DK2410048T3 - Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse af interesse i en filamentøs svampecelle - Google Patents

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en nukleotidsekvens, der omfatter trinene: - tilvejebringelse af en synonym nukleotidkodende sekvens med optimeret kodonfrekvens, således at en nativ kodon er blevet udskiftet med en synonym kodon, hvilken synonyme kodon koder for den samme aminosyre som den native kodon og har en højere frekvens i kodonanvendelse som defineret i tabel 1 end den native kodon, hvor den optimerede kodonfrekvens er således, at mindst 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % og mest fortrinsvis mindst 95 % af de native kodoner er blevet udskiftet med en synonym kodon, idet den synonyme kodon ændrer kodonfrekvensen, således at værdien af den absolutte forskel mellem procenten for den synonyme kodon i frekvensen og den listede optimale procent bliver mindre efter modificering ved anvendelse af følgende liste over optimale procenter: cystein ved TGC (100 %) ; phenylalanin ved TTC (100 %) ; histidin ved CAC (100 %); lysin ved AAG (100 %); asparagin ved AAC (100 %); glutamin ved CAG (100 %); tyrosin ved TAC (100 %); alanin kodes ved GCT (38 %) , GCC (51 %) eller GCG (11 %) ; aspartat ved GAC (64 %); glutamat ved GAG (74 %); glycin ved GGT (49 %), GGC (35 %), GGA (16 %); isoleucin ved ATT (27 %), ATC (73 %); leucin ved TTG (13 %) , CTT (17 %) , CTC (38 %) , CTG (32 %) ; prolin ved CCT (36 %) , CCC (64 %) ; arginin ved CGT (49 %), CGC (51 %); serin ved TCT (21 %) , TCC (44 %) , TCG (14 %), AGC (21 %); threonin ved ACT (30 %), ACC (70 %) og/eller valin ved GTT (27 %), GTC (54 %), GTG (19 %) , hvor kodon-egnetheden af den synonyme nukleotidkodende sekvens med optimeret kodonfrekvens har en egnetshedsværdi, der er mindst 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, fortrinsvis 96 %, 97 %, 98 % og mest fortrinsvis >98 %, where kodon-egnetheden beregnes ved hjælp af følgende funktion:

hvor g symboliserer en nukleotidkodende sekvens, \g\ dens længde, c (k) dens k'ende kodon, rc (CW, er en ønsket andel af kodon c (k) og rc en faktisk andel i den nukleotidkodende sekvens g, og eventuelt - operabel kobling af den synonyme nukleotidkodende sekvens til en kontrolsekvens, såsom: - én translationstermineringssekvens orienteret i 5' mod 3' -retningen, der er udvalgt fra følgende liste af sekvenser: TAAG, TAGA og TAAA, fortrinsvis TAAA, og/eller - én translationsinitiatorkodende sekvens orienteret i 5' mod 3'-retningen, der er udvalgt fra følgende liste af sekvenser: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; og GCTTCCTTC, fortrinsvis GCT TCC TTC. Tabel 1: Optimal kodonfrekvens for filamentøs svamp af synonyme kodoner i %

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den synonyme nukleotidkodende sekvens er omvendt konstrueret fra en aminosyresekvens.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvor den synonyme nukleotidkodende sekvens omfatter en signalsekvens.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, der omfatter yderligere tilvejebringelse af ét intron og den synonyme nukleotidkodende sekvens.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, der omfatter yderligere tilvejebringelse af en translationsinitiatorsekvens, hvilken translationsinitiatorsekvens omfatter nukleinsyresekvensen som defineret ved konsensus-translationsinitiatorsekvensen: 5'-mwChkyCAmv-3' (SEQ ID NO: 16) ved anvendelse af flertydige koder for nukleotider: m (A/C) ; r (A/G) ; w (A/T) ; s (C/G) ; y (C/T); k (G/T); v (A/C/G) ; h (A/C/T) ; d (A/G/T) ; b (C/G/T) ; n (A/C/G/T), og konsensus-translationsinitiatorsekvensen fortrinsvis er én, der er udvalgt fra følgende liste: 5'- mwChkyCAAA-3' (SEQ ID NO: 17), 5' -mwChkyCACA-3' (SEQ ID NO: 18) og 5'-mwChkyCAAG-3' (SEQ ID NO: 19).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor translationsinitiatorsekvensen er 5'-CACCGTCAAA-3' (SEQ ID NO: 22) eller 5'-CGCAGTCAAG-3' (SEQ ID NO: 23).

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6, hvor nukleotidsekvensen er indbefattet i en nukleinsyrekonstruktion eller ekspressionsvektor.