌに調整し、ついで超音波を用いて分解する。この間
氷冷しておく（ＭＳＥ１００ワット超音波ディスインテ
グレーター、２０ｋＨｚにおける最大出力、３０秒５
回）。

【０１８７】次に断片の末端を、１／１００容の０．５
ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰな
らびに１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片
を加えて、１４℃で２時間修復する。ブラント末端をも
つ生成したＤＮＡ断片をアガロースゲル上その大きさに
よって分離する。５００〜１０００ｂｐの大きさの断片
を単離し、ＳｍａＩで切断した脱ホスホリル化ファージ
ベクターＭ１３中にサブクローニングする。

【０１８８】組換えファージの単一鎖ＤＮＡを単離し、
サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）によって開発された方法〔サ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ）ほか：プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第
７４巻、５４６３〜５４６７（１９７６）〕を用いて配
列を決定する。各配列をコンピュータを用いてつなげる
と総配列が得られる〔ステードン（Ｓｔａｄｅｎ，
Ｒ．）：ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．）、第１０巻、４７３１〜４７
５１（１９８２）〕。

【０１８９】ｄ）サブクローンｐＲＨ５７の配列（ＩＦ
Ｎ−ω１） この配列は図１１に示す。１９３３ｂｐのこの断片は、
インターフェロン−ω１の遺伝子を含有する。蛋白質を
コードする領域はヌクレオチド５７６〜１１６３であ
る。配列は全体としてｃＤＮＡクローンＰ９Ａ２と同一
である。ヌクレオチド５７６〜６７４の部分は２３個の
アミノ酸からなるシグナルぺプチドである。ＴＡＴＡボ
ックスは、開始コドンＡＴＧの前方、Ｉ型インターフェ
ロン遺伝子に特徴的な距離にある（４７６〜４８２の位
置）。この遺伝子は、転写時のポリアデニレーションの
ためのシグナル配列を多く含んでいて（ＡＴＴＡＡＡ：
１４９７〜１５０２、または１７６４〜１７９６；ＡＡ
ＴＡＡＡ：１７２９〜１７３４または１７９８〜１８０
３）、その最初のものはクローンＰ９Ａ２で使用され
た。

【０１９０】ｅ）サブクローンｐＲＨＷ２２の配列（Ｉ
ＦＮ−偽ω２） 図１２には、ω１−ＤＮＡサンプルとハイブリダイズす
る、コスミドｃｏｓ９からのＨｉｎｄＩＩＩ断片、２１
３２ｂｐの配列を示す。読み取り枠は９０５〜１３６６
のヌクレオチドにある。それから誘導されるアミノ酸配
列を示す。最初の２３個のアミノ酸は典型的なＩ型イン
ターフェロンのシグナルぺプチドのアミノ酸に類似す
る。以下の１３１個のアミノ酸にはアミノ酸６５までω
１−インターフェロンに類似している。ただし、成熟蛋
白質の最初のアミノ酸はチロシンである。

【０１９１】位置６６のアミノ酸からはＮ−グリコシル
化可能部位の配列である（Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ）。
この点から前方へのアミノ酸配列はＩ型インターフェロ
ンの配列とは異なっている。しかしながら、適当な挿入
とそれによる蛋白質読み取り枠の移動によりＩＦＮ−ω
１に対する類似性を成立させることができる（例９参
照）。したがって、Ｉ型インターフェロンからみて、単
離された遺伝子は偽遺伝子（ＩＦＮ−偽ω２）である。

【０１９２】ｆ）サブクローンｐＲＨ５１の配列（ＩＦ
Ｎ−偽ω３） ｃｏｓＢに由来し、ｂｐ約３５００、ω１−プローブと
ハイブリダイズするＨｉｎｄＩＩＩ断片について部分的
配列決定を行う（図１３）。読み取り枠はヌクレオチド
９２〜３９４から得られる。最初の２３個のアミノ酸は
シグナルぺプチドの特徴を示す。以下のトリプトファン
に始まる配列は、アミノ酸４２までＩＦＮ−ω１に類似
する。その後の誘導された配列はＩＦＮ−ω１とは異な
りアミノ酸７８の後で終わる。この配列は挿入によっ
て、ＩＦＮ−ω１と著しく相同性に変化する（例９）。
この遺伝子はＩＦＮ−偽ω３と命名する。

【０１９３】ｇ）ｐＲＨ５２のインサートの配列（ＩＦ
Ｎ−偽ω４） 長さ３６５９ｂｐ、コスミドＢから単離され、ω１−Ｄ
ＮＡとハイブリダイズするＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列を
図１４に示す。翻訳生成物が部分的にＩＦＮ−ω１と相
同性を示す読み取り枠はヌクレオチド２９５１〜３２５
０に存在する。２３個のアミノ酸からなるシグナルぺプ
チドに続いて、以後のアミノ酸配列はフェニルアラニン
に始まる。ＩＦＮ−ω１に対する相同性はわずかに１６
番目のアミノ酸の後で中断し、２２番目のアミノ酸から
続いて４１番目のアミノ酸で終わる。翻訳は７７番目の
アミノ酸まで可能である。例８ｆ）および８ｇ）の場合
と同様に、インサーションの導入により、ＩＦＮ−ω１
との良好なホモロジーが成立する。ここに単離された偽
遺伝子はＩＦＮ−偽ω４と命名する。

【０１９４】例９ ＩＦＮ−ω族の４種のメンバーに対する遺伝子の評価 図１５にはＩＦＮ−ω１からＩＦＮ−偽ω４までの遺伝
子を、アミノ酸翻訳とともに示す。類似性を高めるた
め、各遺伝子にギャップを挿入しこれを点線で示す。除
去した塩基はない。塩基の番号にはギャップが含まれて
いる。ＩＦＮ−ω１のアミノ酸翻訳はすべてそのままで
ある（たとえば位置３５２〜３５５：Ｈｉｓをコードす
る“Ｃ．ＡＣ”）。

【０１９５】偽遺伝子の場合、アミノ酸への翻訳は、こ
れが疑いの余地なく可能な場合のみとする。この図は、
４個の単離された遺伝子が相互に関係するものであるこ
とを直接示している。たとえば、Ｎ−グリコシル化可能
な位置（ヌクレオチド位置３０１〜３０９）は４個の遺
伝子すべてにみられる。

【０１９６】同様に、ＩＦＮ−偽ω４の場合を除いて、
ヌクレオチド６１１〜６１４に停止コドンを示すトリプ
レットがあり、これはＩＦＮ−ω１の場合、アミノ酸長
１７２の成熟蛋白質を終結させる。この配列では、ＩＦ
Ｎ−偽ω２の停止コドンはヌクレオチド４９７〜４９９
に、ＩＦＮ−偽ω４の停止コドンはヌクレオチド５１２
〜５１４に存在する。

【０１９７】遺伝子またはアミノ酸翻訳の間の相関の程
度は、図１５に示した配列から計算できる。図１６には
ＩＦＮ−ω族のメンバーの間のＤＮＡホモロジーを示
す。２個ずつの比較では、２個のパートナーの一方また
は両方がギャップをもつ位置は計算に入れていない。こ
の比較で、ＩＦＮ−ω１−ＤＮＡとその偽遺伝子の間に
は約８５％のホモロジーが認められる。ＩＦＮ−偽ω２
−ＤＮＡはＩＦＮ−偽ω３およびＩＦＮ−偽ω４のＤＮ
Ａに対して約８２％のホモロジーを示す。

【０１９８】図１７にはシグナル配列の比較結果を、図
１８には成熟蛋白質の比較結果を示す。後者は７２〜８
８％の間を変動する。しかしながら、このホモロジー
は、ＩＦＮ−ω１とＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βの間のホモ
ロジー（例６）より大である。ＩＦＮ−ω族の各メンバ
ーが、ＩＦＮ−αの族のメンバーの場合よりも、たがい
に大きな相違を示すことは、単離されたＩＦＮ−ω遺伝
子４個中の３個が偽遺伝子であり、機能性遺伝子として
同一の選択操作に付されたものでないことによって説明
できるものと思われる。

【０１９９】例１０ 発酵 ａ）菌株の保存 ＬＢ−アガール（２５ｍｇ／Ｌアンピシリン）上の菌株
ＨＢ１０１／ｐＲＨＷ１２の単一コロニーを、２５ｍｇ
／Ｌアンピシリン含有トリプトン−大豆−培地−（ＯＸ
ＯＩＤ ＣＭ１２９）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍ
で振盪しながら、光学密度（５４６ｎｍ）が約５に達す
るまで（対数期）インキュベートする。培養液に１０％
（ｗ／ｖ）滅菌グリセリンを加え、滅菌アンプル中に
１．５ｍｌずつ充填し、−７０℃で凍結する。

【０２００】ｂ）接種ステージ メジウムは１５ｇ／Ｌ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ、
０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ₄ Ｃｌ、
３．０ｇ／Ｌ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．２５ｇ／ＬＭｇＳＯ
₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、０．０１１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ₂ 、５ｇ／
Ｌカサミノ酸（メルク２２３８）、６．６ｇ／Ｌグルコ
ース−一水和物、０．１ｇ／Ｌアンピシリン、２０ｍｇ
／Ｌシステインおよび１ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩を含有
する。このメジウム２００ｍｌをとった１０００ｍｌエ
ルレンマイヤーフラスコ４個それぞれに、ＨＢ１０１／
ｐＲＨＷ１４の解凍培養液１ｍｌを接種し、２５０ｒｐ
ｍで振盪しながら３７℃で、１６〜１８時間インキュベ
ートする。

【０２０１】ｃ）製造ステージ メジウムは１０ｇ／Ｌ （ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ₄ 、４．６
ｇ／Ｌ Ｋ₂ ＨＰＯ₄・３Ｈ₂ Ｏ、０．５ｇ／Ｌ Ｎａ
Ｃｌ、０．２５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、０．０
１１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ₂ 、１１ｇ／Ｌグルコース−一水
和物、２１ｇ／Ｌカサミノ酸（メルク２２３８）、２０
ｍｇ／Ｌシステイン、１ｍｇ／ｌチアミン塩酸塩および
２０ｍｇ／Ｌ ３−β−インドールアクリル酸を含有す
る。１４Ｌのファーメンター（高さ対直径＝３：１）中
に滅菌メジウム８Ｌをとり、上記培養液８００ｍｌを接
種する。

【０２０２】発酵は、２８℃、１０００ｒｐｍで攪拌、
通気速度１ｖｖｍ（容量／容量／分）、初期ｐＨ６．９
で行う。発酵中にｐＨは６．０に低下する。以後、３Ｎ
ＮａＯＨを自動的に加えて、ｐＨをこのレベルに調節
する。光学密度（５４６ｎｍ）が１８〜２０に達したの
ち（通常８．５〜９．５時間を要す）、培養液を通気、
攪拌下に２０℃に冷却し、通気を止めて６Ｎ Ｈ₂ ＳＯ
₄ を加え、ｐＨを２．２にする。８００ｒｐｍ、２０℃
で１時間攪拌したのち、不活性化した培養液をＣＥＰＡ
ラボラトリーＧＬＥ型遠心分離機により、３０，０００
ｒｐｍで遠心分離する。細胞ペーストを凍結し、−２０
℃で保存する。

【０２０３】例１１ インターフェロン−ω−Ｇｌｙの精製 ａ）部分精製 すべての工程は４℃で実施する。培養混合物（発現プラ
スミドで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１）１４０ｇを
あらかじめ冷却した１％酢酸１１５０ｍｌに再懸濁し、
３０分間攪拌する。懸濁液のｐＨを５Ｍ ＮａＯＨ添加
により１０．０とする。この懸濁液をさらに２時間攪拌
する。次に５Ｍ塩酸を用いてｐＨを７．５に再調整し、
攪拌をさらに１５分続ける。懸濁液を１０，０００ｒｐ
ｍ（Ｊ２１遠心分離機、ベックマン、ＪＡ１０−ロータ
ー）、４℃で１時間遠心分離する。

【０２０４】澄明な上清を１５０ｍｌのＣＰＧ（制御細
孔ガラス）カラム（ＣＰＧ１０−３５０、平均サイズ１
２０／２００）に、流速５０ｍｌ／時で適用する。１Ｌ
の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．５／１Ｍ ＮａＣｌ
でカラムを洗浄し、結合して物質を、２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ７．５／１Ｍ ＫＣＮＳ／５０％エチレングリ
コール含有溶液により、流速５０ｍｌ／時で溶出する。
インターフェロンの活性を含む分画を集め、０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム／１０％ポリエチレングリコール４０，
０００約１００容量に対して一夜、透析する。生成した
沈殿を１０，０００ｒｐｍ（Ｊ２１遠心分離機、ＪＡ２
０ローター）、４℃で１時間遠心分離する（第１表参
照）。

【０２０５】

【表２】 第 １ 表 ──────────────────────────────────── 容量 生物学的試験^* 蛋白質 単位/mg 収率 (ml) 単位/ml 総単位 mg/ml 総mg ％ ──────────────────────────────────── 精製前 1150 15000 17.3 ×10⁵ 3.6 4140 4180 100 通過液 2200 < 600 < 1.3 ×10⁵ 0.74 1628 < 600 < 5 溶出液 124.3 170000 21.0 ×10⁶ 16.8 2088 10000 121 透析後 41 300000 12.3 ×10⁶ 12.6 516.6 23800 71 ──────────────────────────────────── * ＣＰＥ減少試験：Ａ５４９細胞、ＥＭＣ−ウイルス 単位：インターフェロン−α２を標準として使用

【０２０６】例１２ ＨｕＩＦＮ−ω１の特性 ａ）ヒト細胞に対する抗ウイルス活性 定量細胞系：ヒト肺癌細胞Ａ５４（ＡＴＣＣＣＣＬ１８
５） チャレンジウイルス：ネズミ脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ
Ｖ） 定量法：細胞変性作用の阻止 蛋白質含量９．４ｍｇ／ｍｌの部分精製ＨｕＩＦＮ−ω
１を細胞培養メジウムで希釈し、定量板に適用した。こ
のプレパレーションは対照標準プレパーションＧｏ−２
３−９０１−５２７（ナショナル・インスティチュート
・オブ・ヘルス、ベセダ、米国）に対し比活性８３００
ＩＥ／ｍｇの抗ウイルス活性を示した。

【０２０７】ｂ）サル細胞に対する抗ウイルス活性 定量細胞系：ＧＬ−Ｖ３ベルベットサル腎臓細胞〔クリ
ストフィニス（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｉｎｉｓ，ＧＪ）：ジ
ャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第３巻、２５
１〜２５８（１９７０）〕 チャレンジウイルス：小水胞口内炎ウイルス（ＶＳＶ） 定量法：プラーク減少 部分精製ＨｕＩＦＮ−ω１プレパレーション（例１２
ａ）参照）を培養メジウムに希釈し、定量細胞に適用し
た。このプレパレーションは比活性５８０単位／ｍｇを
示した。

【０２０８】ｃ）ヒトバーキットリンパ腫細胞（細胞系
Ｄａｕｄ１）に対する抗増殖作用 ヒトバーキットリンパ腫細胞系Ｄａｕｄ１を各種濃度の
ＨｕＩＦＮ−ω（例１２ａ）参照）の存在下に生育させ
た。培養は細胞１００，０００個／ｍｌで開始し、２，
４および６日後の培養液（３７℃）中の細胞密度を測定
した。非処置培養液を対照とした。培養はすべて３個ず
つ行った。図１９に実験結果を示す。細胞増殖は１０単
位／ｍｌで部分的または一時的に、１００単位／ｍｌで
強力に阻止された。

【０２０９】ｄ）ヒト子宮頸癌細胞（細胞系ＨｅＬａ）
に対する抗増殖活性 ヒト子宮頸癌細胞系ＨｅＬａを以下の蛋白質または蛋白
質混合物の存在下に生育させた。 ＨｕＩＦＮ−ω１（例１２ａ参照） １００単位／ｍｌ ＨｕＩＦＮ−γ（例１２ａ参照） １００単位／ｍｌ ヒト腫瘍壊死因子（ＨｕＴＮＦ）、純度９８％以上、ジ
ーンテク・インコーポレーション（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ
Ｉｎｃ．，サンフランシスコ、米国）製〔ペニカ（Ｐｅ
ｎｎｉｃａ，Ｄ）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
第３１２巻、７２４〜７２９（１９８４）参照〕１００
ｎｇ／ｍｌ これらの蛋白質の２種の組合せはすべて、上述したと同
じ濃度に調製する。

【０２１０】いずれの実験についても２個の培養を行
い、初期細胞濃度５０，０００個／３ｃｍペトリ皿、３
７℃で６日間インキュベートし、ついで細胞密度を測定
した。ＨｕＩＦＮ−ω１およびＨｕＴＮＦは、細胞の生
育に弱い影響を与えたのみであったが、ＨｕＩＦＮ−γ
は明らかな細胞変性作用を示した。ＩＦＮ−γとＩＦＮ
−ω１の組合せには相剰的な細胞増殖阻止および細胞毒
作作用がみられる。結果は図２０に示す。

【０２１１】ｅ）低ｐＨにおける安定性 ＨｕＩＦＮ−ω１のプレパレーション（例１２ａ参照）
を細胞培養メジウム（ＲＰＭ１１６４０メジウム、１０
％ウシ胎仔血清含有）で希釈し、塩酸でｐＨを２に調整
した。４℃で２４時間インキュベートしたのち、プレパ
レーションを水酸化ナトリウムを用いて中和し、その抗
ウイルス活性を例１２ａと同様にして滴定した。このプ
レパレーションは中性ｐＨでインキュベートした対照の
７５％の活性を示した。したがって、ＨｕＩＦＮ−ω１
は低ｐＨにおいて安定とみなすことができる。

【０２１２】ｆ）血清学的特性 ＨｕＩＦＮ−ω１とＨｕＩＦＮ−α２の血清学的性質を
比較するため、両蛋白質のサンプル（例１２ａ参照）を
１００単位／ｍｌに希釈し、各種抗血清またはモノクロ
ナール抗体の溶液等容量と混合し、３７℃で９０分間イ
ンキュベートした。これらのサンプルの抗ウイルス活性
を非処置対照の場合と比較した。結果は第２表に示す。

【０２１３】ＨｕＩＦＮ−ω１の抗ウイルス活性はヒト
リンパ球由来ＩＦＮに対する抗血清により、かなり高濃
度で中和されたが、ＨｕＩＦＮ−α２を中和するＨｕＩ
ＦＮ−β、ＨｕＩＦＮ−α₂ に対するポリクロナール抗
血清または各種モノクロナール抗体によっては中和され
なかった。したがって、ＨｕＩＦＮ−ω１は血清学的に
ＨｕＩＦＮ−α２ならびにＨｕＩＦＮ−βとは無関係で
あるといえる。

【０２１４】

【表３】 第 ２ 表 ──────────────────────────────────── 抗血清モノクロ 希釈度 中 和 作 用 ナール抗体 （μｇ/ml) ＨｕＩＦＮ−α２ ＨｕＩＦＮ−ω１ ──────────────────────────────────── ＥＢＩ−１¹⁾ １ ＋ − １０ +++ − １００ +++ − １０００ − ０ ＥＥＩ−３¹⁾ １ +++ − １０ +++ − １００ +++ − １０００ − ０ Ｌ３Ｂ７²⁾ １００ +++ ０ １０００ +++ ０ ヒツジ抗³⁾ 白血球ＩＦＮ １：５００００ +++ − １： ５０００ +++ ０ １： ５００ +++ ＋ １： ５０ − +++ ウサギ抗 HuIFN −α １： １０００ +++ − １： １００ +++ ０ １： １０ − ０ ヒツジ抗⁴⁾ HuIFN −β １： ５０ − ０ ────────────────────────────────────

【０２１５】−：試験せず、 ０：中和作用なし、
＋：部分的中和、+++ ：完全中和¹⁾ ヨーロッパ特許出願Ｃ１１９．４７６号²⁾ ドラッグ・リサーチ（Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）、第３５巻、３６４〜３６９（１９８５）³⁾ リサーチ・リファレンス・リージェント・カタログ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎ
ｔ ｃａｔａｌｏｇ）、Ｎｏ．Ｇ−０２６−５０２−５
６８ リサーチ・リファレンス・リージェント・カタログ（Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ
ｃａｔａｌｏｇ）、Ｎｏ．Ｇ−０２８−５０１−５６
８⁴⁾ リサーチ・リソーシズ・ブランチ、ナショナル・イ
ンスティチュート・オブ・アレルギー・アンド・インフ
ェクシャス・ディジージズ（ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｓｏ
ｕｒｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、ベセダ、メリーラ
ンド（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）米国。

【図面の簡単な説明】

【図１】クローンＥ７６Ｅ９の制限酵素地図。

【図２】クローンＰ９Ａ２の制限酵素地図。

【図３Ａ】クローンＰ９Ａ２のＤＮＡ配列。

【図３Ｂ】図３ＡのつづきのクローンＰ９Ａ２のＤＮＡ
配列。

【図３Ｃ】図３ＢのつづきのクローンＰ９Ａ２のＤＮＡ
配列。

【図４Ａ】クローンＥ７６Ｅ９のＤＮＡ配列。

【図４Ｂ】図４ＡのつづきのクローンＥ７６Ｅ９のＤＮ
Ａ配列。

【図４Ｃ】図４ＢのつづきのクローンＥ７６Ｅ９のＤＮ
Ａ配列。

【図５】プローブとしてクローンＰ９Ａ２のＤＮＡを用
いたゲノムのサザーンブロット解析図。

【図６Ａ】発現クローンｐＲＨＷ１２の構築を示す模式
図。

【図６Ｂ】図６Ａのつづきの発現クローンｐＲＨＷ１２
の構築を示す模式図。

【図７】Ｉ型インターフェロン間のアミノ酸およびヌク
レオチドの差を示す図。

【図８Ａ】ＩＦＮ−αＡ遺伝子の特異なヌクレオチド位
置を示す図。

【図８Ｂ】ＩＦＮ−ω１遺伝子の特異なヌクレオチド位
置を示す図。

【図８Ｃ】ＩＦＮ−αＤ遺伝子の特異なヌクレオチド位
置を示す図。

【図９】特定サンプルからのインターフェロンサブタイ
プの合成を示す模式図。

【図１０】インターフェロンサブタイプの特異的ｍＲＮ
Ａからの検出を示すオートラジオグラム。

【図１１Ａ】ＩＦＮ−ω１遺伝子のＤＮＡ配列。

【図１１Ｂ】図１１ＡのつづきのＩＦＮ−ω１遺伝子の
ＤＮＡ配列。

【図１１Ｃ】図１１ＢのつづきのＩＦＮ−ω１遺伝子の
ＤＮＡ配列。

【図１１Ｄ】図１１ＣのつづきのＩＦＮ−ω１遺伝子の
ＤＮＡ配列。

【図１２Ａ】ＩＦＮ−偽ω２遺伝子のＤＮＡ配列。

【図１２Ｂ】図１２ＡのつづきのＩＦＮ−偽ω２遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１２Ｃ】図１２ＢのつづきのＩＦＮ−偽ω２遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１２Ｄ】図１２ＣのつづきのＩＦＮ−偽ω２遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１３Ａ】ＩＦＮ−偽ω３遺伝子のＤＮＡ配列。

【図１３Ｂ】図１３ＡのつづきのＩＦＮ−偽ω３遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１４Ａ】ＩＦＮ−偽ω４遺伝子のＤＮＡ配列。

【図１４Ｂ】図１４ＡのつづきのＩＦＮ−偽ω４遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１４Ｃ】図１４ＢのつづきのＩＦＮ−偽ω４遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１４Ｄ】図１４ＣのつづきのＩＦＮ−偽ω４遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１４Ｅ】図１４ＤのつづきのＩＦＮ−偽ω４遺伝子
のＤＮＡ配列。

【図１５Ａ】ＩＦＮ−ω遺伝子の補正リスト。

【図１５Ｂ】図１５ＡのつづきのＩＦＮ−ω遺伝子の補
正リスト。

【図１５Ｃ】図１５ＢのつづきのＩＦＮ−ω遺伝子の補
正リスト。

【図１５Ｄ】図１５ＣのつづきのＩＦＮ−ω遺伝子の補
正リスト。

【図１６】シグナル配列のホモロジーを示す図。

【図１７】成熟蛋白質配列のホモロジーを示す図。

【図１８】４種のＤＮＡ配列の相互のホモロジーを示す
図。

【図１９】ヒトバーキットリンパ腫細胞に対するＨｕＩ
ＦＮ−ω１の抗増殖作用を示すグラフ。

【図２０】ヒト子宮頸癌細胞（細胞系ＨｅＬａ）に対す
る抗増殖作用を示すグラフ。

【符号の説明】

図１９において、〇：対照、●：１ＩＥ／ｍｌ、□：１
００ＩＥ／ｍｌ、▼：１００ＩＥ／ｍｌ（＝国際単位／
ｍｌ）；図２０において、Ｃ：非処置対照、Ｔ：ＨｕＴ
ＮＦ、Ｏ：ＨｕＩＦＮ−ω１、Ｇ：ＨｕＩＦＮ−γ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エバ ラストル − ドウオーキン アメリカ合衆国ニユーヨーク州ニユーヨー ク，アブト．６ − ジェイ． モーニン グ サイド ドライブ 90 (72)発明者 ギユンター アドルフ オーストリア国ウイーン，ヨハンナガツセ 20−７ (72)発明者 ピーター スウエツトリイ オーストリア国ウイーン，ヒエトジンガー ハウプトストラーセ 40 ビ − ９ (72)発明者 クリスチヤン ピーラー オーストリア国ウイーン，シユワルズスパ ニエルストラーセ ９−11 (72)発明者 ノルベルト ハウエル ドイツ連邦共和国ビベラツハ １，ハンデ ルストラーセ 12

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式で示されるアミノ酸配列を含有す
   る、ＩＦＮ−ω１と命名されたヒトＩ型インターフェロ
   ンおよびその７８番目のアミノ酸のＮ−グリコシル化誘
   導体： 【化１】 式中、Ｘは１１１番目に存在するアミノ酸Ｇｌｕまたは
   Ｇｌｙを表わす。
2. 【請求項２】 下記式で示される請求項１に記載のヒト
   Ｉ型インターフェロンおよびその７８番目のアミノ酸の
   Ｎ−グリコシル化誘導体： 【化２】 式中、Ｘは１１１番目のアミノ酸ＧｌｕまたはＧｌｙを
   表わす。
3. 【請求項３】 １番目のアミノ酸の前に、アミノ酸Ｍｅ
   ｔをさらに含有する、請求項２に記載のヒトＩ型インタ
   ーフェロン。
4. 【請求項４】 下記式で示されるリーダーペプチドをさ
   らに含有する、請求項２に記載のヒトＩ型インターフェ
   ロン： 【化３】
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒ
   トＩ型インターフェロンを含有する医薬組成物。
6. 【請求項６】 ＩＦＮ−γをさらに含有する請求項５に
   記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 ヒト腫瘍壊死因子をさらに含有する請求
   項５に記載の医薬組成物。